DE1767285A1 - Process for the production of a concentrate of the stable antihamophilic factor with high efficiency - Google Patents
Process for the production of a concentrate of the stable antihamophilic factor with high efficiencyInfo
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Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates des stabilen antihämophilen Paktors mit hohem Wirkungsgrad.Process for the preparation of a concentrate of the stable antihemophilic pactor with high efficiency.
Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, Illinois 60053 Λ (Vereinigte Staaten von Wordamerika)Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, Illinois 60053 Λ (United States of Word America)
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines Konzentrates des antihämophilen Faktors (AHP, Paktor VIII).The invention relates to a method for producing a concentrate of the antihemophilic factor (AHP, Pactor VIII).
Der Vorgang der Blutkoagulation ist eine wichtige Punktion, die normales Vollblut unter passenden Bedingungen auszuführen fähig ist, um unnötige Blutverluste durch offene Wunden oder durch innere Blutungen zu verhüten«The process of blood coagulation is an important puncture, which normal whole blood is able to carry out under suitable conditions to avoid unnecessary blood loss to prevent open wounds or internal bleeding "
Es ist bekannt, daß normales Vollblut einen Paktor enthält, der abwesend oder in beträchtlichem Maße bei f Hämophüie(Bluterkrankheit) fehlend ist. Dieser Paktor wirkt mit der Globulinfraktion des Blutes zusammen und ist als antihämophiler Paktor (AHP, Paktor VIII) bekannt geworden.It is known that normal whole blood contains a factor which is absent or substantially absent in f haemophuia (blood disorder). This pactor interacts with the globulin fraction of the blood and is known as an antihemophilic factor (AHP, factor VIII) become.
Wissenschaftlern ist seit einiger Zeit etwas über AHP und seine Bedeutung bei der Blutkoagulation bekannt. Die Behandlung der Hämophüie hat bisher im allgemeinen in einer Auffüllungstherapie bestanden, wobei dem Patienten viele Liter frisches Vollblut oder speziell be-Scientists have known something about AHP and its role in blood coagulation for some time. Treatment of hemophilia has generally consisted of top-up therapy, with the patient many liters of fresh whole blood or specially
- 2 handeltes Plasma transfundiert wurde.- 2 traded plasma was transfused.
Es ist bekannt, daß jedoch unter üblichen Lagerungsbedingungen Vollblut und flüssiges Plasma seine AHF-Aktivitat innerhalb eines Tages oder darum herum verliert. Da es möglich ist, frisches Plasma einzufrieren und zu lagern, hat die AHF-Aktivität in gefrorenem Plasma eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Monaten oder darum herum.It is known, however, that under normal storage conditions, whole blood and liquid plasma lose their AHF activity loses within a day or around. Since it is possible to freeze fresh plasma and to storage, AHF activity in frozen plasma has a relatively short lifespan of a few months or so hereabouts.
Es ist auch möglich, während der Lagerung den Verlust an AHF-Aktivität herabzusetzen durch Trocknen frisch gefrorenen
Plasmas. Aber bisher ist es nicht möglich gewesen, mit Gewißheit den Gehalt an AHP in diesem getrockneten
Material mit Sicherheit zu kennen, weil der Gehalt an AHP in normalen Individuen, die das Plasma
spenden, außerordentlich von etwa 50$ bis etwa 200$ des
Durchschnitts schwankt.It is also possible to reduce the loss of AHF activity during storage by drying freshly frozen plasma. But so far it has not been possible to know with certainty the content of AHP in this dried material, because the content of AHP in normal individuals receiving the plasma
donating varies greatly from about $ 50 to about $ 200 of the average.
Die konventionelle Auffüllungstherapie besitzt weitere
ernst zu nehmende Nachteile, weil die Hämophilie oft
allergische oder der Behandlung trotzende Zustände bei wiederholter Behandlung mit Plasma entwickelt. Außerdem
neigen die großen Mengen an Plasma dazu, die durch die Hämophilie benötigt werden, ein übergroßes Blutvolumen
oder eine Überladung des zirkulatorischen Systems zu
bewirken. Solche Überladungen rufen eine Überanstrengung des Herzens hervor und führen beim Patienten zum Herzversagen.
Conventional replenishment therapy has other serious disadvantages, because hemophilia often occurs
developed allergic or treatment-defying conditions with repeated treatment with plasma. In addition, the large amounts of plasma required by hemophilia tend to result in excessive blood volume or an overload of the circulatory system
cause. Such overloads cause the heart to overwork and lead to heart failure in the patient.
Wissenschaftler haben schon verschiedene Methoden für die Isolierung d.es AHP oder die Herstellung von Plasmafraktionen mit angereichertem AHP aus Human- oder Tierblut vorgeschlagen. In der Praxis haben sich Verfahren bisher als unzuverlässig erwiesen, weil die AHP-Aktivi-Scientists already have different methods for the isolation of the AHP or the production of plasma fractions suggested with enriched AHP from human or animal blood. In practice, procedures have become previously proven to be unreliable because the AHP activi-
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tat der Fraktionen während der Isolierung verloren zu gehen scheint. AHF ist ein labiles Spurenprotein, welches schwierig vollständig von anderen Plasmaproteinen zu isolieren ist, besonders Fibrinogen und die Ausbeute an AHF aus dem Plasma ist durch diese bisherigen Verfahren nicht hoch gewesen.did the fractions seem to be lost during isolation. AHF is a labile trace protein that is difficult to completely isolate from other plasma proteins, especially fibrinogen and the yield AHF from the plasma has not been high by these previous methods.
Die jUIF-Virkungen der bisher hergestellten Blutfraktionen für die HämophiLi-Therapie sind als gering bekannt und die Kosten der Behandlung sind hoch.The jUIF effects of the blood fractions produced so far for Haemophili therapy are known to be low and the cost of treatment is high.
