AT390373B

AT390373B - METHOD FOR PASTEURIZING PLASMA PROTEINS OR OF PLASMA PROTEIN FRACTIONS

Info

Publication number: AT390373B
Application number: AT0311084A
Authority: AT
Inventors: Helmut Dr Kaltschmid; Walter Dr Doleschel
Original assignee: Schwab & Co Gmbh
Priority date: 1984-10-02
Filing date: 1984-10-02
Publication date: 1990-04-25
Also published as: ATA311084A

Abstract

Pasteurization of lyophilized plasmaproteins in powder form in suspension in a heat transfer agent which is liquid at the pasteurization temperature and does not decompose at this temperature and which reduces the biological activity of the plasma proteins on heating at 60 degree C for 2 hours to not less than 75% of the initial activity. This heat transfer agent is preferably selected from the group of aliphatic, cycloaliphatic and aromatic hydrocarbons, of the aliphatic monoalcohols with at least 3 C atoms and of the oily substances.

Description

Nr. 390 373No. 390 373

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Pasteurisation von Plasmaproteinen bzw. von Fraktionen derselben, bei dem nur eine sehr begrenzte Denaturierung der Plasmaproteine in Kauf genommen werden muß.The present invention relates to a method for pasteurizing plasma proteins or fractions thereof, in which only a very limited denaturation of the plasma proteins has to be accepted.

Die Behandlung von Patienten mit Proteinen oder Proteinfraktionen, die aus humanen Blutplasma hergestellt wurden, birgt immer das Risiko der Übertragung von Krankheiten, insbesondere von Hepatitis in sich, wenn auch dieses Risiko durch sorgfältige Spenderauswahl und eingehende Testung gering gehalten werden kann. Bei der laufenden Gabe von Plasmaproteinen, wie sie z. B. bei Patienten, die an Haemophilie leiden, nötig ist, fällt das Infektionsrisiko allerdings mehr ins GewichtTreating patients with proteins or protein fractions made from human blood plasma always carries the risk of transmission of diseases, especially hepatitis, although this risk can be kept low by careful donor selection and thorough testing. With the ongoing administration of plasma proteins, as z. B. in patients suffering from haemophilia, the risk of infection is more important

Seit einiger Zeit sind Bestrebungen im Gange, dieses Infektionsrisiko durch eine Hitzebehandlung dieser Plasmaproteine oder einzelner seiner Fraktionen auszuschalten. Dem steht entgegen, daß sich zwar Albumin und hitzestabile alpha und beta Globuline unter gewissen Vorkehrungen in wäßriger Lösung pasteurisieren lassen, nicht aber andere Fraktionen wie z. B. Immunglobuline, Gerinnungsfaktoren, vor allem Faktor VH! Konzentrate. Diese werden bei der Hitzebehandlung praktisch vollständig denaturiertEfforts have been underway for some time to eliminate this risk of infection by heat treating these plasma proteins or some of its fractions. This is opposed to the fact that albumin and heat-stable alpha and beta globulins can be pasteurized in aqueous solution under certain precautions, but not other fractions such as. B. immunoglobulins, coagulation factors, especially factor VH! Concentrates. These are practically completely denatured during the heat treatment

Es wurden zwar verschiedene stabilisierende Zusätze wie Saccharide, Zuckeralkohole, Aminosäuren, Ca-Ionen, K- oder Ammoniumcitrat, Salze von Carbonsäuren bzw. Hydroxycarbonsäuren vorgeschlagen (EP-A 18.561, EP-B 37.078, EP-A 77.870, EP-A 106.269 sowie PCT-Anmeldung WO 83/04027), doch sind hier die Denaturierungsraten immer noch ziemlich hoch.Various stabilizing additives such as saccharides, sugar alcohols, amino acids, Ca ions, K or ammonium citrate, salts of carboxylic acids or hydroxycarboxylic acids have been proposed (EP-A 18,561, EP-B 37,078, EP-A 77,870, EP-A 106,269 and PCT application WO 83/04027), but here the denaturation rates are still quite high.

