DE4434538C2

DE4434538C2 - Virus inactivation method in the presence of a polyether and a chaotropic agent

Info

Publication number: DE4434538C2
Application number: DE4434538A
Authority: DE
Inventors: Johann Eibl; Friedrich Dorner; Noel Barrett
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-09-27
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2014-09-28
Also published as: DE4434538A1; DE59410031D1; YU57994A

Description

Die Erfindung betrifft ein hoch wirksames Verfahren zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien unter Erhaltung der biologischen Aktivität bei der Herstellung einer pharmazeutischen Präparation enthaltend ein Plasmaprotein.The invention relates to a highly effective method for Inactivation of infectious agents while maintaining the biological activity in the manufacture of a pharmaceutical preparation containing a plasma protein.

Plasmaproteine sind Proteine, die aus menschlichem oder tierischem Blut bzw. Plasma gewonnen werden können. Die Plasmaproteine sind als pharmazeutische Präparation zur therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Anwendung bestimmt. Solche Präparationen können Enzyme, Proenzyme einschliesslich Gerinnungsfaktoren, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Immunglobuline, Albumin, Plasminogen, Fibrinogen, Fibronectin, t-PA, Urokinase, Prourokinase oder Plasma enthalten. Als Plasmaproteine werden ebenso rekombinante Polypeptide verstanden, die aufgrund ihrer Eigenschaften den genannten Plasmaproteinen äquivalent sind.Plasma proteins are proteins made from human or animal blood or plasma can be obtained. The Plasma proteins are used as a pharmaceutical preparation therapeutic, prophylactic or diagnostic use certainly. Such preparations can be enzymes, proenzymes including coagulation factors, enzyme cofactors, Enzyme inhibitors, immunoglobulins, albumin, plasminogen, Fibrinogen, fibronectin, t-PA, urokinase, prourokinase or Plasma included. Recombinant are also used as plasma proteins Understand polypeptides that due to their properties mentioned plasma proteins are equivalent.

Unter biologischen Präparaten werden pharmazeutisch anwendbare Präparate verstanden, die biologischen Ursprungs sind, d. h. aus natürlichen Quellen isoliert oder aus Zellkulturen gewonnen bzw. rekombinant hergestellt sind. Ein biologisches Präparat enthält beispielsweise ein Plasmaprotein oder eine Vaccine, insbesondere ein virales Antigen.Biological preparations include pharmaceutically usable ones Understood preparations that are of biological origin, d. H. out natural sources isolated or obtained from cell cultures or are produced recombinantly. A biological preparation contains, for example, a plasma protein or a vaccine, especially a viral antigen.

Zu den biologischen Präparaten zählen aber auch Immunglobulinpräparate, monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, Uberstände von Zellkulturen oder Ascitesflüssigkeit von Mäusen. But biological preparations also count Immunoglobulin preparations, monoclonal antibodies or their Fragments, cell culture supernatants or ascites fluid of mice.

Bei der Verabreichung eines biologischen Präparates, insbesondere eines Plasmaprotein-haltigen Präparates besteht ein Infektionsrisiko durch potentiell vorhandene infektiöse Agenzien, wie Hepatitis- oder AIDS-Viren. Das Herstellungsverfahren dieser Präparate muss daher geeignete Inaktivierungsmassnahmen umfassen.When administering a biological preparation, in particular a plasma protein-containing preparation an infection risk from potentially existing infectious Agents such as hepatitis or AIDS viruses. The Manufacturing process of these preparations must therefore be suitable Inactivation measures include.

Unter infektiösen Agenzien werden Krankheitserreger verstanden, die von einem Organismus auf einen anderen Organismus übertragen werden können, beispielsweise Viren oder Prionen.Infectious agents are understood to be pathogens that from one organism to another organism can be transmitted, for example viruses or prions.

Es liegt eine umfangreiche Literatur vor, die sich mit der Inaktivierung von infektiösen Agenzien in pharmazeutischen Präparationen befasst.There is an extensive literature dealing with the Inactivation of infectious agents in pharmaceutical Preparations deals.

Als eine der wirksamsten Methoden zur Inaktivierung von Viren gilt das Erhitzen von Plasmaproteinen in Lösung. Es ist bekannt, dass eine virussichere albuminhaltige Präparation durch Erhitzen einer wässrigen Albuminlösung bei einer Temperatur von 60°C während 10 h hergestellt werden kann. Die biologische Aktivität des Albumins ist dabei nicht beeinträchtigt, da Albumin ein relativ stabiles Plasmaprotein ist.As one of the most effective methods for inactivating viruses heating of plasma proteins in solution applies. It is known, that a virus-safe preparation containing albumin by heating an aqueous albumin solution at a temperature of 60 ° C can be produced during 10 h. The biological activity the albumin's is not affected as albumin is a is relatively stable plasma protein.

