DE1598214C

DE1598214C - Process for the simultaneous implementation of chromatographic analyzes on several columns, in particular of mixtures of amino acids and similar substances

Info

Publication number: DE1598214C
Application number: DE19651598214
Authority: DE
Inventors: Jiri Dr.-Ing. Prag Hrdina
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1964-05-04
Filing date: 1965-04-30
Publication date: 1973-09-06

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung chromatographischer Analysen auf mehreren Kolonnen, insbesondere von Gemischen von Aminosäuren und ähnlichen Stoffen, bei welchem die Eluentenflüssigkeit aus Behältern gemeinsam für die Koionnen abgepumpt und auf die Kolonnen verteilt wird.The invention relates to a method for simultaneously performing chromatographic analyzes on several columns, especially of mixtures of amino acids and similar substances, in which the eluent liquid is pumped out of the container and pumped up together for the Koionnen the columns are distributed.

Es sind Verfahren bekannt, die es ermöglichen, mehrere chromatographische Trennungen von Gemischen von Aminosäuren oder ähnlichen Stoffen in einem Tag durchzuführen. So ist es z. B. möglich, drei Doppelanalysen dadurch durchzuführen, daß die Muster nacheinander in eine klassische Dreierkolonne gebracht werden, wobei eine kürzere Kolonne für das Trennen der basischen Aminosäuren und die zwei weiteren gleichen Kolonnen für das Trennen der Säuren und neutralen Aminosäuren bestimmt sind. Wenn die eine dieser Kolonnen in Funktion ist, wird die andere regeneriert und umgekehrt. Processes are known which make it possible to carry out several chromatographic separations of mixtures of amino acids or similar substances in one day. So it is B. possible to carry out three double analyzes by placing the samples one after the other in a classic column of three be brought, with a shorter column for separating the basic amino acids and the other two equal columns for separating the acids and neutral amino acids are determined. When one of these columns is in operation, the other is regenerated and vice versa.

Es ist auch ein Verfahren bekannt, bei welchem die Eluentenflüssigkeit aus Behältern abgepumpt und auf eine Mehrzahl von Kolonnen verteilt wird. Dabei ist für jede Kolonne eine eigene Pumpe vorgesehen, deren Eingänge die Leitung für die Eluentenflüssigkeit anzapfen. Es wird dadurch eine gleichzeitige, kontinuierliche Trennung in mehreren Kolonnen möglich, was insbesondere dann von Vorteil ist, wenn die Trennprozesse auf den einzelnen Kolonnen nicht beschleunigt werden können und mehrere Stunden oder gar Tage in Anspruch nehmen. Die aus den Koionnen austretenden Eluate werden jeweils in bestimmter Menge in Dosierbehältern eines Verteilers gesammelt, wobei die Dosierbehälter, wenn sie gefüllt sind, nacheinander für die Auswertung entleert werden, die dann auch nacheinander erfolgt.A method is also known in which the eluent liquid is pumped out of containers and is distributed to a plurality of columns. A separate pump is provided for each column, whose inputs tap the line for the eluent liquid. This creates a simultaneous continuous separation in several columns is possible, which is particularly advantageous when the separation processes on the individual columns cannot be accelerated and take several hours or even take days. The eluates emerging from the Koionnen are each in certain Amount collected in the metering containers of a distributor, the metering containers when filled are emptied one after the other for the evaluation, which then also takes place one after the other.

Nachteilig bei den bekannten Verfahren ist es, daß zur präzisen Trennung für jede Kolonne eine Präzisionspumpe erforderlich ist, wobei zur Erzielung genauer Vergleichswerte und Ausgangsgrößen die Kennwerte sämtlicher Pumpen aufeinander 'abzustimmen sind. Da eine solche Abstimmung in den meisten Fällen nicht mit der gewünschten Genauigkeit erzielt werden kann, leidet die Genauigkeit der Analyse.The disadvantage of the known methods is that a precision pump is used for precise separation for each column is required, with the Characteristic values of all pumps are to be coordinated. Since such a vote in the Most cases cannot be achieved with the desired accuracy, the accuracy of the suffers Analysis.

