DE1086654B

DE1086654B - Process for the production of itaconic acid by fermentation

Info

Publication number: DE1086654B
Application number: DEK33818A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1958-01-14
Filing date: 1958-01-14
Publication date: 1960-08-11

Description

Verfahren zur Erzeugung von Itaconsäure durch Gärung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Itaconsäure mit hoher Ausbeute durch Gärung von Ausfallmelasse unter Verwendung eines zur Gattung Aspergillus itaconicus gehörenden Stammes.Process for the production of itaconic acid by fermentation The present The invention relates to a process for producing itaconic acid with high yield by fermentation of molasses using one belonging to the genus Aspergillus itaconicus belonging to the tribe.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur industriellen Erzeugung von Itaconsäure zu schaffen, nach dem ein Schimmelpilz unter submersen Bedingungen gezüchtet und für kurze Zeit mit Ausfallmelasse fermentiert wird, wobei eine günstige Ausbeute erzielt wird. Ausfallmelasse galt bisher als ein industriell schwer verwertbarer Rohstoff.The object of the present invention is to provide a method to create industrial production of itaconic acid, after which a mold grown under submerged conditions and fermented for a short time with molasses is achieved, with a favorable yield is achieved. Molasses was previously considered to be an industrially difficult to use raw material.

Zwar sind Aspergillus itaconicus und Aspergillus terreus bereits als zur Erzeugung von Itaconsäure geeignete Pilzstämme bekanntgeworden, jedoch ist in der industriellen Produktion von Itaconsäure bisher ausschließlich Aspergillus terreus verwendet worden.Aspergillus itaconicus and Aspergillus terreus are already considered Fungal strains suitable for the production of itaconic acid have become known, but in the industrial production of itaconic acid so far exclusively Aspergillus terreus been used.

Die submerse aerobe Gärung durch Züchtung des Schimmelpilzes Aspergillus itaconicus in Melasse zur biotechnischen Gewinnung von Itaconsäure ist bekannt.Submerged aerobic fermentation by growing the Aspergillus mold itaconicus in molasses for the biotechnological production of itaconic acid is known.

Es hat sich erwiesen, daß bei Verwendung eines Stammes von Aspergillus itaconicus die als äußerst vorteilhafter industrieller Rohstoff anzusehende Melasselösung in nicht vorbehandelter Form verwendet werden kann, die einen Zuckergehalt von 15 bis 20% und einen Gehalt an einer an sich bekannten Stickstoffquelle von 0,1 bis 0,5°/o aufweist, ohne daß ihre Anwendung von itaxonsäureanreichernden Bedingungen entscheidend beeinflußt wird, wie dies bei Verwendung von Apergillus terreus der Fall ist, wo z. B. das Vorhandensein von Schwermetallen und Salzen sowie der pg-Bereich und die Zuckerkonzentration in dem Kulturmittel zu berücksichtigen sind.It has been found that when using a strain of Aspergillus itaconicus the molasses solution, which is to be regarded as an extremely advantageous industrial raw material Can be used in a non-pretreated form that has a sugar content of 15 to 20% and a content of a per se known nitrogen source of 0.1 to 0.5% without their application of itaxonic acid-enriching conditions is decisively influenced, as is the case with the use of Apergillus terreus Case is where z. B. the presence of heavy metals and salts as well as the pg range and the sugar concentration in the culture medium must be taken into account.

