DE1225585B

DE1225585B - Process for the biochemical production of itaconic acid

Info

Publication number: DE1225585B
Application number: DE1962P0029211
Authority: DE
Inventors: Robert Carl Nubel; Edwin James Ratajak
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1962-04-18
Filing date: 1962-04-18
Publication date: 1966-09-29

Description

Verfahren zur biochemischen Herstellung von ltakonsäure Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Zierstellung von Itakonsäure durch sub-Merse aerobe Vergärung von Kohlehydrate enthaltenden Nährmedien mittels Aspergillus terreus oder Aspergillus itaconicus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß etwa 10 bis 30% der Kohlehydrate in Form von Rübenmelasse angewendet werden.Process for the Biochemical Production of Itaconic Acid The invention relates to a process for the biochemical decoration of itaconic acid by sub-merses aerobic fermentation of nutrient media containing carbohydrates by means of Aspergillus terreus or Aspergillus itaconicus, which is characterized in that about 10 to 30% of carbohydrates can be used in the form of beet molasses.

Itakonsäure findet bekanntlich auf dem Gebiet der Polymerisation und auf anderen Gebieten ausgedehnte Verwendung, und ihre biochemische Herstellung wurde bereits weitgehend untersucht. Frühere Arbeiten ergaben, daß verschiedene Arten von Aspergillus, einschließlich der Stämme von A. terreus und A. itaeonicus, in der Lage. sind, Itakonsäure durch Oberflächengärung von Kohlehydraten zu erzeugen. Ein bedeutsamer Fortschritt wurde erzielt, als ein submerses, aerobes Gärungsverfahren entwickelt wurde, wie es die USA.-Patentschrift 2 385 283 beschreibt. Die mit diesen Verfahren erzielten Ausbeuten lagen im allgemeinen bei etwa 10 bis 30 Gewichtsprozent des Kohlehydrats, wobei die Gärungsdauer gewöhnlich etwa 7 bis 14 Tage be-. trug.Itaconic acid is known to be found in the field of polymerization and in other fields widespread use, and their biochemical manufacture has been already extensively studied. Previous work indicated that different species of Aspergillus, including the strains of A. terreus and A. itaeonicus, in the situation. are to produce itaconic acid through surface fermentation of carbohydrates. A significant advance has been made as a submerged, aerobic fermentation process as described in U.S. Patent 2,385,283. The ones with these Yields achieved by the process were generally about 10 to 30 percent by weight of the carbohydrate, with fermentation usually lasting about 7 to 14 days. wore.

Seitdem sind in der Fachliteratur zahlreiche Berichte veröffentlicht, die Bemühungen zur Verminderung der Verfahrenskosten beschreiben. So beschreibt die USA.-Patentschrift 2 657173 die fermentative Herstellung von Itakonsäure aus Glukose mit Hilfe von Aspergillus terreus oder Aspergillus itaconicus und führt als mögliche Kohlehydratquellen auch Rübenmelasse und Rohrmelasse auf. Die Beispiele dieser Patentschrift betreffen allerdings lediglieh die Vergärung von Glukose. Eine ausführliche Beschreibung der Versuche zu dieser Patentschrift ist aber in einem Artikel in eIndustrial and Engineering ChemistryK, Bd. 44, S. 2975 bis 2980, 1952, enthalten, in dem die Arbeit des Northern Regional Research Laborstory näher beschrieben wird. Es wird dort berichtet, daß auf 6%igen gereinigten Glukosemedien innerhalb einer angemessenen Zeit Vera besserte ItakQnsäureausbeuten erzielt werden können. In dem Artikel wird darauf hingewiesen, daß zahlreiche Versuche unternommen wurden, die, gerairügte Glukose durch weniger kostspielige Kohlehydratquellen, wie Zuckerrohr und Rübenmelasse, zu ersetzen. Bei diesen Versuchen, konnten jedoch keine bedeutsamen Mengen Itakonsäure hergestellt werden. Wurde die Zuckerkonzentration auf 9 bis 10 a/n erhöht, so waren Gesamtproduktionsge5cllwindigkeit und Ausbaute gering, und Versuche, die Produktionsgeschwindigkeit bei diesen konzentrierten Medien zu verbessern, blieben ohne Erfolg. Man hielt daher eine Begrenzung cler Kohlehydrate in der Lösung auf 5 bis 7 % .für erforderlich.Since then, numerous reports have been published in the specialist literature, Describe efforts to reduce procedural costs. So describes US Pat. No. 2,657,173 describes the fermentative production of itaconic acid Glucose with the help of Aspergillus terreus or Aspergillus itaconicus and leads beet molasses and cane molasses are also possible sources of carbohydrates. The examples however, this patent only relates to the fermentation of glucose. One but a detailed description of the attempts at this patent is in one Article in eIndustrial and Engineering ChemistryK, Vol. 44, pp. 2975 to 2980, 1952, which details the work of the Northern Regional Research Laboratory will. It is reported there that on 6% purified glucose media within In a reasonable period of time, improved itacic acid yields can be achieved. The article notes that numerous attempts have been made to the, restrained glucose from less expensive sources of carbohydrates such as sugar cane and beet molasses, to replace. In these attempts, however, none were significant Amounts of itaconic acid can be produced. The sugar concentration was on 9 to 10 a / n increased, the overall production speed and expansion were low, and Attempts to improve the production speed with these concentrated media, remained unsuccessful. A limit on the number of carbohydrates in the solution was therefore held to be to 5 to 7% .for required.