Aus der EP-A 0 094 611 bzw. der EP-A 0 110 407 ist bekannt, daß sich trockene, z. B. lyophilisierte Plasmaproteine, besonders solche die Faktor VIH enthalten, in trockenem Zustand mit geringerem Verlust an Aktivität pasteurisieren lassen. So müssen laut diesen Europäischen Patentanmeldungen bei Pasteurisationstemperaturen von 65 - 75 °C nur 20 -10 % Aktivitätsverlust bei Faktor Vm Präparaten in Kauf genommen werden. Derartige Trockenerhitzungen sind aber, vor allem bei größeren Mengen, sehr schwierig durchzufiihren, da die Wärmeübertragung in solchen Präparaten sehr schlecht und ungleichmäßig ist, was einerseits partielle Überhitzungen und andererseits partielle ungenügende Erhitzung zur Folge hat. Es ist auch die völlige Virusinaktivierung dabei nicht immer gewährleistet.From EP-A 0 094 611 and EP-A 0 110 407 it is known that dry, e.g. B. lyophilized plasma proteins, especially those containing factor VIH, can be pasteurized in the dry state with less loss of activity. According to these European patent applications at pasteurization temperatures of 65 - 75 ° C only 20-10% loss of activity with factor Vm preparations have to be accepted. Such dry heating, however, is very difficult to carry out, especially in the case of larger quantities, since the heat transfer in such preparations is very poor and uneven, which on the one hand results in partial overheating and on the other hand inadequate heating. Complete virus inactivation is not always guaranteed.

Gemäß EP 0112.563 wurde schließlich vorgeschlagen, eine Beseitigung von infektiösen Viren, insbesondere Hepatitis B- sowie non-A-non-B-Virus sowie von anderen pyrogenen Substanzen mit Lipidstruktur durch eine extraktive Behandlung mit fettlösenden Lösungsmitteln wie Chloroform, Aceton, Diäthyläther, Benzol, Toluol, Xylol, Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Octanol, Tetrahydrofuran oder Mischungen derselben bei etwa 0 °C bis 20 °C, vorzugsweise 2 °C bis 10 °C durchzuführen, wobei diese Behandlung etwa 1-8 Stunden dauern soll. Die Serumproteine sollen dabei 50 - 90 % ihrer ursprünglichen Aktivität beibehalten, es wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß Temperaturen über 30 °C wegen der dann weiter zunehmenden Schädigung der Plasmaproteine auszuschließen sind. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß nur jene infektiös wirkenden Substanzen damit beseitigt werden, die Lipidstruktur besitzen, solche anderer Struktur jedoch unangegriffen bleiben. Überraschenderweise konnte nun gefunden werden, daß eine wirksame und überaus schonende Pasteurisation von Plasmaproteinen dann möglich ist, wenn die Plasmaproteine als Suspension in einem bei Pasteurisationstemperatur flüssigen und stabilen organischen Wärmeüberträger der Pasteurisation unterworfen werden, wobei der verwendete Wärmeüberträger unter weiter unten genannten Bedingungen als "in geringem Ausmaß denaturierend" auf Plasmaproteine wirkend festgestellt worden sein muß. Bei dieser schonenden Pasteurisierung ist eine gleichmäßige Wärmeverteilung gewährleistet und daher eine schädliche lokale Überhitzung vermieden, wobei Aktivitätsverluste auch bei Faktor VIII Konzentraten, von unter 10 % unschwer erzielbar sind.According to EP 0112.563, it was finally proposed to remove infectious viruses, in particular hepatitis B and non-A non-B viruses and other pyrogenic substances with a lipid structure by extractive treatment with fat-dissolving solvents such as chloroform, acetone, diethyl ether, benzene, Toluene, xylene, methanol, ethanol, isopropanol, n-octanol, tetrahydrofuran or mixtures thereof at about 0 ° C to 20 ° C, preferably 2 ° C to 10 ° C, this treatment should take about 1-8 hours. The serum proteins are said to retain 50-90% of their original activity, but it is expressly pointed out that temperatures above 30 ° C. can be ruled out because of the increasing damage to the plasma proteins. This method has the disadvantage that only those infectious substances which have a lipid structure are eliminated, but those of other structures remain unaffected. Surprisingly, it has now been found that an effective and extremely gentle pasteurization of plasma proteins is possible if the plasma proteins are subjected to pasteurization as a suspension in an organic heat transfer medium which is liquid and stable at pasteurization temperature, the heat transfer agent used being referred to as " slightly denaturing " must have been found to act on plasma proteins. This gentle pasteurization ensures an even heat distribution and therefore prevents harmful local overheating, with activity losses of less than 10% being easy to achieve even with factor VIII concentrates.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Pasteurisation von Plasmaproteinen bzw. von Plasmaproteinfraktionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Pasteurisation an pulverförmigen, lyophilisierten Plasmaproteinen oder Plasmaproieinfiaktionen durchführt, die in Suspension in einem bei Pasteurisationstemperatur flüssigen und bei dieser Temperatur nicht zersetzlichen organischen Wärmeüberträger, in dem die Plasmaproteine nicht löslich sind und der auf die Plasmaproteine nur "in geringem Ausmaß denaturierend" wirkt, oder in mehreren solcher Wärmeüberträger, die miteinander mischbar sind, vorliegen.The present invention accordingly relates to a process for the pasteurization of plasma proteins or plasma protein fractions, which is characterized in that the pasteurization is carried out on pulverulent, lyophilized plasma proteins or plasma protein infusions, which are in suspension in an organic liquid which is liquid at pasteurization temperature and not decomposable at this temperature Heat exchanger in which the plasma proteins are insoluble and which only " denaturing to a small extent on the plasma proteins " acts, or in several such heat exchangers that are miscible with each other.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß nicht alle organischen Lösungsmittel oder sonstigen inerten, bei Pasteurisationstemperatur flüssigen Substanzen die in der EP-A 0 112.563 aufgezeigte, starke denaturierende Wirkung auf Plasmaproteine besitzen, wenn Temperaturen von 30 °C oder höher angewandt werden. Es gibt vielmehr eine Reihe von organischen Lösungsmitteln, die ein Erwärmen auf die üblichen Pasteurisationstemperaturen gestatten, ohne daß darin suspendierte Plasmaproteine in nennenswertem Ausmaß geschädigt werden. Unter auf Plasmaproteine nur "in geringem Ausmaß denaturierend" wirkende Lösungsmittel sind im Sinne der vorliegenden Erfindung solche zu verstehen, mit denen ein darin suspendiertes Faktor VHI Konzentrat nach 2-stündigem Erhitzen auf 60 °C mehr als 75 % seiner biologischen Aktivität beibehält. Dieser Auswahltest wird wie folgt durchgeführt: 1 g lyophilisiertes AHF-Pulver mit einer spezifischen Aktivität von Faktor VIII von etwa 0,7 Einheiten/mg Protein, wird mit 100 ml des zu prüfenden Wärmeüberträgers im Rotationskolben an einem Rotationsverdampf»: oder in einem Rührwerksbehälter mit Rückflußkühler mittels Wasserbad unter Drehen bzw. Rühren 2 Stunden auf 60 °C gehalten. Das suspendierte Protein wird anschließend abfiltriert oder abgenutscht und zweimal mit je -2-The present invention is based on the surprising finding that not all organic solvents or other inert substances which are liquid at pasteurization temperature have the strong denaturing effect on plasma proteins shown in EP-A 0 112,563 when temperatures of 30 ° C. or higher are used. Rather, there are a number of organic solvents which permit heating to the usual pasteurization temperatures without causing any appreciable damage to the plasma proteins suspended in them. Taking only " slightly denaturing " In the context of the present invention, active solvents are to be understood as those with which a factor VHI concentrate suspended therein maintains more than 75% of its biological activity after heating to 60 ° C. for 2 hours. This selection test is carried out as follows: 1 g of lyophilized AHF powder with a specific activity of factor VIII of about 0.7 units / mg protein is mixed with 100 ml of the heat exchanger to be tested in a rotary flask on a rotary evaporator: or in a stirrer container The reflux condenser was kept at 60 ° C. for 2 hours by means of a water bath while rotating or stirring. The suspended protein is then filtered off or suction filtered and twice with -2-

