DE1767285B2 - Process for the production of a stable, highly effective AHF concentrate and means for the treatment of haemophilia - Google Patents
Process for the production of a stable, highly effective AHF concentrate and means for the treatment of haemophiliaInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und Mittel zum Herstellen eines Konzentrates des antihämopiiilen Faktors (AHF, Faktor VIII), wie es in den Ansprüchen 1 - 3 im einzelnen gekennzeichnet istThe invention relates to a method and means for producing a concentrate of the antihemophilic factor (AHF, factor VIII), as it is in the Claims 1 - 3 is characterized in detail
Der Vorgang der Blutkoagulation ist eine wichtige Funktion, die normales Vollblut unter passsenden Bedingungen auszuführen fähig ist, um unnötige Blutverluste durch offene Wunden oder durch innere Blutungen zu verholen.The process of blood coagulation is an important one Function that normal whole blood is able to perform under suitable conditions to eliminate unnecessary To make up for blood loss through open wounds or internal bleeding.
Es ist bekannt, daß normales Vollblut einen Faktor enthält, der abwesend oder in beträchtlichem Maße bei Hämophilie (Bluterkrankheit) fehlend ist Dieser Faktor wirkt mit der Globulinfraktion des Blutes zusammen und ist als antihämophiler Faktor (AHF, Faktor VIII) bekannt geworden.It is known that normal whole blood is a factor contains who are absent or to a considerable extent Hemophilia (blood disease) is absent This factor interacts with the globulin fraction of the blood and has become known as antihemophilic factor (AHF, factor VIII).
Wissenschaftlern ist seit einiger Zeit etwas Ober AHF und seine Bedeutung bei der Blutkoagulation bekannt Die Behandlung der Hämophilie hat bisher im allgemeinen in einer Auffüllungstherapie bestanden, wobei dem Patienten viele Liter frisches Vollblut oder speziell behandeltes Plasma transfundiert wurde.Scientists have known something about AHF and its role in blood coagulation for some time Treatment of haemophilia has so far generally consisted of top-up therapy, many liters of fresh whole blood or specially treated plasma were transfused into the patient.
Es ist bekannt daß jedoch unter üblichen Lagerungsbedingungen Vollblut und flossiges Plasma seine AHF-Aktivität innerhalb eines Tages oder darum herum verliert Da es möglich ist frisches Plasma einzufrieren und zu tagern, hat die AHF-Aktivität in gefrorenem Plasma eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Monaten oder darum herum.It is known, however, that under normal storage conditions it is whole blood and liquid plasma AHF activity loses within a day or around it as fresh plasma is possible Freezing and tagging, AHF activity in frozen plasma has a relatively short lifespan of a few months or around.
Es ist auch möglich, während der Lagerung den Verlust an ÄHF-Äklivität herabzusetzen durch Trocknen frisch gefrorenen Plasmas. Aber bisher ist es nicht möglich gewesen, mit Gewißheit den Gehalt an AHF in diesem getrockneten Material mit Sicherheit zu kennen, weil der Gehalt an AHF in normalen Individuen, die das Plasma spenden, außerordentlich von etwa 50% bis etwa 200% des Durchschnitts schwankt.It is also possible to reduce the loss of ÄHF acridity during storage by drying freshly frozen plasma. But so far it is not it was possible to know with certainty the content of AHF in this dried material, because the content of AHF in normal individuals donating the plasma is extraordinarily from about 50% to fluctuates around 200% of the average.
re ernst zu nehmende Nachteile, weil die Hämophilie oft allergische oder der Behandlung trotzende Zustände bei wiederholter Behandlung mit Plasma entwickelt Außerdem neigen die großen Mengen an Plasma dazu, diere serious disadvantages because hemophilia is often allergic or treatment-defying conditions Repeated treatment with plasma also develops, the large amounts of plasma tend to the durch die Hämophilie benötigt werden, ein übergroßes Blutvolumen oder eine Überladung des zirkulatorischen Systems zu bewirken. Solche Oberladungen rufen eine Oberanstrengung des Herzens hervor und führen beim Patienten zum Herzversagen.required by hemophilia, an excessive volume of blood or an overload of the circulatory Effect system. Such overloads provoke an overstrain of the heart and lead to Patient to heart failure.
ίο Wissenschaftler haben schon verschiedene Methoden für die Isolierung des AHF oder die Herstellung von Plasmafraktionen mit angereichertem AHF aus Humanoder Tierblut vorgeschlagen. In der Praxis haben sich Verfahren bisher als unzuverlässig erwiesen, weil dieίο Scientists already have different methods for the isolation of the AHF or the production of plasma fractions with enriched AHF from human or animal blood. In practice, have Procedure so far proven to be unreliable because of the
is AHF-Aktivität der Fraktionen während der Isolierung verloren zu gehen scheint AHF ist ein labiles Spurenprotein, welches schwierig vollstäiig von anderen Plasmaproteinen zu isolieren ist besonders Fibrinogen und die Ausbeute an AHF aus dem Plasmais AHF activity of the fractions during isolation seems to be lost AHF is a labile trace protein, which is difficult to completely remove Isolating other plasma proteins is particularly fibrinogen and the yield of AHF from the plasma ist durch diese bisherigen Verfahren nicht hoch gewesen.has not been high through these previous procedures.
Die AHF-Wirkungen der bisher hergestellten Blutfraktionen für die Hämophilie-Therapie sind als gering bekannt und die Kosten der Behandluhg sind hoch.The AHF effects of the blood fractions produced so far for hemophilia therapy are considered to be minor known and the cost of treatment is high.
