DE1229483B

DE1229483B - Process for the production of itaconic acid by aerobic submerged fermentation

Info

Publication number: DE1229483B
Application number: DEM49543A
Authority: DE
Inventors: Mario Batti; Leonard B Schweiger
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1960-07-01
Filing date: 1961-06-30
Publication date: 1966-12-01

Description

Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch aerobe Submersfermentation Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch aerobe Submersfermentation von Kohlehydraten.Process for the production of itaconic acid by aerobic submerged fermentation The invention relates to a process for the production of itaconic acid by aerobic means Submerged fermentation of carbohydrates.

Itaconsäure ist zusammen mit Citraconsäure und Mesaconsäure durch Pyrolyse von Citronensäure hergestellt worden. Man hat sie auch durch Kohlendioxydabspaltung aus cis-Aconitsäure hergestellt, indem man eine wäßrige Lösung dieser Säure zum Sieden erhitzte. Die Herstellung von Itaconsäure durch Gärung ist von verschiedenen Forschern beschrieben worden. Als erster schrieb K i n o s h i t a die Bildung von Itaconsäure einem Organismus zu, den er Aspergillus itaconicus nannte . (vgl. K i n o s h i t a, Acta Phytochimica, 5 [1931], S. 271). Später fanden Calam,OxfordundRaistrick,daßItaconsäure durch Fermentation mit Aspergillus terreus isoliert werden kann (vgl. C. T. C a 1 a m, A. E. O x f o r d und H. R a i s t r i c k, Biochemical Journal, 33 [1930], S. 1488). Seitdem ist die Herstellung von Itaconsäure durch Gärung in mehreren Patentschriften beschrieben worden. Die USA.-Patentschrift 2 385 283 beschreibt die Herstellung von Itaconsäure inKohlehydrat-Nährlösungendurch aerobe Submerskultur von Aspergillus terreus. Die USA.-Patentschriften 2 462 981 und 2 657173 beschreiben die Fermentation von verhältnismäßig verdünnten Kohlehydratlösungen. Obwohl bei dem Verfahren der letztgenannten Patentschrift, das sich von den früher bekannten Verfahren nur durch die Anwendung eines höheren pH-Bereiches bis 5,0 unterscheidet, aus ; einer 6,15%igen Zuckerlösung im Verlauf von 74 Stunden eine Itaconsäureausbeute von etwa 67 0/0 erhalten wird, läßt das Verfahren in Anbetracht der hohen Produktionskosten an Wirtschaftlichkeit zu wünschen übrig, weil es mit zu stark verdünnten ; Ausgangslösungen durchgeführt werden muß. _ In einer Veröffentlichung von L. B. L o c k w o o d und M. D. R e e v e s in »Arch. Biochem.<c; 6 (1945), S.455, wird die Wirkung verschiedener Spurenelemente auf die Itaconsäuregärung untersucht. Diese , Autoren berichten, daß Ionen von Mangan, Kupfer, Kobalt, Molybdän, Nickel, Chrom, Gallium oder Borsäure, wenn sie dem Fermentationsmedium bei anfänglichen pH-Werten von 2,0, 2,5 und 3,0 zugesetzt wurden, das Wachstum des Itaconsäure erzeugenden , Mycels oder die Bildung von Itaconsäure nicht vermehrten. Sie fanden jedoch, daß bei einem niedrigen pH-Wert von etwa 2,0 sowohl Eisen als auch Zink, jedes für sich, eine Erhöhung der Itaconsäurebildung bewirkten. Ferner beobachteten sie, daß die Wirkung ; dieser beiden Ionen nicht additiv war und daß bei Herabsetzung der anfänglichen Acidität auf einen pH-Wert von 3,0 zwar ein überreichliches Wachstum des Pilzes stattfand, jedoch nur sehr wenig Itaconsäure gebildet wurde. Man hat sich offenbar bisher noch nicht bemüht, die Itaconsäureerzeugung durch sorgfältige Regelung der Konzentration verschiedener Spurenelemente zu steuern.Itaconic acid is done along with citraconic acid and mesaconic acid Citric acid pyrolysis has been produced. They are also obtained by splitting off carbon dioxide prepared from cis-aconitic acid by adding an aqueous solution of this acid to the Boiling heated. The production of itaconic acid by fermentation is of various kinds Has been described by researchers. K i n o s h i t a was the first to write the formation of Itaconic acid to an organism he called Aspergillus itaconicus. (see K i n o s h i t a, Acta Phytochimica, 5 [1931], p. 271). Later Calam, Oxford, and Raistrick found that itaconic acid can be isolated by fermentation with Aspergillus terreus (cf. C. T. C a 1 a m, A. E. O x f o r d and H. R a i s t r i c k, Biochemical Journal, 33 [1930], P. 1488). Since then, the production of itaconic acid by fermentation is in several patents has been described. U.S. Patent 2,385,283 describes the preparation of itaconic acid in carbohydrate nutrient solutions by submerged aerobic culture of Aspergillus terreus. U.S. Patents 2,462,981 and 2,657,173 describe fermentation of relatively dilute carbohydrate solutions. Although in the procedure of the the latter patent, which differs from the previously known method only by the use of a higher pH range up to 5.0 differs from; a 6.15% Sugar solution had an itaconic acid yield of about 67% over the course of 74 hours is obtained, the process is economically viable in view of the high production cost much to be desired because it is too diluted with; Starting solutions carried out must become. _ In a publication by L. B. L o c k w o o d and M. D. R e e v e s in »Arch. Biochem. <C; 6 (1945), p.455, the effect is different Trace elements examined for itaconic acid fermentation. These authors report that ions of manganese, copper, cobalt, molybdenum, nickel, chromium, gallium or boric acid, when added to the fermentation medium at initial pH values of 2.0, 2.5 and 3.0 added, itaconic acid producing, mycelium growth or formation not increased by itaconic acid. However, they found that at a low pH from about 2.0 both iron and zinc, each individually, an increase in itaconic acid production caused. They also observed that the effect; these two ions do not was additive and that when the initial acidity was reduced to a pH value of 3.0, the fungus grew excessively, but only very much little itaconic acid was formed. Apparently no one has tried to itaconic acid production by carefully controlling the concentration of various Control trace elements.