Für die Unterscheidung der einzelnen Komponenten von Gemischen von Eiweißstoffhydrolysaten oder großen Peptiden kommt es auf ein sehr genaues Arbeiten an, was für derartige Analysen auch dadurch beeinflußt wird, daß eine Reihe von Faktoren meist nicht mit genügender Genauigkeit bei konstanten Werten gehalten werden können. So z. B. ist dasFor the differentiation of the individual components of mixtures of protein hydrolysates or For large peptides, it is important to work very precisely, which is also why such analyzes It is influenced that a number of factors usually not with sufficient accuracy at constant Values can be held. So z. B. is that

ίο Auswertungsreagens für diese Analysentypen, ein komplexes Ninhydrinreagens, sehr empfindlich gegen Licht, gegen die Berührung mit Luft und ähnlichem, so daß es nicht als Reagens mit beständigen Eigenschaften betrachtet werden kann. Wie bei der Durchführung von Analysen festgestellt wurde, ist eine häufige Quelle von Betriebsungenauigkeiten der Verlauf der farbbildenden Reaktion des Eluats; aber auch die Schwankung des barometrischen Drucks wird gewöhnlich nicht in Betracht gezogen. Eine weitere Quelle von Ungenauigkeiten ist die Durchrlußgeschwindigkeit des Eluats, die von den Eigenschaften der Pumpe und ihrer Antriebsmotore abhängig ist.ίο evaluation reagent for these types of analysis complex ninhydrin reagent, very sensitive to light, to contact with air and the like, so that it cannot be considered a reagent with stable properties. As with the implementation A common source of operational inaccuracies is history the color-forming reaction of the eluate; but also the fluctuation in barometric pressure is usually not taken into account. Another source of inaccuracy is flow rate of the eluate, which depends on the properties of the pump and its drive motors is.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der eingangs erwähnten Art zu schaffen, bei welchem mit möglichst geringem Aufwand eine große Analysengenauigkeit erzielt wird.The object of the invention is to create a method of the type mentioned at the outset, in which with A high level of analytical accuracy is achieved with as little effort as possible.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Eluentenflüssigkeit periodisch während der gleichzeitigen Trennung in den Kolonnen auf diese verteilt wird.This object is achieved according to the invention in that the eluent liquid periodically during the simultaneous separation in the columns is distributed among them.

' Es läuft somit in mehreren Kolonnen die Trennung gleichzeitig ab, wobei der den Kolonnen gemeinsame Eluent mit derselben,- den Kolonnen gemeinsamen Pumpe gefördert und über einen hinter der Pumpe angeordneten hydraulischen Schalter periodisch auf die einzelnen Koionnen verteilt wird. Da der Eluent für sämtliche Kolonnen mit derselben Pumpe gefördert wird, sind für sämtliche Kolonnen gleiche Ausgangsgrößen gegeben, was der Vergleichsgenauigkeit zugute kommt. Dabei ist eine unterbrochene Zuführung des Eluenten während des jeweiligen Trennprozesses unschädlich, wenn die Unterbrechungsperioden kurz genug sind. Die Unterbrechungspulse können dann automatisch durch die vorhandene Elastizität der Rohrleitungen oder durch die Kolonne selbst unterdrückt werden.The separation thus takes place simultaneously in several columns, the one common to the columns Eluent is conveyed with the same pump common to the columns and via one behind the pump arranged hydraulic switch is periodically distributed to the individual Koionnen. Since the eluent is conveyed with the same pump for all columns, the output variables are the same for all columns given, which benefits the comparison accuracy. There is an interrupted feed of the eluent is harmless during the respective separation process if the interruption periods are short enough. The interruption pulses can then automatically through the existing elasticity of the pipelines or through the column be suppressed.