Durch den Zusatz von Ammoniumsulfat ist im Stand der Technik eine Erhöhung der Virusinaktivierungskapazität einer Wärmebehandlung von Blutprodukten in Lösung beschrieben (EP-0 124 506 B1). Dabei ist das Problem der gleichzeitigen Inaktivierung von Plasmaproteinen bekannt, weshalb vorgeschlagen wird, Protein-stabilisierende Substanzen, wie Glycin, zuzusetzen. Eine erwünschte Stabilisierung der Plasmaproteine bedeutet aber gleichzeitig eine unerwünschte Stabilisierung der infektiösen Agenzien. Das Bestreben geht also dahin, eine Infektivität der Präparation auszuschliessen und gleichzeitig ihre biologische Aktivität weitgehend zu erhalten.The addition of ammonium sulfate is state of the art an increase in virus inactivation capacity Heat treatment of blood products in solution is described (EP-0 124 506 B1). The problem is simultaneous Inactivation of plasma proteins is known for why it is proposed to use protein stabilizing substances, such as Glycine to add. A desired stabilization of the However, plasma proteins also mean an undesirable one Stabilization of infectious agents. The effort goes So to rule out infectivity of the preparation while largely increasing their biological activity receive.

Ein Zusatz von Stabilisatoren zu Plasmaprotein-haltigen Lösungen ist beispielsweise aus EP A 0 292 003 A2 bekannt. Als Stabilisatoren werden Saccharide oder Zuckeralkohole und neutrale Salze, wie Acetate, Phosphate und Sulfate zugesetzt. Salze haben hier eine stabilisierende Wirkung.An addition of stabilizers to those containing plasma protein Solutions are known for example from EP A 0 292 003 A2. As Stabilizers are saccharides or sugar alcohols and neutral salts such as acetates, phosphates and sulfates are added. Salts have a stabilizing effect here.

Eine virusinaktivierende Wirkung von Salzen ist hingegen in WO 9007524 A1 beschrieben. Antikörper gegen Protein C sind bei 22°C mindestens 2 h in Gegenwart von mindestens 2,6 mol/l Guanidin oder 2 mol/l Kaliumthiocyanat stabil. Eine solche Behandlung wird auch vorgeschlagen, um potentiell vorhandene Viren zu inaktivieren. Die genannten Verbindungen haben aufgrund ihres chaotropen Verhaltens nicht nur inaktivierende Wirkung gegenüber Viren, sondern auch gegenüber Proteinen. Deshalb ist es beachtlich, dass die Antikörper bei Raumtemperatur eine gewisse Zeit mit diesen Verbindungen inkubiert werden können, ohne ihre Affinität zu Protein C zu verlieren.However, a virus-inactivating effect of salts is in WO 9007524 A1 described. Antibodies against protein C are included 22 ° C for at least 2 h in the presence of at least 2.6 mol / l Guanidine or 2 mol / l potassium thiocyanate stable. Such Treatment is also suggested to potentially exist Inactivate viruses. Have the connections mentioned not only inactivating due to their chaotropic behavior Effect against viruses, but also against proteins. It is therefore noteworthy that the antibodies at Room temperature a certain time with these compounds can be incubated without affinity for Protein C. to lose.

Aus WO 9015613 A1 ist ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren durch Zusatz von Natriumthiocyanat zu Plasmaprotein-haltigen Lösungen bekannt. Um das Plasmaprotein nicht zu denaturieren wird darauf geachtet, dass die Behandlung möglichst bei 4°C und während einer kurzen Behandlungsdauer erfolgt.WO 9015613 A1 describes a method for inactivating viruses by adding sodium thiocyanate to those containing plasma protein Known solutions. In order not to denature the plasma protein care is taken to ensure that the treatment is at 4 ° C and during a short treatment period.

Thiocyanate werden darüber hinaus als Elutionsmittel im Rahmen einer Immunaffinitätschromatographie eingesetzt. Im Anschluss an die Elution erfolgt unmittelbar die Entfernung des Thiocyanates, um eine Schädigung des gereinigten Proteins zu verhindern (vgl. US 50 55 557).Thiocyanates are also used as eluents in the frame an immunoaffinity chromatography. In connection the elution is immediately removed Thiocyanates to damage the purified protein prevent (see US 50 55 557).

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in einem biologischen Präparat zur Verfügung zu stellen, das aufgrund des Verfahrens frei von infektiösen Agenzien sowie weitgehend frei von Denaturierungsprodukten ist.The invention has for its object a method for Inactivation of viruses in a biological preparation for To make available that due to the procedure free of infectious agents and largely free of Is denaturing products.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch ein Verfahren gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:
The above object is achieved according to the invention by a method which comprises the following steps:

a) adding a polyether to a plasma protein containing solution,
b) inactivating infectious agents in the presence of the Polyether and a chaotropic agent by a physico-chemical or chemical treatment, and
c) Removal of the polyether and the chaotropic agent.

Polyether umfassen gemäss der Erfindung auch Polyhydroxyether, wie Polyalkylenglykol, und insbesondere Polyethylenglykol und Polypropylenglykol.According to the invention, polyethers also include polyhydroxy ethers, such as polyalkylene glycol, and in particular polyethylene glycol and Polypropylene glycol.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe
A preferred embodiment is characterized in that one step

a) as a polyether, a low molecular weight polyethylene glycol selected from the group PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 900 and PEG 1000 admits,
b) the inactivation of infectious agents in the presence of the Polyethylene glycol and a chaotropic agent, and
c) the polyethylene glycol and the chaotropic agent are removed.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Stufe (b) die Inaktivierung von infektiösen Agentien in Gegenwart des Polyethers und des chaotropen Agens durch eine physikalische, physikalisch-chemische oder chemische Behandlung mit der Maßgabe, dass eine Detergens-Behandlung ausgenommen ist.In a further preferred embodiment takes place in stage (b) the inactivation of infectious agents in the presence of the Polyether and the chaotropic agent through a physical, physico-chemical or chemical treatment with the Provided that a detergent treatment is excluded.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren bei pharmazeutischen Präparationen gemäß Anspruch 1.The invention relates to a method for inactivating Viruses in pharmaceutical preparations according to claim 1.