Es wurde nun gefunden, daß es bei Anwendung von Nährmedien, die Erdalkahionen und Ionen bestimmter Spurenelemente in bestimmten Konzentrationen enthalten, gelingt, Itaconsäure durch aerobe Submersfermentation aus wesentlich konzentrierteren Zuckerlösungen zu erzeugen, als es bisher möglich war, wodurch bedeutende wirtschaftliche Vorteile erzielt werden.It has now been found that when nutrient media are used, the alkaline earth ions and contain ions of certain trace elements in certain concentrations, Itaconic acid through aerobic submerged fermentation from much more concentrated sugar solutions than was previously possible, creating significant economic benefits be achieved.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch aerobe Submersfermentation eines hierfür übliche Nährstoffe enthaltenden Nährmediums mittels Aspergillus ' terreus ist dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium eine auf Saccharose berechnete Zuckerkonzentration von etwa 10 bis 25 Gewichtsprozent, eine Konzentration an Erdalkaliionen von etwa 350 bis 3500 Teilen je Million und eine Konzentration an Kupfer- und/oder Zinkionen von etwa 0,5 bis 200 Teilen je Million aufweist.The inventive method for the preparation of itaconic acid by aerobic submerged fermentation of a nutrient medium containing the usual nutrients means Aspergillus' terreus is characterized in that the nutrient medium is a Sugar concentration calculated on sucrose of about 10 to 25 percent by weight, an alkaline earth ion concentration of about 350 to 3500 parts per million and a concentration of copper and / or zinc ions of about 0.5 to 200 parts each Million.

In einer vorzugsweisen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Konzentration des Nährmediums an Kupfer- und Zinkionen je etwa 1 bis 50 Teile je Million.In a preferred embodiment of the method according to the invention the concentration of copper and zinc ions in the nutrient medium is approximately 1 to 50 parts per million.

In weiterer Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens wird die Konzentration an Kupfer- und/oder Zinkionen während des ganzen Verlaufs der Gärung auf 0,5 bis 200 Teile je Million gehalten.In a further embodiment of the present method, the concentration on copper and / or Zinc ions throughout the fermentation process held at 0.5 to 200 parts per million.

Durch diese höheren Zuckerkonzentrationen im Ausgangsgut wird es möglich, die Produktionskosten je Gewichtseinheit an Itaconsäure gegenüber den Produktionskosten des Verfahrens gemäß der USA.-Patentschrift 2 657173, bei dem die Zuckerkonzentration im Fermentationsmedium höchstens 7 Gewichtsprozent betragen darf, um etwa 40 0/0 zu senken.These higher sugar concentrations in the starting material make it possible the production costs per unit weight of itaconic acid versus the production costs of the method according to US Pat. No. 2,657,173, in which the sugar concentration in the fermentation medium may not exceed 7 percent by weight, around 40 0/0 to lower.

Die Wasserstoffionenkonzentration des Fermentationsmediums wird gewöhnlich auf einen pH-Wert oberhalb 3,0, und zwar vorzugsweise im Bereich von etwa 3,0 bis 4,0, eingestellt. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Einstellung des Fermentationsmediums auf den gewünschten pH-Wert ist der Zusatz von gasförmigem Ammoniak. In späteren Verfahrensstufen kann man ebenfalls gasförmiges Ammoniak zusetzen, um den pH-Wert des Fermentationsmediums zu erhöhen. Dieser spätere Zusatz erfolgt gewöhnlich etwa 48 bis 60 Stunden nach der Beimpfung des Fermentationsmediums.The hydrogen ion concentration of the fermentation medium becomes ordinary to a pH above 3.0, preferably in the range from about 3.0 to 4.0, set. An advantageous method of adjusting the fermentation medium The addition of gaseous ammonia is necessary to achieve the desired pH. In later Process steps you can also add gaseous ammonia to adjust the pH to increase the fermentation medium. This later addition is usually made approximately 48 to 60 hours after inoculation of the fermentation medium.

Die Fermentation kann bei jeder gewünschten Temperatur durchgeführt werden. Jedoch sind etwas erhöhte Temperaturen, z. B. 29 bis 35'C, vorzugsweise 32 bis 35°C, günstiger. Die Fermentationsdauer beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gewöhnlich etwa 160 bis 200 Stunden.The fermentation can be carried out at any desired temperature will. However, slightly elevated temperatures, e.g. B. 29 to 35'C, preferably 32 to 35 ° C, cheaper. The fermentation time is in the case of the invention Procedure usually about 160 to 200 hours.