Andere Nachteile bei früheren Versuchen, die bei der Isolierung von aHF festgestellt wurden, sind die Eigenschaften des AHF, daß es sehr leicht durch Hitze, Einfrieren, Auftauen und andauernde Lagerung denaturiertOther drawbacks with previous attempts at isolating aHF are its properties of the AHF that it is very easily denatured by heat, freezing, thawing and prolonged storage
Zu den verschiedenen Verfahren, die bisher für die Isolierung von AHF vorgeschlagen worden sind, gehören Chromatographie, stufenförmige Absorption und Elution und selektive Ausfällung. Verschiedene Ausfällungsmittel, die benutzt worden sind, sind Äthanol, Äthyläther, Ammoniumsulfat, Phosphat-Natriumcitrat, Amino- * säuren und Kältefällungsverfahren. Kürzlich wurde die klinische Verwendung von mit Glycin gefällter AHF-Fraktion des Vollplasmas durch Webster und Mitarbeiter (Amer. J. Med, Sciences, Vol. 250, Nr. 6, Seite 643-650 (1965)) beschrieben. Über klinische Versuche zur AHF-Auffüllungstherapie mit einer kältegefällten Fraktion des Vollplasmas in einem geschlossenen Beutelsystem wurde durch Pool und Mitarbeiter (New England J. Med., Vol. 273, Nr. 27; Seiten 1443-1447 (1965)) ein Bericht veröffentlicht. Keine dieser zuletzt genannten Verfahren hat sich jedoch als eine vollständig ausführbare Methode zur !isolierung von AHF erwiesen.The various methods that have heretofore been proposed for the isolation of AHF include chromatography, step absorption and elution, and selective precipitation. Various precipitants, which have been used are, ethanol, ethyl ether acids, ammonium sulfate, phosphate, citrate, amino * and cold precipitation method. Recently, the clinical use of glycine-precipitated AHF fraction of whole plasma has been described by Webster et al. (Amer. J. Med, Sciences, Vol. 250, No. 6, pp. 643-650 (1965)). A report was published by Pool and coworkers (New England J. Med., Vol. 273, No. 27; pages 1443-1447 (1965)) on clinical trials of AHF replenishment therapy with a cold-precipitated fraction of the whole plasma in a closed bag system. However, none of these latter methods have proven to be a fully feasible method of isolating AHF.
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BADBATH
Die vorliegende Erfindung, die sich gegenüber den bisherigen Verfahren auszeichnet, betrifft ein Verfahren für die Darstellung eines stabilen hochwirksanien AHF-Xonzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktionierung des kältegefällten Konzentrates von Humanoder Tier-AHF erfolgt.The present invention, which is distinguished from the previous methods, relates to a method for the presentation of a stable, highly effective AHF concentrate, characterized in that a fractionation of the cold-precipitated concentrate of human or Animal AHF takes place.
Der vorstehend benutzte Ausdruck "kältegefälltes Konzentrat des AHF" bezieht sich auf die Fällung, die beim Behandeln von Human- oder Tierblutplasma bei S= 40C erhalten wird und von dem Überstehenden abgetrennt wurde. Bevorzugt wird, daß dieses kältegefällte Konzentrat des AHF durch sehr schnelles Einfrieren von frischem Plasma erhalten wird, aber gelagertes Plasma kann ebenfalls als Ausgangsmaterial bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Weiterhin wird bevorzugt,das Einfrieren in einem Temperaturbereich von etwa -20 C bis etwa -400C und folgendem langsamen Tauen auf etwa 40G durchzuführen.The expression "cold-precipitated concentrate of the AHF" used above relates to the precipitation which is obtained when treating human or animal blood plasma at S = 4 ° C. and which has been separated off from the supernatant. It is preferred that this cryoprecipitated concentrate of the AHF be obtained by very rapid freezing of fresh plasma, but stored plasma can also be used as a starting material in the practice of the present invention. Furthermore, it is preferable to carry out the freezing in a temperature range from about -20 C to about -40 0 C and the following slow thawing at about 4 0 G.
Zusätzlich zu der Stabilität und der hohen Wirksamkeit der AHF-Aktivität, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, bei der das kältegefällte Konzentrat des AHF anstelle des Vollplasmas als Ausgangamaterial benutzt wird, hat es den großen Vorteil, die Retention von anderen Plasmakomponenten wie Albumin, Gammaglobulin und dergleichen zu gestatten, welche gewöhnlich zerstört werden, wenn das Vollplasma durch die bisher bekannten Verfahren zur Darstellung von AHF-Fraktionen behandelt wird, die zur Behandlung der Hämophilie bestimmt sind.In addition to the stability and high potency of the AHF activity obtained by the method of the present Invention is obtained in which the cold-precipitated concentrate of the AHF instead of the full plasma as Starting material is used, it has the great advantage of the retention of other plasma components such as albumin, To allow gamma globulin and the like, which are usually destroyed when the whole plasma by the previously known method for the representation of AHF fractions is treated for the treatment of hemophilia are determined.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das kältegefällte Konzentrat des AIiF vorzugsweise fraktioniert, um ein stabiles hochwirksames AHF mittels einer oder mehrererAccording to the present invention, the cold precipitated Concentrate of the AIiF preferably fractionated to provide a stable, highly effective AHF using one or more
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- 5 der folgenden Stufen zu erhalten:- Obtain 5 of the following levels:
a) Fällung mit Glycin,a) precipitation with glycine,
Td) Fällung mit Polyäthylenglykol.Td) precipitation with polyethylene glycol.
In der Glycin-Fällungsstufe wird das kältegefällte Konzentrat des AHF zuerst wieder aufgelöst und dann die wieder aufgelöste Fraktion mit einer wäßrigen Glycinlösung mit einer Molarität von etwa 1,3 Ms etwa 1,8 gefällt, gefolgt von der Abtrennung und Wiederauflösung des Niederschlages. JIn the glycine precipitation stage, the cold-precipitated concentrate of the AHF is first dissolved again and then the redissolved fraction is precipitated with an aqueous glycine solution with a molarity of about 1.3 Ms about 1.8, followed by the separation and redissolution of the precipitate. J
Die Abtrennung des kältegefällten Konzentrates und der Glycin-gefällten Fraktion für die erfindungsgemäße Verwendung kann beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration der entsprechenden Niederschläge oder durch ähnliche Verfahren erfolgen.The separation of the cold-precipitated concentrate and the glycine-precipitated fraction for the use according to the invention can for example by centrifugation or filtration of the appropriate precipitates or by similar procedures are carried out.
Die Wiederauflösung der abgetrennten Niederschläge kann durch Erwärmen und Rühren in mit Citrat versetzter Salzlösung erfolgen. Im Falle der Wiederauflösung des kältegefällten Konzentrates wird es bevorzugt, eine Glycinmit Citrat versetzte Salzlösung zu verwenden und das Volumen des kältegefällten Konzentrates auf etwa ein IThe separated precipitates can be redissolved by heating and stirring in salt solution mixed with citrate take place. In the case of redissolving the cold-precipitated concentrate, it is preferred to use a glycine with Use citrate-added saline solution and reduce the volume of the cryoprecipitated concentrate to about an I.
Zehntel des Volumens des Originalpläsmas, aus dem das kältegefällte Konzentrat gewonnen wurde, zu erhöhen. Die Glycin-gefällte Fraktion wird vorzugsweise mit Gitrat versetzter Salzlösung durchgeführt, um das Volumen der Fraktion auf etwa ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycin-gefällte Fraktion entspricht, zu erhöhen.Tenth of the volume of the original plasma from which the cryoprecipitated concentrate was obtained to increase. The glycine-precipitated fraction is preferably citrated spiked saline solution carried out to reduce the volume of the fraction to about one twentieth of the plasma volume, which corresponds to the glycine-precipitated fraction.