Weitere Literaturstellen aus »Zucker«. 1962, S. 38, und »Chemical Engineering«, 1955, Heft 6, S. 11G und 118, geben nur unbestimmte Angaben darüber wieder, daß Melassen als Kohlehydratquelle bei der Itakonsäureherstellung verwendet werden können. Sie legen in keiner Weise die bestimmte Kombination der Erfindung aus etwa 10 bis 30% Rübenmelasse und einem anderen Kohlehydrat nahe, Nach der deutschen Auslegeschrift 1086 654 wurde Rübenzuekerausfallmelasse in einer 15 bis 2001Q Glukose entsprechenden Menge bei der bioehemischert Herstellung von Itakonsäure verwendet. Dabei betrug jedoch schon, die reine Gärungsdauer 7 Tage; dazu kamen noch 2,$ Tage für die Ijerstellung des Impfmaterials, so daß insgesamt 9,5 Tage erforderlieh waren.Further references from "Zucker". 1962, p. 38, and "Chemical Engineering ”, 1955, No. 6, pp. 11G and 118, give only vague information about it again that molasses is used as a source of carbohydrates in itaconic acid manufacture can be. They in no way specify the particular combination of the invention from about 10 to 30% beet molasses and another carbohydrate close, according to the German Auslegeschrift 1086 654 was beet sugar molasses in a 15 to 2001Q glucose corresponding amount used in the bio-chemically mixed production of itaconic acid. However, the pure fermentation period was 7 days; in addition there were 2. $ days for the preparation of the inoculation material, so that a total of 9.5 days were required.

Demgegeniiber sind für das eründungsgemäM für die biochemische Herstellung von Italo nsäure eingesetzte Gemisch aus 10 bis, 3001o Rübenmelasse und anderen KQhlieliydraten nur 18 Stunden zur Herstellung des Impfmaterials und 3 Tage zur Gärung erforderlich. Das erfindungsgemäße Verfahren führt also in einer wesentlich kürzeren Zeit zu optimalen Ausbeuten an ItakQnsäure und ist somit wesentlieli wirkungsvoller. Auch wird erfindungsgemäß keine Stickstoffquelle benötigt.In contrast, according to the invention for biochemical production Mixture of 10 to, 3001o beet molasses and others used by Italian acid KQhlieliydrates only 18 hours for the preparation of the inoculation material and 3 days for Fermentation required. The method according to the invention thus results in a substantial shorter time to optimal yields of itacic acid and is therefore much more effective. According to the invention, no nitrogen source is required either.

Die in dem Gärmedium des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Rübenmelasse ist ein bekanntes, im Handel verfügbares Nebenprodukt der Zuckergewinnung aus Zuckerrüben. Sie enthält gewöhnlich etwa 50 Gewichtsprozent Zucker, hauptsächlich Rohrzucker. Es ist indessen nicht möglich, lediglich durch Verwendung einer wäßrigen Rohrzuckerlösung die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erreichen.The beet molasses used in the fermentation medium of the method according to the invention is a well-known commercially available by-product of sugar production from sugar beet. It usually contains about 50 percent by weight sugar, mainly Cane sugar. However, it is not possible simply by using an aqueous one Cane sugar solution to achieve the advantages of the method according to the invention.

Eine besonders vorteilhafte Rübenmelassekonzentration entspricht etwa 15 bis 25% der gesamten Kohlehydrate.A particularly advantageous beet molasses concentration corresponds approximately 15 to 25% of total carbohydrates.