Andere Nachteile bei früheren Versuchen, die bei der Isolierung von AHF festgestellt wurden, sind die Eigenschaften des AHF, daß es sehr leicht durch Hitze. Einfrieren, Auftauen und andauernde Lagerung denaturiert wirdOther drawbacks with previous attempts at the Isolation of AHF have been found to be the properties of AHF in that it is very easily exposed to heat. Freezing, thawing and prolonged storage is denatured
GB-PS 1006 258 beschriebt die Behandlung mit Polyäthylenglykolen zur Einigung bzw. Fraktionierung von Proteinen in 2 Stufen nur für die Gewinnung von homogenem Gammaglobulin beschrieben ist Für die Gewinnung von Fibrinogen ist eine Fraktionierung inGB-PS 1006 258 describes the treatment with Polyethylene glycols for the unification or fractionation of proteins in 2 stages only for the production of homogeneous gamma globulin is described. For the production of fibrinogen a fractionation in
is nur einer Stufe mit Polyäthylenglykol vorgesehen. Da AHF mit Fibrinogen näher verwandt ist als mit Gammaglobulin Am.). Med Sei. 250, Dez. 1935, Seite 65/643 wird der Fachmann durch die GB-PS 10 06 258 von der Verwendung von Polyäthylenglykol abgehalten.is only intended for one stage with polyethylene glycol. There AHF is more closely related to fibrinogen than to gammaglobulin Am.). Med Sei. 250, Dec. 1935, p 65/643 becomes the expert through GB-PS 10 06 258 discouraged the use of polyethylene glycol.
Ferner ist zu berücksichtigen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in völlig unerwarteter Weise das von den vorhergehenden Stufen stammende Polyäthylenglykol nicht bei der Glycinfällung mit AHF ausgefällt wird, sondern in der überstehenden flüssigen PhaseIt should also be taken into account that in the process according to the invention in a completely unexpected manner Polyethylene glycol from the previous stages did not precipitate in the glycine precipitation with AHF but in the supernatant liquid phase verbleibt Da das Polyäthylenglykol für Patienten schädlich sein kann, wird hierdurch ein besonderer technischer (therapeutischer) Effekt erzieltDa remains the polyethylene glycol for patients can be harmful, a special technical (therapeutic) effect is achieved
Zu den verschiedenen Verfahren, die bisher für die Isolierung von AHF vorgeschlagen worden sind,Among the various methods that have so far been proposed for the isolation of AHF, gehören Chromatographie, stufenförmige Absorption und Elution und selektive Ausfällung. Verschiedene Ausfällungsmittei, die benutzt worden sind, sind Äthanol, Aihyläther, Ammoniumsulfat, Phosphat-Natriumcitrat, Aminosäuren und Kältefällungsverfahren.include chromatography, step absorption and elution, and selective precipitation. Different Precipitants that have been used are ethanol, ethyl ether, ammonium sulfate, phosphate-sodium citrate, amino acids, and cryoprecipitation processes.
Kürzlich wurde die klinische Verwendung von mit Glycin gefällter AHF-Fraktion des Vollplasmas durch Webster und Mitarbeiter (Amer. J. Med Sciences, Vol. 250, Nr. 6, Seite 643-650 (1965)) beschrieben, über klinische Versuche zur AHF-Auffüllungstherapie mitRecently, the clinical use of glycine-precipitated AHF fraction of whole plasma has been introduced Webster et al. (Amer. J. Med Sciences, Vol. 250, No. 6, pages 643-650 (1965)), about clinical trials on AHF replenishment therapy with einer kältegefällten Fraktion des Vollplasmas in einem geschlossenen Beutelsystem wurde durch Pool und Mitarbeiter (New England J. Med. Vol. 273, Nr. 27, Seiten 1443-1447 (1965)) ein Bericht veröffentlicht. Keine dieser zuletzt genannten Verfahren hat sicha cold-precipitated fraction of the whole plasma in a closed bag system was passed through pool and Coworkers (New England J. Med. Vol. 273, No. 27, pp. 1443-1447 (1965)) published a report. Neither of these latter procedures has worked jedoch als eine vollständig befriedigende, auch im FabrikmaOstab ausführbare Methode zur Isolierung von AHF erwiesen, so daß ein ungelöstes und dringendes Bedürfnis an einem industriell ausführbaren Verfahrenhowever, as a completely satisfactory one, even im Factory-scale feasible method of isolating AHF proved so that an unresolved and urgent need for an industrially feasible process
zur Gewinnung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzen trates besteht.to obtain a stable, highly effective AHF concentrate.