Eine von den Analysen kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Vorteil zur Analyse des Standardmusters dienen, welches durch sein Ergebnis mit hoher Genauigkeit die einzelnen Koeffizienten bestimmt, die zur Auswertung der einzelnen Komponenten erforderlich sind. Die Parameter können in genügend breiten Grenzen schwanken, ohne daß dies einen besonderen Einfluß auf die analytische Genauigkeit des Resultats hätte. Hieraus geht der wesentliche Vorteil hervor, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren die Einrichtung zur Einhaltung der einzelnen Betriebsparameter wesentlich einfacher und billiger durchgeführt werden kann. Im Falle, daß es nicht auf einen besonders hohen Genauigkeitsgrad ankommt, kann eine Kontrollanalyse mit einem Standardmuster bekannter Zusammensetzung entfallen. Ein weiterer Vorteil einer gemeinsamen Pumpe für mehrere Kolonnen besteht darin, daß Präzisionspumpen eingespart werden können, die bei bekannten Verfahren zur gleichzeitigen Trennung in mehreren Kolonnen erforderlich sind.One of the analyzes can advantageously be used in the method according to the invention to analyze the Standard pattern are used, which by its result with high accuracy the individual coefficients which are required to evaluate the individual components. The parameters can be set in sufficiently wide limits fluctuate without this having any particular influence on the analytical accuracy of the result would have. This has the essential advantage that the method according to the invention provides the means for compliance the individual operating parameters can be carried out much easier and cheaper. In case that If a particularly high degree of accuracy is not required, a control analysis with a standard sample can be used known composition are omitted. Another benefit of a common pump for several columns is that precision pumps can be saved, those in known Process for simultaneous separation in several columns are required.

In einer Ausgestaltung der.Erfindung wird bei einem Analyseverfahren, bei welchem die aus den Kolonnen ausgetretenen Eluate getrennt voneinander mit einem einheitlichen Auswertungsreagens periodisch vermischt und ausgewertet werden, vorgeschlagen, daß das Auswertungsreagens auf die Eluate während ihrer gleichzeitigen Zuführung zur Auswertungsstation periodisch verteilt wird. Auch hierzu braucht nur eine einzige gemeinsame Pumpe vorgesehen zu sein, durch welche das Auswertungsreagens zu den kapillaren Leitungen und den weiteren Einrichtungen, welche zur Auswertung der Eluate bestimmt sind, gepumpt wird.In one embodiment of the invention, in an analysis method in which the from the Columns of leaked eluates are periodically separated from one another with a uniform evaluation reagent mixed and evaluated, suggested that the evaluation reagent on the eluates is periodically distributed during their simultaneous delivery to the evaluation station. Also on this only a single common pump needs to be provided through which the evaluation reagent to the capillary lines and the other facilities that are used to evaluate the eluates are intended to be pumped.

Ein Beispiel für eine Einrichtung zur praktischen Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt.An example of a device for practicing the method according to the invention is shown in the drawing.

Eine Pumpe Pv fördert aus nicht eingezeichneten Behältern eine oder mehrere Pufferlösungen, die als Eluenten verwendet werden. Die Zuleitung zu den einzelnen Kolonnen Vl bis V 4 wird durch einen Mehrweghahn Kv beherrscht. Vor den Kolonnen V 1 bis V 4 sind gegebenenfalls Dosiereinrichtungen Dl bis D 4 angeordnet. Die Pumpe Pv kann als einfache Pumpe ausgeführt sein, die aus den einzelnen Behaltern so fördert, daß ein mehrfacher Sprunggradient, der für die Elutionschromatographie geeignet ist, gebildet werden kann. An Stelle eines Sprunggradienten kann auch ein kontinuierlicher Gradient durch Verwendung an sich bekannter Mischer gebildet werden, oder durch Verwendungeines Pumpaggregats, durch welches ein beliebig wählbarer Gradient gebildet werden kann.A pump Pv delivers one or more buffer solutions, which are used as eluents, from containers not shown. The feed line to the individual columns Vl to V 4 is controlled by a multi-way valve Kv . In front of the columns V 1 to V 4, metering devices D1 to D 4 are optionally arranged. The pump Pv can be designed as a simple pump which delivers from the individual containers in such a way that a multiple jump gradient which is suitable for elution chromatography can be formed. Instead of a step gradient, a continuous gradient can also be formed by using mixers known per se, or by using a pump unit, by means of which any gradient that can be selected as desired can be formed.