Das Verfahren nach der Erfindung bietet den Vorteil, daß die Ausfallmelasse in ihrem ursprünglichen Zustand ohne die Notwendigkeit beispielsweise eines Entsalzens verwendet werden kann und keine Regulierung des pg und kein Zusatz verschiedener die Gärung beschleunigender Mittel erforderlich ist. -Überdies kann Itaconsäure in einem hochkonzentrierten Kulturmittel mit günstigster Ausbeute in kurzer Zeit angereichert werden. Als organische oder anorganische Stickstoffquelle wird vorteilhaft Na N 03,N H4 N 03 oder Pepton verwendet.The method according to the invention offers the advantage that the molasses in their original state without the need, for example, of desalting can be used and no regulation of the pg and no addition of various fermentation accelerating agents are required. -In addition, itaconic acid can in a highly concentrated culture medium with the most favorable yield in a short time be enriched. It is advantageous as an organic or inorganic nitrogen source Na N 03, N H4 N 03 or peptone used.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung soll nunmehr durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht werden: Beispiel 1 Beispiel einer submersen Kultur in einem geschüttelten Kolben Ein 20 ml eines sterilisierten Kulturmittels enthaltender Erlenmeyerkolben von 250 ml wurde auf eine drehbare Schüttelvorrichtung von 5 cm Ausschlagweite gesetzt und bei 220 Umdrehungen in der Minute geschüttelt, wobei die Kultivation bei einer gleichbleibenden Raumtemperatur von 28' C durchgeführt wurde. a) Zuckerhaltige Stoffe Glucose, raffinierter weißer Zucker, Rohzucker, Rohrzuckerausfallmelasse oder Rübenzuckerausfallmelasse in einer 15% Glucose entsprechenden Menge wurden der Reihe nach verwendet, denen 0,1 bis 0,25% N H4 N 03, 0,250/, K H2 P 04 und 0,0250/G M9S04.7H20 als organische Salze zur Bereitung des Kulturmittels zugesetzt wurden.The method according to the present invention will now be illustrated by the following examples: Example 1 Example of a submerged culture in a shaken flask A 250 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml of a sterilized culture medium was placed on a rotatable shaker with a deflection of 5 cm and rotated at 220 revolutions shaken per minute, the cultivation being carried out at a constant room temperature of 28 ° C. a) Sugar-containing substances glucose, refined white sugar, raw sugar, cane sugar molasses or beet sugar molasses in an amount corresponding to 15% glucose were used in sequence, to which 0.1 to 0.25% N H4 N 03, 0.250 /, K H2 P 04 and 0.0250 / G M9S04.7H20 were added as organic salts to prepare the culture medium.

Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt: Tabelle 1 Raffinierter Rohrzucker Rübenzucker- Glucose weißer Zucker Rohzucker ausfallmelasse ausfallmelasse Anfall an Itaconsäure im Verhältnis zu Zucker (%) . . . .............. 40,2 39,8 58,4 65,6 63,5 pH zu Beginn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 5,0 - 5,4 5,2 5,3 5,8 pg am Ende ....................... 1,6 1,6 2,0 2,8 3,0 Bei den bekannten Verfahren zur Gewinnung von Itaconsäure wurde es -als wesentliche Vorbedingung betrachtet, daß der pH-Bereich der Gärungsbrühe zwischen 1,8 und 2,3 gehalten werden mußte, um eine hohe Ausbeute zu erzielen. Bekanntlich wird bei diesen Verfahren die Gärung entscheidend durch Schwermetallinonen, insbesondere Eisenionen, in der Gärungsbrühe beeinflußt, und es galt als schwierig, einen Rohstoff wie Ausfallmelasse in der Form zu verwenden, in der er gewonnen wird bzw. anfällt.The analytical results on the 7th day of cultivation were as follows: Table 1 Refined cane sugar beet sugar glucose white sugar raw sugar molasses molasses Itaconic acid attack in proportion to sugar (%) . . . .............. 40.2 39.8 58.4 65.6 63.5 pH at the beginning. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 5.0-5.4 5.2 5.3 5.8 pg at the end ....................... 1.6 1.6 2.0 2.8 3.0 In the known processes for the production of itaconic acid, it was regarded as an essential precondition that the pH range of the fermentation broth had to be kept between 1.8 and 2.3 in order to achieve a high yield. It is known that fermentation in these processes is decisively influenced by heavy metal linones, in particular iron ions, in the fermentation broth, and it was considered difficult to use a raw material such as molasses in the form in which it is obtained or is obtained.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß bei Verwendung von Rohstoffen, wie Rohzucker oder Ausfallmelasse, eine höhere Ausbeute als bei Verwendung von raffiniertem Zucker, wie Glucose oder raffiniertem weißem Zucker, zu erwarten ist, wie die Tabelle 1 zeigt, wobei sich noch die Vorteile ergeben, daß die Gärung nicht, wie bisher, durch Eisenionen behindert wird und kein Zusatz von die Gärung beschleunigenden Mitteln erforderlich ist, so daß ein Rohstoff, wie beispielsweise Ausfallmelasse, ohne Vorbehandlung, wie Entsalzen, so verwendet werden kann, wie er anfällt. Außer Ausfallmelasse kann auch jeder- andere zuckerhaltige Rohstoff verwendet werden.The method according to the present invention is characterized by this from that when using raw materials such as raw sugar or molasses, a higher yield than using refined sugar such as glucose or refined white sugar, is to be expected, as Table 1 shows, adding the benefits show that the fermentation is not, as before, hindered by iron ions and none The addition of agents that accelerate fermentation is required, so that a raw material such as precipitated molasses, without pretreatment such as desalination, is used in this way can be as it arises. In addition to molasses, any other sugary one can also be used Raw material to be used.