Nr. 390 373 etwa 50 ml an einem leicht flüchtigen Lösungsmittel gewaschen, das mit dem verwendeten Wärmeüberträger mischbar ist. Nach Luft- und Vakuumtrocknung wird im so erhaltenen Präparat eine Faktor Vin Bestimmung nach Simone, van der Heiden, Abilgaard, J. Lab-Clin. Med. 69,706,1967 durchgeführt. Lösungsmittel, die den Anforderungen dieses Tests genügen, sind vorzugsweise unter den aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, unter aliphatischen Monoalkoholen mit mehr als 2 C-Atomen, insbesondere unter den geradkettigen Monoalkoholen, sowie unter öligen Substanzen wie z. B. Silikonölen zu finden. Verzweigte Alkohole wirken meist stärker denaturierend als die geradkettigen Isomeren, wobei niedrige verzweigtkettige Alkohole wie z. B. tert-Butanol sogar die Bedingungen des Tests nicht mehr erfüllen.No. 390 373 about 50 ml of a volatile solvent that is miscible with the heat exchanger used. After air and vacuum drying, a factor Vin determination according to Simone, van der Heiden, Abilgaard, J. Lab-Clin. Med. 69,706,1967. Solvents that meet the requirements of this test are preferably among the aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbons, under aliphatic monoalcohols with more than 2 carbon atoms, in particular under the straight-chain monoalcohols, and among oily substances such as. B. to find silicone oils. Branched alcohols usually have a stronger denaturing effect than the straight-chain isomers, with lower branched-chain alcohols such as. B. tert-butanol even no longer meet the conditions of the test.