Jede der Kolonnen Vl bis V 4 hat unter ihrem kapillarem Austritt einen normalen Dreiweghahn d\ bis i/4, durch den der Ausfluß aus der Kolonne W 1 bis V 4 entweder in den Abfall oder in zugehörigen Reaktoren KR 1 bis KR 4 geschaltet werden kann. Zwischen den Hähnen d\ bis ά,χ und den kapillaren Reaktoren KR 1 bis KR 4 sind in die zugehörige kapillare Leitung Röhren angeschlossen, die zu den einzelnen Austritten eines Hahns Kn führen. Der Hahn Kn schaltet periodisch und schrittweise die Förderung der Pumpen Pn um, wobei es von Vorteil ist, daß die einzelnen Schritte des Hahns Kn im Rhythmus des schrittweisen Umschaltens des Mehrweghahns Kv verlaufen.Each of the columns Vl to V 4 has a normal three-way valve d \ to i / 4 under its capillary outlet, through which the outflow from the column W 1 to V 4 can be switched either to the waste or in associated reactors KR 1 to KR 4 . Between the taps d \ to ά, χ and the capillary reactors KR 1 to KR 4, tubes are connected in the associated capillary line, which lead to the individual outlets of a tap Kn . The tap Kn switches over the delivery of the pumps Pn periodically and step by step, it being advantageous that the individual steps of the tap Kn run in the rhythm of the step-by-step switching of the multi-way tap Kv .

Die einzelnen kapillaren Reaktoren KR 1 bis KR 4 sind im gleichen Bade in einem Gefäß N angeordnet, das diese auf konstanter Temperatur hält. Man erhält die Temperatur durch einen Tauchsieder oder durch Heizen des Gefäßes N von unten. Das Bad im Gefaß N kann ebenfalls nahe von 100° C mit den bekannten thermostatischen Einrichtungen gehalten werden, wobei mit Vorteil eine Flüssigkeit verwendet wird, deren Siedepunkt wesentlich höher ist als 100° C und die möglichst wenig verdampft, wie zum Beispiel Glyzerin.The individual capillary reactors KR 1 to KR 4 are arranged in the same bath in a vessel N which keeps them at a constant temperature. The temperature is obtained by an immersion heater or by heating the vessel N from below. The bath in the vessel N can also be kept close to 100 ° C with the known thermostatic devices, with advantage being used a liquid whose boiling point is significantly higher than 100 ° C and which evaporates as little as possible, such as glycerine.

Die Flüssigkeit aus den einzelnen Reaktoren f· KR 1 bis KR 4 wird zugehörigen Küvetten F 1 bis F 4 zugeführt, die mit den gleichen geometrischen und optischen Parametern ausgeführt sind. Jeder der Ausflüsse aus den einzelnen Küvetten F I bis F 4 kann mit einem Durchflußmesser B versehen sein. Ein hydraulischer Schalter H schaltet die Ausläufe der einzelnen Küvetten Fl bis F 4 so um. daß jeder Auslauf auf den Durchflußmesser B geschaltet werden kann, wobei die übrigen Ausläufe direkt zum Abfall geschaltet sind. Auf diese Art kann die Geschwindigkeit in jedwedem der Kreise gemessen werden, die den einzelnen Kolonnen V 1 bis V 4 zugehören.The liquid from the individual reactors f · KR 1 to KR 4 is fed to associated cuvettes F 1 to F 4, which are designed with the same geometric and optical parameters. Each of the outflows from the individual cuvettes FI to F 4 can be provided with a flow meter B. A hydraulic switch H switches the outlets of the individual cuvettes F1 to F 4. that each outlet can be switched to the flow meter B , with the remaining outlets being switched directly to waste. In this way, the speed can be measured in any of the circles belonging to the individual columns V 1 to V 4.