Ebenfalls wird bevorzugt, jede der entsprechenden wiederaufgelöBten kältegefällten Niederschlagskonzentrate und der Glycin-gefällten Fraktionen zu reinigen und durch zusätzliches Zentrifugieren und/oder Filtrieren zu klä-It is also preferred that each of the corresponding redissolved cold-precipitated precipitate concentrates and the glycine-precipitated fractions to be purified and carried out additional centrifugation and / or filtration to clarify
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- 6 ren, um jeden unlöslichen Anteil zu entfernen.- 6 to remove any insoluble matter.
Die vorstehende Fraktionierung eines kältegefällten Niederschlagskonzentrates des AHP durch Ausfällung mit Glycin ergibt ein AHF-Konzentrat von hoher Wirksamkeit, welches gefroren werden kann und sich bei der Lyophilisierung stabil erweist und bei üblichen Kühllagerungsbedingungen für einen Zeitraum von einem Jahr und langer aufbewahrt werden kann. Die Wirksamkeit eines in jeder Stufe vorliegenden Materials, welches durch das vor-" ßtehend geschilderte Fraktionierverfahren dargestellt wurde, kann sehr exakt bestimmt werden, so daß der verabreichende Arzt vom ersten Augenblick an genau weiß, wieviel AHF sein Patient erhält.The above fractionation of a cold-precipitated precipitate concentrate of the AHP by precipitation with Glycine results in a highly effective AHF concentrate, which can be frozen and is stable upon lyophilization and under normal cold storage conditions can be kept for a period of one year or more. The effectiveness of one in each Stage of the present material, which is represented by the fractionation process described above can be determined very precisely, so that the administering doctor knows exactly from the first moment how much AHF his patient is receiving.
Da das wieder aufgelöste AHF-Konzentrat, welches durch das vorstehend genannte Fraktionierverfahren dargestellt wurde, mehr als die fünffache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens hat, kann dem Hämophilie-Kranken eine AHF-Menge verabreicht werden, die das Herz in anderer Weise verabreicht, nicht tolerieren würde. Ebenfalls hervorzuheben ist, daß die AHF-Aktivität in dem k vorstehend hergestellten Konzentrat weniger als ein Fünfzehntel der im Plasma anwesenden Proteinmenge beträgt, das die gleiche Menge an AHF-Aktivität besitzt. Dieser niedrigere Proteingehalt verringert das Risiko von allergischen Reaktionen beim Hämophiliekranken-Empfänger und reduziert die Möglichkeit der Überlastung des zirkulierenden Systems.Since the redissolved AHF concentrate, which by the above fractionation method was shown to be more than five times the AHF activity of the same Plasma volume, the haemophilia patient can be given an amount of AHF that the heart in another Administered wisely, would not tolerate. It should also be emphasized that the AHF activity in the k concentrate prepared above is less than one fifteenth of the amount of protein present in the plasma, that has the same amount of AHF activity. This lower protein content reduces the risk of allergic reactions in the recipient with haemophilia and reduces the possibility of overloading the circulating system.
Ein anderes Beispiel für eine Ausführungsform, die zum Fraktionieren des kältegefällten Konzentrates des AHF gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, besteht in der Fällung mit Polyäthylenglykol. PoIyäthylenglykole sind hochmolekulare Polymere, die imAnother example of an embodiment used for fractionating the cryoprecipitated concentrate of the AHF which can be used in accordance with the present invention consists in precipitation with polyethylene glycol. Polyethylene glycols are high molecular weight polymers that are im
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allgemeinen durch Umsetzen von Äthylenoxyd mit Äthylenglykol oder Wasser hergestellt werden und die folgende Strukturgenerally by reacting ethylene oxide with ethylene glycol or water can be produced and the following structure
HO(C2H4O)nG2H4OHHO (C 2 H 4 O) n G 2 H 4 OH
besitzen, in der η die durchschnittliche Zahl an Oxyäthylengruppen angibt. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen die Polyäthylenglykole nicht toxisch sein und können einen Ilolekulargewichtsbereich von etwa 200 "bis etwa 20 000 besitzen.in which η is the average number of oxyethylene groups indicates. According to the present invention, the polyethylene glycols should be non-toxic and can range in molecular weight from about 200 "to own about 20,000.
Der "bevorzugte Molekulargewichtsbereich dieser liegt a The "preferred molecular weight range of these is a
zwischen etwa 400 bis etwa 6000. PEG- 4000, welches ein Polyäthylenglykolprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 ist, ist das bevorzugteste dieser Gruppe.between about 400 to about 6000. PEG-4000, which is a Medium molecular weight polyethylene glycol product of 4000 is the most preferred of this group.
In der Polyäthylenglykol-Fällungsstufe wird bevorzugt 3 bis 4 Gew.-^ Polyäthylenglykol, bezogen auf das wieder aufgelöste AHF-Konzentrat unter Einbehaltung des Überstehenden, gefolgt von der Verwendung von etwa 10 Gew«-$> Polyäthylenglykol des Überstehenden unter Einbehaltung des Niederschlages, verwendet. Die letztere Ausfällung wird dann abgetrennt und in mit Citrat versetzter Salzlösung wiedergelöst.In the polyethylene glycol precipitation stage, 3 is preferred to 4 wt .- ^ polyethylene glycol, based on the again dissolved AHF concentrate with retention of the supernatant, followed by using about 10 wt% polyethylene glycol of the supernatant with retention of the precipitate. The latter precipitate is then separated and placed in citrated saline solution redissolved.
Die Polyäthylenglykol-Fällungsstufe kann ebenso in Kombination mit der Glycin-Fällungsstufe verwendet werden. Wenn die Polyäthylenglykolfällungsstufe der Glyeinfällungsstufe vorausgeht, soll die Molarität der verwendeten Glycinlösung bei etwa 1,3 liegen.The polyethylene glycol precipitation stage can also be used in combination can be used with the glycine precipitation stage. When the polyethylene glycol precipitation stage is the gly precipitation stage precedes, the molarity of the glycine solution used should be around 1.3.