Als Erdalkalüon können z. B. Calciumionen in Form löslicher Calciumsalze, z. B. als Chlorid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Lactat oder Itaconat, zugesetzt werden. Andere Erdalkaliionen, die sich für diesen Zweck eignen, sind Barium, Strontium und Magnesium. Obwohl bereits bekannt ist, daß Magnesium ein notwendiger Nährstoff für das Wachstum des Organismus und die Erzeugung von Itaconsäure ist, hat man bisher nicht erkannt, daß Magnesium in größeren als Spurenmengen die Ausbeuten an Itaconsäure erhöht. Ebensowenig hat man erkannt, daß Calcium, Barium oder Strontium für diesen Zweck verwendet werden können.As alkaline earth z. B. Calcium ions in the form of soluble calcium salts, z. B. as chloride, sulfate, phosphate, nitrate, lactate or itaconate are added. Other alkaline earth ions that are suitable for this purpose are barium, strontium and magnesium. Although it is already known that magnesium is a necessary nutrient for the growth of the organism and the production of itaconic acid, one has so far not recognized that magnesium in larger than trace amounts the yields of itaconic acid elevated. Neither has it been recognized that calcium, barium or strontium are responsible for this Purpose can be used.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Erkenntnis, daß das Fermentationsmedium außer den Erdalkalüonen noch eine minimale Konzentration an Kupferionen, Cu++; und bzw. oder Zinkionen, Zn++, enthalten muß. Auch diese Ionen können in Form von ionisierbaren Salzen der betreffenden Metalle, z. B. als Sulfate, Chloride, Carbonate oder Nitrate, zugesetzt werden. Die Kupfer- und Zinkionen können in wirksamer Weise nicht nur zu Beginn der Gärung, sondern auch zu späteren Zeitpunkten der Fermentation, z. B. 24, 48 oder 60 Stunden nach dem Beginn der Gärung, zugesetzt werden.An important feature of the invention is the finding that the fermentation medium in addition to the alkaline earths, a minimal concentration of copper ions, Cu ++; and or or zinc ions, Zn ++, must contain. These ions can also be ionizable in the form of Salts of the metals concerned, e.g. B. as sulfates, chlorides, carbonates or nitrates, can be added. The copper and zinc ions can not only be effective at the beginning of fermentation, but also at later stages of fermentation, e.g. B. 24, 48 or 60 hours after the start of fermentation, can be added.

Die genaue Konzentration an Kupfer- und bzw. oder Zinkionen im Fermentationsmedium hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, zu denen auch die Eisenkonzentration im Fermentationsmedium gehört. Es ist bekannt; daß Eisen schon in Mengen von etwa 1 Teil je Million die bei der Fermentation erhaltene Itaconsäureausbeute stark beeinträchtigt. Wenn man einem derartigen Fermentationsmedium aber Kupfer oder Zink zusetzt, erhält man sogar in Anwesenheit von Eisen zufriedenstellende Ausbeuten. Es ist aber nicht nur die Konzentration des Kupfers und Zinks in bezug auf die Eisenwenge in dem Medium kritisch, sondern die Konzentration von Eisen, Kupfer und Zink muß auch in bezug auf die Konzentration an Erdalkaliionen, wie Calcium, eingestellt werden. Allgemein findet man, daß bei Anwendung von Erdalkaliionen allein ohne Zusatz von Kupfer- oder Zinkionen keine zufriedenstellende Ausbeute an Itaconsäure erhalten wird. Arbeitet man jedoch mit einer Kombination von Erdalkaliionen, wie Calciumionen, und entweder Kupfer- oder Zinkionen, so erhält man nahezu optimale Ausbeuten. Als Beispiel für die vorteilhafte Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei erwähnt, daß in einem Falle, in welchem der Calciumchloridgehalt des Fermentationsmediums 0,6% betrug/ .und Kupfer-und Zinkionen fortgelassen wurden, die Ausbeute an Itaconsäure aus einer 11,60/0igen Lösung von Invertzucker nach 161stündiger Vergärung 16 Gewichtsprozent betrug. Bei Zusatz von je 1 Teil Kupfer- und Zinkionen je Million wurde bei einer ähnlichen Gärung bei der gleichen Konzentration an Calciumchlorid eine Itaconsäureausbeute von 51,5 Gewichtsprozent erzielt. Wenn andererseits Kupfer- und Zinkionen in einer Konzentration von je 3 Teilen je Million zugesetzt wurden, das Calcium jedoch fortgelassen wurde, so erhielt man aus einer Invertzuckerlösung mit einem Zuckergehalt von 12,840/0 eine Itaconsäureausbeute von: 3,5 Gewichtsprozent. Nach Zusatz von 1,20/0 Caleiumchlorid stieg die Ausbeute auf 47,3 Gewichtsprozent. Man sieht also, daß durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutend bessere Ausbeuten an Itaconsäure erzielt werden können.The exact concentration of copper and / or zinc ions in the fermentation medium depends on a number of factors including the iron concentration in the Fermentation medium belongs. It is known; that iron already in amounts of about 1 Part per million severely affects the itaconic acid yield obtained in fermentation. If one adds copper or zinc to such a fermentation medium, however, one obtains satisfactory yields are obtained even in the presence of iron. But it is not only the concentration of copper and zinc in relation to the iron levels in the medium critical but the concentration of iron, copper and zinc must also be related can be adjusted to the concentration of alkaline earth ions such as calcium. Generally it is found that when using alkaline earth ions alone without the addition of copper or zinc ions, a satisfactory itaconic acid yield is not obtained. Is working however, one is using a combination of alkaline earth ions, such as calcium ions, and either Copper or zinc ions, almost optimal yields are obtained. As an example for the advantageous effect of the method according to the invention should be mentioned that in one Case in which the calcium chloride content of the fermentation medium was 0.6% / .and copper and zinc ions have been omitted, the yield of itaconic acid from a 11.60 / 0 solution of invert sugar after 161 hours of fermentation 16 percent by weight fraud. When adding 1 part each of copper and zinc ions per million, one similar fermentation at the same concentration of calcium chloride, an itaconic acid yield of 51.5 percent by weight achieved. On the other hand, if copper and zinc ions in one Concentrations of 3 parts per million each were added, but the calcium omitted was obtained from an invert sugar solution with a sugar content of 12.840 / 0 an itaconic acid yield of: 3.5 percent by weight. After the addition of 1.20 / 0 calcium chloride the yield increased to 47.3 percent by weight. So you can see that through the application the process according to the invention achieved significantly better yields of itaconic acid can be.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.The following examples are intended to explain the invention in more detail.

