DE1643815C3 - Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur dextrins erschwert. Ebenfalls sind modifizierte Stärken enzymanschen Herstellung von Cyclodextrin aus 30 im allgemeinen nicht als Substrat verwendet worden, Stärke. weil die daraus erhaltenen Ausbeuten an Cyclodextrin

Cyclodextrine, auch bekannt als Schardinger-Dex- wesentlich niedriger waren, als die aus unmodifizierter trine, enthalten 6 oder mehr miteinander unter Bildung Stärke erhaltenen (siehe dazu D. French. Die von Cycloverbindungen durch 1,4-Bindungen ver- Stärke, 15, 280-284, 1963).

bundcne Anhydro-A-D-GIucose-Reste. Cyclodextrine 35 Obwohl Cyclodextrine bekannt waren, sind sie können spezieller klassifiziert werden durch die An- nicht in großen Mengen verfügbar gewesen. Wirtzahl von vorhandenen Glukoseeinheiten. Der 6glie- schaftliche Mittel für ihre Gewinnung haben bisher drige Ring wird als Λ-Cyclodextrin oder Cyclohexa- gefehlt. Viele Faktoren tragen zu den hohen Kosten amylose, der 7gliedrige Ring als /^-Cyclodextrin oder der Gewinnung von Cyclodextrin durch die bis-Cycloheptaamylose usw. bezeichnet. 4° herigen Verfahren bei.

Als Ergebnis der einzigartigen cyclischen Struktur Ein größerer Nachteil dieser bisherigen Verfahren

weisen Cyclodextrine ein beträchtliches Potential als für die Gewinnung von Cyclodextrin ist der Um-Komplexbildner auf, weil sie Einschlußverbindungen stand, daß die Umsetzung nur mit geringen Feststoffmit Molekülen bilden, welche innerhalb des Hohl- konzentrationen ausführbar ist. Die Kosten des Umraums des cyclischen Moleküls verbleiben. Die Cyclo- 45 gehens mit großen Flüssigkeitsmengen einschließlich dextrine finden vielseitige Verwendung, z. B. in der des Erwärmens auf hohe Temperaturen und anNahrungsmittel-, Tabak- und Arzneimittelindustrie. schließendes Abkühlen ebenso wie lange Reaktions-Cyclodextrine werden aus Stärke durch die Ein- zeiten machten die bisherigen Herstellungsverfahren wirkung eines Enzyms, gewöhnlich bekannt als Cyclo- in wirtschaftlicher Hinsicht nicht reizvoll,
dextrintransglycosylase (B. macerans-Amylase), her- 50 Die wirtschaftliche Gewinnung wird ferner durch gestellt. Die Quelle des Enzyms ist üblicherweise eine den Umstand erschwert, daß, um das Cyclodextrin Kultur von Bacillus macerans. Die Fähigkeit, dieses aus verdünnten Umsetzungsflüssigkeiten zu gewinnen, Enzym zu erzeugen, ist häufig ein Kriterium, um ein geeignetes Fällmittel, beispielsweise Trichlor-Stämme von Bacillus macerans von anderen nahe ver- äthylen, zugesetzt wird, um das Cyclodextrin im wandten Mikroorganismen zu unterscheiden. Zur 55 wesentlichen unlöslich zu machen. Die Löslichkeiten Herstellung des Cyclodextrin synthetisierenden En- der Cyclodextrin-Komplexe in diesen verdünnten lyms wird Bacillus macerans unter geeigneten Bedin- Flüssigkeiten sind, daß es nicht möglich ist, das gegungen auf Medien, welche geeignete Quellen an Stick- samte in den Flüssigkeiten vorhandene Cyclodextrin itoff, Kohlenstoff, Wachstumsfaktoren und Mineral- zu gewinnen. Beispielsweise ist die Löslichkeit des «offen enthalten, gezüchtet. Verschiedene geeignete 6° Cyclodextrins in Anwesenheit von Trichloräthylen so Mittel zum Erzeugen von Cyclodextrintransglyco- groß, daß 20 % des gesamten vorhandenen Cyclosylase sind in der Literatur (D. F r e η c h in »Methods dextrins in Lösung verbleiben, was einen wesentlichen in Enzymology«, S. P. C ο 1 ο w i c k and N. O. Ka- Verlust bedeutet.

plan, Academic Press, New York, N. Y., Vol. V, Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein

1962, S. 148 bis 155) beschrieben. 65 Verfahren für die Umwandlung von Stärke in Cyclo-

Die Cyclodextrintransglycosylase-Aktivität von dextrin zu entwickeln, bei welchem höhere Feststoff-Bacillus-macerans-Zubereitungen wird zweckmäßiger- geholte des Stärkesubstrats in Lösung angewendet weise durch das Tilden-Hudson-Verfahren (E. B. T i 1- werden können und das Cyclodextrin in höheren

Konzentrationen als bisher gewonnen wird, das Tyclodextrin oder seine Komplexe leicht kristallisierjar sind und während der Umsetzung kristallisieren können, ferner Stärken eingesetzt werden können, velche wegen ihres geringen Pastenbildungsvermögens jder ihrer Neigung zur Retrogradation bisher nicht iafür geeignet waren und hohe Ausbeuten an Cyclodextrin erzielt werden.

Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von Cyclodextrin durch Umsetzung von Stärke mit Cyclodextrintransglycosylase ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einer partiell hydrolysierten Stärke, deren Dextrose-Äquivalent nicht höher als etwa 20 ist, durchführt.

Das Dextrose-Äquivalent (im folgenden als »DE« bezeichnet) ist die Gesamtmenge der vorhandenen reduzierenden Zucker, berechnet als Dextrose und ausgedrückt in % Trockensubstanz.

Vorzugsweise wird die Umsetzung mit einer partiell hydrolysierten Stärke, deren DE-Wert nicht höher als etwa 6 ist, durchgeführt.

Dabei kann die Umsetzung mit einem Stärkehydrolysat mit einem Feststoffgehalt zwischen etwa 10 und etwa 40% durchgeführt werden.

Wenn erfindungsgemäß ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von nicht mehr als etwa 20 der Einwirkung von Cyclodextrintransglycosylase unterworfen wird, werden ausgezeichnete Ausbeuten an Cyclodextrin erhalten; die Umsetzung zu Cyclodextrin kann leicht bei hohen Stärkekonzentrationen ausgeführt werden. Schwierigkeiten mit Stärkeretrogradation und Verunreinigung des Produktes durch Stärke werden vermieden und Isolierung und Reinigung des Cyclodextrins vereinfacht.

Nach den bisher bekannten Verfahren für die Herstellung von Cyclodextrin aus 5 /_uiger Stärkesuspension mußten 2233 Liter Wasser je 45,4 kg hergestelltem Cyclodextrin angewendet werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei welchem 34 Gewichtsprozent Feststoff enthaltende Lösung von partiell hydrolysierter Stärke mit 50°_oiger Ausbeute zu Cyclodextrin umgesetzt werden kann, brauchen nur 220 Liter Wasser je 45,4 kg hergestelltes Cyclodextrin behandelt zu werden. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren auch mit niedrigeren Feststoffgehalten angewendet werden kann, besteht einer der wesentlichen praktischen Vorteile dieses Verfahrens darin, daß es möglich ist, Cyclodextrin in einem Medium zu gewinnen, welches eine geringe Menge an Wasser enthält. Der Feststoffgehalt des Ausgangsreaktionsgemisches überschreitet üblichem/eise 10 Gewichtsprozent und liegt vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 50 Gewichtsprozent.

Die gemäß der Erfindung gewonnenen Cyclodextrine sind für die gleichen Zwecke wie die nach früheren Verfahren erhaltenen brauchbar. Beispielsweise sind nach dem e.findungs};emäßen Verfahren gewonnene Produkte geeignet als. aromafi eisetzende Stoffe für Tabakrauch und können auf einer Trägernltergrundlage zur Herstellung ve η Tabakliltem aufgebracht werden. Sie sind auch als an sich bekannte Inklusionsagentien in der Chromatographie brauchbar.

Zur Herstellung der partiell hydrolysierten Stärke kann jede Art von Stärke oder Stärkefraktion benutzt werden, z. B. Getreide- und Knollenstärken, wachsartige oder amylosereiche Stärke:) und diet Amylose- oder Amylopectinfraktionen daraus. Auch rohe Stärkequellen können benutzt werden, ?.. B. vermahlenes Getreide, macerierte Knollen oder teilgereinigte Stärke daraus. Wenn solche rohen Stärkequellen benutzt werden, kann das Cyclodextrin durch Erwärmen des Umsetzungsprodukls, um das Cyclodextrin löslich zu machen, Filtrieren von Unlöslichem und Kristallisation oder Ausfällung des Cyclodextrins aus dem Kiltrat gewonnen werden.

Die partielle Hydrolyse der Stärke kann durch übliehe Mittel bewerkstelligt werden. Geeignete Katalysatoren hierfür sind z. B. Säuren, saure Salze, saure Ionenaustauscherharze und geeignete Enzyme. Man behandelt also gelatinierte Stärke mit Säure oder Enzymen oder mit beiden.