Als restliche Kohlehydrate können verschiedene Mono- und Disaccharide, wie Rohrzucker, Glukose oder Fruktose, oder Gemische dieser Zucker, wie Invertzucker, verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Kohlehydratquelle ist wegen ihrer leichten Verfügbarkeit und geringen Kosten die Zuckerrohrmelasse. Sie ist ein sehr bekanntes Handelsprodukt und wird manchmal als rohe Zuckerrohrmelasse oder als »hochwertige« Melasse bezeichnet. Sie wird durch partielle -Inversion des geklärten, konzentrierten Zuckerrohrsaftes hergestellt und enthält gewöhnlich insgesamt etwa 70 bis 75 Gewichtsprozent Zucker, davon bestehen etwa zwei Drittel aus Invertzucker und der Rest aus Rohrzucker.The remaining carbohydrates can be various mono- and disaccharides, such as cane sugar, glucose or fructose, or mixtures of these sugars, such as invert sugar, be used. A particularly preferred source of carbohydrates is because of its lightness Availability and low cost the cane molasses. She is a very well known one Commercial product and is sometimes used as raw sugar cane molasses or as "high-quality" Denotes molasses. It is clarified and concentrated through partial inversion of the Sugar cane juice and usually contains a total of about 70 to 75 percent by weight Sugar, about two thirds of which consists of invert sugar and the rest of cane sugar.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt deshalb das Kohlehydrat ausschließlich von wenig kostspieligen Melassen, und zwar von Rüben und Zuckerrohrmelasse. Der Ausdruck Melasse schließt auch gereinigte Melasse ein, d. h. Melasse, die irgendeiner der in der Vergärungstechnik bekannten Reinigungsstufen, wie einer Behandlung mit aktivierter Kohle oder Bleicherde, Kationenaustauscherharzen, Ferrocyanid, Kalk oder Bentonit, unterworfen wurde. Derartige Behandlungen können manchmal eine günstige Wirkung erzielen, da sie aus der Melasse Verunreinigungen, wie Schwermetalle oder Erdalkalien, entfernen.In a preferred embodiment of the invention, therefore, originates the carbohydrate exclusively from inexpensive molasses, namely from beets and cane molasses. The term molasses also includes purified molasses, d. H. Molasses that have been subjected to any of the purification stages known in fermentation technology, such as treatment with activated charcoal or fuller's earth, cation exchange resins, Ferrocyanid, lime or bentonite, was subjected. Such treatments can sometimes have a beneficial effect, as they contain impurities from the molasses, such as heavy metals or alkaline earths.

Sie sind jedoch in keiner Weise wesentlich, um die Vorteile zu erzielen,- die für das erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnend sind.However, they are in no way essential to achieve the advantages, which are characteristic of the method according to the invention.

Beim Ansatz der Gärmedien für das erfindungsgemäße Verfahren werden die Melassen oder anderen Zucker mit Wasser verdünnt, für optimale Ergebnisse wird im allgemeinen eine Gesamtzuckerkonzentration von etwa 10 bis 18 Gewichtsteilen pro 100 Volumteile bevorzugt. Gesamtzuckerkonzentrationen wie in bekannten Verfahren von weniger als 10% können angewendet werden, ergeben jedoch gewöhnlich keinen Vorteil. Für eine hohe Produktionskapazität werden die höheren Konzentrationen, wie 15 bis 16 % Zucker; bevorzugt.When preparing the fermentation media for the method according to the invention the molasses or other sugar is diluted with water for best results generally a total sugar concentration of about 10 to 18 parts by weight per 100 parts by volume preferred. Total sugar concentrations as in known methods less than 10% can be used but usually gives no benefit. For a high production capacity, the higher concentrations, such as 15 to 16% sugar; preferred.