Das AHP-Konzentrat, welches durch die aufeinanderfolgenden Ausfällungsstufen mit Glycin und Polyäthylenglykol, wie vorstehend beschrieben, erhalten worden ist, kann eingefroren werden und bleibt stabil auch bei der Lyophilisierung und bei der Aufbewahrung unter üblichen Kühllagerungsbedingungen für Zeiten von einem Jahr undThe AHP concentrate, which is produced through the successive precipitation stages with glycine and polyethylene glycol, as described above, can be frozen and remains stable even after lyophilization and when stored under normal cold storage conditions for periods of one year and
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länger. Das wiedereingesetzte AHF-Konzentrat hat dann mehr als die dreißigfache AHP-Aktivität eines gleichen Plasmavolumensj die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist weniger als in einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteine enthalten im Vergleich zu der gleichen AHP-Aktivität im Plasma.longer. The reused AHF concentrate then has more than thirty times the AHP activity of an equal volume of plasmaj the AHF activity of this concentrate contains less than one hundredth of the proteins present in the plasma compared to the same AHP activity in plasma.
Das kältegefällte Konzentrat des AHP, welches durch Glycinausfällung und/oder Polyäthylenglykolausfällung fraktioniert worden ist, kann zur Reinigung weiter mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt werden. Diese Reinigung kann entweder vor oder nach der Glycin- und/oder Polyäthylenglykolausfällung ausgeführt werden und kann durch Säulen- oder absatzweise Ladungsverfahren ausgeführt werden. Das nach diesem Verfahren gereinigte Konzentrat besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß es sowohl intramuskulär wie auch intravenös verabreicht werden kann, wobei letztere Methode allgemein verwendet wird für solche AHP-Konzentrate, die nicht mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt worden sind. Das AHP-Konzentrat, welches mit ECTEOLA-Celluloseharz gereinigt worden ist, ist frei von Pibrogen durch Zugabe von Thrombin und durch Immuno-Elektrophorese gefunden worden.The cold-precipitated concentrate of the AHP, which has been fractionated by glycine precipitation and / or polyethylene glycol precipitation, can be further treated with ECTEOLA cellulose resin for cleaning. This purification can be carried out either before or after the glycine and / or polyethylene glycol precipitation and can be carried out by column or batch charge processes. The concentrate purified by this method has the additional advantage that it can be administered intramuscularly as well as intravenously, the latter method being generally used for those AHP concentrates which have not been treated with ECTEOLA cellulose resin. The AHP concentrate, which has been purified with ECTEOLA cellulose resin, has been found to be free of pibrogen by the addition of thrombin and by immunoelectrophoresis.
Der hier benutzte Ausdruck "ECTEOLA-Celluloseharz" bezieht sich auf eine modifizierte Cellulose, die aktive basische Substituenten enthält, die in das Cellulosemolekül durch Reaktion mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin eingeführt wurden. Verfahren zur Herstellung von ECTEOLA-Celluloseharzen sind allgemein von Sober und Peterson (J.Am. Chem. öoc'y., Vol. 76, Seiten 1711-12 (1956? a.a.O. Vol. 78, Seite 751-55 (1956); Vol. 78, Seiten 756-63 (1956); und Peterson und Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, Seiten 43-44 (1961)) beschrieben worden.As used herein, "ECTEOLA cellulosic resin" refers to a modified cellulose that is active contains basic substituents that are formed in the cellulose molecule by reaction with epichlorohydrin and triethanolamine were introduced. Methods for making ECTEOLA cellulosic resins are generally described by Sober et al Peterson (J. Am. Chem. Ooc'y., Vol. 76, pp. 1711-12 (1956? Op. Cit. Vol. 78, pp. 751-55 (1956); Vol. 78, pp. 756-63 (1956); and Peterson and Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, pages 43-44 (1961)).
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ECTEOLA-Celluloseharze sind im Handel erhältlich. Es wurde jedoch gefunden, daß es vorteilhaft ist, eingangs diese Harze einer Natriumhydroxyd-Behandlung und \7iederauswaschung zu unterziehen, bevor diese in der schon beschriebenen Reinigungsstufe eingesetzt werden.ECTEOLA cellulose resins are commercially available. It However, it has been found that it is advantageous to initially treat and wash these resins with sodium hydroxide before they are used in the cleaning stage already described.
In der Reinigungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz wird das Harz vorzugsweise erst mit einer Chloridpufferlösung, die eine Konzentration von etwa 0,8 Gew.-$ Natriumchlorid besitzt, in das Gleichgewicht gebracht und dann in die M In the cleaning stage with ECTEOLA cellulose resin, the resin is preferably first brought into equilibrium with a chloride buffer solution, which has a concentration of about 0.8% by weight of sodium chloride, and then in the M
Chromatographieglassäule eingefüllt. Das AHF-Konzentrat, welches gereinigt werden soll, wird zu der Säule gegeben und schließlich mit einer Chloridpufferlösung, die eine Molarität von etwa 0,5 besitzt, eluiert.Chromatography glass column filled. The AHF concentrate, which is to be cleaned is added to the column and finally with a chloride buffer solution containing has a molarity of about 0.5 elutes.
Andere Methoden zur Reinigung der AHF-Konzentrate der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gegenwärtig sein.Other methods of cleaning the AHF concentrates The present invention will be apparent to those of ordinary skill in the art.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter. Auch ist die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt, die lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zwecks Beschränkung ange- tThe following examples further illustrate the invention. Nor is the invention specific to these Examples are limited, which are given for the purpose of illustration and not for the purpose of limitation
geben sind. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich auf die Gewichtsbasis, es sei denn, daß eine andere spezifische Angabe erfolgt ist.are given. All parts and percentages are on a weight basis unless otherwise specified Specification has been made.
Ein stabiles Human-AHF-Konzentrat mit hoher Y/irksarakeit wird durch die aufeinanderfolgende Fraktionierung des Humanblutplasmas hergestellt, zuerst durch Kältefällung und dann durch Glycinfällung in folgender Weise:A stable human AHF concentrate with high Y / irksarakeit is obtained by the successive fractionation of the Human blood plasma produced, first by cold precipitation and then by glycine precipitation in the following way:
Reagenzien:Reagents:
Mit Citrat versetzte Salzlösung:Salt solution mixed with citrate:
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Ein Teil 0,1 molares Natriumeitrat auf vier Gewichtsteile 0,9$ Salz. One part 0.1 molar sodium citrate to four parts by weight $ 0.9 salt.
Glycin mit Ci brat versetzte Salzlösung: Das erforderliche Glycin wird zu der mit Citrat versetzten Salzlösung gegeben, um in Bezug auf das Glycin eine 0,1 molare Lösung zu erhalten.Salt solution mixed with glycine with Ci brat: The required glycine is added to the citrated saline solution to reduce the glycine to obtain a 0.1 molar solution.