Die vorliegende Erfindung, die sich gegenüber den bisherigen Verfahren auszeichnet, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durch Ausfällung von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20 000 fraktioniert, wobei in der ersten Stufe mit 3 bis 4 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Kältefällungskonzentrat des AHF, in der zweiten Stufe mit 10Gew.-% Polyäthylenglykol bezogen auf das Oberstehende versetzt wird, wonach man die sich ergebende Ausfällung abtrennt und noch Wiederauflö- 1 s sen die Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8 und nachfolgender Isolierung der Ausfällung durchführtThe present invention, which is distinguished from the previous methods, relates to a method for the production of a stable, highly effective AHF concentrate, characterized in that one Cold precipitation concentrate from human or animal AHF in two successive stages by precipitation of Polyethylene glycol with a molecular weight of 200 to 20,000 fractionated, with 3 to 4 wt .-% polyethylene glycol in the first stage, based on the Cold precipitation concentrate of the AHF, in the second stage with 10Gew .-% polyethylene glycol based on the The above is added, after which the resulting precipitate is separated off and still redissolved 1 s sen fractionation with an aqueous glycine solution with a molarity of 1.8 and more Performs isolation of the precipitate
Eine weitere Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist dadibch gekennzeichnet, daß man eine Reinigungsstufe anter Verwendung von triäthanolaminoäthyliertem Celhiloseharz anschließtAnother embodiment of the above method is characterized in that one Purification stage followed by the use of triethanolaminoethylated celhilose resin
Ferner betrifft die Erfindung das Mittel enthaltender Wirkstoff das nach einem oder mehreren der Verfahrens-Ausführungsfonnen erhaltene stabilen hochwirk- samen AHF-Konzentrat Dieses kann intravenös oder intramuskulär verabreicht werden zur Behandlung von Hämophilie bei Mensch und Tier.Furthermore, the invention relates to the agent-containing active ingredient, the stable, highly effective, obtained according to one or more of the method execution forms. seeds AHF concentrate This can be given intravenously or intramuscularly to treat Haemophilia in humans and animals.
Der vorstehend benutzte Ausdruck »Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF« bezieht sich jo auf die Fällung, die beim Behandeln von Human- oder Tierbhitplastna bei S4°C erhalten wird und von dem Oberstehenden abgetrennt wurde. Bevorzugt wird, daß dieses Kältefällungskonzentrat JeD AHF durch sehr schnelles Einfrieren von frischem Plasma erhalten wird, aber gelagertes Plasma kann ebenfalls als Ausgangsmaterial bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Weiterhin wird bevorzugt, das Einfrieren in einem Temperaturbereich von etwa -200C bis etwa -40"C und folgendem langsamen « Tauen auf etwa 4°C durchzuführen.The expression "cold precipitation concentrate from human or animal AHF" used above relates to the precipitation which is obtained in the treatment of human or animal carboplastna at S4 ° C. and which has been separated off from the above. It is preferred that this cryoprecipitation concentrate JeD AHF be obtained by freezing fresh plasma very rapidly, but stored plasma can also be used as a starting material in the practice of the present invention. Furthermore, it is preferable to carry out the freezing in a temperature range of about -20 0 C to about -40 "C and the following slow" thawing at about 4 ° C.
Zusätzlich zu der Stabilität und der hohen Wirksamkeit der AHF-Aktivität die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, bei der das kältegefällte Konzentrat des AHF anstelle des Vollpias- 4-> mas als Ausgangsmaterial benutzt wird, hat es den großen Vorteil, die Retention von anderen Plasmakomponenten wie Albumin, Gammaglobulin und dergleichen zu gestatten, welche gewöhnlich zerstört werden, wenn das Vollplasma durch die bisher bekannten Verfahren zur Darstellung von AHF-Fraktionen behandelt wird, die zur Behandlung der Hämophilie bestimmt sind.In addition to the stability and high effectiveness of the AHF activity achieved by the method of present invention is obtained in which the cold-precipitated concentrate of the AHF instead of the full pias 4-> mas is used as a starting material, it has the great advantage of allowing the retention of other plasma components such as albumin, gamma globulin and the like, which are usually destroyed, when the whole plasma is treated by the previously known method for displaying AHF fractions, which are intended for the treatment of hemophilia are.
Polyäthylenglykole sind hochmolekulare Polymere, die im allgemeinen durch Umsetzen von Äthylenoxyd mit Äthyienglykol oder Wasser hergestellt werden und die folgende StrukturPolyethylene glycols are high molecular weight polymers that are generally produced by reacting ethylene oxide be made with ethylene glycol or water and the following structure
besitzen, in der π die durchschnittliche Zahl an Oxyäfhylengruppen angibt. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen die Polyäthylenglykole nicht toxisch sein und können einen Molekulargewichtsbereich von etwa 200 bis etwa 20 000 besitzen.in which π is the average number Oxyäfhylengruppen indicating. According to the present invention, the polyethylene glycols are said to be non-toxic and can have a molecular weight range of from about 200 to about 20,000.
Der ausgewählte Molekuiargcwichtsbcreich dieser μ liegt zwischen etwa 400 bis etwa 6000. PEG 4000, welches ein Polyäthylenglykolprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 ist. ist besondersThe selected molecular weight range of these μ is between about 400 to about 6000. PEG 4000, which is a polyethylene glycol product with a mean molecular weight of 4000. is special geeignete von dieser Gruppe.suitable from this group.
In der erfindungsgemäßen Polyäthylenglkyol-Fällungsstufe wird 3 bis 4Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das wieder aufgelöste AHF-Konzentrat unter Einbehaltung des Oberstehenden, gefolgt von der Verwendung von etwa 10Gew.-% Polyäthylenglykol des Oberstehenden unter Einbehaltung des Niederschlages, verwendet Die letztere Ausfällung wird dann abgetrennt und nach Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8, bevorzugt in mit Citrat versetzter Salzlösung wiedergelöstIn the polyethylene glycol precipitation stage according to the invention, 3 to 4 wt .-% polyethylene glycol, based on the redissolved AHF concentrate with retention of the above, followed by the Using about 10% by weight of polyethylene glycol of the above with retention of the precipitate, the latter precipitate is then used separated and after fractionation with an aqueous glycine solution with a molarity of 1.8, preferred redissolved in citrated saline solution
Das erhaltene AHF-Konzentrat kann eingefroren werden und bleibt stabil auch bei der Lyophilisierung und bei der Aufbewahrung unter üblichen Kühllagerungsbedingungen für Zeiten von einem Jahr und langer. Das wiedereingesetzte AHF-Konzentrat hat dann mehr als die dreißigfache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens; die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist weniger als in einem Hundertstel der im Plasma anwensenden Proteine enthalten im Vergleich zu der gleichen AHF-Aktivität im Plasma.The AHF concentrate obtained can be frozen and remains stable even after lyophilization and when stored under normal cold storage conditions for periods of one year or more. The reused AHF concentrate then has more than thirty times the AHF activity of the same Plasma volume; the AHF activity of this concentrate is less than a hundredth of that in plasma Applied proteins contain compared to the same AHF activity in the plasma.