Mit dem im folgenden verwendeten Ausdruck »Stärkehydrolysat« wird das Produkt bezeichnet, welches aus der enzymatischen oder sauren Hydrolyse von Stärke stammt, wobei die Hydrolyse mit gelatinierter Stärke durchgeführt wird.

Falls man mit Säure hydrolysiert, kann man die Acidität während der Hydrolyse erniedrigen, wenn die Temperatur und Zeit der Hydrolyse gesteigert werden; dies kann bis zu einem Punkt geschehen, an dem noch ausreichende Hydrolysewirkung sogar in neutraler Lösung erhalten werden kann, das ist bei einer Temperatur von 204³C.

Ein besonders geeignetes Verfahren zur partiellen Hydrolyse von Stärke besteht in der Verwendung von bakterieller x-Amylase. Das Enzym kann in Form von handelsüblichen wärmewiderstandsfähigen x-Amylasen, gewonnen durch gewisse Stämme von Bacillus subtilis oder Bacillus mesentericus, erhalten werden.

Wärmebeständige bakterielle jc-Amylase-Zubereitungcn sind besonders geeignet, es können aber auch andere -t-Amylase-Zubereitungen verwendet werden, beispielsweise solche, welche aus Bakterien, Pilzen, Cerealien oder Tieren stammen. Wenn die Zubereitungen hohe saccharogene Enzymaktivität besitzen, sollten die Reaktionsbedingungen (pH-Weri, Temperatur und Zeit) so gewählt werden, daß die verflüssigende Enzyrnaktivität möglichst hoch und die saccharogene Enzymaktivität möglichst niedrig sind. Wenn die partielle Hydrolyse enzymatisch durchgeführt wird, muß die Temperatur während der Hydrolyse unterhalb der Inaktivierungstcmperatur des betreffenden Enzyms liegen.

Der Hydrolysekataiysator kann vor, während oder nach der Gelatinierung der Stärke zugesetzt werden. Durch die partielle Hydrolyse wird erreicht, daß die Stärkepasteviskosität so weit herabgesetzt wird, daß die Stärke leicht bei hoher Feststoff konzentration gehandhabt werden kann. Durch die partielle Hydrolyse wird die Stärke löslich, so daß sie leicht der Enzymolyse durch das zum Gewinnen des Cyclodextrins verwendete Enzym unterworfen werden kann. Zusätzlich wird durch die partielle Hydrolyse die Retrogradation der Stärke erheblich zurückgedrängi und die Wirksamkeit der Enzymolyse erhöht. Fernei ist das Cyclodextrin leichter gewinnbar. Vorzugsweise wird die partielle Hydrolyse bis zu einem DE-WeH im Bereich zwischen etwa 0,5 und etwa 6 ausgeführt Zwar kann die Stärke auch bis zu einen höherer oder niedrigeren Grad hydrolysiert werden, doc treten, wenn der DE-Wert wesentlich niedriger als 0, liegt, mit abnehmenden DE-Wcrten allmählich di eingangs erwähnten Probleme bei der Verwendun von unhydrolysierten Stärken auf, nämlich eine ζ

hohe Viskosität und Retrogradation der Stärke. Wenn die Hydrolyse bis zu einem DE-Wert wesentlich über 6 durchgeführt wird, nimmt die Ausbeute an Cyclodextrin ab

Die Umsetzung der partiell hydrolysierten Stärke zu Cyclodextrin geschieht durch die Einwirkung von Cyclodextrin-Transglycosylase. Dieses Enzym ist am aktivsten bei Temperaturen zwischen etwa 40 und etwa 6O⁰C und bei pH-Werten vorzugsweise zwischen etwa 5,5 und etwa 7,5. Höchste Ausbeaten au Cyclodextrin erhält man innerhalb dieser Grenzen; es können aoer auch etwas höhere oder niedrigere pH- und Temperaturwerte angewandt werden.

Die eingesetzte Menge an Cyclodextrin-Transglycosylase ist von der Schnelligkeit, mit welcher die Enzymolyse durchgeführt werden soll, und den Reaktionsbedingungen abhängig. Beispielsweise ist bei konstanten Temperatur- und pH-Bedingungen die erforderliche Zeit, um eine bestimmte Menge an Cyclodextrin zu erhalten, der Menge an benutztem Enzym umgekehrt proportional.

Im allgemeinen können höchste Ausbeuten an Cyclodextrin innerhalb etwa 2 bis 7 Tagen bei 50° C und bei einem pH-Wert von etwa 7 erhallen werden, wenn die Enzymmenge zwischen etwa 100 und etwa 1000 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärke liegt.