Ebenso ist dies in der Regel der Fall bei Säuren, sowie stark polaren Lösungsmitteln wie Dimethylformamid und Acetonitril. Ebenfalls zu stark denaturierend im Sinne der vorliegenden Erfindung wirkt Chloroform.Likewise, this is usually the case with acids, as well as strongly polar solvents such as dimethylformamide and acetonitrile. Chloroform is also too strongly denaturing in the sense of the present invention.

In der Folge werden Denaturierungswerte für einige repräsentative Lösungsmittel, die nach der oben angegebenen Methode überprüft wurden, und die der Erfordernis eines Erhaltes von mindestens 75 % der Aktivität entknochen haben, angegeben.The following are denaturation values for some representative solvents which were checked by the above-mentioned method and which have removed the need to preserve at least 75% of the activity.

Tabelle I Wärmeübertrager Aktivität nach 2-stündiger Behandlung bei _60°Cin % des AusgangswertesTable I heat exchanger activity after 2 hours of treatment at _60 ° C% of the initial value

Cyclohexan 99,1 n-Heptan 99,5 Benzol 99,2 Paraffinöl 99,7 n-Propanol 98,0 n-Butanol 88,1 n-Pentanol 78,0 n-Octanol 81,7 Ähnlich gute Ergebnisse werden mit Lösungsmitteln, wie Toluol, Xylol, Butylacetat, oder Äthylenglykolmonomethyläther erzielt.Cyclohexane 99.1 n-heptane 99.5 benzene 99.2 paraffin oil 99.7 n-propanol 98.0 n-butanol 88.1 n-pentanol 78.0 n-octanol 81.7 Similar good results are obtained with solvents such as Toluene, xylene, butyl acetate, or ethylene glycol monomethyl ether achieved.

Hingegen ergaben z. B. folgende andere Lösungsmittel Aktivitätswerte nach erfolgter Behandlung von unter 75 % der Ausgangsaktivität und wurden daher als nicht geeignet eingestuft.In contrast, z. B. Following other solvent activity values after treatment of less than 75% of the initial activity and were therefore classified as unsuitable.

Tabellen Wärmeüberträger Aktivität nach 2-stündiger Behandlung bei 60 °C in % des AusgangswertesTables of heat transfer activity after 2 hours of treatment at 60 ° C in% of the initial value

Methanol Äthanol tert Butanol Tetrahydrofuran Methyläthylketon Essigsäureäthylester Acetonitril Dimethylformamid Hexansäure Chloroform vollständig denaturiert 69.8 65.9 71,2 71,0 73.7 67.7 46.4 vollständig denaturiert 46.5 Lösungsmittel, die als Wärmeüberträger für das erfindungsgemäße Verfahren vorgesehen sind, sollen möglichst wasserfrei sein. Schon geringe Wassermengen im System können zu stärkeren Denaturierungen führen. Es ist daher zweckmäßig, Wassergehalte im System von über 1 Gew.% zu vermeiden. Verwendet man Wärmeüberträger, die mit Wasser nicht mischbar sind, so ist dem Wassergehalt des Systems mehr Augenmerk zu schenken, als in jenen Fällen, in denen der Wärmeüberträger mit Wasser mischbar ist und vermutlich so der direkten Einwirkung auf die Plasmaproteine mehr entzogen ist. So wird z. B. die denaturierende Wirkung von n-Heptan durch die Gegenwart von nur 0,2 % Wasser im System so erhöht, daß im oben angeführten Test nur mehr 63,3 % der ursprünglichen Aktivität erhalten bleibt, während bei 0,2 % Wasser im System und n-Propanol als Wärmeüberträger immerhin 83,8 % der ursprünglichen Aktivität festgestellt wurden.Methanol ethanol tert-butanol tetrahydrofuran methyl ethyl ketone ethyl acetate acetonitrile dimethylformamide hexanoic acid chloroform completely denatured 69.8 65.9 71.2 71.0 73.7 67.7 46.4 completely denatured 46.5 Solvents intended as heat exchangers for the process according to the invention should be as anhydrous as possible. Even small amounts of water in the system can lead to stronger denaturations. It is therefore advisable to avoid water contents in the system of more than 1% by weight. If heat exchangers are used which are not miscible with water, more attention should be paid to the water content of the system than in those cases in which the heat exchanger is miscible with water and is presumably thus more removed from direct influence on the plasma proteins. So z. B. the denaturing effect of n-heptane increased by the presence of only 0.2% water in the system so that only 63.3% of the original activity is retained in the above test, while at 0.2% water in the system and n-propanol as the heat exchanger was found to be 83.8% of the original activity.