Beispiel 1 41 einer geklärten, von Kationen befreiten hochwertigen Siruplösung mit einem Zuckergehalt von 13 0/0, berechnet als Saccharose, werden- mit 0,20/0 NÜ4NH2 C02 - NH@HCOs, 0,10/0 M9S04 - 7 H20, 0,0140/0 KHZPO4, 3 Teilen Zinkionen je Million in Form- von ZnS04 - 7 1120, 3 Teilen Kupferionen je Million in Form von CUS04 ' 5 11,0 und 1,20/0 CaC12 - 2 H20 versetzt. Das Gemisch wird mit einer Suspension von Aspergillus terreus NRRL 1960 beimpft. Das Fermentationsmedium wird während der ersten 24 Stunden mit 1,25 Raumteilen Luft je Minute und danach mit 1,5 Raumteilen Luft je Minute belüftet. Die Fermentation wird 184 Stunden . fortgesetzt. Die bei verschiedenen Anfangs-pH-Werten erzielten Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I Ausbeute Erzeugte an Itaconsäure, Itacon- bezogen auf PH Sporenkeimung säte zuge- ver- führten brauchten Zucker Zucker g o/o* %** 2,49 sehr langsam 136 24,7 95,1 3,05 normal 291 57,8 89,6 3,50 ziemlich schnell 291 57,5 90,4 4,0 schnell 277 55,0 98,9 * g erzeugte Itaconsäure 100g zugeführter Zucker ' ** g erzeugte Itaconsäure 2@ -100. g verbrauchter Zucker 342 Hierbei wird angenommen, daß 1-Mol Hexose oder 0,5 Mol Saccharose 1 Mol Itaconsäure liefert. Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß ein AnfangspH-Wert von mehr als etwa 3 für praktisch brauchbare Itaconsäureausbeuten vorteilhaft ist.Example 1 41 of a clarified, high-quality syrup solution freed from cations with a sugar content of 13%, calculated as sucrose, with 0.20 / 0 NÜ4NH2 C02 - NH @ HCOs, 0.10 / 0 M9S04 - 7 H20.0 , 0140/0 KHZPO4, 3 parts of zinc ions per million in the form of ZnS04 - 7 1120, 3 parts of copper ions per million in the form of CUS04 '5 11.0 and 1.20 / 0 CaC12 - 2 H20. The mixture is inoculated with a suspension of Aspergillus terreus NRRL 1960. The fermentation medium is aerated during the first 24 hours with 1.25 parts by volume of air per minute and then with 1.5 parts by volume of air per minute. The fermentation will last 184 hours. continued. The results obtained at various initial pH values are summarized in Table I. Table I. yield Produced in itaconic acid, Itacon- based on PH spore germination sowed needed led Sugar sugar go / o *% ** 2.49 very slow 136 24.7 95.1 3.05 normal 291 57.8 89.6 3.50 pretty fast 291 57.5 90.4 4.0 fast 277 55.0 98.9 * g itaconic acid produced 1 00 g of added sugar ' ** g itaconic acid produced 2 @ -100. g sugar consumed 342 It is assumed here that 1 mole of hexose or 0.5 mole Sucrose provides 1 mole of itaconic acid. From these values it can be seen that an initial pH greater than about 3 is beneficial for practical itaconic acid yields.

Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung der Eisenkonzentration im Fermentationsmedium auf die Itaconsäureausbeute. Beispiel 2 Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit einem Zuckepehalt von 13,6 °/o Sacchatose. Die Menge an Ammoncarbonat beträgt 0,240/, und der anfängliche pH-Wert 3,2. Nach 138 Stunden wird der pH-Wert durch Zusatz von NH40H wieder auf 3,2 eingestellt. Die Anfangskonzentration an Cu++ und Zn++ beträgt wie im Beispiel 1 je 3 Teile je Million und die Konzentration an Ca+-" in Form von CaC12 - 2 H,0 2700 Teile je Million. Dem Fermentationsmedium werden verschiedene Mengen an Eisen, Fe+++, in Form von FeCl3 6 H20 zugesetzt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II Eisen Erzeugte Itaconsäure Ausbeute in T/M* g Gewichtsprozent** 0 321 57 1 140 25 2 99 17 4 98 17 * T/M = Teile je Million. * * g erzeugte Itaconsäure 100g zugeführter Zucker . Diese Werte zeigen, daß schon Eisenkonzentrationen von nur etwa 1 Teil je Million die Erzeugung von Itaconsäure beeinträchtigen.The following example illustrates the effect of the iron concentration in the fermentation medium on the itaconic acid yield. Example 2 The procedure is as in Example 1, but with a sugar content of 13.6% sacchatose. The amount of ammonium carbonate is 0.240 /, and the initial pH is 3.2. After 138 hours the pH is adjusted to 3.2 again by adding NH40H. The initial concentration of Cu ++ and Zn ++ is as in Example 1 per 3 parts per million and the concentration of Ca + - "in the form of CaC12-2 H, 0.2700 parts per million. The fermentation medium is different amounts of iron, Fe +++, in the form of FeCl3 6 H20 added The results of these experiments are summarized in Table II. Table II Iron Produced Itaconic Acid Yield In T / M * g weight percent ** 0 321 57 1 140 25 2 99 17 4 98 17 * T / M = parts per million. * * g itaconic acid produced 1 00 g of added sugar. These values show that iron concentrations as low as about 1 part per million impair the production of itaconic acid.

Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung von Kupfer und Zink als Gegenmittel gegen den ungünstigen Einfluß des Eisens in dem Fermentationsmedium. Beispiel 3 Man arbeitet nach Beispiel 2, mit dem Unterschied, daß das Fermentationsmedium 13,68 °/o Saccharose enthält und die Konzentrationen an Kupfer- und Zinksalzen verändert werden, wobei einige derselben zu Beginn der Fermentation und einige 20 bis 24 Stunden nach der Beimpfung zugesetzt werden. Die Menge an erzeugter Itaconsäure wird nach 160 Stunden langer Vergärung bestimmt. Die Werte finden sich in Tabelle III. Tabelle IIl Gesamtmenge an Kupfer und Zink Eisen Erzeugte nach 20 bis Itaconsäure zu Beginn 24 Stunden T/M* T/M* T/M* g 0 12 0 269 0 12 0,5 365 0 12 1,5 366 0 12 3 318 3 12 0 213 3 15 0,5 354 3 15 1,5 358 3 15 3 355 * T/M = Teile je Million. Diese Werte zeigen, daß eine Gesamtmenge an Kupfer und Zink von 12 Teilen je Million offenbar nicht ganz ausreicht, um der Anwesenheit von 3 Teilen Eisen je Million entgegenzuwirken, daß aber eine Gesamtmenge von 15 Teilen je Million an Kupfer und Zink ausreichend ist; denn die Itaconsäureerzeugung fällt bei Anwesenheit von 12 Teilen je Million an Kupfer und Zink von 366 g bei einem Eisengehalt von 1,5 Teilen je Million auf 318 g bei einem Eisengehalt von 3 Teilen je Million, während die Itaconsäureerzeugung bei einem Gesamtgehalt an Kupfer und Zink von 15 Teilen je Million auf einem Wert von etwa 350 g bleibt, wenn der Eisengehalt im Bereich von 0,5 bis 3 Teilen je Million variiert.The following example illustrates the action of copper and zinc as antidotes to the adverse influence of iron in the fermentation medium. Example 3 The procedure is as in Example 2, with the difference that the fermentation medium contains 13.68% sucrose and the concentrations of copper and zinc salts are changed, some of them at the start of fermentation and some 20 to 24 hours after inoculation can be added. The amount of itaconic acid produced is determined after fermentation for 160 hours. The values can be found in Table III. Table III total quantity Produced iron in copper and zinc after 20 to itaconic acid at the beginning 24 hours T / M * T / M * T / M * g 0 12 0 269 0 12 0.5 365 0 12 1.5 366 0 12 3 318 3 12 0 213 3 15 0.5 354 3 15 1.5 358 3 15 3 355 * T / M = parts per million. These values show that a total of 12 parts per million of copper and zinc is apparently not quite sufficient to counteract the presence of 3 parts per million of iron, but that a total of 15 parts per million of copper and zinc is sufficient; for itaconic acid production falls in the presence of 12 parts per million of copper and zinc from 366 g with an iron content of 1.5 parts per million to 318 g with an iron content of 3 parts per million, while itaconic acid production with a total content of copper and zinc from 15 parts per million remains to a value of about 350 g when the iron content varies in the range of 0.5 to 3 parts per million.