Das kältegefällte Konzentrat des AHF, welches fraktioniert worden ist, kann zur Reinigung weiter mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt werden. Diese Reinigung kann durch Säulen- oder absatzweise Ladungsverfahren ausgeführt werden. Das nach diesem Verfahren gereinigte Konzentrat besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß es sowohl intramuskulär wie auch intravenös verabreicht werden kann, wobei letztere Methode allgemein verwendet wird für solche AHF-Konzentrate, die nicht mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt worden sind Das AHF-Konzentrat, welches mit ECTEOLA-Celluloseharz gereinigt worden ist, ist frei von Fibrogen durch Zugabe von Thrombin und durch Immuno-Elektrophorese gefunden worden.The cold-precipitated concentrate of the AHF, which has been fractionated, can be further used for cleaning ECTEOLA cellulose resin. This purification can be done by column or batch Charge procedures are carried out. The concentrate purified by this process has the additional advantage that it is both intramuscular as well as can be administered intravenously, the latter method being generally used for those AHF concentrates not containing ECTEOLA cellulose resin The AHF concentrate which has been purified with ECTEOLA cellulose resin is found free of fibrogen by addition of thrombin and by immunoelectrophoresis.
Der hier benutzte Ausdruck »ECTEOLA-Celluloseharz« bezieht sich auf eine modifizierte Cellulose, die aktive basische Substituenten enthält, die in das Cellulosemolekül durch Reaktion mit 5pichlorhydrin und Triäthanolamin eingeführt wurden. Verfahren zur Herstellung von ECTEOLA-Cellulosehat-zen sind allgemein von Sober und Peterson (J. Am. Cheni. Soc'y, Vol. 76, Seiten 1711 -12 (1956; a. a. O. VoL 78, Seite 751 -55 (1956); Vol.78, Seiten 756-63 (1956); und Peterson und Sober, (ßiochem. Preparations, VoL 8, Seiten 43-44 (1961)) beschrieben worden.The term "ECTEOLA cellulose resin" used here refers to a modified cellulose that Contains active basic substituents that are introduced into the cellulose molecule by reacting with 5pichlorohydrin and triethanolamine were introduced. Processes for the production of ECTEOLA cellulose hats are generally described by Sober and Peterson (J. Am. Cheni. Soc'y, Vol. 76, pages 1711-12 (1956; loc. Cit. VoL 78, pages 751-55 (1956); Vol. 78, pp. 756-63 (1956); and Peterson and Sober, (Biochem. Preparations, VoL 8, pages 43-44 (1961)).
ECTEOLA-Celluloseharze sind im Handel erhältlich. Es wurde jedoch gefunden, daß es vorteilhaft ist, eingangs diese Harze einer Natriumhydroxyd-Behandlung und Wiederauswaschung zu unterziehen, bevor diese in der schon beschriebenen Reinigungsstufe eingesetzt werden.ECTEOLA cellulose resins are commercially available. It has been found, however, that it is advantageous to initially subject these resins to a sodium hydroxide treatment and rewashing before these can be used in the cleaning stage already described.
In der Reinigungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz wird das Harz vorzugsweise erst mit einer Chloridpufferlösung, die eine Konzentration von etwa 03 Gew.-% Natriumchlorid besitzt, in das Gleichgewicht gebracht und dann in die Chromatographieglassäule eingefüllt Das AHF-Konzentrat, welches gereinigt werden soll, wird zu der Säule gegeben und schließlich mit einer Chloridpufferlösung, die eine Molarität von etwa 03 besi(zt,eluier(.In the cleaning stage with ECTEOLA cellulose resin, the resin is preferably first mixed with a chloride buffer solution that has a concentration of about 03% by weight. Sodium chloride has been brought into equilibrium and then filled into the chromatography glass column The AHF concentrate to be purified is added to the column and finally with a chloride buffer solution that has a molarity of about 03 besi (zt, eluier (.
Andere Methoden zur Reinigung der AHF-Konzentrate der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gegenwärtig sein.Other methods of purifying the AHF concentrates of the present invention will be apparent to those of ordinary skill in the art.