Gepuffertes Waschwasser:Buffered wash water:
Zu destilliertem V/asser wird l/lOO Volumen gepufferte Citratlösung zugefügt, welche durch Einstellen 0,5 molaren Natriumcitrats mit 0,5 molarer Citronensäure auf pH 6,88 hergestellt worden ist.1/100 volume is buffered to distilled water Citrate solution added, which by adjusting 0.5 molar sodium citrate with 0.5 molar citric acid pH 6.88 has been established.
Essigsäure:Acetic acid:
Man stellt 1,0 normale und 0,1 normale wäßrige LösungenMake 1.0 normal and 0.1 normal aqueous solutions
Glycin:Glycine:
Man stellt eine 1,3 molare wäßrige Lösung her.A 1.3 molar aqueous solution is prepared.
Arbeitsweise:Working method:
Humanblutplasma wird tiefgekühlt (^ 40C) aus einem Spenderzentrum erhalten. Das Plasma wird in Pfaudlerkessel eingetaucht und auf einer Temperatur unter 40C gehalten. Es wird im kontinuierlichen Fluß oder durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert. Die erhaltene Kälteausfällung wird gesammelt und für weitere Fraktionierung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.Human blood plasma is obtained frozen (^ 4 0 C) from a donor center. The plasma is immersed in Pfaudler's kettle and kept at a temperature below 4 ° C. It is centrifuged in continuous flow or by single tube centrifugation. The resulting cold precipitate is collected and used for further fractionation according to the present invention.
Zu der Kälteausfällung wird Glycin- mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt. Die Menge beträgt ein Zehntel des Plaamavolumens, aus dem die Kälteausfällung stammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Kälteausfällung und der Glycin- mit Citrat versetzten Salzlösung inGlycine salt solution mixed with citrate is added to the cold precipitate. The amount is one tenth of the volume of plaama from which the cold precipitate originates. The dissolution is achieved by mixing the cold precipitate and the glycine-citrated saline solution in
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einer warmen Umgebung (Raumtemperatur, aber nicht 30 G übersteigend) bewirkt.a warm environment (room temperature, but not 30 G exceeding) causes.
Wenn die Kälteausfällung sich aufgelöst hat, kann diese, falls erforderlich, (in Abhängigkeit von der anwesenden Menge an roten Blutkörperchen und anwesenden denaturiertem Protein) durch weiteres Zentrifugieren und/oder Filtration geklärt werden.When the cold precipitate has dissolved, it can, if necessary, (depending on the Amount of red blood cells and denatured protein present) by further centrifugation and / or filtration be clarified.
Die aufgelöste Kältefällung wird dann auf pH 6,88 mit 0,1 normaler Essigsäure eingestellt. Durch geeignete ™The dissolved cold precipitation is then adjusted to pH 6.88 with 0.1 normal acetic acid. Through suitable ™
Mittel (beispielsweise Benutzung eines Kühlschrankes oder Verwendung eines Isopropanol-Trockeneisbades) wird die Lösung auf eine Temperatur von 6 bis 10 C abgekühlt. Zu der gekühlten Lösung wird die erforderliche Menge Glycin gegeben, um die Lösung in Bezug auf Glycin 1,2 molar zu erhalten. Die Mischung wird sanft 45 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 20C bis 1O0C gerührt und dann im kontinuierlichen Fluß oder gefäßweise zentrifugiert. Die sich ergebende Glycinausfällung wird gesammelt und vorsichtig gewaschen mit gepuffertem \7asser bei einer Temperatur zwischen 0 C bis 4 C.Means (e.g. use of a refrigerator or use of an isopropanol dry ice bath) the solution is cooled to a temperature of 6 to 10 ° C. The required amount of glycine is added to the cooled solution to obtain the 1.2 molar glycine solution. The mixture is stirred gently for 45 to 60 minutes at a temperature of 2 0 C to 1O 0 C, and then centrifuged in the tube as continuous flow or. The resulting glycine precipitate is collected and carefully washed with buffered water at a temperature between 0 C to 4 C.
Zu der Glycinausfällung wird mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt, die r.Ienge beträgt ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycinausfällung entstammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Glycinausfällung und der mit Citrat versetzten Salzlösung in einer warmen Umgebung (Raumtemperatur aber nicht 30 C übersteigend} bewirkt.Salt solution mixed with citrate is added to the glycine precipitate added, the length is one twentieth of the plasma volume from which the glycine precipitate originates. the Dissolution is achieved by mixing the glycine precipitate and the citrated saline solution in a warm Environment (room temperature but not exceeding 30 C) causes.
Wenn sich die Glycinausfällung aufgelöst hat, wird ec· bevorzugt,die Lösung durch Zentrifugieren und/oder Filtration unter Verwendung eines 293 mm Milliporefiltern (benutzte Llnnbrane: 1,2^-', 0,45 C" und 0,3 ^) zu klären.When the glycine precipitate has dissolved, it is preferred to clarify the solution by centrifugation and / or filtration using a 293 mm Millipore filter (membranes used: 1.2 ^ - ', 0.45 C "and 0.3 ^) .
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Das flüssige Blutplasmaprodukt, welches in der vorstehend geschilderten Weise durch aufeinanderfolgende Fraktionierung gewonnen worden ist, nämlich erst Kälteausfällung und dann durch Glycin-Ausfällung, besitzt eine AHF-Konzentration mit hoher Y/irksamkeit. Dieses flüssige Produkt wird dann abgepackt, tiefgekühlt (-6O0C) und in einem Schnellgefrierer (-200C bis -300C) für mindestens drei Stunden gelagert. Das gefrorene Produkt kann dann unter üblichen Kühllagerungsbedingungen (= 40C, vorzugsweise -2O0C bis -3O0C) ohne Verlust seiner AHF-Aktivität für einen Zeitraum von einem Jahr und langer aufbewahrt werden. Dieses Produkt enthält, wenn es flüssig zur Verabreichung kommt, die fünffache AHP-Aktivität eines gleichen Volumens normalen Blutplasmas und es enthält nur ein Fünfzehntel der Proteinmenge, die Plasma mit dem gleichen Gehalt an AHF-Aktivität aufweist. Das in Lösung gegangene Produkt kann intravenös an Hämophiliekranke mit üblichen Transfusionsmethoden und Mitteln verabreicht werden.The liquid blood plasma product, which has been obtained in the manner described above by successive fractionation, namely first cold precipitation and then by glycine precipitation, has an AHF concentration with high efficiency. This liquid product is then packaged, frozen (-6O 0 C) and stored in a quick freezer (-20 0 C to -30 0 C) for at least three hours. The frozen product can (= 4 0 C, preferably -2O 0 C to -3O 0 C) without loss of AHF activity for a period of one year and then be stored long under normal refrigerated storage conditions. This product, when administered in liquid form, contains five times the AHP activity of an equal volume of normal blood plasma, and it contains only one-fifteenth the amount of protein found in plasma with the same level of AHF activity. The dissolved product can be administered intravenously to haemophilia sufferers using conventional transfusion methods and means.