Bevorzugte Ausgestaltungen dieser Verfahren sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 15.Preferred embodiments of these methods are the subject of Claims 2 to 15.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass der Zusatz eines Polyethers und eines chaotropen Agens, wie z. B. Polyethylenglykol, in einer Konzentration von 5 bis 30 Gew.-%, einen unerwartet positiven Effekt auf eine Inaktivierungsbehandlung zur Beseitigung von Infektiosität ausübt. Dadurch können die Bedingungen der Inaktivierungsbehandlung so gewählt werden, dass die biologische Aktivität der Plasmaproteine weitgehend erhalten bleibt.It has surprisingly been found that the addition of a Polyether and a chaotropic agent such. B. Polyethylene glycol, in a concentration of 5 to 30% by weight, an unexpectedly positive effect on one Inactivation treatment to remove infectivity exercises. This allows the conditions of the Inactivation treatment should be chosen so that the biological activity of the plasma proteins largely preserved remains.

Die Konzentration des Polyethers und des chaotropen Agens wird so gewählt, dass keine Fällungsreaktionen verursacht werden. Die Präzipitation von Proteinen birgt nämlich die Gefahr in sich dass infektiöse Partikel im Präzipitat eingeschlossen sind. Dadurch werden die infektiösen Partikel einer Inaktivierungsbehandlung schlecht zugänglich. In Abwesenheit eines Präzipitats ist daher keine verzögerte Inaktivierung von infektiösen Agenzien zu beobachten. Ebenso ist es möglich, die Temperatur einer Wärmebehandlung bei gleichbleibender Effektivität herabzusetzen. The concentration of the polyether and the chaotropic agent will chosen so that no precipitation reactions are caused. Precipitation of proteins is dangerous that the infectious particle is trapped in the precipitate are. This makes the infectious particles one Inactivation treatment difficult to access. In absence of a precipitate is therefore not a delayed inactivation of infectious agents. It is also possible that Temperature of a heat treatment with the same To reduce effectiveness.

Die verbesserte Inaktivierungsbehandlung in Gegenwart eines Polyethers und eines chaotropen Agens konnte nicht erwartet werden. Es wurde nämlich erstmals gefunden, dass in Gegenwart eines Polyethers und eines chaotrophen Agens alleine, beispielsweise Polyethylenglykol, vorhandene Viren inaktiviert werden.The improved inactivation treatment in the presence of a Polyether and a chaotropic agent could not be expected become. It was found for the first time that in the present a polyether and a chaotrophic agent alone, for example polyethylene glycol, inactivates existing viruses become.

Die Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien umfasst vorzugsweise eine Wärmebehandlung, insbesondere bei einer Temperatur von 20 bis 60°C, vorzugsweise im Bereich von 25 bis 45°C.Treatment to inactivate infectious agents preferably comprises a heat treatment, especially at a temperature of 20 to 60 ° C, preferably in the range of 25 to 45 ° C.

Als geeigneter Polyether wird vorzugsweise Polyethylenglykol, und besonders bevorzugt ein niedermolekulares Polyethylenglykol verwendet. Als besonders geeignete Polyethylenglykole sind hier solche zu nennen, die aus der Gruppe PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 900 und PEG 1000 ausgewählt werden. Zur Entfernung des Polyethers eignen sich eine Reihe von bekannten Massnahmen. Das Plasmaprotein wird aus der behandelten Lösung vorteilhafterweise durch Präzipitation oder Adsorption, vorzugsweise durch Chromatographie, entfernt. Der Polyether verbleibt hingegen in Lösung und wird so vom Plasmaprotein abgetrennt. Die Entfernung des Polyethers erfolgt vollständig bzw. bis zu einem physiologisch akzeptablen Gehalt im verabreichungsfertigen Präparat.A suitable polyether is preferably polyethylene glycol, and particularly preferably a low molecular weight polyethylene glycol used. Polyethylene glycols are particularly suitable here to name those from the group PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 900 and PEG 1000 can be selected. For removal of the polyether are a number of known measures. The plasma protein is made from the treated solution advantageously by precipitation or adsorption, preferably removed by chromatography. The polyether however, remains in solution and is thus from the plasma protein severed. The polyether is removed completely or up to a physiologically acceptable content in ready-to-use preparation.

Gemäss der Erfindung kann vorgesehen sein, dass nach Zugabe eines Polyethers zu einer das Plasmaprotein enthaltenden Lösung dieselbe lyophilisiert wird, so dass die anschliessende Behandlung des Plasmaproteins zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien in Gegenwart des Polyethers im festen Zustand als Lyophilisat erfolgt. Diese Behandlung stellt eine physikalisch- chemische oder eine chemische Behandlung dar. Dazu zählt z. B. auch eine Behandlung in Gegenwart von viruziden Substanzen, gegebenenfalls kombiniert mit einer Strahlenbehandlung oder Hitzebehandlung. According to the invention it can be provided that after adding a Polyether to a solution containing the plasma protein the same is lyophilized so that the subsequent Treatment of plasma protein to inactivate infectious Agents in the presence of the solid polyether as Lyophilisate takes place. This treatment represents a physical represents chemical or a chemical treatment. B. also treatment in the presence of virucidal substances, optionally combined with radiation treatment or Heat treatment.