Die Herstellung, klinische Erprobung am Menschen und die Verwertbarkeit und die dabei erhaltenen Effekte der nicht nach Anspruch 3 gereinigten stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrate am Menschen sindThe manufacture, clinical testing on humans and the usability and the resulting Effects of the stable, highly effective AHF concentrates not purified according to claim 3 on humans
vom Erfinder und Mitarbeitern in der Fachzeitschrift: »Journal of the American Medical Association« vom 26. August 1968, Seiten 613-617 in der Arbeit mit dem Titel »A New High-Potency Glycine Precipitated Antihemophilie Factor (AHF) Concentrate« beschrieben worden.from the inventor and employees in the trade journal: "Journal of the American Medical Association" of August 26, 1968, pages 613-617 in the work with the Title "A New High-Potency Glycine Precipitated Antihemophilia Factor (AHF) Concentrate" has been described.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter. Auch ist die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt, die lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zwecks Beschränkung angegeben sind. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich auf die Gewichtsbasis, es sei denn, daß eine andere spezifische Angabe erfolgt istThe following examples further illustrate the invention. Nor is the invention based on this specific examples which are given for the purpose of illustration and not of limitation. All parts and percentages are on a weight basis unless otherwise specified
Ein stabiles Human-AHF-Konzentrat mit hoher Wirksamkeit wird durch die aufeinanderfolgende Fraktionierung des Humanblutplasmas hergestellt, zuerst durch Kältefällung und dann durch Polyäthylenglykol- und Glycinfällung in folgender Weise:A stable human AHF concentrate with high potency is created by the successive Fractionation of human blood plasma produced, first by cold precipitation and then by polyethylene glycol and glycine precipitation in the following way:
Reagenzien Mit Citrat versetzte SalzlösungReagents Salt solution mixed with citrate
Ein Teil 0,1 molares Natriumeitrat auf vier Gewichtsteile 0,9% Salz.One part 0.1 molar sodium citrate to four parts by weight 0.9% salt.
Das erforderliche Glycin wird zu der mit Citrat versetzten Salzlösung gegeben, um in bezug auf das Glycin eine 0,1 molare Lösung zu erhalten.The required glycine is added to the citrated saline solution in order to be related to the Glycine to obtain a 0.1 molar solution.
Zu destilliertem Wasser wird 1/100 Volumen gepufferte Citratlösung zugefügt, welche durch Einstellen 0,5 molaren Natrtumcitrats mit 0,5 molarer Citronensäure auf pH 6,88 hergestellt worden ist1/100 volume of buffered citrate solution is added to distilled water, which by adjusting 0.5 molar sodium citrate with 0.5 molar Citric acid has been produced to pH 6.88
Man stellt 1,0 normale und 0,1 normale wäßrige Lösungen her.Prepare 1.0 normal and 0.1 normal aqueous solutions.
GlycinGlycine
Man stellt eine 1,8 molare wäßrige Lösung her. ArbeitsweiseA 1.8 molar aqueous solution is prepared. Way of working
Humanblutplasma wird tiefgekühlt (< 4° C) aus einem Spenderzentrum erhalten. Das Plasma wird in Pfaudlerkessel eingetaucht und auf einer Temperatur unter 4° C gehalten. Es wird im kontinuierlichen Fluß oder durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert Die erhaltene Kälteausfällung wird gesammelt und für weitere Fraktionierung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.Human blood plasma is obtained frozen (<4 ° C) from a donor center. The plasma is immersed in Pfaudler's kettle and at a temperature below 4 ° C held. It is centrifuged in continuous flow or by single-vessel centrifugation Cold precipitate is collected and sent for further fractionation in accordance with the present invention used.
Zu der Kälteausfällung wird Glycin- mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt. Die Menge beträgt ein Zehntel des Plasmavolumens, aus dem die Kälteausfällung stammt Die Auflösung wird durch Mischen der Kälteausfällung einer warmen Umgebung (Raumtemperatur, aber nicht 300C Obersteigend) bewirktGlycine salt solution mixed with citrate is added to the cold precipitate. The amount is one tenth of the volume of plasma from which the cryoprecipitate is derived, the resolution is effected by mixing the cryoprecipitate a warm environment (room temperature, but not 30 0 C Upper Rising)
Wenn die Kälteausfällung sich aufgelöst hat, kann diese, falls erforderlich, (in Abhängigkeit von der anwesenden Menge an roten Blutkörperchen und anwesenden denaturiertem Protein) durch weiteres Zentrifugieren und/oder Filtration geklärt werden.When the cold precipitate has dissolved, it can, if necessary, (depending on the present amount of red blood cells and present denatured protein) by further Centrifugation and / or filtration to be clarified.
Die aufgelöste Kältefällung wird dann auf pH 6,5 mit 0,1 normaler Essigsäure eingestellt.The dissolved cold precipitation is then adjusted to pH 6.5 with 0.1 normal acetic acid.