Nach der Umsetzung kann das im Reaktionsgemisch enthaltene Cyclodextrin leicht durch übliche Fällungsund Kristallisationsverfahren gewonnen und gereinigt werden. Man kann hierzu die Fähigkeit von Cyclodextrinen zur Bildung von Einschlußverbindungen mit vielen organischen Verbindungen benutzen. So führt der Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels, z. B. Trichloräthylen, Tetrachloräthan oder Brombenzol zum Ausfällen von schwerlöslichen Cyclodextrinkomplexen. Durch Ausnutzung verschiedener Fällungsmittel ist es möglich, das eine oder andere Cyclodextrin zu isolieren, beispielsweise \- oder /^-Cyclodextrin in gereinigter Form. Die unlöslichen Cyclodextrinkomplexe können gewünschtenfalls auch durch Umkristallisieren gereinigt werden.

Man kann auch festes Cyclodextrin durch direkte Kristallisation aus dem Reaktionsgemisch durch bekannte Kristallisationsmittel erhalten. Schließlich kann auch das Reaktionsgemisch mit dem darin enthaltenen Cyclodextrin nach geeignetem Reinigen zu einem festen Cyclodextrin enthaltenden Simp eingedampft oder getrocknet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Zu einer 30eewichtsprozentigen Suspension von Kartoffelstärke "mit pH 7,2 wurden 0,025 Gewichtsprozent, bezogen auf die Stärkefeststoffe einer bak teriellen Λ-Amylase-Zubereitung HT 1000 (unter diesem Handelsnamen verkauft von der Miles Chemical Laboratories) zugesetzt. Die Suspension wurde allmählich während 30 Minuten in ein auf einer Temperatur von 90 bis 92"C gehaltenes Gefäß gegeben. Dann wurde weitere 25 Minuten bei dieser Temperatur gerührt, bis die Stärke auf einen DE-Wert von 2,6 hydrolysiert war. Die hydrolysierte Stärke wurde dann unverzüglich auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt, auf 12f°C erhitzt und 15 Minuten auf dieser Temperatur gehalten, um restliche x-Amylasc-Aktivität zu vernichten.

D-TS so erhaltene Stärkehydrolysat wurde dann auf 45°C gekühlt und der pH-Wert auf 6,0 eingestellt. Das Hydrolysat wurde dann in Anwesenheit von 5 ml Toluol pro ioO ml Reaktionsgemisch mit einer Menge von CyclodeUrin-Transglveo-ylase äquivalent 200 Tilden-Hudson-Einheiten "pro 100 g Stärkehydrolysatfeststoffe \ ersetzt und 5 Tage auf einer Temperatur von 45 ΐ gehalten. Dann wurde durch 15 Minuten langes Sieden das Enzym inaktiviert, das Toluol abgetrieben und das Cyclodextrin löslich gemacht. Das Gemisch wurde noch heiß dann filtriert.

Das Filtrat wurde in drei Anteile A, B und C geteilt und wie folgt behandelt:

Teil A wurde durch direkte Fällung mit Trichloräthylen analysiert, um die Menge an anwesenden Cyclodextrin zu bestimmen. Hierzu wurde, ebenso wie bei allen folgenden Beispielen, die folgende Methode angewendet:

Der Cyclodextringehalt wurde durch Zusetzen eines Überschusses von Trichloräthylen zu der Umsetzungsflüssigkeit (25 ml pro 100 ml Umsetzungsflüssigkeit) bestimmt. Dabei wurde die Mischung 3 bis 7 Tage bei 25 bis 3O⁰C geschüttelt, im Vakuum durch Whatman Nr. 1 Filterpapier filtriert, der Filterkuchen mit einer 10% des Volumens der Umsetzungsflüssigkeit entsprechenden Menge Wasser von 5⁰C gewaschen, der Filterkuchen quantitativ entnommen und bei 8O⁰C unter einem Vakuum von etwa 710 Torr während etwa 24 Stunden getrocknet.

Die Ausbeute an rohen Cyclodextrinen wurde aus dem Gewicht des Cyclodextrin-Filterkuchens durch folgende Formel berechnet:

% Cyclodextrinausbeute = 100 Trockengewicht des Filterkuchens pro Volumen Flüssigkeit Gewicht der Stärkefeststoffe pro Flüssigkeitsvolumen

Teil B wurde 24 Stunden bei einem pH von 6, in Anwesenheit von 0,02 % einer bakteriellen «-Amylase-Zubereitung (HT 1000) auf 8O⁰C gehalten und danach während 15 Minuten auf 121⁰C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die Menge an vorhandenem Cyclodextrin wurde dann wie vorstehend bestimmt.