Erfindungsgemäß erfolgt die Inaktivierung von infektiösen Agenzien durch Behandlung einer Lösung oder eines Lyophilisats der Präparation in Gegenwart eines Polyethers und eines chaotropen Agens. Es hat sich herausgestellt, dass durch die Kombination eines chaotrop wirksamen Salzes, wie z. B. Thiocyanat, mit einem Polyether, wie z. B. Polyethylenglykol, ein synergistischer Effekt auf die Inaktivierung von Viren beobachtet wird, wobei die biologische Aktivität der Präparation im wesentlichen erhalten bleibt. So werden auch resistente Viren, wie Vaccinia-Virus oder Parvovirus, im Vergleich zu einer Behandlung mit Thiocyanat alleine, wesentlich rascher und bei geringeren Konzentrationen an Thiocyanat inaktiviert. Die Reduktion der Thiocyanat- Konzentration und der Behandlungsdauer wirkt sich wiederum vorteilhaft auf die biologische Aktivität des Präparates aus.According to the invention, the inactivation of infectious Agents by treating a solution or a lyophilisate the preparation in the presence of a polyether and one chaotropic agent. It has been found that through the Combination of a chaotropically effective salt, such as. B. Thiocyanate, with a polyether, such as. B. polyethylene glycol, a synergistic effect on the inactivation of viruses is observed, the biological activity of the Preparation remains largely intact. So will be resistant viruses, such as vaccinia virus or parvovirus, im Compared to treatment with thiocyanate alone, much faster and at lower concentrations Inactivated thiocyanate. The reduction of thiocyanate Concentration and the duration of treatment in turn affects beneficial to the biological activity of the preparation.

Als chaotropes Agens wird beispielsweise ein Thiocyanat, Harnstoff oder ein Guanidiniumsalz verwendet. Unter den letzteren sind insbesondere Natrium-, Ammonium- oder Kaliumthiocyanat zu nennen. Als Guanidiniumsalz ist insbesondere Guanidiniumhydrochlorid bevorzugt.For example, a thiocyanate, Urea or a guanidinium salt is used. Among the the latter are in particular sodium, ammonium or To name potassium thiocyanate. As a guanidinium salt especially guanidinium hydrochloride is preferred.

Die chaotropen Agenzien werden in Konzentrationen von ca. 0,1 bis 2 mol/l verwendet.The chaotropic agents are used in concentrations of approx. 0.1 up to 2 mol / l used.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es erstmals möglich, labile Plasmaproteine, d. h. leicht denaturierbare Proteine, in Gegenwart von chaotropen Salzen in Lösung zu behandeln und die biologische Aktivität der Plasmaproteine im wesentlichen zu erhalten.With the method according to the invention, it is possible for the first time labile plasma proteins, d. H. easily denaturable proteins, in Treat the presence of chaotropic salts in solution and the biological activity of the plasma proteins essentially increases receive.

Der Zusatz eines Polyethers und eines chaotropen Agens während der Virusinaktivierung ermöglicht also die Herstellung einer pharmazeutischen Präparation, die Plasmaproteine enthält, welche weitgehend frei von Denaturierungsprodukten sind. The addition of a polyether and a chaotropic agent during virus inactivation thus enables the production of a pharmaceutical preparation containing plasma proteins, which are largely free of denaturing products.

Die Entfernung des chaotropen Agens erfolgt auf an sich bekannte Weise bis zu einem Gehalt, der die physiologische Verträglichkeit des Präparates nicht beeinträchtigt. Vorzugweise soll dieser Gehalt unterhalb der Nachweisgrenze liegen. Zur Entfernung von chaotrop wirksamen Salzen kann die plasmaproteinhaltige Lösung dialysiert bzw. ultrafiltriert werden. Gleichzeitig mit dieser physikalischen Behandlung werden potentiell vorhandene infektiöse Partikel abgetrennt. Andererseits kann das Plasmaprotein durch Präzipitation und/oder Adsorption, vorzugsweise durch Chromatographie, vom chaotropen Agens abgetrennt werden.The chaotropic agent is removed in itself known way up to a level that is physiological Tolerability of the preparation is not affected. This content should preferably be below the detection limit lie. To remove chaotropically active salts, the solution containing plasma protein dialyzed or ultrafiltered become. Simultaneously with this physical treatment potentially existing infectious particles are separated. On the other hand, the plasma protein can be precipitated and / or adsorption, preferably by chromatography, of chaotropic agent can be separated.