b) pH-Bereich Die Bereitung des Kulturmittels erfolgt durch Zusatz von 0,251% N H4 N 03, 0,25%, K H2 P O4 und 0,025°/(x Mg504-7H20 als anorganische Salze zu Glucose oder Ausfallmelasse, deren Zuckerkonzentration 15 % betrug.b) pH range The culture medium is prepared by adding it of 0.251% N H4 N 03, 0.25%, K H2 P O4 and 0.025 ° / (x Mg504-7H20 as inorganic Salts to glucose or molasses, the sugar concentration of which was 15%.

Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation lauteten wie folgt: Tabelle 2 Ausbeute an Itaconsäure im Verhältnis zu Zucker (Oh) Verwendeter Zucker PH Rohrzucker- - Glucose ausfallmelasse 1,8 12,3 - 2,0 17,5 21,8 2,5 35,0 36,5 3,0 39,9 49,0 3,5 40,2 56,6 4,0 31;0 50,0 5,0 28,5 39,9 nicht reguliert 11,0 60,8 Bei der bisherigen Verwendung von Aspergillus terreus ist es als wesentliche Vorbedingung angesehen worden, .das pg der Gärungsbrühe bei 1,3 bis 2,2 zu halten, um einen hohen Anfall von Itaconsäure zu erzielen. Demgegenüber zeichnet sich das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung weiter dadurch aus, däß eine günstige Ausbeute innerhalb eines weiteren p$-Bereiches von 2,5 bis 5,0 erzielt werden kann, wie dies aus Tabelle 2 eindeutig hervorgeht. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß bei Verwendung von Ausfallmelasse als Kulturmittel mit großer Pufferungswirkung selbst dann, wenn das. pn zu Beginn nicht reguliert wurde, die Gärungsbrühe automatisch innerhalb eines pg-Bereiches von 2,5 bis 3,5 gehalten wird, so daß eine beträchtliche Menge von Itaconsäure anfällt. Daher ist eine Regulierung des pg, wie sie bisher üblich war, nicht erforderlich. c) Zuckerkonzentrationen Die Bereitung des Kurmittels erfolgt durch Zusatz von 0,1% N H4 N 03 zu Lösungen von Rohzuckerausfallmelasse in 6,0 bis 20,0% Glucose entsprechenden Mengen.The analysis results on the 7th day of cultivation were as follows: Table 2 Itaconic Acid Yield to Sugar (Oh) Used sugar PH cane sugar - Glucose precipitated molasses 1.8 12.3 - 2.0 17.5 21.8 2.5 35.0 36.5 3.0 39.9 49.0 3.5 40.2 56.6 4.0 31; 0 50.0 5.0 28.5 39.9 not regulated 11.0 60.8 In the previous use of Aspergillus terreus, it has been regarded as an essential precondition to keep the pg of the fermentation broth at 1.3 to 2.2 in order to achieve a high amount of itaconic acid. In contrast, the process according to the present invention is further characterized in that a favorable yield can be achieved within a further p $ range from 2.5 to 5.0, as can be clearly seen from Table 2. A further advantage is that if precipitated molasses is used as a culture medium with a large buffering effect, even if the pn was not regulated at the beginning, the fermentation broth is automatically kept within a pg range of 2.5 to 3.5, so that a considerable amount of itaconic acid is produced. Therefore, regulation of the pg, as has been customary up to now, is not necessary. c) Sugar concentrations The preparation of the therapeutic agent takes place by adding 0.1% N H4 N 03 to solutions of raw sugar molasses in amounts corresponding to 6.0 to 20.0% glucose.

Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation lauteten folgendermaßen: Tabelle 3 Konzentrationen von Rohrzuckerausfall- melasse (%) ...... 6,0 10,0 15,0 20,0 Anfall an Itaconsäure im Verhältnis zu Zucker (%) ....... 25;0 54,8 60,0 58,2 pH zu Beginn ....... 5,1 5,2 5,0 5,1 p$ am Ende ........: 2,4 2,5 2,7 2,8 Bei der bisher üblichen Kultivation von Aspergillus terreus unter submersen Bedingungen wurden etwa 6% als optimale Zuckerkonzentration betrachtet, und es galt als schwierig, eine hohe Ausbeute mit einem Kulturmittel von hoher Zuckerkonzentration zu erzielen. Darin bestanden die Mängel der Kultivation bei der submersen Itaconsäuregärung.The analysis results on the 7th day of cultivation were as follows: Table 3 Concentrations of Cane sugar failure molasses (%) ...... 6.0 10.0 15.0 20.0 Attack of itaconic acid in relation to Sugar (%) ....... 25; 0 54.8 60.0 58.2 Initial pH ....... 5.1 5.2 5.0 5.1 p $ at the end ........: 2.4 2.5 2.7 2.8 In the hitherto customary cultivation of Aspergillus terreus under submerged conditions, about 6% was considered to be the optimal sugar concentration, and it was considered difficult to obtain a high yield with a culture medium having a high sugar concentration. This was the deficiency of cultivation in submerged itaconic acid fermentation.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß in kurzer Zeit ein hoher Anfall an Itaconsäure mit einem Kulturmittel von hoher Zuckerkonzentration erzielt werden kann, wie aus der Tabelle 3 ersichtlich ist.The inventive method has the advantage that in a short time a high build-up of itaconic acid with a culture medium with a high concentration of sugar can be achieved, as can be seen from Table 3.

d) Stickstoffquellen Die Bereitung des Kulturmittels erfolgte durch Zusatz von N H4 N 03, (NH4)2S04, N H4 Cl, Na N 03, Harnstoff oder Pepton als Stickstoffquelle in einer Menge von 0,05 bis 0,5°/o im Verhältnis zu einer Lösung von Rohrzuckerausfallmelasse in einer 15,00% Glucose entsprechenden Menge.d) Nitrogen sources The culture medium was prepared by Addition of N H4 N 03, (NH4) 2S04, N H4 Cl, Na N 03, urea or peptone as nitrogen source in an amount of 0.05 to 0.5% in relation to a solution of cane sugar precipitated molasses in an amount corresponding to 15.00% glucose.

Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt: Bei dem üblichen Verfahren mit Aspergillus terreus wurden physiologisch saure anorganische Salze, wie (NH4)2S04 und NH4C1, als bevorzugte Stickstoffquellen betrachtet, während nach dem erfindungsgemäßen Verfahren physiologisch basische oder neutrale; Salze, wie N H4 N 03, Na N 03 und Pepton, als am besten geeignet erkannt wurden.The analytical results on the 7th day of cultivation were as follows: In the usual method with Aspergillus terreus, physiologically acidic inorganic salts, such as (NH4) 2SO4 and NH4C1, were regarded as preferred nitrogen sources, while in the method according to the invention physiologically basic or neutral; Salts such as N H4 N 03, Na N 03 and peptone were found to be the most suitable.

e) Stickstoffkonzentrationen Die Bereitung des Kulturmittels erfolgte durch Zusatz von Mengen zwischen 0,01 und 0,5% N H4 N 03 zu einer Lösung von Rohrzuckerausfallmelasse in einer 15% Glucose entsprechenden Menge.e) Nitrogen concentrations The preparation of the culture medium took place by adding amounts between 0.01 and 0.5% N H4 N 03 to a Solution of cane sugar molasses in an amount corresponding to 15% glucose.