Konzentration 3,5% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert Das Oberstehende wird dekantiert und mit 0,1Concentration is 3.5% The mixture will be mild stirred at room temperature for 10 minutes and then centrifuged for 15 minutes at 5000 revolutions / minutes. The above is decanted and 0.1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 638 eingestellt Es wird zusätzliches Folyäthylenglykol 4000 zj der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzentration 10% erreicht Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und einenormal sodium hydroxide solution adjusted to pH 638. Additional polyethylene glycol 4000 zj added to the solution until the polyethylene glycol concentration reaches 10%. The mixture is mild at Stirred room temperature for 30 minutes and a halbe Stunde bei 5000 Umdrehungen zentrifugiert Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2° C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer TemperaturThe centrifuged at 5000 revolutions for half an hour The supernatant is decanted and the precipitate is washed in cold water (2 ° C.). Spin washing is done by centrifugation for 5 minutes at 5000 revolutions / minute at one temperature bei —4° C durchgeführt Das Oberstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöstcarried out at -4 ° C. The above is carried out decanted and the precipitate is dissolved in sodium chloride solution mixed with citrate
Der wiederaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88The redissolved precipitate is brought to pH 6.88 by adding 0.1 normal acetic acid eingestellt Durch geeignete Mittel (beispielsweise Benutzung eines Kühlschrankes oder Verwendung eines Isopropanol-Trockeneisbades) wird die Lösung auf eine Temperatur von 6 bis 100C abgekühlt Zu der gekühlten Lösung wird die erforderliche Menge 13 Molare Glycinadjusted By suitable means (for example use of a refrigerator or use of an isopropanol dry ice bath) the solution is cooled to a temperature of 6 to 10 ° C. The required amount of 13 molar glycine is added to the cooled solution gegoben, um die Lösung in bezug auf Glycin 1,2 molar zu erhalten. Die Mischung wird sanft 45 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 2°C bis 100C gerührt und dann Lm kontinuierlichen Fluß oder gefäßweise zentrifugiert Die sich ergebende Glycinausfällung wird gesammelt undgiven to obtain the solution in terms of glycine 1.2 molar. The mixture is stirred gently for 45 to 60 minutes at a temperature of 2 ° C to 10 0 C and then Lm continuous flow or as vascular centrifuged the resulting Glycinausfällung is collected and vorsichtig gewaschen mit gepuffertem Wasser bei einer Temperatur zwischen 00C bis 4°CCarefully washed with buffered water at a temperature between 0 0 C to 4 ° C
Zu der Glycinausfällung wird mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt die Menge beträgt ein Zwanzigstel des Plasmavoiumens, dem die Glycinausfällung entSalt solution mixed with citrate is added to the glycine precipitate, the amount is one twentieth of the Plasmavoiumens, to which the glycine precipitation ent stammt Die Auflösung wird durch Mischen der Glycinausfällung und der mit Citrat versetzten Salzlösung in einer warmen Umgebung (Raumtemperatur aber nicht 30° C übersteigend) bewirkt Wenn sich die Glycinausfällung aufgelöst hat wird esThe resolution is obtained by mixing the Glycine precipitation and the citrated saline solution in a warm environment (room temperature but not exceeding 30 ° C) When the glycine precipitate has dissolved it will bevorzugt, die Lösung durch Zentrifugieren und/oder Filtration unter Verwendung eines 293 mm Milliporefil ters (benutzte Membrane: 1,2 μπτ, 0,45 um und 03μπι) zu klären. Das Konzentrat nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Akpreferably the solution by centrifugation and / or Filtration using a 293 mm Milliporefil age (membrane used: 1.2 μπτ, 0.45 μm and 03μπι) to clarify. The concentrate produced according to this example has a 30-fold AHF-Ak tivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Ak- tivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-Aktivitätactivity of an equal plasma volume and the AHF activity The effectiveness of this concentrate is less than a hundredth of the amount of protein present in the plasma present and shows an equal numerical value of AHF activity
Beispiel 1 wird wiiderholt einschließlich der zusätzlichen Reinigungsstufe der AHF-Fraktion mit ECTEO-LA-Celluloseharz in der folgenden Weise.Example 1 is repeated including the additional purification step of the AHF fraction with ECTEO-LA cellulose resin in the following manner.
Reagenzien ECTEOLA-CelluloseharzReagents ECTEOLA cellulose resin
1. Man miteeht 60 g Natriumhydroxyd mit 150 ml Wasser.1. Take 60 g of sodium hydroxide with 150 ml Water.
2. Man läßt die Mischung abkühlen.2. Allow the mixture to cool.
3. Man gibt 60 g Cellulose (Wha'mao Cellulose Pulver CF 11) in einen Becher und vermischt sorgfältig mit der vorstehend genannten Natriumhydroxydlö3. Add 60 g of cellulose (Wha'mao cellulose powder CF 11) in a beaker and carefully mixed with the aforementioned sodium hydroxide solution sung.sung.
4. Man läßt die Mischung über Nacht (12 Stunden) stehen.4. The mixture is left to stand overnight (12 hours).
5. Am nächsten Tage wird eine Lösung von 35 ml5. The next day a solution of 35 ml
Triethanolamin und 60 inl Epichlorhydrin hergestellt. Man mischt gut unter einem Abzug.Triethanolamine and 60 ml epichlorohydrin. Mix well under a hood.
6. Man gießt diese Lösung schnell zu der vorstehend genannten Cellulose und durchmischt gut. Das Reaktionsgefäß wird aus der Zugrichtung genommen. (Die Reaktion ist exotherm und die Temperatur steigt auf etwa 1000C. Das Gemisch wird braun in ein bis zwei Stunden.6. This solution is quickly poured into the cellulose mentioned above and mixed well. The reaction vessel is removed from the direction of pull. (The reaction is exothermic and the temperature rises to about 100 ° C. The mixture turns brown in one to two hours.
7. Man kühlt das Gemisch auf Raumtemperatur unter dem Abzug.7. Cool the mixture to room temperature under the hood.
8. In kleinen Anteilen gibt man 350 ml 2 molare Kochsalzlösung zu.8. 350 ml of 2 molar saline solution are added in small portions.
9. Diese Mischung wird durch ein grobkörnig gesintertes Glasfilter filtriert.9. This mixture is filtered through a coarse-grained sintered glass filter.
10. Der Niederschlag wird zweimal mit 500 ml 1 N Natriumhydroxydlösung gewaschen. (Dies entfernt10. The precipitate is washed twice with 500 ml of 1N Washed sodium hydroxide solution. (This removed
die starke Verfärbung).
!!. Man susnendicrt den Nicdcrschls17 in 350 rn! 1 N
Salzsäure in der Filternutsche. Man legt Vakuum an.the strong discoloration).