In einer der vorstehend genannten zweckmäßigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird in Stufe (b) eine Detergensbehandlung ausgenommen; unter einer solchen Detergensbehandlung ist eine Behandlung mit für eine Virusinaktivierung gemäß dem Stand der Technik üblicherweise verwendeten Detergentien im engeren Sinne zu verstehen, d. h. also mit z. B. Tensiden, wie die für derartige Zwecke eingesetzten oberflächenaktiven Mittel, z. B. insbesondere Polyoxyethylenderivate der Sorbitanester (Polysorbat), die unter dem Warenzeichen "Tween" erhältlich sind. Solche Detergentien werden im Zusammenhang mit einer Virusinaktivierung, zumindest in Kombination mit anderen Maßnahmen, beschrieben in z. B. EP 0 479 597 A2 (wo insbesondere Tween 80® verwendet wird), US 47 64 369 (nach der die Virusinaktivierung mit Di- oder Trialkylphosphat in Kombination mit Detergentien durchgeführt wird), und EP 00 50 061 B1 (worin die Virusinaktivierung und Verringerung oder Beseitigung von Substanzen, die unerwünschte Wirkungen, z. B. Pyrognizität besitzen, durch Zugabe eines amphiphilen Mittels erfolgt, das z. B. ein Gallensäuresalz, ausgewählt aus Natriumcholat und Natriumdeoxycholat, oder ein nicht-ionisches Tensid ausgewählt aus den polyoxyethylierten Derivaten der partiellen Ester von C₁₂-C₂₂-Fettsäuren und Anhydriden ist). In one of the above-mentioned advantageous embodiments according to the invention, a detergent treatment is excluded in step (b); Such a detergent treatment is a treatment with detergents usually used for virus inactivation according to the prior art in the narrower sense, that is to say with z. B. surfactants, such as the surfactants used for such purposes, e.g. B. in particular polyoxyethylene derivatives of sorbitan esters (polysorbate), which are available under the trademark "Tween". Such detergents are described in connection with virus inactivation, at least in combination with other measures, in e.g. B. EP 0 479 597 A2 (where in particular Tween 80® is used), US 47 64 369 (after which the virus inactivation is carried out with di- or trialkyl phosphate in combination with detergents), and EP 00 50 061 B1 (in which the virus inactivation and Reduction or elimination of substances which have undesirable effects, for example pyrognicity, is carried out by adding an amphiphilic agent, for example a bile acid salt selected from sodium cholate and sodium deoxycholate, or a nonionic surfactant selected from the polyoxyethylated derivatives of partial ester of C ₁₂ -C ₂₂ fatty acids and anhydrides).

Unter der erfindungsgemäß ausgenommenen Detergentien sind insbesondere zu verstehen:Among the detergents excluded according to the invention are to understand in particular:

Nicht-ionische Detergentien, Polyoxyethylenderivate von Fettsäuren, partielle Ester von Sorbit(ol)anhydriden, wie z. B. "Tween 80®", "Tween 20®" und Polysorbat 80®", und nicht- ionische öllösliche Detergentien, wie sie unter dem Warenzeichen "Triton X-100®" (oxyethyliertes Alkylphenol) vertrieben werden, sowie außerdem Natriumdeoxycholat, und sogenannte "Zwittergents", d. h. synthetische zwitterionische Detergentien, die als "Sulfobetaine" bekannt sind, wie z. B. N- Dodecyl-N,N-dimethyl-2-ammonio-1-ethansulfonat, und ähnliche Substanzen, oder nicht-ionische Detergentien, wie z. B. Octyl- beta-D-glucopyranosid.Non-ionic detergents, polyoxyethylene derivatives of Fatty acids, partial esters of sorbitol (ol) anhydrides, such as. B. "Tween 80®", "Tween 20®" and Polysorbate 80® ", and non- ionic oil-soluble detergents, such as those under the Trademark "Triton X-100®" (oxyethylated alkylphenol) are sold, as well as sodium deoxycholate, and so-called "hermaphrodite gents", d. H. synthetic zwitterionic Detergents known as "sulfobetaines" such as e.g. B. N- Dodecyl-N, N-dimethyl-2-ammonio-1-ethanesulfonate, and the like Substances, or non-ionic detergents, such as. B. octyl beta-D-glucopyranoside.

Im allgemeinen sind nicht-ionische oberflächenaktive oxyethylierte Alkylphenole, polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Polyoxyethylensäuren und Polyoxyethylenoxypropylenfettsäuren. Spezifische Beispiele davon sind die folgenden:
Alkylphenoxypolyethoxy (30) ethanol
Polyoxyethylen (2) sorbitanmonolaurat
Polyoxyethylen (20) sorbitanmonopalmitat
Polyoxyethylen (20) sorbitanmonostearat
Polyoxyethylen (20) sorbitantristearat
Polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat
Polyoxyethylen (20) sorbitantrioleat
Polyoxyethylen (20) palmitat
Polyoxyethylen (20) laurylether
Polyoxyethylen (20) cetylether
Polyoxyethylen (20) stearylether
Polyoxyethylen (20) oleylether
Polyoxyethylen (20) hydriertes Castoröl
Polyoxyethylen (20) oxypropylenmonostearat.Generally, non-ionic surfactants are oxyethylated alkylphenols, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene acids and polyoxyethylene oxypropylene fatty acids. Specific examples of these are the following:
Alkylphenoxypolyethoxy (30) ethanol
Polyoxyethylene (2) sorbitan monolaurate
Polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate
Polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate
Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate
Polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate
Polyoxyethylene (20) palmitate
Polyoxyethylene (20) lauryl ether
Polyoxyethylene (20) cetyl ether
Polyoxyethylene (20) stearyl ether
Polyoxyethylene (20) oleyl ether
Polyoxyethylene (20) hydrogenated castor oil
Polyoxyethylene (20) oxypropylene monostearate.