Die Rübenmelassen können auf verschiedene Art in die Produktionsgärung eingeführt werden. Sie können, wie bereits angegeben, direkt beim Ansatz des Produktionsmediums mit den Zuckerrohrmelassen oder anderen Kohlehydraten vermischt werden. In einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform des Verfahrens wird die Rübenmelasse als primäre Kohlehydratquelle für die submerse aerobe Züchtung eines Impfmaterials mit dem ausgewählten Mikroorganismus verwendet. Dieses Impfmaterial kann anschließend auf ein Zuckerrohrmelassemedium übertragen werden, um die submerse, aerobe Gärung einzuleiten. Wenn diese Ausführungsform des Verfahrens ausgewählt wird, so werden die verschiedenen Rüben- und Zuckerrohrmelassekonzentrationen so gewählt, daß sie in die beschriebenen Bereiche fallen, und das Produktionsmedium wird mit so viel Impfmaterial versetzt, daß die Rübenmelasse etwa 10 bis 30% der gesamten Kohlehydrate entspricht. Beispielsweise können etwa 20 Volumprozent eines Rübenmelasseimpfmaterials zu einem Zuckerrohrrnelassemedium äquivalenter Konzentration gegeben werden, um den gewünschten Anteil Rübenmelasse in der Produktionsgärung bereitzustellen.The beet molasses can be fermented in various ways to be introduced. As already stated, you can do this directly when preparing the production medium mixed with the sugar cane molasses or other carbohydrates. In a particularly advantageous embodiment of the method is the beet molasses as primary source of carbohydrates for submerged aerobic cultivation of inoculum the selected microorganism is used. This inoculum can then Transferred to a cane molasses medium for submerged, aerobic fermentation initiate. If this embodiment of the method is selected, so will the various beet and cane molasses concentrations chosen so that they fall into the areas described, and the production medium is using as much Inoculum added that the beet molasses is about 10 to 30% of the total carbohydrates is equivalent to. For example, about 20 percent by volume of a beet molasses inoculum can be used be added to a sugar cane pulp medium of equivalent concentration to provide the desired proportion of beet molasses in the production fermentation.

Neben dem Kohlehydrat können dem Impfmaterial und dem Gärmedium auch andere, dem Fachmann bekannte Bestandteile zugesetzt werden. Die Zugabe verschiedener Salze, wie Magnesium, Zink- und Kupfersalze, in geringerer Konzentration ist z. B. oft von Vorteil. Sie können als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen enthalten sein oder getrennt zugefügt werden. Außerdem können Stickstoffquellen, wie Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff, Aminosäuren u. ä., zugefügt werden, dies ist jedoch gewöhnlich nicht notwendig. Wenn die Schaumbildung übermäßig stark ist, so kann eine Spur Antischaummittel, wie Sojabohnenöl, eingearbeitet werden.In addition to the carbohydrate, the inoculum and the fermentation medium can also other ingredients known to those skilled in the art can be added. The addition of various Salts such as magnesium, zinc and copper salts, in lower concentrations, are e.g. B. often an advantage. They can be contained as impurities in other components be added or added separately. In addition, nitrogen sources such as nitrates, Ammonium salts, urea, amino acids and the like can be added, but this is common unnecessary. If the foaming is excessive, a trace of anti-foaming agent, such as soybean oil.

Mikroorganismen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßigerweise zu verwenden sind, sind die Pilze, besonders die Itakonsäure erzeugenden Stämme von Aspergillus, wie Stämme von A. itaconicus und vorzugsweise von A. terreus. Eine Anzahl derartiger Organismen ist bekannt und verfügbar. A. verreus NRRL 1960 und NRRL 265 z. B. sind von der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, zu beziehen. Die Erfindung schließt auch die Itakonsäure erzeugenden Varianten dieser Mikroorganismen ein, die auf verschiedene Weise, z. B. durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Senfgas oder nach anderen bekannten Verfahren erhalten werden.Microorganisms that are expediently in the process according to the invention to be used are the fungi, especially the itaconic acid producing strains from Aspergillus such as strains from A. itaconicus and preferably from A. terreus. One A number of such organisms are known and available. A. verreus NRRL 1960 and NRRL 265 e.g. B. are from the culture collection of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois. The invention also includes itaconic acid generating Variants of these microorganisms that exist in various ways, e.g. B. by X-ray irradiation, Ultraviolet radiation, treatment with mustard gas or other known methods can be obtained.

Nachdem das Medium durch Hitze oder auf andere Weise sterilisiert worden ist, kann es mit dem ausgewählten Organismus geimpft werden, zweckmäßigerweise durch Übertragung von Sporen von einem Schrägagar oder von Oberflächen-Plattenkulturen oder vorzugsweise durch Zugabe eines vorher hergestellten Impfmaterials. Wird die letztgenannte Methode angewandt, so fällt der pH-Wert gewöhnlich auf einen Wert zwischen etwa 4 und 5,5: Sollte er niedriger sein, so ist es manchmal angebracht, ihn mit Alkali auf einen in .diesen Bereich fallenden Wert einzustellen.After the medium is sterilized by heat or other means has been, it can be inoculated with the selected organism, expediently by transferring spores from an agar slant or from surface plate cultures or preferably by adding a previously prepared inoculum. Will the If the latter method is applied, the pH value usually falls to a value between about 4 and 5.5: Should it be lower, it is sometimes appropriate to set it with alkali to a value falling within this range.