!!. Sus n One endicrt the Nicdcrschls 17 in 350 rn! 1 N hydrochloric acid in a suction filter. You put on a vacuum.
12. Man wiederholt Stufe Il mit 250 ml I N Natriumhydroxydlösung. 12. Step II is repeated with 250 ml of IN sodium hydroxide solution.
13. Man wiederholt die Stufe 11 mit 250ml IN Salzsäure.13. Repeat step 11 with 250ml IN Hydrochloric acid.
14. Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxylösung. 14. Repeat step 11 with 250 ml of 1N sodium hydroxide solution.
15. Man füllt den Niederschlag in einen 3 Literbecher.15. The precipitate is poured into a 3 liter beaker.
16. Man fügt 250 ml I N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.16. Add 250 ml of IN sodium hydroxide solution and mixes.
17. Man fügt destilliertes Wasser zu der Mischung, um den Becher zu füllen; man mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.17. Add distilled water to the mixture to fill the cup; you mix, cover and leave to stand overnight.
18. Man dekantiert das Überstehende.18. The excess is decanted.
19. Man setzt Wasser zu dem Niederschlag, um den Becher zu füllen und mischt.19. Add water to precipitate to fill beaker and mix.
20. Man wäscht die Mischung auf dem Filter mit Wasser (vier Liter oder mehr, bis ein negativer Test für Alkali mit 1%iger alkoholischer Phenolphthaleinlösung erhalten wird).20. Wash the mixture on the filter with water (four liters or more until a negative test for alkali is obtained with 1% alcoholic phenolphthalein solution).
21. Man führt eine Schlußwaschung mit zwei 250 ml Portionen absoluten Alkohols durch.21. A final wash is carried out with two 250 ml portions of absolute alcohol.
22. Man breitet das Produkt auf Filterpapier aus. Man zerdrückt und breitet das Produkt aus. um es über Nacht zu trocknen.22. Spread the product on filter paper. You crush and spread the product. to get it over To dry overnight.
Chloridpuffer:Chloride buffer:
0.8% NaCl (8 g/L)0.8% NaCl (8 g / L)
0,02Mlmidazol(l.36g/L)0.02Mlmidazole (l.36g / L)
Man stellt auf pH 6,9 mit 1 N Salzsäure ein.The pH is adjusted to 6.9 with 1N hydrochloric acid.
Eluierpuffer:Elution buffer:
03 M NaCl03 M NaCl
0,02 M Imidazol (U6 g/L)0.02 M imidazole (U6 g / L)
Man stellt auf pH 63 mit 1 N Salzsäure ein.The pH is adjusted to 63 with 1N hydrochloric acid.
Ein im Handel erhältliches ECTEOLA-Celluloseharz, welches erst mit NaOH behandelt worden und ausgewaschen worden ist beispielsweise wie in der folgenden Weise, kann an Stelle des vorstehend hergestellten ECTEOLA-Celluloseharzes verwendet werden.A commercially available ECTEOLA cellulose resin which has first been treated with NaOH and For example, as in the following manner, may be used in place of the above produced ECTEOLA cellulose resin can be used.
Auswaschungscyclus von im Handel erhältlichem ECTEOLA-Celluloseharz:Leach cycle of commercially available ECTEOLA cellulose resin:
1. Man mischt 60 g handelsübliches ECTEOLA-CeHuloseharz mit 350 ml 2 M Kochsalzlösung.1. Mix 60 g of commercially available ECTEOLA CeHulose resin with 350 ml of 2 M saline solution.
2. Man filtriert dieses Gemisch durch ein grobkörniges gesintertes Glasfilter.2. This mixture is filtered through a coarse-grained sintered glass filter.
3. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml I N Natriumhydroxydlösung.3. Wash the precipitate twice with 500 ml of IN sodium hydroxide solution.
4. Man wäscht einmal mit 350 ml I N Salzsäure.4. Wash once with 350 ml of IN hydrochloric acid.
5. Man wäscht einmal mit 250 ml I N Natriumhydro- -, xydlösung.5. Wash once with 250 ml of IN sodium hydroxide solution.
6. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Salzsäure.6. Wash once with 250 ml of 1N hydrochloric acid.
7. Man wäscht einmal mit 250 ml I N Natriumhydroxydlösung. 7. Wash once with 250 ml of IN sodium hydroxide solution.
8. Man überführt den Niederschlag in einen 3 ,ο Literbecher, fügt 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.8. Transfer the precipitate into a 3, o liter beaker, add 250 ml of 1 N sodium hydroxide solution to and mix.
9. Man fügt destilliertes Wasser zu dem Gemisch, um den Becher zu füllen, mischt, deckt ab und IaQt über Nacht stehen.9. Add distilled water to the mixture to fill the beaker, mix, cover and IaQt Standing at night.
ι-, 10. Man dekiintiert die Flüssigkeit ab, fügt 3 Liter Wasser zum Niederschlag, mischt und filtriert.ι-, 10. The liquid is dekiintiert, 3 liters are added Water to precipitate, mix and filter.
11. Man wäscht den Niederschlag mit Wasser bis der Phenophthaleintest negativ ist.11. Wash the precipitate with water until the phenophthalene test is negative.
12. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml >,, absolutem Äthylalkohol.12. Wash the precipitate twice with 500 ml > ,, absolute ethyl alcohol.
13. Man breitet den Niederschlag zur Lufttrocknung auf Filterpapier aus.13. Spread the precipitate on filter paper to air dry.