Beispiel 1 wird wiederholt einschließlich der Stufe der Zugabe der mit Citrat versetzten Salzlösung zu der Glycin-Ausfällung. Der wiederaufgelöste Niederschlag wird auf pH 6,5 mit 1,0 normaler Essigsäure eingestellt. PoIyäthylenglykol mit dem mittleren Molekulargewicht 4000 wird der lösung in solchen Mengen zugesetzt, daß die PEG-Konzentration 3,5$ beträgt. Diese Mischung wird sanft bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt und 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Min, zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und auf pH 6,88 mit 1,0 normaler Natriumhydroxydlösung eingestellt. Zusätzliches PoIyäthylenglykol 4000 wird zu der Lösung zugegeben, um die endgültige PEG-Konzentration auf 10$ einzustellen. Die Mischung wird sanft bei Raumtemperatur 30 Minuten ge-Example 1 is repeated including the step of adding the citrated salt solution to the glycine precipitate. The redissolved precipitate is adjusted to pH 6.5 with 1.0 normal acetic acid. Polyethylene glycol with an average molecular weight of 4000 is added to the solution in such amounts that the PEG concentration is $ 3.5. This mixture will stirred gently at room temperature for 10 minutes and centrifuged at 5000 rpm for 15 minutes. The protruding is decanted and adjusted to pH 6.88 with 1.0 normal sodium hydroxide solution. Additional polyethylene glycol 4000 is added to the solution to adjust the final PEG concentration to $ 10. the Mixture is gently stirred at room temperature for 30 minutes
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rührt und bei 5000 Umdrehungen/Min, eine halbe Stunde zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird mit kaltem Wasser (20C) gewaschen. Unter Aufwirbeln wird dann während fünf Minuten bei einer Temperatur bei -40C ausgewaschen. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag in mit Citrat versetzter Salzlösung aufgelöst. Die geklärte Lösung wird unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Dieses flüssige Endprodukt kann verschlossen eingefroren und durch Lagerung in einem Schnellgefrierer für mindestens drei Stunden gelagert Jjstirred and centrifuged at 5000 revolutions / min for half an hour. The supernatant is decanted and the precipitate is washed with cold water (2 ° C.). With swirling is then washed for five minutes at a temperature at -4 0 C. The supernatant is decanted and the precipitate is dissolved in salt solution mixed with citrate. The clarified solution is filtered as described in Example 1 using a 293 mm Millipore filter. This liquid end product can be frozen and stored in a quick freezer for at least three hours. Jj
werden. Danach kann es unter normalen Einfrierbedingungen für den nachfolgenden Gebrauch in der Hämophilie-Therapie aufbewahrt gehalten werden und zwar in dar Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1.will. Thereafter it can be used under normal freezing conditions for subsequent use in hemophilia therapy be kept in the type of end product according to Example 1.
Beispiel 2 wird wiederholt einschließlich der zusätzlichen Reinigungsstufe der AHF-Praktion mit ECTSOLA-Celluloseharz in der folgenden Weise.Example 2 is repeated including the additional purification step of the AHF preparation with ECTSOLA cellulose resin in the following way.
ReagenzienReagents
ECTEOLA-Celluloseharz;ECTEOLA cellulose resin;
1.) Man mischt 60 g Natriumhydroxyd mit 150 ml './asser. "1.) Mix 60 g of sodium hydroxide with 150 ml of water. "
2.) Man läßt die Mischung abkühlen.2.) The mixture is allowed to cool.
3.) Man gibt 60 g Cellulose (Whatman Cellulose Pulver CP 11) in einen Becher und vermischt sorgfältig mit der vorstehend genannten Natriumhydroxydlösung.3.) 60 g of cellulose (Whatman Cellulose Powder CP 11) are added to a beaker and mixed carefully the above-mentioned sodium hydroxide solution.
4.) Man läßt die Mischung über Nacht (12 Stunden) stehen.4.) The mixture is left to stand overnight (12 hours).
5.) Am nächsten Tage wird eine Lösung von 35 ml Triäthanolamin und 60 ml Epichlorhydrin hergestellt. Man mischt gut unter einem Abzug.5.) The next day, a solution of 35 ml of triethanolamine and 60 ml of epichlorohydrin prepared. Mix well under a hood.
6.) Man gießt diese Lösung schnell zu der vorstehend genannten Cellulose und durchmischt gut. Das Reaktionsgefäß wird aus der Zugrichtung genommen. (Die6.) This solution is quickly poured into the cellulose mentioned above and mixed well. The reaction vessel is taken from the direction of pull. (The
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Reaktion ist exotherm und die Temperatur steigt au:? etwa 100 C. Das Gemisch wird braun in ein bi^ zv/ei Stunden.The reaction is exothermic and the temperature rises :? about 100 C. The mixture turns brown in a bit Hours.
7.) Man kühlt das Gemisch auf Raumtemperatur unter dem Abzug.7.) The mixture is cooled to room temperature below the Deduction.
8.) In kleinen Anteilen gibt man 350 ml 2 molare Kochsalzlösung zu.8.) 350 ml of 2 molar saline solution are added in small portions to.
9.) Diese l/lischung wird durch ein grobkörnig gesintertes Glasfilter filtriert.9.) This oil mixture is sintered by a coarse-grained Filtered glass filter.
10.) Der Niederschlag wird zweimal mit 500 ml IN Hatriumhydroxydlöaung gewaschen. (Dies entfernt die starke Verfärbung).10.) The precipitate is twice with 500 ml IN Hatriumhydroxydlöaung washed. (This removes the strong discoloration).
11.) Man suspendiert den Niederschlag in 350 ml III Salzsäure in der Filternutsehe» Man legt Vakuum an.11.) The precipitate is suspended in 350 ml of III hydrochloric acid in the filter groove »You put on a vacuum.
12.) Man wiederho.lt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung. 12.) Step 11 is repeated with 250 ml of 1 N sodium hydroxide solution.
13.) Man wiederholt die Stufe 11 mit 250 ml IH Salzsäure.13.) Step 11 is repeated with 250 ml of 1H hydrochloric acid.
14.) Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml IN Natriumhydroxydlösung. 14.) Step 11 is repeated with 250 ml of IN sodium hydroxide solution.
15.) Man füllt den Niederschlag in einen 3 Literbecher.15.) The precipitate is filled into a 3 liter beaker.
16.) Man fügt 250 ml IN Natriumhydroxydlösung zu und mischt.16.) 250 ml of IN sodium hydroxide solution are added and mixes.