Das folgende Beispiel erläutert die Beziehung zwischen den Konzentrationen an Kupfer- und Zinkionen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Beispiel 4 Man arbeitet gemäß Beispiel l mit der folgenden Abänderung: Geklärter, von Kationen befreiter hochwertiger Sirup mit einem Gehalt von 11,60/, Saccharose wird als Kohlehydratmedium mit 0,60/, CaC12 2 H20 bei einem pH-Wert von 3,3 verwendet. Die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt 1,25 Raumteile Luft je Minute. Die Konzentrationen an Kupfer und Zink, zugesetzt als Sulfate, werden unabhängig voneinander variiert. Die Ergebnisse für eine Gärung von 161 Stunden Dauer sind in Tabelle IV zusammengestellt. Tabelle IV Zink Kupfer Erzeugte Itaconsäure- Itaconsäure ausbeute in T/M* T/M* g Gewichtsprozent 0 0 74 16 0,5 0 201 43,3 1,0 0 205 44,2 3,0 0 196 42,2 6,0 0 234 50,4 0,5 0,5 257 55,4 1,0 0;5 240 51;7 3,0 0,5 244 52,6 6,0 0,5 257 55,4 0,5 1,0 243 52,4 1,0 1,0 239 51,5 3,0 1,0 241 51,9 6,0 1,0 243 52,4 0,5 2,0 248 53,4 1,0 2,0 247 53,2 3,0 2,0 224 48,2 6,0 2,0 229 49,4 * T/M = Teile je Million. Diese Werte zeigen, daß der Zusatz von Zinkionen allein eine beträchtliche Ausbeuteerhöhung an Itaconsäure bewirkt, daß jedoch in Anwesenheit von Zink-und Kupferionen noch höhere Ausbeuten erzielt werden. Es ist zu bemerken, daß das Verhältnis zwischen den Konzentrationen an Zink- und Kupferionen in ziemlich weiten Bereichen schwanken kann, ohne daß eine wesentliche Wirkung auf die Itacon-Säureausbeute bemerkbar ist, sofern nur eine Mindestkonzentration an Zink- und bzw. oder Kupferionen vorhanden ist.The following example illustrates the relationship between the concentrations of copper and zinc ions in the process of the invention. Example 4 The procedure is as in Example 1 with the following modification: Clarified, high-quality syrup from which cations have been removed with a content of 11.60 /, sucrose is used as a carbohydrate medium with 0.60 /, CaC12 2 H20 at a pH of 3.3 used. The ventilation rate is 1.25 parts of air per minute. The concentrations of copper and zinc, added as sulfates, are varied independently of one another. The results for a fermentation of 161 hours are shown in Table IV. Table IV Zinc Copper Produced Itaconic Acid Itaconic acid yield in T / M * T / M * g weight percent 0 0 74 16 0.5 0 201 43.3 1.0 0 205 44.2 3.0 0 196 42.2 6.0 0 234 50.4 0.5 0.5 257 55.4 1.0 0; 5 240 51; 7 3.0 0.5 244 52.6 6.0 0.5 257 55.4 0.5 1.0 243 52.4 1.0 1.0 239 51.5 3.0 1.0 241 51.9 6.0 1.0 243 52.4 0.5 2.0 248 53.4 1.0 2.0 247 53.2 3.0 2.0 224 48.2 6.0 2.0 229 49.4 * T / M = parts per million. These values show that the addition of zinc ions alone brings about a considerable increase in itaconic acid yield, but that even higher yields are achieved in the presence of zinc and copper ions. It should be noted that the ratio between the concentrations of zinc and copper ions can vary within fairly wide ranges without a significant effect on the itaconic acid yield being noticeable, provided that only a minimum concentration of zinc and / or copper ions is present .

Das folgende Beispiel erläutert die gegenseitige Beziehung zwischen Calciumionen und Kupferionen bei der Herstellung von Itaconsäure. Beispiel 5 Man `ärbeitet nach Beispiel 1 mit einem geklärten, von Kationen befreiten hochwertigen Sirup, der 12,84 °/o Saccharose enthält, und dem 0,014 °/o KH2P04, 0,10/0 M,gSG4 - 7 H20, 0,2 % NH,NH,C02 - NH4HC03 und 3 Teile Zink je Million als ZiiS04 - 7 H20 zugesetzt werden. Die Konzentration an CaC12 - 2 H20 und Kupferionen als CUS04 - 5 H20 wird hierbei variiert. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle V. Tabelle V Kupfer CaCt2 - 2H,0 Erzeugte Ausbeute Itaconsäure in Gewichts- T/M* °/o g Prozent 0,5 0,6 284 58,2 0,5 1,2 277 56,8 1 0 11 2,25 1 0,6 272 55,7 1 1,2 273 55,9 2 0,6 248 50,8 2 1,2 277 56,8 3 0 17 3,5 3 0,6 178 35,5 3 1,2 231 47,3 6 0 18 3,7 6 0,6 164 35,5 6 1,2 154 31,6 9 0 14 2,7 9 0,6 - 103 21,1 9 1,2 124 25,4 12 0 12 2,5 12 0;6 86 17,6 12 1,2 1.15 23,6 * T/M = Teile je Million. Diese Werte zeigen, daß sich bei vollständigem Fortlassen der Calciumionen praktisch keine Itaconsäure bildet. Es wurde bemerkt, daß bei den niedrigsten ' Kupferkonzentrationen das Wachstum ausreichend bis übermäßig war. Der Zusatz größerer Konzentrationen an Kupferionen führte zur Wachstumshemmung und zur Chlamydosporenbildung.The following example illustrates the mutual relationship between calcium ions and copper ions in the production of itaconic acid. Example 5 Work is carried out according to Example 1 with a clarified, high-quality syrup that has been freed from cations and contains 12.84% sucrose, and the 0.014% KH2P04, 0.10 / 0 M, gSG4 - 7 H20.0, 2 % NH, NH, C02 - NH4HC03 and 3 parts zinc per million are added as ZiiS04 - 7 H20. The concentration of CaC12-2 H20 and copper ions as CUS04-5 H20 is varied. The results can be found in Table V. Ta ble V Copper CaCt2-2H, 0 Yield produced Itaconic acid in weight T / M *% og percent 0.5 0.6 284 58.2 0.5 1.2 277 56.8 1 0 11 2.25 1 0.6 272 55.7 1 1.2 273 55.9 2 0.6 248 50.8 2 1.2 277 56.8 3 0 17 3.5 3 0.6 178 35.5 3 1.2 231 47.3 6 0 18 3.7 6 0.6 164 35.5 6 1.2 154 31.6 9 0 14 2.7 9 0.6 - 103 21.1 9 1.2 124 25.4 12 0 12 2.5 12 0; 6 86 17.6 12 1.2 1.15 23.6 * T / M = parts per million. These values show that practically no itaconic acid is formed if the calcium ions are completely omitted. It was noted that at the lowest copper concentrations the growth was sufficient to excessive. The addition of larger concentrations of copper ions led to growth inhibition and the formation of chlamydospores.