Im allgemeinen sollte daher zweckmäßig dafür gesorgt werden, daß bei Verwendung von Wärmeüberträgem, die mit Wasser mischbar sind, ein Wassergehalt von 0,5 Gew.% nicht überschritten wird, während bei mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln die Einhaltung eines maximalen Wassergehalts von 0,2 % -3-In general, therefore, it should be appropriately ensured that when using heat exchangers that are miscible with water, a water content of 0.5% by weight is not exceeded, while with water-immiscible solvents, compliance with a maximum water content of 0.2 % -3-

Nr. 390 373 empfehlenswert ist. Diese empfohlenen Grenzen für tolerierbare Wasserwerte im System sind jedoch nur Richtwerte, da Schwankungen abhängig vom Lösungsmittel und von der eingesetzten Serumproteinfraktion bestehen. In allen Fällen empfiehlt es sich daher, vor Einsatz eines Lösungsmittels dessen Brauchbarkeit im oben angegebenen Test zu überprüfen, um unerwünschte Fehlschläge zu vermeiden.No. 390 373 is recommended. However, these recommended limits for tolerable water values in the system are only guidelines, as there are fluctuations depending on the solvent and the serum protein fraction used. In all cases, it is therefore advisable to check the suitability of the solvent in the test given above to avoid undesirable failures.

Ist ein verwendeter Wärmeüberträger bei der gewählten Pasteurisationstemperatur bereits flüchtig, sollte zweckmäßig durch geeignete Maßnahmen, z. B. durch Anwendung eines Rückflußkühlers dafür gesorgt werden, daß das Volumen während der Pasteurisierung etwa konstant bleibt.If a heat exchanger used is already volatile at the selected pasteurization temperature, it should be expedient to take appropriate measures, e.g. B. can be ensured by using a reflux condenser that the volume remains approximately constant during pasteurization.

Die erfindungsgemäß ausgewählten Wärmeübertrager können einzeln oder auch als Mischungen untereinander, sofern völlige Mischbarkeit vorliegt, eingesetzt werden.The heat exchangers selected according to the invention can be used individually or as mixtures with one another, provided that they are completely miscible.

Temperatur und Behandlungsdauer der erfindungsgemäßen Pasteurisation richten sich nach den für die Pasteurisation von Blutfraktionen gebräuchlichen Werten. Natürlich ist auch dem Siedepunkt des Wärmeüberträgers Rechnung zu tragen. Im allgemeinen ist eine Pasteurisation bei 55 bis 65 °C bei einer Dauer von 8-12 Stunden zu empfehlen, da hier der Vorteil von geringer Denaturierung und wirksamer Zerstörung von infektiösen Substanzen miteinander verbunden werden können. Natürlich nimmt die denaturierende Wirkung der Behandlung mit der Dauer und der angewendeten Temperatur meist zu, sodaß mit einer höheren Denaturierungsrate zu rechnen ist, die aber im Vergleich zu den Verfahren gemäß dem Stand der Technik immer noch relativ günstig liegt. So wird z. B. bei einer Pasteurisation von 2 Stunden bei 98,4 °C mit n-Heptan als Wärmeüberträger immer noch eine Aktivität von 53,2 % des Ausgangswertes im oben angeführten Test verzeichnetThe temperature and duration of treatment of the pasteurization according to the invention depend on the values customary for the pasteurization of blood fractions. Of course, the boiling point of the heat exchanger must also be taken into account. In general, pasteurization at 55 to 65 ° C for a period of 8-12 hours is recommended, since the advantages of low denaturation and effective destruction of infectious substances can be combined here. Of course, the denaturing effect of the treatment usually increases with the duration and the temperature used, so that a higher denaturation rate can be expected, which, however, is still relatively cheap in comparison with the methods according to the prior art. So z. B. at a pasteurization of 2 hours at 98.4 ° C with n-heptane as the heat exchanger still an activity of 53.2% of the initial value in the above test

Im allgemeinen können Temperaturen von 50 - 120 °C und Pasteurisationszeiten von 2 - 20 Stunden Anwendung finden, es sind aber auch andere Varianten wie z. B. schockartige Erhitzung von nur wenigen Sekunden möglich. In solchen Fällen empfehlen sich vor allem hochsiedende Wärmeüberträger wie z. B. hochsiedende aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol oder Xylol, Silikonöle oder Paraffinöle.In general, temperatures of 50 - 120 ° C and pasteurization times of 2 - 20 hours can be used, but there are also other variants such as. B. shock-like heating of only a few seconds possible. In such cases, especially high-boiling heat exchangers such as. B. high-boiling aromatic hydrocarbons such as toluene or xylene, silicone oils or paraffin oils.