Amphiphile oberflächenaktive Mittel, die sowohl hydrophile wasserlösliche als auch hydrophobe wasserunlösliche Gruppen enthalten, und die häufig in anionische, kationische, ampholytische und nicht-ionische oberflächenaktive Mittel eingeteilt werden; Beispiele für solche amphiphile, erfindungsgemäß ausgeschlossene Detergentien sind:
Anionische Mittel:
Sulfatiertes oxyethyliertes Alkylphenol (Triton W-30)®;
sulfatierter Lauryletheralkohol;
Natriumdodecylbenzolsulfonat (Nacconol NR)®;
Natrium 2-sulfoethyloleat (Igepon A)®;
Natrium N-methyl-N-oleylethanol sulfonat (Igepon T)®;
Natriumdodecylsulfat;
Natriumcholat;
Natriumdeoxycholat;
Natriumdodecylsulfonat;
Natriumdodecyl-N-sarconisat.
Kationische Mittel:
Dodecyldimethylbenzylammoniumchlorid (Triton K-60)®;
oxyethylierte Amine (Ethomeen)®;
Cetyltrimethylammoniumbromid;
Tetradecylammoniumbromid;
Dodecylpyrimidiniumchlorid;
Hexadecyltrimethylammoniumchlorid.
Ampholytische Mittel:
Dodecyl beta-alanin;
N-dodecylaminoethanesulfonsäure;
Palmitoyllysolecithin;
Dodecyl-N-betain.Amphiphilic surfactants, which contain both hydrophilic water-soluble and hydrophobic water-insoluble groups, and which are often classified into anionic, cationic, ampholytic and non-ionic surfactants; Examples of such amphiphilic detergents excluded according to the invention are:
Anionic agents:
Sulfated oxyethylated alkylphenol (Triton W-30) ®;
sulfated lauryl ether alcohol;
Sodium dodecylbenzenesulfonate (Nacconol NR) ®;
Sodium 2-sulfoethyl oleate (Igepon A) ®;
Sodium N-methyl-N-oleylethanol sulfonate (Igepon T) ®;
Sodium dodecyl sulfate;
Sodium cholate;
Sodium deoxycholate;
Sodium dodecyl sulfonate;
Sodium dodecyl-N-sarconisate.
Cationic agents:
Dodecyldimethylbenzylammonium chloride (Triton K-60) ®;
oxyethylated amines (Ethomeen) ®;
Cetyltrimethylammonium bromide;
Tetradecylammonium bromide;
Dodecylpyrimidinium chloride;
Hexadecyltrimethylammonium chloride.
Ampholytic agents:
Dodecyl beta-alanine;
N-dodecylaminoethanesulfonic acid;
Palmitoyl lysolecithin;
Dodecyl-N-betaine.

Oxyethylierte Alkylphenole (Triton X-100)®, partielle Ester von C₁₂-C₂₂-Fettsäuren (z. B. Laurin-, Palmitin-, Stearin- und Ölsäuren) und Hexitanhydride (z. B. Hexitane und Hexide) (Spans), wie sie z. B. in den US-Patenten 2232820, 2232821, 2303432 beschrieben werden; polyoxyethylierte Derivate dieser partiellen Ester, die durch Addition von Polyoxyethylenketten an nicht-esterifizierte Hydroxylgruppen erhalten werden (Tween®, z. B. Tween 80® oder Polysorbat 80®) wie z. B. in US- Patent 2380166 beschrieben; partielle polyoxyethylierte Fettsäureester (Myrj45®); Polyoxyethylenfettsäurealkoholether (Brij®).Oxyethylated alkylphenols (Triton X-100) ®, partial esters of C ₁₂ -C ₂₂ fatty acids (e.g. lauric, palmitic, stearic and oleic acids) and hexitan hydrides (e.g. hexitanes and hexides) (spans) how they z. Described in U.S. Patents 2232820, 2232821, 2303432; polyoxyethylated derivatives of these partial esters, which are obtained by adding polyoxyethylene chains to non-esterified hydroxyl groups (Tween®, for example Tween 80® or Polysorbate 80®), such as, for example, Described, for example, in U.S. Patent 2,380,166; partial polyoxyethylated fatty acid esters (Myrj45®); Polyoxyethylene fatty acid alcohol ether (Brij®).

Unter den ausgeschlossenen oxyethylierten Alkylphenolen (Triton X), sind inbesondere zu nennen die der Formel RC₆H₄(OC₂H₄)_nOH, worin R Octyl oder Nonyl ist und n mindestens 3 bedeutet, wie z. B. Octylphenoxyethanol; solche oberflächenaktive Mittel werden unter dem Warenzeichen "Triton X", z. B. Triton X-100, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton X-405 und Triton N-100 vertrieben.Among the excluded oxyethylated alkylphenols (Triton X), particular mention should be made of the formula RC ₆ H ₄ (OC ₂ H ₄ ) _n OH, in which R is octyl or nonyl and n is at least 3, such as, for. B. octylphenoxyethanol; such surfactants are sold under the trademark "Triton X", e.g. B. Triton X-100, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton X-405 and Triton N-100.

