DE1598325C - Laboratonumsreagens zur Bestimmung der Glutamat Oxalacetat Transaminase - Google Patents
Laboratonumsreagens zur Bestimmung der Glutamat Oxalacetat TransaminaseInfo
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Description
Aus H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie GmbH, Weinheim
1962, S. 837 bis 842, ist es bekannt, die Glutamat-Oxalacetat-Transaminase in Serum mittels einer gepufferten
Lösung von Asparaginsäure oder ihrem Natriumsalz und α-Ketoglutarsäure oder ihrem Natriumsalz
als Substrate, Malat-Dehydrogenase als Enzym, reduziertem Diphosphopyridinnucleotid als
Coenzym sowie Alkaliphosphaten spektrophotometrisch zu bestimmen. Die Lösungen der Einzelbestandteile
müssen im Eisschrank aufbewahrt werden. Die DPNH-Lösung muß wöchentlich erneuert werden.
Diese Maßnahmen sind für den Kleinverbraucher umständlich, da er im allgemeinen nur geringe
Reagensmengen benötigt und größere Ansätze die Gefahr des Verderbs durch das Wachstum von Mikroorganismen
mit sich bringen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Laboratoriumsreagens in trockener Form zur Bestimmung der
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase in biologischen Flüssigkeiten, wie im Serum, zu schaffen, das stabil ist,
reproduzierbare Ergebnisse liefert und sich einfach und bequem, z. B. in Form von Tabletten, verpacken
läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus Asparaginsäure und «-Ketoglutarsäure
als Substrate, Malat-Dehydrogenase (MDH) als Enzym, Diphosphopyridinnucleotid in reduzierter
Form (DPNH) als Coenzym sowie einem Alkaliphosphat als Puffer, das dadurch zusätzlich gekennzeichnet
ist, daß es in trockener Form vorliegt und zusätzlich
a) Gummiarabicum, Äthylendiamintetraessigsäuretetranatriumsalz, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
und sein Sulfat und Ammoni.umsulfat sowie
b) Mannit enthält.
Aus der USA.-Patentschrift 3 072 532 ist es bekannt, proteolytische Enzyme, insbesondere Protease, die in
Sublingualtabletten verwendet werden sollen, mit wasserlöslichen, stabilisierenden und löslichkeitsfordernden
Substanzen zusammen mit üblichen Trägern und Exzipienten zu verwenden. Als stabilisierende
Substanzen werden die verschiedensten Verbindungen genannt, wie festes Polyäthylenglykol, Pflanzengummen,
Kohlenhydrate, Disaccharide, Zuckeralkohole, wie Mannit, Gelatine und Natriumchlorid.
Protease ist in trockener Form stabil, verliert jedoch in wäßrigem Medium rasch ihre Aktivität. Die
Stabilisatoren sollen also die Protease bei ihrem Kontakt mit dem Speichel stabilisieren.
Aus der Zeitschrift »Die Pharmazie«, Bd. 2 (1947), S. 349, ist ein Enzym als Trockenreagens, nämlich
Urease auf einem Papier als Träger bekannt. Es ist aus H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen
ίο Analyse, S. 1000, bekannt, daß Urease-Trockenpulver
bei 0 bis 4° C monatelang haltbar sind, während wäßrige Urease-Lösungen instabil sind.
In trockenen Mischungen ist das Enzym Malat-Dehydrogenase gewöhnlich sehr instabil, aber das
Laboratoriumsreagens der Erfindung erwies sich als überraschend stabil. Das Reagens wird üblicherweise
in trockener Form in Einheitsmengen, in Behältern aus Folie, oder in Kapseln in den Handel gebracht.
Jede dieser Einheiten enthält eine gerade ausreichende Menge an Reagens, um damit einen einzigen Test
einer Probe durchzuführen. Um eine Bestimmung auszuführen, wird eine Packung ausgewählt, die das
Reagens für diesen besonderen. Test enthält. Das gesamte Reagens in der Packung ist vorher gemessen
und von festgesetzter Aktivität. Es kann demzufolge unmittelbar in einer Standardmenge Wasser zu einem,
flüssigen Reagens gelöst werden. Dieses flüssige Reagens wird dann mit der biologischen Probe gemischt
und führt zu einer enzymatischen Reaktion.
Das Ausmaß oder die Geschwindigkeit dieser Reaktion ist eine Funktion der Menge oder der Aktivität der zu
bestimmenden Substanz. In jedem Test wird, unabhängig von der besonderen Art der Bestimmung, ein
Coenzym aus einer Form in eine andere überführt, wobei die eine Form bei einer bestimmten Wellenlänge
das Licht absorbiert. Dementsprechend wird die optische Dichte der Probe als Funktion der zu bestimmenden
Substanz variieren. Durch Messung der optischen Dichte des Ansatzes zu verschiedenen Zeiten
kann man daher die Menge oder die Aktivirät der zu bestimmenden Substanz errechnen.