Die Analysenresultate am 7. Tage der Kultivation waren wie folgt: Tabelle 5 Konzentrationen von N H4 N 03 (0/0) . . . . 0,01 011 0,25 0,5 Anfall an Itaconsäure im Verhältnis zu Zucker (%) ....... 35,3 60,5 24,0 22,7 pl, zu Beginn ........ 5,1 5,3 5,2 5,3 px am Ende ......... 2,7 2,8 2,8 2,8 Die optimale Stickstoffkonzentration liegt demnach in dem Bereich von 0,01 bis 0,25%.The analytical results on the 7th day of cultivation were as follows: Table 5 Concentrations of N H4 N 03 (0/0). . . . 0.01 011 0.25 0.5 Attack of itaconic acid in relation to Sugar (%) ....... 35.3 60.5 24.0 22.7 p l, at the beginning ........ 5.1 5.3 5.2 5.3 px at the end ......... 2.7 2.8 2.8 2.8 The optimal nitrogen concentration is therefore in the range from 0.01 to 0.25%.

Beispiel 2 Beispiel einer Kultivation in einem submersen Kulturentank von 51 Fassungsvermögen Eine Suspension von Mycelia, die 60 Stunden lang einer Schüttelbehandlung unterworfen worden war, wurde in einer Menge von etwa 10% einem Kulturmittel zugesetzt, und die Kultivation erfolgte unter den folgenden Bedingungen: Rühren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 Umdr./Min. Lüftung ................... 11/1/Min. Menge des Kulturmittels ... 3 1 Temperatur . .... . . . . .. .. .. . 28' C Kulturmittel in % I A B Rohrzuckerausfallmelasse ....... 25 17 NH4N03 ..................... 0,1 0,1 Analysenresultate am 7. Tage Anfall an Itaconsäure Kultur- im Verhältnis zu im Verhältnis zu mittel Pg zu Beginn verbrauchtem anfänglichem Zucker Zuckergehalt (%) (°/o) A 5,0 62,5 50,1 B 5,1 58,3 48,5 Nach Beendigung der Kultivation wurden die Mycelpilze entfernt, und die Brühe wurde konzentriert, wobei Rohkristalle von Itaconsäure gewonnen wurden.Example 2 Example of cultivation in a submerged culture tank of 51 capacity A suspension of mycelia which had been subjected to a shaking treatment for 60 hours was added in an amount of about 10% to a culture agent, and the cultivation was carried out under the following conditions: Stirring. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 rev / min. Ventilation ................... 11/1 / min. Amount of culture medium ... 3 1 Temperature. .... . . . .. .. ... 28 ' C Culture media in% IAB Cane sugar molasses ....... 25 17 NH4N03 ..................... 0.1 0.1 Analysis results on the 7th day Attack of itaconic acid Culture in proportion to in proportion to medium Pg initial consumed at the beginning Sugar sugar content (%) (° / o) A 5.0 62.5 50.1 B 5.1 58.3 48.5 After the completion of the cultivation, the mycelial fungi were removed and the broth was concentrated to obtain crude crystals of itaconic acid.

Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, hat sich das erfindungsgemäße Verfahren zur industriellen Erzeugung von Itaconsäure unter Verwendung von Aspergillus itaconicus als ein in vielen Punkten weit vorteilhafteres Verfahren erwiesen als das bisherige Verfahren, in welchem Aspergillus terreus verwendet wird.As can be seen from the above, the Process according to the invention for the industrial production of itaconic acid using from Aspergillus itaconicus as a method which is far more advantageous in many respects proven to be the previous method in which Aspergillus terreus is used.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the biotechnological production of itaconic acid by submerged cultivation of the mold Aspergillus itaconicus in molasses, thereby characterized in that a non-pretreated molasses solution is used, the one Sugar content of 15 to 20% and a content of a nitrogen source known per se from 0.1 to 0.5%.

2. The method according to claim 1, characterized in that that Na N 03, N H4 N 03 or peptone is used as the nitrogen source. Into consideration drawn references: U.S. Patent No. 2,657,173; "Technical Mycology" by A. Niethammer, Stuttgart 1947, p. 147; "Industrial Fermentations", Vol. 1, by Underkofler and Hickey, New York 1954, pp. 488 to 497; Chemiker-Zeitung, No. 11 June 5, 1954, p. 350.