Die Aufarbeitung der Mischungen nach beendeter erfindungsgemäßer Pasteurisation gestaltet sich sehr einfach. Der verwendete Wärmeüberträger kann durch Abfiltrieren oder Abnutschen abgetrennt werden.Working up the mixtures after the pasteurization according to the invention has ended is very simple. The heat exchanger used can be separated by filtering or suction filtering.

Ist der eingesetzte Wärmeüberträger schwer flüchtig oder gar hochsiedend, empfiehlt es sich, die zurückbleibenden Serumproteine mit einem leichtflüchtigen Lösungsmittel, das mit dem verwendeten Wärmeüberträger mischbar ist, einmal oder vorzugsweise mehrmals nachzuwaschen und dann das Präparat zu trocknen. Es kann dann auf jede übliche Weise für die Bereitung von Plasmaproteinpräparaten, z. B. unter Auflösen in Wasser, Mischen mit anderen Zusätzen, Einstellen bestimmter Konzentrationen, weiterverarbeitet werden. Als Waschlösungsmittel hat sich in vielen Fällen n-Hexan wegen seiner guten Flüchtigkeit besonders bewährtIf the heat transfer medium used is difficultly volatile or even high-boiling, it is advisable to wash the remaining serum proteins once or, preferably, several times with a volatile solvent that is miscible with the heat transfer medium used, and then to dry the preparation. It can then be used in any conventional manner for the preparation of plasma protein preparations, e.g. B. with dissolving in water, mixing with other additives, setting certain concentrations, further processed. In many cases, n-hexane has proven particularly useful as a washing solvent because of its good volatility

Es sind aber auch andere flüchtige Lösungsmittel, z. B. Diäthyläther, Aceton brauchbar.But there are also other volatile solvents, e.g. B. diethyl ether, acetone usable.

Eine andere Möglichkeit der Aufarbeitung, die dann anwendbar ist, wenn ein mit Wasser mischbarer Wärmeüberträger eingesetzt wird, besteht darin, daß die Suspension nach beendeter Pasteurisation abgekühlt und solange mit Wasser verdünnt wird, bis das Plasmaprotein in Lösung gegangen ist Aus der so erhaltenen, meist opaleszierenden Lösung kann das Plasmaprotein mit üblichen Proteinfällungsmitteln, wie z. B. Äthylalkohol, Polyäthylenglykol, Glycin, Aussalzmittel wie NaCl oder Ammonsulfat oder Kombinationen dieser Fällungsmittel ausgefällt und der üblichen Endfertigung zugeführt werden.Another way of working up, which is applicable when a water-miscible heat exchanger is used, is that the suspension is cooled after the pasteurization has ended and diluted with water until the plasma protein has dissolved opalescent solution, the plasma protein with conventional protein precipitants such. As ethyl alcohol, polyethylene glycol, glycine, salting-out agents such as NaCl or ammonium sulfate or combinations of these precipitants are precipitated and fed to the usual finishing process.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können lyophilisierte Plasmaproteine mit gutem Erfolg pasteurisiert werden. Insbesondere gilt dies für Frischplasma, Immunserumglobulin, sowohl für i.V.- als auch i.M-Verabreichung, Kryopräzipität, Cohn I Fraktion, Faktor VIII Konzentrat, Faktor IX Konzentrat, Prothrombinkomplex, Fibrinogen, Fibronectin und Antithrombin ΠΙ, die alle in lyophilisiertem Zustand eingesetzt werden. Dabei wird gute Mektionssicherheit erzielt.With the method according to the invention, lyophilized plasma proteins can be pasteurized with good success. This applies in particular to fresh plasma, immune serum globulin, both for IV and IM administration, cryoprecipitation, Cohn I fraction, factor VIII concentrate, factor IX concentrate, prothrombin complex, fibrinogen, fibronectin and antithrombin ΠΙ, all of which are used in a lyophilized state. Good mection security is achieved.

In den nachfolgenden Beispiel«! wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert:In the following example «! the method according to the invention is explained in more detail:

Beispiel 1:Example 1:

Lyophilisiertes, pulverförmiges Frischplasma wurde in n-Heptan als Wärmeübertrager suspendiert, wobei pro Gramm Frischplasma 100 g Wärmeüberträger eingesetzt wurden. Die Suspension wurde dann am Rotationsverdampfer 10 Stunden bei 60 °C pasteurisiert. Nach beendeter Pasteurisation wurde der Niederschlag von n-Heptan abfiltriert, zweimal mit n-Hexan gewaschen und zuerst in Luft und anschließend im Vakuum getrocknet.Lyophilized, powdery fresh plasma was suspended in n-heptane as a heat exchanger, 100 g of heat exchanger being used per gram of fresh plasma. The suspension was then pasteurized on a rotary evaporator at 60 ° C. for 10 hours. After the pasteurization had ended, the precipitate was filtered off from n-heptane, washed twice with n-hexane and dried first in air and then in vacuo.

Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen in diesem Frischplasma betrug die folgenden Prozentsätze vom Ausgangswert vor der Pasteurisation.The biological activity of the individual fractions in this fresh plasma was the following percentages from the starting value before pasteurization.

Faktor VHI Faktor IX Faktor Π Immunglobulin 923% 933% 89,0 %Factor VHI factor IX factor Π immunoglobulin 923% 933% 89.0%

IgG IgA 97,0 % 99,5 % -4-IgG IgA 97.0% 99.5% -4-

Nr. 390 373No. 390 373

Beispiel 2:Example 2:

Lyophilisiertes i. V. Immunglobulin wurde wie in Beispiel 1 angegeben in n-Heptan 10 Stunden bei 60 °C pasteurisiert und wie in Beispiel 1 aufgearbeitet. Das Immunglobulin zeigte nach der Pasteurisation folgende Kenndaten: a) Bestimmung des Polymergehaltes durch UltrazentrifugationLyophilized i. V. As in Example 1, immunoglobulin was pasteurized in n-heptane for 10 hours at 60 ° C. and worked up as in Example 1. After pasteurization, the immunoglobulin showed the following characteristics: a) Determination of the polymer content by ultracentrifugation

Polymere und Dimere 10 Monomere vor Pasteurisation 8rel% 92 rel % nach Pasteurisation 9,5 rel % 90,5 rel %Polymers and dimers 10 monomers before pasteurization 8rel% 92 rel% after pasteurization 9.5 rel% 90.5 rel%

Es hat also keine nennenswerte Denaturierung stattgefunden, b) Antikomplementäraktivität 15 vor Pasteurisation nach Pasteurisation % Komplement von 100 % 16 % 12 %There was therefore no significant denaturation, b) anti-complement activity 15 before pasteurization after pasteurization% complement of 100% 16% 12%

Die Antikomplementäraktivität stieg also durch die Pasteurisation nicht nur nicht an, sondern wurde niedriger. 20The anti-complementary activity not only did not increase due to the pasteurization, but also decreased. 20th

c) Radiale Immundiffusion IgA IgG vor Pasteurisation 120 mg/dl 4820 mg/dl nach Pasteurisation 115 mg/dl 4560 mg/dl 25 Beispiel 3:c) Radial immunodiffusion IgA IgG before pasteurization 120 mg / dl 4820 mg / dl after pasteurization 115 mg / dl 4560 mg / dl 25 Example 3:

Lyophilisiertes i.m.Immunglobulin wurde wie in Beispiel 1 beschrieben 10 Stunden bei 60 °C mit n-Heptan als Wärmeüberträger pasteurisiert, anschließend abfiltriert und wie in Beispiel 1 aufgearbeitet Das pasteurisierte Immunglobulin zeigte folgende Werte: 30 Bestimmung des Polymergehaltes durch Ultrazentrifugation: nach Pasteurisation 2,5% 16,8 % 80,7 % vor PasteurisationLyophilized immunoglobulin was pasteurized as described in Example 1 for 10 hours at 60 ° C with n-heptane as the heat exchanger, then filtered off and worked up as in Example 1. The pasteurized immunoglobulin showed the following values: 30 Determination of the polymer content by ultracentrifugation: after pasteurization 2.5 % 16.8% 80.7% before pasteurization

Polymere 1,9 %Polymers 1.9%

Dimere 15,1 %Dimers 15.1%

Monomere 83,0 % 35Monomers 83.0% 35

Es fand also keine nennenswerte Aggregatbildung stattSo there was no significant aggregate formation

Beispiel 4:Example 4:

Lyophilisierter Prothrombin-Komplex wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit n-Heptan als Wärmeüberträger 40 10 Stunden bei 60 °C pasteurisiert und anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt. DieLyophilized prothrombin complex was pasteurized as described in Example 1 with n-heptane as heat exchanger 40 at 60 ° C. for 10 hours and then further treated as described in Example 1. The

Aktivitätsausbeute betrug an Faktor IX 90,3 %, an Faktor II 93,0 % und an Faktor X 97,3 %. Es waren keine aktivierten Faktoren zu verzeichnen.Activity yield was 90.3% on factor IX, 93.0% on factor II and 97.3% on factor X. There were no activated factors.