Jeder Bestandteil liegt in einer Menge vor, die sicherstellt, daß eine einheitliche, meßbare, enzym-:
katalysierte Reaktion mit Maximalgeschwindigkeit abläuft.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Das vollständige Reagens zur Glutamat-Oxalacetat-Transaminase-(abgeküizt:
GOT)-Bestimmung besteht aus einer trockenen Mischung der folgenden Substanzen:
Enzym Malat-Dehydrogenase (MDH), Puffer Dinatriumhydrogenphosphat,
Stabilisator Gummi arabicum, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und sein Sulfat-Salz,
Ammoniumsulfat und Äthylendiamintetraessigsäuretetranatriumsälz,
Substrat Asparaginsäure und a-Ketoglutarsäure, Coenzyme ReduziertesDiphosphopyridinnucleotid
(DPNH),
Füllstoff Mannit.
Füllstoff Mannit.
Zur Herstellung einer großen Zahl von Einheiten dieses Reagens wird das folgende Verfahren angewendet,
welches eine Charge an trockenem Reagens liefert, die in einer großen Zahl von kleinen Mengen
aufgeteilt und in etwa 10 000 Kapseln verpackt wird.
3 4
Als erstes wird ein Tris-(hydroxymethyl)-amino- Das trockene, lyophilisierte Pulver, das die Malat-
methan-(abgekürzt:Tris)-Äthylendiaminessigsäure-(ab Dehydrogenase enthält, wird dann zur Abpackung in
gekürzt: EDTA)-Stabilisator hergestellt. Dieser Stabili- Kapseln zubereitet. Hierzu werden die folgenden
sator bzw. Puffer ist eine Mischung von Tris-(hydroxy- Chemikalien in den angegebenen Mengen eingesetzt:
methyl)-aminomethan und seinem Sulfat-Salz, Am- 5 L.Asparaginsäure 220 bis 260 g
momumsulfatundAthylendiamintetraessigsaure-tetra- «-Ketoglutarsäure . . 50 bis 60 g
natriumsalz . Dinatriumhydrogen-
Em trockenes lyophilisiertes Pulver wird her- phoSphat 200 bis 600 g
gestellt, das die Malat-Dehydrogenase (MDH) enthalt. Natriumcarbonat 140 bis 280 g
Hierzu werden die folgenden Chemikalien in den io Mannit 800 bis 2000 ε
angegebenen Mengen eingesetzt: DPNH ........../.... 6 bis 8 g
Malat-Dehydrogenase ... 3 bis 6 · 106 Einheiten ,«ei-· u ·
Gummiarabicum 2 bis 10 g Lyophilisiertes Pulver .8 bis 20 · 10« Einheiten
Tris-EDTA Puffer 1 bis 4 ml Die !--Asparaginsäure, «-Ketoglutarsäure, das Di-
15 natriumhydrogenphosphat, das Natriumcarbonat und
Das Gummiarabikum wird in etwa 50 ml Wasser Mannit werden vermischt und 6 bis 10 Stunden in
gelöst. Diese Lösung wird anschließend mit der Malat- einer Kugelmühle zu einem feinen Pulver vermählen.
Dehydrogenase-Lösung und der. Tris-EDTA-Lösung Eine Probe der Mischung von etwa 100 mg wird in
vermischt. Hierauf wird die Lösung gefroren und so ungefähr 5 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert dieser
lange unter vermindertem Druck gehalten, bis jegliche, so Lösung liegt zwischen 7,4 und 7,6. Wenn der pH-Wert
Feuchtigkeit entfernt ist. Dabei entsteht ein trockenes zu niedrig ist, wird eine passende Menge an Natrium-
lyophilisiertes Pulver, welches das Enzym Malat- carbonat zugesetzt, um ihn anzuheben. Ist der pH-
Dehydrogenase zusammen mit Stabilisatoren enthält, Wert zu hoch, werden weitere L-Asparaginsäure und
deren Wirkung darin besteht, die Aktivität der Malat- «-Ketoglutarsäure zugefügt. Das Vermählen in der
Dehydrogenase auf der gewünschten Höhe zu halten. 25 Kugelmühle wird, falls nötig, wiederholt und das
\ Das lyophilisierte Pulver, das die Malat-Dehydroge- Pulver anschließend bei 40° C im Vakuum über
nase enthält, wird getestet, um die Aktivität des Phosphorpentoxid getrocknet.
Enzyms Malat-Dehydrogenase zu bestimmen. Hierzu Die vorgenannten Pulver werden vermischt, um
wird ein Reagens verwendet, in dem die folgenden einen pH-Wert im gewünschten Bereich sicherzustellen.