Nach der Impfung kann die submerse aerobe Fortpflanzung zweckmäßigerweise in üblichen Gärungsgefäßen durchgeführt werden, die mit Rührvorrichtungen und solchen zur Einführung von Luft unterhalb des Flüssigkeitsspiegels ausgestattet sind. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, erwies es sich als wünschenswert, verhältnismäßig hohe Gärungstemperaturen, zwischen etwa 35 und 42°C, anzuwenden. Eine Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 1/4 bis 1/2 Volum Luft je Volum Medium je Minute ist erwünscht, manchmal können jedoch noch höhere Geschwindigkeiten, bis zu etwa 2 Volum je Volum je Minute, mit Vorteil angewendet werden. Diese Bedingungen eignen sich sowohl für die Züchtung des Impfmaterials als auch für die Produktionsgärung.After vaccination, submerged aerobic reproduction can expediently be carried out in conventional fermentation vessels with stirrers and such are equipped to introduce air below the liquid level. Around To get the best results, it turned out to be desirable, proportionate high fermentation temperatures, between about 35 and 42 ° C, should be used. A ventilation speed from about 1/4 to 1/2 volume of air per volume of medium per minute is desirable, sometimes however, even higher speeds, up to about 2 volumes per volume per minute, can be used to advantage. These conditions are suitable for both breeding of the inoculum as well as for the production fermentation.

Die optimale Gärdauer schwankt etwas, sie hängt ab von dem bestimmten Organismus, der Temperatur und den anderen gewählten Bedingungen. Wird ein Impfmaterial , auf Rübenmelasse hergestellt. und dann auf das Produktionsmedium übertragen, so sind gewöhnlich für die Züchtung des Impfmaterials Zeiten von etwa 18 bis 24 Stunden angemessen. Die Produktionsgärung ist gewöhnlich in der überraschend kurzen Zeit von etwa 21/z bis 31/2 Tagen im wesentlichen abgeschlossen.The optimal fermentation time varies somewhat, it depends on the particular one Organism, temperature and other chosen conditions. Becomes an inoculating material , made on beet molasses. and then on the production medium times of about 18 to 24 hours appropriate. The production fermentation is usually surprising in that essentially completed in a short period of about 21/2 to 31/2 days.

Es erwies sich als besonders vorteilhaft, wenngleich auch nicht als wesentlich, wenn ein Teil der erzeugten Itakonsäure während der Produktionsgärung neutralisiert wird. Dies kann durch Zugabe einer Base, wie Kalk, Ammoniak oder Kalium- oder Natriumhydroxyd, geschehen. Gewöhnlich wird Kalk bevorzugt. Die teilweise Neutralisation wird am besten dann durchgeführt, wenn der Itakonsäuregehalt der Nährlösung auf etwa 2 bis 5 g je 100- ccm, vorzugsweise 2,5 bis 4,5 g angestiegen ist. Dies ist gewöhnlich etwa 18 bis 48 Stunden nach .der Impfung der Fall. Es wird so viel Base zugefügt, daß etwa 20 bis 50°/o der gebildeten Itakonsäure neutralisiert wird. Nach so erfolgter Einstellung läßt man die Gärung unter den gleichen Temperatur-und Belüftungsbedingungen wie zuvor fortschreiten, bis die Produktionsrate der Itakonsäure unwesentlich wird.It turned out to be particularly beneficial, albeit not as essential if some of the itaconic acid produced during production fermentation is neutralized. This can be done by adding a base such as lime, ammonia or potassium or sodium hydroxide. Lime is usually preferred. The partial neutralization is best done when the itaconic acid content of the nutrient solution rises about 2 to 5 g per 100 ccm, preferably 2.5 to 4.5 g has increased. This is usually about 18 to 48 hours after vaccination. There will be so much base added that about 20 to 50% of the itaconic acid formed is neutralized. To Once this has been adjusted, fermentation is allowed to take place under the same temperature and ventilation conditions proceed as before until the rate of itaconic acid production becomes negligible.