Das folgende Beispiel erläutert die Notwendigkeit der Anwesenheit eines zweiwertigen Erdalkalisalzes für die optimale Erzeugung von Itaconsäure. Beispiel 6 Man arbeitet nach Beispiell unter Verwendung eines geklärten, von Kationen befreiten hochwertigen Sirups mit einem Gehalt von 13,6 °/o Zucker, berechnet Kupfer Zink Saccharose Erzeugte Ausbeute Calciumsalz a/o PH Itaconsäure in Gewichts- T/M* T/M* °/o g Prozent . Lactat .................... 0,063 3 3 13,6 3,3 125 23 Lactat . ... ...... ..... . . . .. 0,126 3 3 13,6 3,3 287 53 Itaconat .................. 0,1 48 48 14,2 3,55 300 53 Ca(OH)2.................. 0,054 15 15 12,4 3,5 286 58 Itaconsäure ............... 0,17 Ca(N03)2 - 4 H20 . . . . . . . . . . 0,2 15 15 12,4 3,4 300 60 Ca(H2P04)2 - H20 . . . . . . . . . . 0,1 24 24 11,3 3,4 267 59 CaS04.................... 0,275 48 48 13,4 3,4 313 55 CaS04.... I....... ........ 0,55 48 48 13,4 3,38 318 59 CaC12 - 2 H20 . . . . . . . . . . . . . 0,3 6 6 13,4 3,32 298 56 CaC12 - 2 H20 . . . . . . . . . . . . . 0,6 6 6 13,4 3,27 313 58 * T/M = Teile je Million. als Saccharose. Außerdem enthält das Fermentationsmedium 0,014 °/o KH2P04, 0110/0 M9S04 - 7H,0, 0,2 °/o NH4NHZC02 - NH4HC03 und je 3 Teile Kupfer und Zink je Million in Form von Kupfer- und Zinksulfat. Der pH-Wert beträgt 3,3. Die nach 185 stündiger Gärung gewonnenen Ergebnisse zeigen die Wirkung der Verwendung verschiedener Chloride von einwertigen und zweiwertigen Metallen. Tabelle VI zuge- Erzeugte Ausbeute setztes Itacon- Metallsalz Kation säure Gewichts- Kation g Prozent T/M Keines . . . . . . . . . . . . 0 48 9 CaCl2 - 2 H20 ...... 337 235 43 CaCl2 - 2 H20 ...... 675 263 48 CaC12 - 2 H20 ..... 1350 284 52 CaC12 - 2 H20 ..... 2700 321 59 M9C12 6 H20...... 337 110 20 M9C12 6 H20 ..... 675 169 31 MgC12 - 6 H20 ..... 1350 251 46 M9C12 - 6 H20 ..... 2700 262 48 KCl .............. 337 25 5 KCl .............. 675 21 4 KCl .............. 1350 16 3 KCl .............. 2700 15 3 * T/M = Teile je Million. Diese Werte zeigen, daß sowohl Calciumchlorid als auch Magnesiumchlorid zufriedenstellende Ausbeuten an Itaconsäure liefern, was auf Kaliumchlorid nicht zutrifft. Bei einem ähnlichen Versuch erweist sich auch Natriumchlorid als unwirksam, während Bariumchlorid (BaC12 - 2 H20) zufriedenstellende Ausbeuten an Itaconsäure liefert.The following example illustrates the need for the presence of a divalent alkaline earth salt for optimal production of itaconic acid. EXAMPLE 6 The example is carried out using a clarified, high-quality syrup from which cations have been removed and a sugar content of 13.6%, calculated Copper Zinc Sucrose Produced Yield Calcium salt a / o PH Itaconic acid in weight T / M * T / M *% og percent . Lactate .................... 0.063 3 3 13.6 3.3 125 23 Lactate. ... ...... ...... . . .. 0.126 3 3 13.6 3.3 287 53 Itaconate .................. 0.1 48 48 14.2 3.55 300 53 Ca (OH) 2 .................. 0.054 15 15 12.4 3.5 286 58 Itaconic acid ............... 0.17 Ca (N03) 2-4 H20. . . . . . . . . . 0.2 15 15 12.4 3.4 300 60 Ca (H2P04) 2 - H20. . . . . . . . . . 0.1 24 24 11.3 3.4 267 59 CaS04 .................... 0.275 48 48 13.4 3.4 313 55 CaS04 .... I ........ ....... 0.55 48 48 13.4 3.38 318 59 CaC12-2 H20. . . . . . . . . . . . . 0.3 6 6 13.4 3.32 298 56 CaC12-2 H20. . . . . . . . . . . . . 0.6 6 6 13.4 3.27 313 58 * T / M = parts per million. as sucrose. The fermentation medium also contains 0.014% KH2P04, 0110/0 M9S04 - 7H, 0.2% NH4NHZC02 - NH4HC03 and 3 parts of copper and zinc per million in the form of copper and zinc sulphate. The pH is 3.3. The results obtained after 185 hours of fermentation show the effect of using different chlorides of monovalent and divalent metals. Table VI generated yield set Itacon Metal salt cationic acid weight Cation g percent T / M None. . . . . . . . . . . . 0 48 9 CaCl2 - 2 H20 ...... 337 235 43 CaCl2 - 2 H20 ...... 675 263 48 CaC12 - 2 H20 ..... 1350 284 52 CaC12 - 2 H20 ..... 2700 321 59 M9C12 6 H20 ...... 337 110 20 M9C12 6 H20 ..... 675 169 31 MgC12 - 6 H20 ..... 1350 251 46 M9C12 - 6 H20 ..... 2700 262 48 KCl .............. 337 25 5 KCl .............. 675 21 4 KCl .............. 1350 16 3 KCl .............. 2700 15 3 * T / M = parts per million. These data show that both calcium chloride and magnesium chloride give satisfactory yields of itaconic acid, which potassium chloride does not. In a similar experiment, sodium chloride also proves to be ineffective, while barium chloride (BaC12-2 H20) gives satisfactory yields of itaconic acid.

Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung verschiedener Calciumsalze bei der Herstellung von Itaconsäure. Beispiel ? Man arbeitet nach Beispiel l unter Verwendung eines geklärten, von Kationen befreiten hochwertigen Sirups, der 0,2°/o NH,NH2C02 - NH,HC03, 0,014°/o KH,P04 und 0,10/, MgS04 - 7 H20 enthält. Der pH-Wert beträgt etwa 3,3 bis 3,5. An Stelle des Calciumchlorids werden verschiedene andere Calciumsalze verwendet. Die Mengen an Kupfer- und Zinkionen, der Zuckergehalt des Mediums und der pH-Wert werden ebenfalls verändert. Die Werte sind in Tabelle VII angegeben: Tabelle VII Diese Werte zeigen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verschiedene Calciumsalze verwendet und dabei zufriedenstellende Ausbeuten an Itaconsäure erzielt werden können.The following example illustrates the use of various calcium salts in the production of itaconic acid. Example ? One works according to Example 1 under Use of a clarified high quality syrup, freed from cations, of 0.2% Contains NH, NH2C02 - NH, HC03, 0.014% KH, PO4 and 0.10 /, MgS04 - 7 H20. The pH is about 3.3 to 3.5. Various others are used in place of calcium chloride Calcium salts used. The amounts of copper and zinc ions, the sugar content of the Medium and the pH value are also changed. The values are given in Table VII given: Table VII These values show that in the inventive Process used various calcium salts and thereby satisfactory yields of itaconic acid can be achieved.

Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines einzelnen Calciumsalzes in verschiedenen Konzentrationen mit verschiedenen Konzentrationen an Kupfer- und Zinkionen. Beispiel 8 Man arbeitet nach Beispiel 1 unter Verwendung von Calciumsulfat als Calciumsalz und dem normalen geklärten, von Kationen befreiten hochwertigen Sirup unter Zusatz von 0,2 % NH4NHZC02 - NH4HC03, 0,014°/o KH1P04 und 0,10/, M9S04 - 7H20. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle VIII. Tabelle VIII Erzeugte Ausbeute CaS04 Kupfer Zink Itacon- @ Gewichts- °/o T/M* T/M* g Prozent 0/0 0,27 6 6 221 41,3 0,27 12 12 284 53,1 ' 0,27 24 24 276 51,6 0,27 48 48 293 54,8 0,55 6 6 198 37,0 0,55 12 12 305 57,0 0,55 24 24 285 53,3 0,55 48 48 318 59,4 * T/M = Teile je Million. Diese Werte zeigen, daß der Bedarf des Fermentationsmediums an Calciumionen, der Bedarf an Kupferionen- und der Bedarf an Zinkionen untereinander in Beziehung stehen und daß man mit verschiedenen Konzentrationen an Calciumionen arbeiten kann, wenn die Konzentrationen an Kupfer- und Zinkionen entsprechend eingestellt werden.The following example illustrates the use of a single calcium salt in different concentrations with different concentrations of copper and zinc ions. Example 8 The procedure is as in Example 1 using calcium sulfate as the calcium salt and the normal, clarified, high-quality syrup freed from cations with the addition of 0.2 % NH4NHZC02 - NH4HC03, 0.014% KH1P04 and 0.10 /, M9S04 - 7H20. The results can be found in Table VIII. Table VIII Yield generated CaS04 copper zinc Itacon- @ weight- ° / o T / M * T / M * g percent 0/0 0.27 6 6 221 41.3 0.27 12 12 284 53.1 ' 0.27 24 24 276 51.6 0.27 48 48 293 54.8 0.55 6 6 198 37.0 0.55 12 12 305 57.0 0.55 24 24 285 53.3 0.55 48 48 318 59.4 * T / M = parts per million. These values show that the requirement of the fermentation medium for calcium ions, the requirement for copper ions and the requirement for zinc ions are interrelated and that one can work with different concentrations of calcium ions if the concentrations of copper and zinc ions are adjusted accordingly.

Claims

Claims: 1. Process for the production of itaconic acid by aerobic submerged fermentation of a nutrient medium containing the usual nutrients by means of Aspergillus terreus, which indicates that the nutrient medium a sugar concentration calculated on sucrose of about 10 to 25 percent by weight, an alkaline earth ion concentration of about 350 to 3500 parts per million and a concentration of copper and / or zinc ions of about 0.5 to 200 parts each Million.

2. The method according to claim 1, characterized in that a pH of 3.0 to 4.0 is maintained.

3. The method according to claim 2, characterized characterized in that the concentration of the nutrient medium in copper and zinc ions each is about 1 to 50 parts per million.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized characterized in that calcium ions are used as alkaline earth ions.

5. Procedure according to claim 1 to 4, characterized in that the concentration of copper and / or Zinc ions to 0.5 to 200 parts per million throughout the fermentation process is held. References considered: USA: Patent No. 2,657,173.