Teil C wurde mit bakterieller Λΐ-Amylase wie vorstehend beschrieben behandelt, auf eine Temperatur von 121° C erhitzt und dann auf 75° C gekühlt. Danach wurde die Flüssigkeitstemperatur während der nächsten 51 Stunden allmählich auf etwa 30° C verringert, wobei die Flüssigkeit gerührt wurde, um die Kristallisation des vorhandenen Cyclodextrins zu begünstigen. Die angesammelten Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gewonnen, gewaschen, getrocknet und gewogen. Diese Kristalle werden als Teil C-I bezeichnet. Die vereinigte Mutterlauge und Waschflüssigkeit wurden durch Behandlung mit Aktivkohle gereinigt und filtriert, um die Kohle zu entfernen. Die gereinigte Mutterlauge wurde dann eingedampft, um einen als Teil C-2 bezeichneten Sirup zu ergeben.

Die Ergebnisse dieser Behandlung folgen in dei Tabelle I.

Tabelle I

Anteil Beschreibung

DE

Gesamttrockensubstanz

(g/100 ml)

Cyclodextrinausbeute

(⁰O

A	Ursprüngliche Flüssigkeit	4,3	41,1	39
B	Λ-amylase-bchandeIte Flüssigkeit	13.1	39.2	37
C-I	Kristallines Cyclodextrin			27
C-2	Konzentrierte Mutterlauge	16.8	58,0	10

Dieses Beispiel zeigt die Gewinnung von Cyclodextrin in erheblicher Ausbeute durch das erfindungsgemäße Verfahren. Die im wesentlichen gleichen Cyclodextrinausbeuten aus den Teilen A und B zeigen, daß der ausgefällte Cyclodextrinkomplex, erhalten durch dieses Verfahren, im wesentlichen frei von nicht umgesetzter Stärke ist. Überdies wird gezeigt, daß geeignete Fnzyme, wie bakterielle «-Ar-vlase, gebraucht werden können, um ohne merkliche gleichzeitige Hydrolyse des vorhandenen Cyclodextrins und ohne Ausbeuteverminderung in der Konvertierungsflüssigkeit verbleibende nicht cvclische Glucane zu hydrolysieren. Die Ergebnisse erläutern auch die Möglichkeit, das Cyclodextrin in beträchtlicher Menge durch direktes Kristallisieren neben einem Sirupprodukt mit einem Gehalt an Cyclodextrin zu gewinnen.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die Behandlung eines Stärkehydrolysats mit der Behandlung von unhydrolysierter Stärke mit einem Enzym zur Gewinnung von Cyclo dextrin verglichen.
Eine 30gewichtsprozentige Suspension von Kar toffelstärke wurde mit bakterieller oc-Amvlase wie in Beispiel 1 behandelt, um ein Stärkehydrolysat mi einem DE von 2,0 und einem Feststoffgehalt von 34 j pro 100 ml zu ergeben. Dieses Stärkehydrolysat wurdi mit Wasser auf Trockenfeststoffgehalte, wie in dei folgenden Tabelle TI angegeben, verdünnt. Die Hydro lysate wurden dann bei 50⁰C und bei einem pH vor 7,2 in Anwesenheit von Toluol mit einer Cyclodextrin-Transglycosylase-Menge von 200 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärke-Trockensubstanz konvertiert Nach 7 Tagen der Konvertierung wurde das restliche Enzym durch Erhitzen auf 100⁰C während 10 Minuter inaktiviert, und das vorhandene Cyclodextrin wurde durch Fällung mit Trichloräthylen bestimmt.

Die unhydrolysierten Stärkebreie wurden mit ver· schiedenen Trockensubstanzgehalten hergestellt, ir gleicher Weise gelatiniert und unmittelbar mit Cyclodextrin-Transglycosylase behandelt. Die erhaltener Ergebnisse folgen in Tabelle II.

Tabelle II	Substrat-	Erzeugtes	Cyclodextrin	fcigenschaften der Umsetzungsflüssigkeit	Filtration	609641/45
Substrat	lconzentration		Stärke		schlecht
			(Gewichts		schlecht
	(g/100 ml)	(g/100 ml)	prozent)	Fluidität	schlecht
	3,2	0,4	13	fließend	schlecht
Gelatinierte	5,4	1,5	28	fließend	nicht filtrierbar
Stärke	8,1	2,5	31	fließend	nicht filtrierbar
	10,8	4,3	40	fließend	gut
	16,1	—	—	nicht fließend	gut
	21,5	—	—	nicht fließend	gut
	3,4	0,9	26	fließend	gut
Teilhydrolysierte	5,7	2,1	37	fließend	got
Stärke (2,0 DE)	8,5	3,4	40	fließend	got
	IU	4,7	42	fließend	got
	17,0	7,9	46	fließend	got
	22,7	11,0	48	fließend
	28,3	13,2	47	fließend
	34,0	17,6	52	fließend

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des neuen Verfahrens, Cyclodextrin in hohen Ausbeuten mit hohen Trockensubstanzgehalten zu erzeugen. Bei den bisherigen Verfahren war dies nicht möglich.