Zweckmäßigerweise wird der Fortgang der Gärung verfolgt, indem periodisch Proben entnommen und der Itakonsäuregehalt der Nährlösung bestimmt werden. Genormte Bestimmungsmethoden sind dafür verfügbar und dem Fachmann bekannt. Eine geeignete Methode besteht z. B. darin, daß man die Probe filtriert, .das Filtrat ansäuert, anschließend mit Lösungsmittel extrahiert und mit Brom titriert. Ausbeuten von 50 g oder mehr Itakonsäure je 100 g Kohlehydratbeschickung sind nach dem neuen Verfahren möglich. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Art der Angabe der Ausbeuten besser ist als andere, die gelegentlich verwendet wurden. Zeitweilig war es z. B. üblich, .die Ausbeute, ausgedrückt als Endkonzentration Itakonsäure, als Prozentsatz der anfänglichen Kohlehydratkonzentration zu bestimmen. Das letztgenannte Verfahren ergibt häufig irrtümlicherweise hohe Ergebnisse, besonders bei Versuchen kleinen Maßstabs mit hohen Belüftungsgeschwindigkeiten, wo eine beträchtliche Verdunstung stattfinden kann.The progress of fermentation is expediently followed by periodically Samples are taken and the itaconic acid content of the nutrient solution is determined. Standardized Determination methods are available for this and known to the person skilled in the art. A suitable one Method consists e.g. B. in that the sample is filtered. The filtrate is acidified, then extracted with solvent and titrated with bromine. Yields of 50 grams or more of itaconic acid per 100 grams of carbohydrate charge are according to the new process possible. It should be noted that this way of reporting the yields is better is than others that have been used occasionally. At times it was z. B. common, .the yield, expressed as the final concentration of itaconic acid, as a percentage of the determine initial carbohydrate concentration. The latter method often erroneously gives high results, especially small experiments Scale with high ventilation speeds where there is considerable evaporation can take place.

Die Gewinnung des Produktes erfolgt ohne Schwierigkeiten nach genormten und bekannten Verfahren. Das Produkt kann z. B. aus der filtrierten Nährlösung durch Einengen, Kühlen und Auskristallisieren isoliert werden. Wahlweise kann .die Itakonsäure aus der filtrierten Nährlösung an einem Anionenaustauscherharz adsorbiert und mit einer wäßrigen Base eluiert werden. Die Gewinnung erfolgt besonders mühelos, da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr starke Nährlösung bereitgestellt wird.The product is obtained without difficulty in accordance with standardized methods and known methods. The product can e.g. B. from the filtered nutrient solution Concentration, cooling and crystallization can be isolated. Optionally, the itaconic acid from the filtered nutrient solution adsorbed on an anion exchange resin and with be eluted with an aqueous base. The extraction is particularly effortless because provided a very strong nutrient solution according to the method according to the invention will.