17.) Man fügt destilliertes Wasser zu der Mischung, um den Becher zu füllen; man mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.17.) Add distilled water to the mixture to fill the beaker; you mix, cover and lets stand overnight.
18.) Man dekantiert das Überstehende.18.) The excess is decanted.
19.) Man setzt V/asser zu dem Niederschlag, um den Becher zu füllen und mischt,19.) Add water to the precipitate around the beaker to fill and mix,
20.) Man wäscht die Mischung auf dem Filter mit l/asser (vier Liter oder mehr, bis ein negativer Test für Alkali mit l^iger alkoholischer Phenolphthaleinlösung erhalten wirej).20.) Wash the mixture on the filter with water (four liters or more, until a negative test for alkali with an alcoholic phenolphthalein solution get wirej).
21.) Man führt eine Schlußwaschung mit zwei 250 ml Portionen absoluten Alkohols durch.21.) A final wash is carried out with two 250 ml portions of absolute alcohol.
22.) Man breitet das Produkt auf Filterpapier aus. Man22.) Spread the product on filter paper. Man
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zerdrückt und breitet das Produkt aus, um es ü"ber Nacht zu trocknen.crushes and spreads the product to cover it To dry overnight.
Chloridpuffer:Chloride buffer:
0,8^ NaCl (8 g/l)0.8 ^ NaCl (8 g / l)
0,02 M Imidazol (1,36 g/L)0.02 M imidazole (1.36 g / L)
Man stellt auf pH 6,9 mit IH Salzsäure ein.The pH is adjusted to 6.9 with 1H hydrochloric acid.
Eluierpuffer:Elution buffer:
0,5 M NaCl -0.5 M NaCl -
0,02 M Imidazol (1,36 g/L) "0.02 M imidazole (1.36 g / L) "
Man stellt auf pH 6,9 mit IN Salzsäure ein.The pH is adjusted to 6.9 with 1N hydrochloric acid.
Ein im Handel erhältliches ECTEOLÄ-Celluloseharz, welches erst mit NaOH behandelt worden und ausgewaschen worden ist, beispielsweise wie in der folgenden Weise, kann an Stelle des vorstehend hergestellten ECTEOLA-Celluloseharzes verwendet werden.A commercially available ECTEOLÄ cellulose resin which has only been treated with NaOH and washed out, for example as in the following manner, can Can be used in place of the ECTEOLA cellulose resin prepared above.
Auswaschungscyclus von im Handel erhältlichem ECTEOLA-Celluloseharz Wash cycle of commercially available ECTEOLA cellulose resin
1.) Man mischt 60 g handelsübliches ECTEQLA-Cellulose-1.) Mix 60 g of commercially available ECTEQLA cellulose
harz mit 350 ml 2ΓΙ Kochsalslösung, ä resin with 350 ml 2ΓΙ saline solution, similar
2.)-Man filtriert dieses Gemisch durch ein grobkörniges2.) - This mixture is filtered through a coarse-grained one
gesintertes Glasfilter.
3.) Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 nl IH
Natriumhydroxydlösung.sintered glass filter.
3.) The precipitate is washed twice with 500 μl 1H sodium hydroxide solution.
4.) Man wasch1; einmal mit 350 ml IN Salzsäure. 5.) Man wäscht einmal mit 250 ml IN liatriumhydroxydlösung. 4.) One wash 1 ; once with 350 ml IN hydrochloric acid. 5.) It is washed once with 250 ml IN liatrium hydroxide solution.
6.) Man wäscht einmal mit 250 ml IN Salzsäure. 7.) Man wäscht einmal mit 250 ml 3N Natriumhydroxyd-6.) It is washed once with 250 ml of IN hydrochloric acid. 7.) Wash once with 250 ml of 3N sodium hydroxide
8.) Man überiührt den Niederschlag in einen 3 Liter becher, fügt 250 ml IN Hatriumhydroxydlösung zu8.) The precipitate is stirred into a 3 liter beaker, adds 250 ml IN sodium hydroxide solution
1 0 9 8 3 '- / 1 r> 7 81 0 9 8 3 '- / 1 r > 7 8
5AD OBtGlNAL 5 AD OBtGlNAL
mischt.mixes.
9.) Man fügt destilliertes Y/asser zu dem Gemisch, um den Becher zu füllen, mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.9.) One adds distilled water / water to the mixture filling the cup, mixes, covers and lets stand overnight.
10.) Man dekantiert die Flüssigkeit ab, fügt 3 Liter Wasser zum Niederschlag, mischt und filtriert.10.) The liquid is decanted off, 3 liters of water are added to the precipitate, mixed and filtered.
11.) Man wäscht den Niederschlag mit Wasser bis der Phenojphthaleintest negativ ist.11.) The precipitate is washed with water until the phenojphthalein test is negative.
12.) Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml absolutem Äthylalkohol.12.) The precipitate is washed twice with 500 ml of absolute ethyl alcohol.
13.) Man breitet den Niederschlag zur Lufttrocknung auf Filterpapier aus.13.) Spread the precipitate on filter paper to air dry.