Die Ergebnisse bestätigen ferner die bisherige Ansicht, daß hohe Feststoff Umwandlungen nicht zweckmäßig sind, wenn das Substrat aus gelatinierter aber nicht hydrolysierter Starke besteht.

Beispiel 3

Die Tatsache, daß das Ausmaß der Ihdrolyse sich auf die Ausbeute an aus Stärkchydroh säten erhältlichem Cyclodextrin auswirkt, wird durch die Verwendung einer 30gewichtsprozentigen Dispersion \oii enzym-\erflüssigter wachsartiger Milostärke gezeigt.

Das VerflüssigungSNerfahren bei diesem Beispiel war gleich dem im Beispiel 1 beschriebenen mit der Abänderung, daß eine geeignete Menge von bakterieller a-Amylase verwendet wurde, um verschiedene DE-Werte zii erhalten. 30gewichtsprozentige Dispersionen von wachsartiger Milostärke wurden bei einer Temperatur von 90 bis 92'C während den jeweils erforderlichen Zeiten zu verschiedenen DE-Werten hydrolysiert.

Getrennte Muster der teilhydrolysierten Stärke von 34 g Trockensubstanz pro IUO ml wurden auf 121"C erwärmt, um die restliche \-Amslase-Aktivität zu vernichten. Die Muster wurden danach bei 50"C und einem pH von 7,2 in Gegenwart von Toluol mit

ίο einem Cyclodextrin-Transglycosylase-Zusatz von 400 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärkefeststoffe umgesetzt. Das vorhandene Cyclodextrin wurde nach 4 und 7 Tagen Umsetzung durch die vorbeschriebene Trichloräthylenfällung bestimmt. Tabelle III zeigt, daß Ausbeuten an Cyclodextrin über 40% erhalten wurden, wenn die Stärke vor der Umsetzung zu einem DE im Bereich \on 0,4 bis 6 hydrolysiert wurde und daß Cyclodextrinausbeuten über 3 g pro 100 ml bei einem DE bis 20 erhalten werden.

Tabelle III	Cyclodextrinausbeuten	7 Tage	Cyclodextrin	7 Tage
DE des		(g. 100 ml)	ausbeuten	CO)
Teil-	4 Tage	18.4	4 Tage	54
hydrolysats	(g/100 ml)	17,4	("„)	51
	16,5	18,0	49	53
0,4	15,3	15,3	45	45
1,0	14,3	14.0	42	41
1,9	12,2	10.9	36	32
3,5	10,5	7,5	31	22
6,0	8,2	0,1	24	18
8,8	5,8	5,1	17	15
12,0	4,4	"3 "7 -* j '	13	11
15,1	3,1	2,4	9	7
17,1	1 "7	0,7	V	2
19,6	1,7		5
22,9	0,7		2
25,5

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert, daß es zweckmäßig ist, die Cyclodextrinbildung in Anwesenheit einer angemessenen Menge eines geeigneten Fällungsmittels ablaufen zu lassen. Vermutlich besteht die Funktion des Fällungsmittels darin, unlösliche Komplexe mit den entstehenden Cyclodextrinen zu bilden, wodurch diese aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden und hierdurch das Gleichgewicht der Reaktion zugunsten weiterer Cyclodextrinerzeugung verschoben wird. Beispiele geeigneter Fällungsmittel werden in Tabelle IV gezeigt.

In diesem Beispiel wurde eine 30gewichtsprozentige Suspension von Kartoffelstärke auf 1,9 DE verflüssigt und wie im Beispiel 1 angegeben, erwärmt. Die verflüssigte Stärke wurde in mehrere Anteile aufgeteilt und bei 50⁰C und einem pH von 7,0 und mit einer Cyclodextrin-Transglycosylasemenge von 500 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Substrat-Trockensubstanz umgesetzt. 5 Stunden nach Beginn der Umsetzung wird das Cyclodextrinfällungsmittel in dei Umsetzungsfliissigkeit in einer Menge von etwa 20 £ pro 100 g festes Substrat dispergiert.