Jede der Küvetten Fl bis F 4 ist in einem besonderen photometrischen Kanal, der gestrichelt durch die optische Achse angezeigt ist, angeordnet. Auf dieser Achse liegen auch die Lichtquelle und Elemente £ I bis £ 4 für das Messen des durch die Küvetten durchgelaufenen Lichtflusses.Each of the cuvettes F1 to F 4 is arranged in a special photometric channel, which is indicated by dashed lines through the optical axis. The light source and elements £ 1 to £ 4 for measuring the light flux that has passed through the cuvettes are also located on this axis.

Die Lichtquellen für die einzelnen Kanäle können verschieden sein oder es kann eine einzige Lichtquelle bei geeigneter Anordnung der Kanäle verwendet werden. Diese Anordnung hat den Vorteil dann, wenn für das Messen eine relative Kompensationsmethode verwendet wird. Eine Schreibvorrichtung bzw. Registrierapparat Z kann in diesem Falle so ausgebildet sein, daß ihr servomotorisches System zur Ausbildung einer Kompensationseinrichtung verwendet werden kann, die lediglich auf das Verhältnis der Lichtflüsse empfindlich ist. Der Registrierapparat Z kann als Mehrpunkteinrichtung ausgebildet sein, die nacheinander zu den Kreisen der einzelnen Kanäle verbindet und die in diesen Kanälen gemessenen Werte· aufzeichnet. Der Registrierapparat Z kann auch als Vielfachlinienschreiber mit der Möglichkeit der direkten Messung integraler Werte ausgeführt sein, die dem Inhalt der einzelnen Komponenten in den analysierten Gemischen proportional sind.The light sources for the individual channels can be different or there can be a single light source can be used with a suitable arrangement of the channels. This arrangement has the advantage when a relative compensation method is used for the measurement. A writing device or registration apparatus Z can in this case be designed so that its servomotor System for the formation of a compensation device can be used, which only on the Ratio of light fluxes is sensitive. The registration apparatus Z can be used as a multipoint device be formed, which successively connects to the circles of the individual channels and which in values measured by these channels. The recorder Z can also be used as a multi-line recorder with the possibility of direct measurement of integral values corresponding to the content of the individual components in the analyzed mixtures are proportional.

Die ganze Einrichtung kann so angeordnet sein, daß immer Teilgruppen gemeinsam für eine Reihe von Kolonnen bei ihrem gleichzeitigen Lauf verwendet werden können. Auf der Zeichnung sind die einzelnen chromatographischen Kolonnen V I bis V 4 als wirklich einfache und einzelne Kolonnen angezeigt. Das Verfahren und die Einrichtung gemäß der Erfindung kann auch für zwei oder mehrere Kolonnenprozesse unter der Voraussetzung der AnWendung von mehreren hydraulischen Schaltern verwendet werden.The entire device can be arranged in such a way that subgroups can always be used together for a series of columns while they are running at the same time. In the drawing, the individual chromatographic columns VI to V 4 are shown as really simple and individual columns. The method and the device according to the invention can also be used for two or more column processes, provided that several hydraulic switches are used.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patent claims:

1. Method for performing chromatographic analyzes on several at the same time Columns, especially of mixtures of amino acids and similar substances, in which ' the eluent liquid is pumped out of the containers together for the columns and onto the columns is distributed, characterized in that that the eluent liquid after pumping out periodically during the simultaneous Separation in the columns is distributed to this.

2. The method according to claim 1, wherein the eluates which have emerged from the columns are separated periodically mixed with each other with a uniform evaluation reagent and evaluated are, characterized in that the evaluation reagent on the eluates during their simultaneous delivery to the evaluation station is periodically distributed.