Als weitere Detergentien, die gemäß der erfindungsgemäßen zweckmäßigen Ausführungsform ausgenommen sind, sind die amphiphilen Detergentien: Gallensäuresalze, wie z. B. Natriumcholat und Natriumdeoxycholat. As further detergents according to the invention Appropriate embodiment are excluded, are amphiphilic detergents: bile acid salts, such as. B. Sodium cholate and sodium deoxycholate.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte pharmazeutische Präparation zeichnet sich überraschenderweise vor allem durch ein sehr geringes Ausmaß an Denaturierung aus. Die biologische Aktivität des Plasmaproteins nach Inaktivierung von infektiösen Agenzien ist - im Vergleich zur Aktivität vor der Inaktivierungsbehandlung - zu mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80%, am meisten bevorzugt zu mindestens 90% erhalten.The pharmaceutical manufactured by the method according to the invention Preparation stands out Surprisingly, especially because of its very small size out of denaturation. The biological activity of the Plasma protein is after inactivation of infectious agents - compared to the activity before Inactivation treatment - at least 50%, preferably at least 80%, most preferably at least 90% receive.

Die biologische Aktivität der durch das erfindungsgemässe Verfahren hergestellten Präparation wird im Falle eines Faktors der Gerinnung, Fibrinolyse oder Thrombolyse, oder dessen Inhibitor gemessen durch seinen Einfluss auf die enzymatische Reaktion im Rahmen der Blutgerinnung. Die biologische Aktivität eines Immunglobulins kann nach der Auftrennung des Präparates mittels HPLC- Chromatographie beurteilt werden. Etwaige Denaturierungsprodukte bzw. Aggregate werden so von Immunglobulin-monomeren bzw. -dimeren abgetrennt und quantitativ bestimmt.The biological activity of those produced by the method according to the invention preparation is used in the event of a factor of coagulation, fibrinolysis or Thrombolysis, or its inhibitor measured by its Influence on the enzymatic reaction within the Blood clotting. The biological activity of an immunoglobulin after separation of the preparation using HPLC Chromatography can be assessed. Any Denaturation products or aggregates are thus from Immunoglobulin monomers or dimers separated and quantified.

Der positive Effekt auf die Inaktivierung von infektiösen Agenzien durch Polyether, wie z. Polyethylenglykol, war für den Fachmann überraschend. Es war allgemein bekannt, dass Substanzen, die Plasmaproteine stabilisieren, auch eine stabilisierende Wirkung auf Viren ausüben. In diesem Zusammenhang sei z. B. auf eine Veröffentlichung von B Horowitz et al. in Transfusion, 25, 523-527 (1985) verwiesen. Danach war in Gegenwart eines Polyethers eine verschlechterte Inaktivierungskinetik zu erwarten.The positive effect on the inactivation of infectious Agents through polyethers, such as. Polyethylene glycol, was for the Surprising specialist. It was common knowledge that Substances that stabilize plasma proteins, including one have a stabilizing effect on viruses. In this Connection is z. B. on a publication by B Horowitz et al. in Transfusion, 25, 523-527 (1985). After that was deteriorated in the presence of a polyether Inactivation kinetics to be expected.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird so lange durchgeführt, dass potentiell vorhandene Viren aus der Gruppe der grossen membranumhüllten RNA-Viren, kleinen membranumhüllten RNA-Viren und der membranumhüllten DNA-Viren vollständig inaktiviert werden. Dies kann durch Versuche mit Modellviren bestätigt werden. Die Bedingungen des erfindungsgemässen Verfahrens werden so gewählt, dass ein dem biologischen Präparat zugesetztes Virus aus jeder Gruppe durch das erfindungsgemässe Verfahren inaktiviert wird, so dass der Virustiter unter der Nachweisgrenze liegt. Als Modellvirus eignen sich vor allem HIV, FSME-Virus und Pseudorabies-Virus (PSR).The method according to the invention is carried out as long as that potentially existing viruses from the large group membrane-enveloped RNA viruses, small membrane-enveloped RNA viruses and the membrane-enveloped DNA viruses are completely inactivated become. This can be confirmed by experiments with model viruses become. The conditions of the method according to the invention are selected so that the biological preparation added virus from each group by the inventive Procedure is inactivated so that the virus titer under the Detection limit is. As a model virus are particularly suitable HIV, TBE virus and pseudorabies virus (PSR).

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich insbesondere zur Inaktivierung von Hepatitis-Viren, vor allem von Hepatitis B, Hepatitis C und non-A-non-B-Hepatitisviren sowie von Retroviren, vor allem von AIDS-Viren.The method according to the invention is particularly suitable for Inactivating hepatitis viruses, especially hepatitis B, Hepatitis C and non-A-non-B hepatitis viruses as well as from Retroviruses, especially AIDS viruses.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele noch näher erläutert:The following examples further illustrate the invention explains:

1. Deactivation of model viruses in one Gamma globulin-containing solution with thiocyanate in Presence of polyethylene glycol