Chemikalien der angegebenen Mengen enthalten sind: 30 Das DPNH und die errechnete Menge des lyophilisierten
Pulver, welches Malat-Dehydrogenase enthält,
Oxalessigsäure, 1 mg/ml 0,1 ml wjrd zur Mischung gegeben. Es wird soviel DPNH
DPNH, 2 mg/ml 0,1 ml zugesetzt, daß ein Zehntausendstel der resultierenden
Phosphat-Puffer, 0,1 m, pH 7,5 2,7 ml Mischung gelöst in 3 ml Wasser bei 340 Millimicron
35 eine optische Dichte von 0.8 bis 1,0 ergibt, was
Die genannten Lösungen werden vermischt zu einem praktisch für die Messung ist. Diese Mischung wird
flüssigen Reagens, mit dessen Hilfe der Test ausgeführt anschließend in einer Kugelmühle gemahlen,
werden kann. Eine passende Menge des lyophilisierten Das erhaltene Pulver wird in eine Vielzahl von
Pulvers, welches das Enzym Malat-Dehydrogenase Einheitsmengen geteilt. Jede reicht aus, um ein flüssiges
enthält, wird in Wasser gelöst. Man verwendet 20 mg 40 Reagens zur Durchführung eines Testes einer Probe
des Pulvers auf etwa 20 ml Wasser. Ungefähr 0,02 ml zu ergeben. Jede Einheit wird dann in einen passenden
dieser Lösung werden nun mit dem Reagens vereinigt. Behälter wie eine Kapsel gefüllt. Bei Verwendung einer
Im gleichen Moment wird die Umwandlung von Gelatinekapsel wird zusammen mit der Kapsel ein
DPNH in DPN beginnen. Die Lösung wird in ein Trockenmittel wie Aluminiumoxid verwendet. Es ist
geeignetes Spektralphotometer gestellt und die optische 45 wünschenswert, daß stets gleich große Kapseln ver-
Dichte im Reagens nach passenden Zeitabschnitten, wendet werden, unabhängig von welcher Charge die
z. B. nach jeder Minute, gemessen. Nach mehreren Kapsel hergestellt°wurde.
Ablesungen wird ein Mittelwert gebildet, der die Um eine der Kapseln zu einer Glutamat-Oxalacetat-
Aktivität der Malat-Dehydrogenase im lyophilisierten Transaminase-(GOT)-Bestimmung zu verwenden, wird
Pulver anzeigt. Die Änderung der optischen Dichte 50 zunächst eine Probe eines Serums oder einer anderen
von 0,001 pro Minute bedeutet eine Aktivität von biologischen Flüssigkeit von passender Größe bereitet.
1 Einheit. Daraus wird die Menge an lyophilisiertem, Eine gemäß diesem Beispiel hergestellte Kapsel wird
Malat-Dehydrogenase enthaltenden Pulver berechnet, in einer passenden Menge Wasser gelöst. Das flüssige
die einer Aktivität zwischen 8 und 20 · 10* Einheiten Reagens wird mit der. Testprobe vermischt. Die
entspricht. 55 folgenden Reaktionen laufen ab:
a-Ketoglutarat + Aspartat G0T > Glutamat + Oxalacetat
Oxalacetat + DPNH MDH > Malat +DPN
Oxalacetat + DPNH MDH > Malat +DPN
Da a-Ketoglutarat, Asparaginsäure und Malat- DPNH in DPN überführt werden. Die Probe wird in
Dehydrogenase in der Kapsel im Überschuß angeboten ein geeignetes Spektralphotometer gestellt und die
sjnd, wird die Geschwindigkeit der genannten Reak- optische Dichte bei 230 Millimicron gemessen. Dationen
nur durch die Aktivität der Glutamat-Oxal- 65 durch kann die Geschwindigkeit bestimmt werden,
acetat-Transaminase (GOT), die ursprünglich vorlag, mit der DPNH umgewandelt wird. Hieraus kann
begrenzt werden. Proportional zur Aktivität der wiederum die Aktivität der Glutamat-Oxalacetat-
ursprünglich vorhandenen Aktivität der GOT wird Transaminase berechnet werden.
Claims (1)
- Patentanspruch:Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der GIutamat-Oxalacetat-Transaminase in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus Asparaginsäure und «-Ketoglutarsäure als Substrate, Malat-Dehydrogenase (MDH) als Enzym, Diphosphoryridinnucleotid in reduzierter Form (DPNH) als Coenzym sowie einem Alkaliphosphat als Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es in trokkener Form vorliegt und zusätzlich a) Gummiarabicum, Äthylendiamintetraessigsäure-tetranatriumsalz, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und sein Sulfat und Ammoniumsulfat sowie b) Mannit enthält.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56175766 | 1966-06-30 | ||
| DEC0042756 | 1967-06-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1598325C true DE1598325C (de) | 1973-08-02 |
Family
ID=
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