Aus der vorhergehenden Beschreibung geht hervor, daß die Anwendung der angegebenen Mengen Rübenmelasse eine Reihe völlig unerwarteter Vorteile bietet. Die Gärdauer wird, selbst bei stark konzentrierten Kohlehydratlösungen, um 60 bis 80 0/0 herabgesetzt, wodurch die Kapazität der Anlage wesentlich erhöht wird. Zudem wird die Umwandlung in das Produkt gegenüber mit vielen bisher bekannten Verfahren erzielten Ergebnissen verdoppelt. Die Gewinnung der Itakonsäure aus den erhaltenen stark konzentrierten Itakonsäure-Nährlösungen ist wesentlich vereinfacht. Diese wesentlichen Vorteile werden selbst dann erzielt, wenn das gesamte Kohlehydrat aus Rüben- und Zuckerrohrmelasse besteht, wodurch eine wesentliche Kosteneinsparung bei den Rohstoffen möglich ist.From the preceding description it can be seen that the application the specified amounts of beet molasses offers a number of completely unexpected advantages. Even with highly concentrated carbohydrate solutions, the fermentation time is around 60 to 80 0/0 reduced, whereby the capacity of the system is significantly increased. In addition the conversion into the product is compared with many previously known processes results obtained doubled. The recovery of itaconic acid from the obtained highly concentrated itaconic acid nutrient solutions is much simplified. These substantial benefits are obtained even when the entire carbohydrate is made up Beet and sugar cane molasses is made, which is a significant cost saving is possible with the raw materials.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung. Beispiel 1 Rübenmelasse, mit Wasser auf 15% (Gew./Vol.) Zucker verdünnt ..... 2000 ccm ZnS04, 50 % (Gew./Vol.) wäßrige Lö- sung ........................... 6 ccm MgS04 ' 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . log CuS04 » 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,04 g Sojabohnenöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 ccm Das obige Impfmateriahnedium, das einen pH-Wert von etwa 7,6 aufweist, wird 30 Minuten bei 100° C sterilisiert, auf etwa 35° C abgekühlt und mit 5 ccm Sporensuspension eines Stammes von A. terreus von einer Oberflächen-Plattenkultur geimpft. Das submerse Wachstum erfolgt in einem genormten, 21 fassenden Gärgefäß, das mit einem schnellaufenden Schraubenrührer ausgestattet ist. Das Rühren und die Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 500 ccm Luft je Minute werden insgesamt 18 Stunden bei etwa 33 bis 37° C fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt ist der pH-Wert auf etwa 4,5 gefallen. Zuckerrohrmelasse, mit Wasser auf 15 II/o (Gew./Vol.) Zucker verdünnt 2000 ccm ZnS04, 50 % (Gew./Vol.) wäßrige Lö- sung ........................... 4 ccm MgS04*7 H20 .................... 6 g CuS04 - 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,02 g Das obige Produktionsmedium wird 45 Minuten bei 100° C sterilisiert und anschließend 5 Minuten bei einem Dampfdruck von 1,05 atü in einem Autoklav behandelt. Nachdem es sich auf 40° C abgekühlt hat, werden 400 cm des wie beschrieben hergestellten Impfmaterials zugefügt, und man läßt die submerse, aerobe Gärung unter kräftigem Rühren ablaufen. Während des Gärvorganges wird die Temperatur auf etwa 39 bis 42° C gehalten und Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 bis 1000 ccm/Min. unter die Oberfläche eingeleitet. Der pH-Wert, der zu Beginn etwa 5,11 betrug, fällt allmählich und beträgt nach 24 Stunden etwa 3,1. Die Prüfung der Nährlösung zeigt einen Itakonsäuregehalt von etwa 4 g/100 ccm.The following examples serve to illustrate. example 1 Beet molasses, with water to 15% (W / v) Sugar diluted ..... 2000 ccm ZnS04, 50% (w / v) aqueous solvent sung ........................... 6 ccm MgS04 '7 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . log CuS04 »5 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.04 g Soybean oil. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 cc The above inoculum medium, which has a pH of about 7.6, is sterilized at 100 ° C for 30 minutes, cooled to about 35 ° C and inoculated with 5 cc spore suspension of a strain of A. terreus from a surface plate culture. The submerged growth takes place in a standardized, 21-capacity fermentation vessel, which is equipped with a high-speed screw stirrer. Stirring and aeration at a rate of 500 cc air per minute are continued for a total of 18 hours at about 33 to 37 ° C. At this point the pH has dropped to around 4.5. Sugar cane molasses, with water on 15 II / o (w / v) sugar diluted 2000 cc ZnS04, 50% (w / v) aqueous solvent sung ........................... 4 ccm MgS04 * 7 H20 .................... 6 g CuS04 - 5 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.02 g The above production medium is sterilized for 45 minutes at 100 ° C. and then treated in an autoclave for 5 minutes at a steam pressure of 1.05 atmospheres. After it has cooled to 40 ° C., 400 cm of the inoculum prepared as described are added and the submerged, aerobic fermentation is allowed to proceed with vigorous stirring. During the fermentation process, the temperature is kept at about 39 to 42 ° C and air at a rate of about 500 to 1000 ccm / min. initiated below the surface. The pH, which was about 5.11 at the beginning, falls gradually and is about 3.1 after 24 hours. The test of the nutrient solution shows an itaconic acid content of about 4 g / 100 ccm.

Zu diesem Zeitpunkt wird der pH-Wert durch Zugabe eines halben Äquivalents Kalk auf etwa 3,8 eingestellt; die Gärung wird weitere 48 Stunden bei 40° C bei gleicher Belüftung und Rührung fortgesetzt. Dann wurde festgestellt, daß die Nährlösung etwa 170 g Itakonsäure enthielt und im wesentlichen frei von anderen organischen Säuren war. Das Produkt kann in Salz- oder Säureform gewonnen werden, wenn man bei einem geeigneten pH-Wert einengt, kühlt und auskristallisiert. Das Produkt kann gegebenenfalls weitergereinigt werden, indem man es aus Wasser oder anderen Lösungsmitteln umkristallisiert.At this point the pH is adjusted by adding half an equivalent Lime set to about 3.8; the fermentation will take another 48 hours at 40 ° C same ventilation and stirring continued. Then it was found that the nutrient solution contained about 170 g of itaconic acid and was essentially free of other organic acids Acids was. The product can be obtained in salt or acid form if one is at Concentrates to a suitable pH, cools and crystallizes out. The product can optionally further purified by removing it from water or other solvents recrystallized.