Nach 3 Tagen Umsetzung für eine Versuchsreihe und nach 4 Tagen Umsetzung für eine zweite Versuchs reihe wurde das Enzym durch Erhitzen inaktiviert Um eine Störung der Cyclodextrin-Bcstimmung durct unreagierte Stärke zu vermeiden, wurde jede Flüssig keit dann mit 0,01% der bakteriellen a-Amylas< (HT 1000) während 24 Stunden bei 6O⁰C und einen pH von 7,0 umgesetzt. Nachdem die bakterieUf a-Amylase durch Erhitzen inaktiviert war, wurde di( gebildete Cyclodextrinmenge durch Trichloräthylen fällung bestimmt. Die durch die Fällungsmittel be wirkte Ausbeutesteigerung ist aus der folgend« Tabelle IV ersichtlich.

Tabelle IV	Beispiel 5	Stiirkc-	Hrzeugtes Cyclodextrin	Dieses	4 Tage	Cyclodcxtrin-Ausbeute	4 Tage
Füllungstnittcl		kimzcntntion	3 Tage	(g/100 ml)	i Tage	(%)
	fy'IOOnu	(g/100 ml)	16.8	(VJ	50
	33,3	14,8	15,7	44	47
p-Cymol	33.3	14,9	15,7	45	47
Tetrachloräthan	33,3	13,2	15,4	40	46
Benzol	33.3	13,1	15,1	39	45
Kohlenstoflfdisultid	33.3	13,0	15.3	39	45
Toluol	33,9	13,3	14,4	39	43
Naphthalin (in Äther)	33.3	12,6	13,8	38	41
Trichloräthyien	33,3	15,5	11,7	47	35
Cyclohexan	33,3	10,2	11,6	31	35
Hexan	33,5	10,4	11,5	31	34
Chloroform	33,5	9,3	10,8	28	32
Brombenzol	33,5	10,4	10,3	31	30
Kohlenstofftetrachlorid	33,9	10,9	7,6	32	23
Anthracen (in Äther)	33,3	6,3	3,2	19	10
Thymol	33,3	3,7		11	in mehrere Anteile ^TI -T-I 1
Kontrollversuch			Stärkehydrolysat wurde

Dieses Beispiel erläutert die Gewinnung von Cyclodextrin in beträchtlichen Ausbeuten aus hohen Feststoffkonzentrationen von Maisstärke durch das erfindungsgemäße Verfahren.

Maisstärke ist typisch für solche Stärken, weiche beim Gelieren hohe Pastenviskosität besitzen und eine ausgesprochene Neigung zur Retrogradation entfalten. Diese Pastenbildung hat die Verwendung von Maisstärke und ähnlichen Stärken für eine technische Gewinnung von Cyclodextrin nach den bisherigen Verfahren ausgeschlossen.

Eine 30gewichtsprozentige Suspension von Maisstärke wurde auf 2,1 DE teilhydrolysiert und dann in Befolgung des Verfahrens gemäß Beispiel 1 erwärmt.

Tabelle V

50°C in Anwesenheit von Toluol mit Cyclodextrin-Transglycosylase während der Zeiten und unter den Bedingungen, wie sie in Tabelle V foigen, umgesetzt wurden. Die Cyclodextrin-Transglycosylase-Aktivität wurde nach der Umsetzung durch Erhitzen auf 100⁰C während 10 Minuten vernichtet. Um zu vermeiden, daß unreagierte Stärke die Cyclodextrin-Bestimmung stört, wurden die Umsetzungsflüssigkeiten der Einwirkung von bakterieller «-Amylase wie zuvor beschrieben ausgesetzt. Nach dem Erhitzen, um die bakterielle a-Amylase zu inaktivieren, wurde das vorhandene Cyclodextrin durch Trichloräthylenfällung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse folgen in Tabelle V.

Umsetzungstemperatur

Enzymmenge

Gesamttrockensubstanz

(Einheiten/g T. S.) (g/100 ml)

Cyclodextrin Cyclodextrinausbeute Tage 7 Tage 4 Tage 7 Tage

(g/100 ml) (g/100 ml) (%) (%)

200	38,1	6
400	38,1
200	38,1
400	38,1
Beispiel

15,3 20,8

15,8 18,9 20,3
22,0

17,7
21,3

40
55

42
50

53
58

47
56

Dieses Beispiel erläutert die wirksame Gewinnung von Cyclodextrin bei hohen Feststoff konzentrationen ans Stärke, welche durch übliche Säurehydrolyse teilhydrolysiert wurde.

Salzsäure wurde zu einer 18gewichtsprozentigen Suspension von wachsartiger Milostärke bis zu einer Normalität von 0,032 zugesetzt. Die Temperatur dieser Mischung wurde auf 97 bis 99°C gesteigert, am Gelatinierung und Teilhydrolyse zu bewirken. Kachdem die Stärke auf 3,4 DE teilhydrolysiert war, wurde Natriumhydroxyd bis zu einen pH von 5,6 zugesetzt, wodurch die Säurehydrolyse beendet wurde. Das erhaltene Stärkehydrolysat wurde anschließend filtriert, auf 30 % Trockensubstanz durch Eindampfen konzentriert trad mit Cyclodextrin-Transglycosylase bei 55°C und einem pH von 7,0 in Gegenwart von Toluol umgesetzt.