Eine 10%ige Lösung, enthaltend ein i. m. verträgliches Gammaglobulin wurde hergestellt durch eine Plasmafraktionierung nach Cohn. Die Lösung wurde mit einer Suspension, enthaltend HIV-1, FSME-Virus oder PSR-Virus versetzt. Der Lösung wurde Ammoniumthiocyanat bis zu einer Konzentration von 0,3 mol/l und PEG 200 bis zu einem Gehalt von von 10 Gew.-% zugesetzt. Anschliessend wurde auf 30°C erwärmt und der jeweilige Virustiter nach 0, 1, 3, 6 und 10 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angeführt. Als Kontrollwert diente der Virustiter in der verwendeten Virussuspension. Der Virustiter zur Zeit der Behandlungsdauer O ist jeweils in den Tabellen aufgeführt.A 10% solution containing an i. m. tolerable Gamma globulin was produced by plasma fractionation according to Cohn. The solution was containing with a suspension HIV-1, TBE virus or PSR virus added. The solution was Ammonium thiocyanate up to a concentration of 0.3 mol / l and PEG 200 up to a content of 10 wt .-% added. The mixture was then heated to 30 ° C. and the respective Virus titers determined after 0, 1, 3, 6 and 10 h. The results are listed in the table below. As a control value served the virus titer in the virus suspension used. The Virus titer at the time of treatment O is in each case Tables listed.

Mittels HPLC konnte festgestellt werden, dass es durch die Inaktivierungsbehandlung zu keiner Aggregatbildung gekommen ist. Using HPLC it could be determined that the Inactivation treatment did not lead to aggregate formation is.

Tabelle 1 Table 1

2. Comparative example with only ammonium thiocyanate or Polyethylene glycol

Der Gammaglobulin-haltigen Lösung aus Beispiel 1 wurde in einem Ansatz Ammoniumthiocyanat in einer Konzentration von 0,3 mol/l zugegeben. In einem weiteren Ansatz wurde der Gammaglobulin- haltigen Lösung aus Beispiel 1 PEG 200 bis zu einem Gehalt von 10 bzw 30% zugegeben. Die Lösungen wurden mit einer HIV-1- haltigen Suspension versetzt und auf einer Temperatur von 30°C gehalten. Der Virustiter wurde nach 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 6 und 10 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angeführt.The gamma globulin-containing solution from Example 1 was in one Mix ammonium thiocyanate in a concentration of 0.3 mol / l admitted. In another approach, the gamma globulin containing solution from Example 1 PEG 200 up to a content of 10 or 30% added. The solutions were developed with an HIV-1 containing suspension added and at a temperature of 30 ° C. held. The virus titer was determined after 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6 and 10 h determined. The results are in the table below cited.

Tabelle 2 Table 2

Aus Tabelle 2 ist deutlich erkennbar, dass beide Agenzien allein im Vergleich zur Kombination einen deutlich geringeren virusinaktivierenden Effekt auf HIV-1 ausüben. Dagegen ist aus Tabelle 1 ersichtlich, dass der Effekt der Kombination ein synergistischer ist, zumal die Inaktivierungskinetik der Kombination aus Polyether und chaotropem Agens wesentlich rascher verläuft als die Addition der Kinetik, die durch die einzelnen Agenzien erreicht wird.From Table 2 it can be clearly seen that both agents in comparison to the combination alone, a significantly lower one exert virus-inactivating effect on HIV-1. Against it is over Table 1 shows that the effect of the combination is more synergistic, especially since the inactivation kinetics of Combination of polyether and chaotropic agent essential is faster than the addition of the kinetics caused by the individual agents is achieved.

Claims

1. A method for inactivating viruses of the group of large and small membrane-enveloped RNA viruses and membrane-enveloped DNA viruses in a biological preparation, which comprises the following steps:

a) adding a polyether and a chaotropic agent to a solution of the biological preparation,
b) inactivation of infectious agents by a physico-chemical or chemical treatment and
c) Removal of the polyether and the chaotropic agent.

2. The method according to claim 1, characterized in that that a polyhydroxy ether is used as the polyether becomes.

3. The method according to claim 2, characterized in that that as polyhydroxy ether polyethylene glycol or Polypropylene glycol is used.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the inactivation of infectious agents in the presence of a low molecular weight polyethylene glycol selected from the group PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 900 and PEG 1000.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the inactivation of infectious agents in the presence of a polyether in a concentration of 5 to 30% by weight, whereby proteins are not precipitated.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the chaotropic agent is selected is from the group of thiocyanates, urea and Guanidinium salts.

7. The method according to claim 6, characterized in that as thiocyanate ammonium, sodium or Potassium thiocyanate is used.

8. The method according to claim 6, characterized in that as guanidinium salt guanidinium hydrochloride is used.

9. The method according to any one of claims 1 to 8 thereby characterized in that the chaotropic agent in a Concentration of 0.1 to 2 mol / l is used.

10. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized characterized that as a chaotropic agent Thiocyanate in a concentration of 0.1 to 2 mol / l is used.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized characterized in that the treatment in a Temperature in the range of 20 to 60 ° C performed becomes.

12. The method according to claims 1 to 11, characterized characterized that treatment during a Duration of 1 to 10 h is carried out.

13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized characterized in that the biological preparation Contains immunoglobulin.

14. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized characterized in that as a biological preparation Factor of coagulation, fibrinolysis or thrombolysis or an inhibitor substance thereof.

15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized characterized inactivation in the presence of the polyether and a chaotropic agent by a physical, physical-chemical or chemical Treatment with the exception of one Detergent treatment takes place.