Das ECTF.OLA-Celluloseharz wird über Nacht (12 Stunden) in einem 5"C Schrank im Gemisch mitThe ECTF.OLA cellulose resin is mixed with in a 5 "C cabinet overnight (12 hours)
.', Chloridpuffer im Verhältnis 15 g Harz zu 600 ml Puffer behandelt. Der erhaltene Harzbrei wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 234 cm bis 3,81cm Durchmesser und 45.72 cm Höhe eingefüllt. Nachdem der Puffer sich bis zu dem Spiegel des Harzes abgesenkt. ', Chloride buffer in a ratio of 15 g resin to 600 ml buffer treated. The resulting resin slurry is poured into a column with a diameter of 234 cm to 3.81 cm Diameter and 45.72 cm high. After the buffer has lowered itself to the level of the resin
in hat, wird die AHF-Fraktion auf 2{h ml pro Minute eingestellt und die Menge der AHF Fraktion, die zu einer Einzclsäule gegeben wird, enthält 1000 bis 2500 Einheiten AUF. (Eine Einheit AHF entspricht der AHF-Aktivität in einem cm' des normalen Humanblut-in, the AHF fraction is adjusted to 2 { h ml per minute and the amount of the AHF fraction that is added to a single column contains 1000 to 2500 units of UP. (One unit of AHF corresponds to the AHF activity in one cm 'of normal human blood
r< plasmas). Nachdem das AHF in die Säule gegeben worden ist. wird das Harz mit 200 bis 500 ml Chloridpuffer ausgewaschen. Wenn der Chloridpuffer bis zu dem Spiegel des Harzes sich abgesenkt hat, wird der Eluierpuffer in die Säule gegeben. Das Eluat wird in r < plasmas). After the AHF has been added to the column. the resin is washed out with 200 to 500 ml of chloride buffer. When the chloride buffer has dropped to the level of the resin, the elution buffer is added to the column. The eluate is in
an Zehn-ml-Portionen gesammelt und auf Protein-Fibrogen- und AHF-Aktivität geprüft. collected in ten ml portions and checked for protein-fibrogen and AHF activity.
Die Eluatteile. die die größte wirksame AHF-Aktivität besitzen, werden zurückbehalten und durch die Zugabe von 1% Albumin stabilisiert. Die stabilisierteThe eluate parts. which have the greatest effective AHF activity are retained and by the Addition of 1% albumin stabilizes. The stabilized
i-, Lösung wird dann unter Benutzung eines 293 min Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Ein Silberfilter der gleichen Größe kann anstelle des Milliporefilters benutzt werden. Das endgültige flüssige Produkt wird dann verschlossen eingefroren und danni-, solution is then made using a 293 min Millipore filter, as described in Example 1, filtered. A silver filter of the same size can be used in place of the Millipore filters can be used. The final liquid product is then sealed and then frozen
5n in einem Schnellgefrierer noch mindestens 3 Stunde
aufbewahrt und unter gewöhnlichen Kühlbedingungen in der Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1
aufbewahrt.5n in a quick freezer for at least 3 more hours
stored and kept under normal cooling conditions in the manner of the end product according to Example 1.
Beispiel 1 wird wiederholt und zwar bis zu der Arbeitsstufe, bei der die sich ergebende Glycinausfällung in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst wird. Die aufgelöste Glycinausfällung wird auf pH 63Example 1 is repeated up to the Work stage in which the resulting glycine precipitate is dissolved in citrated saline solution will. The dissolved glycine precipitate is brought to pH 63
r,o durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure eingestellt Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen Konzentration 33% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifu-r, o adjusted by adding 0.1 normal acetic acid Polyethylene glycol 4000 is added until its concentration is 33%. The mixture becomes mild stirred at room temperature for 10 minutes and then centrifuged for 15 minutes at 5000 revolutions / minutes
b5 giert Das Überstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 5,88 eingestellt Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzen-b5 yaws The supernatant is decanted and 0.1 normal sodium hydroxide solution adjusted to pH 5.88. Additional polyethylene glycol 4000 is added added to the solution until the polyethylene glycol concentrate
!ration 10% erreicht. Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 500 Umdrehungen zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2°C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei "5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei -4°C durchgeführt. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst.! ration 10% reached. The mixture will be mild at Stirred at room temperature for 30 minutes and centrifuged at 500 revolutions for half an hour. That The supernatant is decanted and the precipitate is washed in cold water (2 ° C.). The spin washing is made by centrifugation for 5 minutes at "5000 revolutions / minute at a temperature carried out at -4 ° C. The supernatant is decanted and the precipitate is in with citrate dissolved saline solution.
Der wicderaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt und dann mil Glycin gemäß dem Arbeitsverfahren des Beispiels I ausgefällt. Die GlycinausfällungThe redissolved precipitate is brought to pH 6.88 by adding 0.1 normal acetic acid and then precipitated with glycine according to the procedure of Example I. The glycine precipitation
wird gewaschen und geklärt und dann, wie im Beispiel I beschrieben, eingefroren.is washed and clarified and then frozen as described in Example I.
Das AHF-Konzentrat, hergestellt nach dem Verfahren dieses Beispiels, enthält weniger als 0,05% (allgemein um etwa 0,01%) zurückgebliebenes PoIyäthylenglykol. The AHF concentrate made according to the procedure of this example contains less than 0.05% (generally by about 0.01%) remaining polyethylene glycol.
Das Konzentral, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-Aktivität. The Concentral, produced according to this example, has over 30-fold AHF activity an equal plasma volume and the AHF activity of this concentrate is less than a hundredth the amount of protein present in the plasma and shows an equal numerical value for AHF activity.
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