Beispiel 2 Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei A. itaconicus an Stelle von A. terreus verwendet wird. Auch diesmal werden ausgezeichnete Itakonsäureausbeuten erzielt. Beispiel 3. Rübenmelasse, verdünnt auf 18°/o (Gew./Vol.) Zucker . . . . . . . . . . . . . . 200 eem Zückerrohrmelasse . . . . . . . . . . . . . . . . . 1800 ccm Die angegebenen Bestandteile werden vereinigt, heiß sterilisiert und mit einer Suspension von A. terreus-Sporen geimpft. Die subiaerse Gärung erfolgt bei 35 bis 40° C, während Luft mit einer Geschwindigkeit von 11/Min. zugeleitet wird, bis ein Itakonsäuregehalt von etwa 5 g/100 ccm erreicht ist. Zu diesem Zeitpunkt werden 2011/o der Säure durch Zugabe von Kalk neutralisiert, .die Gärung wird fortgeführt wie bisher, bis aufeinanderfolgende Proben anzeigen, daß die Produktbildung unwesentlich geworden ist. Die Nährlösung wird filtriert und eingeengt, wonach das Produkt in hoher Ausbeute kristallisiert.Example 2 The procedure of Example 1 is repeated using A. itaconicus in place of A. terreus. This time, too, excellent itaconic acid yields are achieved. Example 3. Beet molasses, diluted to 18% (W / v) sugar. . . . . . . . . . . . . . 200 eem Sugar cane molasses. . . . . . . . . . . . . . . . . 1800 cc The stated components are combined, sterilized while hot and inoculated with a suspension of A. terreus spores. The subiaerse fermentation takes place at 35 to 40 ° C, while air at a rate of 11 / min. is fed until an itaconic acid content of about 5 g / 100 ccm is reached. At this point in time, 2011 / o of the acid is neutralized by adding lime. Fermentation is continued as before, until successive samples indicate that the product formation has become insignificant. The nutrient solution is filtered and concentrated, after which the product crystallizes in high yield.

Beispiel 4 Rübenmelasse, verdünnt auf 10% (Gew./Vol.) Zucker . . . . . . . . . . . . . . 600 ccm Glukose, 1011/9 (Gew./Vol.) wäßrige Lösung ........... . ........... 1400 cem Das vereinigte sterile Medium wird mit A. terreus-Sporen geimpft und eine subrnerse aerabe Gärung bei 40 bis 41° C durchgeführt, bis sich 2 g Itak_onsäure je 100 ccm gebildet haben. Darauf wird so viel Ammoniak zugefügt, daß die Hälfte der Säure, neutralisiert wird; die Gärung wird wie vorher fortgeführt, wobei Itakonsäure in hoher Ausbeute erzeugt wird.Example 4 Beet molasses, diluted to 10% (W / v) sugar. . . . . . . . . . . . . . 600 cc Glucose, 1011/9 (w / v) aqueous Solution ........... . ........... 1400 cem The combined sterile medium is inoculated with A. terreus spores and a subrneral aerobic fermentation is carried out at 40 to 41 ° C. until 2 g of itaconic acid per 100 ccm have formed. Then enough ammonia is added that half of the acid is neutralized; fermentation continues as before, producing itaconic acid in high yield.

Beispiel 5 Rübenmelasse, verdünnt auf 1511/o (Gew./Vol.) Zucker . . . . . . . . . . . . . . 600 ccm Fruktose, 15 0/0 (Gew./Vol.) wäßrige Lösung ......................... 1400 cem Das vereinigte sterile Medium wird mit A. terreus-Sporen geimpft, und eine submerse, aerobe Gärung wird bei 40 bis 41° C durchgeführt, bis die. Geschwindigkeit, mit der sich Itakonsäure bildet, unwesentlich wird. Das Produkt wird in guter Ausbeute gewonnen.Example 5 Beet molasses, diluted to 1511 / o (W / v) sugar. . . . . . . . . . . . . . 600 cc Fructose, 15% (w / v) aqueous Solution ......................... 1400 cem The combined sterile medium is inoculated with A. terreus spores and a submerged aerobic fermentation is carried out at 40 to 41 ° C until the. The rate at which itaconic acid is formed is insignificant. The product is obtained in good yield.

Claims

Claim: Process for the biochemical production of itaconic acid by submerged aerobic fermentation of carbohydrates containing nutrient media by means of Asporgillus terreus or Aspergillus itaeoni "eus, characterized in that about 10 to 301 / o of the carbohydrates are used in the form of beet molasses. Into consideration Extracted publications: German Auslegeschrift No. 1086 654; USA., Patent specification No. 2,657,173; ".Zucker", 1962, p. 33; "Chemieal Engeneering", 1955, issue 6, p. 116 and 118.