Verfahrensweise:Procedure:
Wenn das Ausgangsmaterial für die Reinigung mit ECTEOLA-Celluloseharz das Kältefällungskonzentrat des AHF oder die Polyäthylenglykol-gefällte Fraktion des AHF ist, wird die AHF-Fraktion erst in Chloridpuffer aufgelöst. Wenn das Ausgangsmaterial die Glycin-gefällte Fraktion des AHF ist, wird die AHF-Fraktion erst gegen Chloridpuffer für eine Stunde dialysiert, um Glycin zu entfernen und die Jonenstärke herabzusetzen. Die Reinigung der gepufferten AHF-Fraktion durch Säulentechnik mit dem vorstehend präparierten ECTEOLA-Celluloseharz vollzieht sich wie folgt: If the starting material for cleaning with ECTEOLA cellulose resin is the cold precipitation concentrate of the AHF or the polyethylene glycol-precipitated fraction of the AHF, the AHF fraction is first dissolved in chloride buffer. If the starting material is the glycine-precipitated fraction of the AHF, the AHF fraction is first dialyzed against chloride buffer for one hour in order to remove glycine and reduce the ionic strength. The purification of the buffered AHF fraction by column technology with the ECTEOLA cellulose resin prepared above is carried out as follows:
Tas EOTEOM-Celluloseharz wird über Nacht (12 Stunden) in. einem 50C Schrank im Gemisch mit Chloridpuffer im Verhältnis 15 g Harz zu 600 ml Puffer behandelt. Der erhaltene Harzbrei wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 2j54 cm bis 3,81 cm Durchmesser und 45,72 cm Höhe eingefüllt. Nachdem der Puffer eich bis zu dem Spiegel des Harzes abgesenkt hat, wird die AHF-Fraktion auf 2 1/2 ml pro Minute eingestellt und die Menge der AHF-Fraktion, die zu einer Einzeleäule gegeben wird, ent- Tas EOTEOM cellulose resin (12 hours) overnight in. A C 5 0 cabinet g in a mixture with chloride buffer in a ratio of 15 ml resin to 600 buffer. The resulting resin slurry is poured into a column with a diameter of 2J54 cm to 3.81 cm in diameter and 45.72 cm in height . After the buffer has lowered to the level of the resin , the AHF fraction is adjusted to 2 1/2 ml per minute and the amount of the AHF fraction that is added to a single column is
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hält 1000 bis 2500 Einheiten AHF. (Eine Einheit AHF entspricht der AHF-Aktivität in einem cm des normalen Humanblutplasmas). Nachdem das AHF in die Säule gegeben worden ist, wird das Harz mit 200 bis 500 ml Chloridpuffer ausgewaschen. Wenn der Ohloridpuffer bis zu dem Spiegel des Harzes sich abgesenkt hat, wird der Eluierpuffer in die Säule gegeben. Das Eluat wird in Zehn-ml-Portionen gesammelt und auf Protein-Fibrogen- und AHF-Aktivität geprüft.holds 1000 to 2500 units of AHF. (One unit of AHF corresponds to the AHF activity in one cm of normal Human blood plasma). After the AHF has been added to the column, the resin is buffered with 200 to 500 ml of chloride washed out. If the chloride buffer is up to the When the level of the resin has decreased, the elution buffer is added to the column. The eluate is made in ten ml portions collected and checked for protein-fibrogen and AHF activity.
Die Eluatteile, die die größte wirksame AHF-Aktivität fThe eluate parts that have the greatest effective AHF activity f
besitzen, werden zurückbehalten und durch die Zugabe von Vfo Albumin stabilisiert. Die stabilisierte Lösung wird dann unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Ein Silberfilter der gleichen Größe kann anstelle des Milliporefilters benutzt werden. Das endgültige flüssige Produkt wird dann verschlossen eingefroren und dann in einem Schnellgefrierer noch mindestens 3 Stunden aufbewahrt und unter gewöhnlichen Kühlbedingungen in der Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1 aufbewahrt.are retained and stabilized by adding Vfo Albumin. The stabilized solution is then filtered as described in Example 1 using a 293 mm Millipore filter. A silver filter of the same size can be used in place of the Millipore filter. The final liquid product is then frozen closed and then kept in a quick freezer for at least 3 hours and kept under normal cooling conditions in the manner of the end product according to Example 1.
Beispiel 1 wird wiederholt und zwar bis zu der Arbeitsstufe ,bei der die sich ergebende Glyeinausfallung in mit Gitrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst wird. Die aufgelöste Glycinausfallung wird auf pH 6,5 durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure eingestellt. Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen Konzentration 3,5$ beträgt. Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt. Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der lösung zugefügtExample 1 is repeated up to the stage in which the resulting glyein precipitation in saline solution mixed with citrate is dissolved. The dissolved glycine precipitate is brought to pH 6.5 Addition of 0.1 normal acetic acid adjusted. Polyethylene glycol 4000 is added to its concentration Is $ 3.5. The mixture becomes mild at room temperature stirred for 10 minutes and then centrifuged at 5000 rpm for 15 minutes. The protruding is decanted and adjusted to pH 6.88 with 0.1 normal sodium hydroxide solution. It becomes additional Polyethylene glycol 4000 was added to the solution
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bis die Polyäthylenglykolkonzentration 10$ erreicht. Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 5000 Umdrehungen zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (20C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei -40C durchgeführt. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst.until the polyethylene glycol concentration reaches $ 10. The mixture is gently stirred at room temperature for 30 minutes and centrifuged at 5000 revolutions for half an hour. The supernatant is decanted and the precipitate is washed in cold water (2 ° C.). The spin washing is carried out by centrifugation for 5 minutes at 5000 revolutions / minute at a temperature at -4 0 C. The supernatant is decanted and the precipitate is dissolved in sodium chloride solution mixed with citrate.
Der wiederaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt und dann mit Glycin gemäß dem Arbeitsverfahren des Beispiels 1 ausgefällt, jedoch mit der Abweichung, daß die Molarität des Glycinreagenzes 1,8 beträgt. Die Glycinausfällung wird gewaschen und geklärt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingefroren.The redissolved precipitate is adjusted to pH 6.88 by adding 0.1 normal acetic acid and then precipitated with glycine according to the procedure of Example 1, with the exception that the molarity of the glycine reagent is 1.8. The glycine precipitation is washed and clarified and then, as described in Example 1, frozen.
Das AHP-Konzentrat, hergestellt nach dem Verfahren dieses Beispiels, enthält weniger als 0,05$ (allgemein um etwa 0,01$) zurückgebliebenes Polyäthylenglykol, wobei jedoch das AHP-Konzentrat, welches nach der Arbeitsweise des Beispiels 2 hergestellt wird, Polyäthylenglykol in der Größenordnung von etwa 0,5$ Polyäthylenglykol enthält.The AHP concentrate, produced according to the process of this For example, contains less than $ 0.05 (generally around $ 0.01) of residual polyethylene glycol, however the AHP concentrate, which is prepared according to the procedure of Example 2, polyethylene glycol in the Contains on the order of about $ 0.5 polyethylene glycol.
Das Endprodukt, welches durch das Verfahren nach diesem Beispiel erhalten wird ,ist substantiell löslicher als das ähnliche Produkt, welches nach dem vorstehenden Beispiel 2 erhalten wird.The final product obtained by the process of this example is substantially more soluble than the similar product obtained in Example 2 above.
Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 3Ofache AHP-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHP-Aktivität.The concentrate, prepared according to this example, has a more than 30-fold AHP activity of one the same plasma volume and the AHF activity of this concentrate is less than a hundredth of that amount of protein present in the plasma and shows an equal numerical value of AHP activity.
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Verschiedene Modifikationen und Anpassungen der vorliegenden Erfindung können nach der Kenntnisnahme der vorstehenden Beschreibung und der zugehörigen Ansprüche durch einen Durchschnittsfachmann durchgeführt werden, ohne den Erfindungsgedanken und den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Alle derartigen Variationen und Modifikationen gehören in den Bereich der Erfindung, wie diese in den folgenden Ansprüchen angegeben sind.Various modifications and adaptations of the present invention can be made after reading the above Description and the associated claims are carried out by a person of ordinary skill in the art, without departing from the spirit and scope of the invention. All such variations and Modifications are within the scope of the invention as set out in the following claims.
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