Nachdem getrennte Anteile des Hydrolysats 4 und 7 Tage umgesetzt worden waren, wurde das gebfldete Cyclodextrin durch Fällung mit Trichloräthyten bestimmt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle VL Tabelle VI schließt auch zwei Versuche ein, bei welchen

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ID Ö1Ö

die Stärke vor ihrer Verwendung als Substrat durch Säurehydrolyse auf ein DE von 8,1 hydrolysiert wurde.

Tabelle VI	Trocken-	Enzym-	Cyclodextrin-	7 Tage
DE der	substanz-	mengc	nusbcute	(X)
Teil-	konzen- tration		4 Tage)	38
hydrolysate	(g/100 ml)		(%)	48
	18,5	200	29	35
3,4	18,5	400	39	47
3,4	32.5	200	28	19
3,4	32,5	400	37	23
3,4	34,5	200	15
8.1	34,5	400	19
8,1

Die Vorteile der Erfindung sind vielseitig. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, daß das Verfahren die Cyclodextrin-Herstellung bei hohen Feststoffkonzentrationen ermöglicht. Ein anderer Vorteil besteht darin, daß man das Verfahren auf eine größere Auswahl an Stärkesubstraten, z. B. Maisstärke, welche im wesentlichen bisher unbrauchbar war, anwenden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner durch verbesserte Wirtschaftlichkeit aus, weil

ίο niedrigere Betriebskosten erforderlich sind, um eine gegebene Menge an Cyclodextrin zu erzeugen, da die Erfindung zu einem verbesserten Cyclodextrinprodukt führt und höhere Substratgehalte als 3 bis 5"'„ Feststoffkonzentration benutzt werden können. Es ist nicht nur möglich, sondern auch zweckmäßig, die Umsetzung bei Substratkonzentrationen von 20 bis 30% auszuführen, weil die vorstehenden Vorteile ohne wesentliche Verringerung der Ausbeute verwirklicht werden.

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Claims (3)

d e η und C. S. H u d s ο η, J. Bacteriol. 43, 527-544, Patentansprüche: 1952) gemessen. Dieses Meßverfahren ist auf alle Kulturflüssigiciten oder auf Enzymzubereitungen an-

1. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin wendbar, welche durch Eindampfen, Adsorption an durch Umsetzung von Stärke mit Cyclodextrin- 5 geeignete Adsorbenzien und anschließendes Austransglycosylase, dadurch gekennzeich- waschen daraus, Lösungsmittel- oder Salzfällungen net, daß man die Umsetzung mit einer partiell oder Fraktionierung, oder andere für den Fachmann hydrolysierten Stärke, deren Dextrose-Äquivalent bekannte Mittel gereinigt oder konzentriert wurden, nicht höher als etwa 20 ist, durchführt. Rohe Kulturflüssigkeiten enthalten im allgemeinen

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- io 3 bis 6 Tüden-Hudson-Einheiten pro ml.

zeichnet, daß man die Umsetzung mit einer par- Nach den üblichen bekannten Verfahren zur Her-

tiell hydrolysierten Stärke, deren Dextrose-Aqui- stellung von Cyclodextrin wird Cyclodextrintrans-

valent nicht höher als etwa 6 ist, durchführt. glycosylase einer verdünnten Lösung einer geeigneten

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gelatinierten Stärke zugesetzt, worauf man die Engekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einem 15 zymolyse unter geeigneten Bedingungen ablaufen Stärkehydrolysat mit einem Feststoffgehalt zwi- läßt.

sehen etwa 10 und etwa 40% durchführt. Bisher wurde für dieses Verfahren Kartoffelstärke

wegen ihrer geringeren Neigung zum Retrogradieren bei der angewendeten Umsetzungstemperatur vorge-10 zogen. Ferner wurde es nicht als ausführbar erachtet, Kartoffelstärke mit Konzentrationen von mehr als 5⁰J, Feststoffe zu verwenden; es ist nämlich wegen der

hohen Viskosität und der Stärkekonzentrationen unmöglich, mit höheren Stärkekonzentrationen zu ar-25 betten. Wenn die Stärke während der Enzymolyse retrogradiert, führt dies zur Anwesenheit von viel nicht umgewandelter Stärke in den Umsetzungsflüssigkeiten, was die Gewinnung des vorhandenen Cyclo-