Beispiel 5: 45 Lyophilisiertes Fibrinogen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit n-Heptan als Wärmeüberträger 10 Stunden bei 60 °C pasteurisiert und wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet.Example 5: 45 Lyophilized fibrinogen was pasteurized as described in Example 1 with n-heptane as the heat exchanger for 10 hours at 60 ° C. and worked up as described in Example 1.

Gerinnbares Protein vor Pasteurisation: 95 % des Gesamtproteins Gerinnbares Protein nach Pasteurisation: 93 % des Gesamtproteins 50 Untersuchung mit der Ultrazentrifuge:Clottable protein before pasteurization: 95% of the total protein. Clottable protein after pasteurization: 93% of the total protein. 50 Examination with the ultracentrifuge:

Sedimentationskonstante 7,6 S 13,4 S 18,6 S 21,3 S vor 76,2 16,8 4,4 2,6 Pasteurisation in rel % nach 77,0 15,8 4,7 2,5 -5- 60Sedimentation constant 7.6 S 13.4 S 18.6 S 21.3 S before 76.2 16.8 4.4 2.6 Pasteurization in rel% after 77.0 15.8 4.7 2.5 -5- 60

Claims

No. 390 373 Example 6: Lyophilized AHF powder with a specific activity of approximately 0.7 units factor Vlfi / mg protein (containing small amounts of citrate, sodium chloride and glycine) was mixed with the heat exchanger shown in the table below for 10 hours at 60 ° C pasteurized. The work-up was carried out as described in Example 1, n-hexane serving as the washing liquid in all cases. The activity yield is summarized in the following table: Tables! Heat exchanger activity yield% cyclohexane 93.2 n-heptane 93.0 benzene 92.2 paraffin oil 87.2 silicone oil 87.2 Example 7: 1 g of lyophilized AHF powder was suspended in 100 ml of n-propanol as a heat exchanger and in a rotary evaporator 60 ° C for 1,2,4,8 and 16 hours pasteurized. After pasteurization, the AHF was separated by filtration, washed with n-hexane and dried in vacuo. The activity yields obtained are summarized in the table below. Pasteurization time (hours) Activity (%) 0 100.0 1 99.2 2 100.0 4 87.9 8 81.5 16 70.2 Example 8: 50 mg lyophilized antihrombin ΙΠ powder with an antithrombin IH activity of 97 international units were suspended in 20 ml of n-heptane and pasteurized for 10 hours at 60 ° C. The solid was then filtered off, washed with 10 ml of n-hexane and dried in vacuo. The activity determination of the pasteurized antithrombin IH concentrate thus obtained was carried out according to the method of J.Fareed, H.C. Mesmore and J.U.Balis, Chromogenic Peptide Substrates, pages 183-195, Churchill-Livingstone, Edinburgh 1979. The pasteurized product showed 93.6% of the initial activity. PATENT CLAIMS 1. Process for pasteurization of plasma proteins or plasma protein fractions, characterized in that the pasteurization is carried out on powdery, lyophilized plasma proteins or plasma protein factions, which are in suspension in an organic heat transfer medium which is liquid at pasteurization temperature and not decomposable at this temperature and in which the plasma proteins are insoluble, and which reduces the biological activity of the plasma proteins by heating to 60 ° C. for 2 hours to not less than 75% of the starting activity, or is present in several such heat exchangers which are miscible with one another.

2. The method according to claim 1, characterized in that the volume of the plasma protein suspension is kept constant during the pasteurization. -6- No. 390 373

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the water content in the pasteurization system is at most 1% by weight.

4. The method according to claim 3, characterized in that an immiscible or only up to 5% miscible heat exchanger is used and the water content in the system is a maximum of 0.2% by weight

5. The method according to claim 3, characterized in that the heat exchanger is miscible with water and the water content of the system is a maximum of 0.5% by weight

6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that the plasma protein or its fraction is filtered off after the end of the heat treatment, washed out with a miscible with the heat exchanger, easily evaporable solvent and then gently dried.

7. The method according to claims 1 to 5, characterized in that when using a water-miscible heat exchanger, the suspension is cooled after the pasteurization, diluted with water until a solution of the plasma protein is obtained and the plasma protein is precipitated from the solution with conventional protein precipitants and is separated.

8. The method according to claims 1 to 7, characterized in that 8 to 12 hours at a temperature of 55 to 65 ° C is pasteurized.

9. The method according to claims 1 to 8, characterized in that an aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbon is used as the heat exchanger.

10. The method according to claims 1 to 8, characterized in that an aliphatic monoalcohol with at least 3 carbon atoms is used as the heat exchanger.

11. The method according to claim 10, characterized in that the aliphatic monoalcohol is straight-chain.

12. The method according to claims 1 to 8, characterized in that a silicone oil is used as the heat exchanger. -7-