DE1181703B

DE1181703B - Process for the microbiological conversion of steroids and fatty acids

Info

Publication number: DE1181703B
Application number: DEW26373A
Authority: DE
Inventors: Stanley Glenn Knight
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1958-09-15
Filing date: 1959-09-14
Publication date: 1964-11-19
Also published as: CH421028A

Description

Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroiden und Fettsäuren Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroiden und Fettsäuren mit Hilfe von Sporen, die während der Züchtung in einem Nährstoffmedium durch vegetatives Wachstumsmaterial gebildet worden sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Einführung von Sauerstoff in Steroide, zur Einführung von Doppelbindungen in Steroide und zur Umwandlung von Fettsäuren, die mindestens 4 Kohlenstoffatome enthalten, in Ketone geeignet.Process for the microbiological conversion of steroids and fatty acids The invention relates to a method for the microbiological conversion of steroids and fatty acids with the help of spores, which during cultivation in a nutrient medium have been formed by vegetative growth material. The inventive method is especially for the introduction of oxygen into steroids, for the introduction of double bonds into steroids and to convert fatty acids that have at least 4 carbon atoms contained, suitable in ketones.

Die mikrobiologische Umwandlung von Steroiden erfolgte bisher meistens in einem Nährstoffe enthaltenden Gärmedium, das z. B. Maisquellwasser, Sojabohnenmehl u. dgl. zusammen mit Melasse und Rohrzucker u. dgl. als assimilierbare Quellen von sowohl Stickstoff als auch Kohlenstoff enthielt, und in Gegenwart des erhaltenen Mycels und der während der Gärung gebildeten alkoholischen Flüssigkeit. Verfahren dieser Art sind z. B. in den USA.-Patentschriften 2 753 290 und 2 793 162 beschrieben.The microbiological conversion of steroids has so far mostly taken place in a nutrient-containing fermentation medium which z. B. Corn steeple, soybean meal and the like together with molasses and cane sugar and the like as assimilable sources of contained both nitrogen and carbon, and in the presence of the obtained Mycelium and the alcoholic liquid formed during fermentation. procedure of this type are z. In U.S. Patents 2,753,290 and 2,793,162.

Derartige Umwandlungen sind ferner schon sowohl mit dem Mycel als auch mit der alkoholischen Gärflüssigkeit allein vorgenommen worden. Auch die Verwendung einer überstehenden Flüssigkeit, die aus zerkleinertem Mycel erhalten worden ist, ist schon vorgeschlagen worden. Ein solches Verfahren ist besonders in der USA.-Patentschrift 2 602 769 und speziell im Beispiel 18, Spalte 33 bis 34 dieser Patentschrift, beschrieben worden. Wie in diesem Beispiel ausgeführt worden ist; ergibt die überstehende Flüssigkeit eine beträchtliche, die alkoholische Gärflüssigkeit eine bessere und der Mycelrückstand eine vollständige Umwandlung. Die sogenannte »Oxydationsaktivität«, auf die die Umwandlung zurückzuführen ist, wird bekanntlich von Enzymen bewirkt, und wie aus der genannten Patentschrift 2 602 769 ferner bekannt ist, sind die während der Gärung gebildeten Enzyme sowohl mit dem Mycel als auch mit der alkoholischen Gärflüssigkeit verbunden.Such transformations are also already with the mycelium as has also been done with the alcoholic fermentation liquor alone. Also the use a supernatant fluid obtained from crushed mycelium, has already been proposed. One such method is particularly in U.S. Patent 2,602,769 and specifically in Example 18, columns 33 to 34 of this patent been. As has been done in this example; gives the supernatant liquid a considerable one, the alcoholic fermentation liquid a better one and the mycelial residue a complete transformation. The so-called "oxidative activity" to which the Conversion is known to be effected by enzymes, and how from of the aforementioned patent specification 2 602 769 is also known, are those during fermentation enzymes formed both with the mycelium and with the alcoholic fermentation liquid tied together.

Die Gewinnung der umgewandelten Steroide aus dem Gärungsmedium bietet Schwierigkeiten. Auch die Gewinnung in guten Ausbeuten entweder aus dem das vegetative Wachstum enthaltenden Mycel oder aus der organische Nährstoffe enthaltenden alkoholischen Gärflüssigkeit, die beide von Gärungsnebenprodukten verunreinigt sind, bietet Schwierigkeiten. Im Hinblick darauf sind sowohl verbesserte Gewinnungsverfahren (z. B. Extraktionsverfahren) als auch Verfahren gesucht worden, bei denen die Umwandlung mit Enzymen, die sowohl von Mycel als auch von alkoholischer Gärflüssigkeit frei sind, erfolgen sollte. Dabei konnte jedoch kein geeigneter Enzymextrakt gefunden werden, der eine angemessene Umwandlung bewirkt hätte, so daß bei technischen Arbeitsverfahren entweder das vollständig vergorene Medium, das sowohl Mycel als auch alkoholische Gärflüssigkeit enthält oder das Mycel oder die alkoholische Gärflüssigkeit allein, die durch Filtrieren des vergorenen Mediums erhalten worden ist, verwendet worden ist.Obtaining the converted steroids from the fermentation medium provides Trouble. Also the extraction in good yields either from the vegetative Mycelium containing growth or from the alcoholic containing organic nutrients Fermentation liquor, both contaminated with fermentation by-products, presents difficulties. In view of this, both improved recovery processes (e.g. extraction processes) and processes have been sought in which the conversion with enzymes that both are free of mycelium and alcoholic fermentation liquid. However, no suitable enzyme extract could be found that was adequate Conversion would have effected, so that in technical working processes either the complete fermented medium that contains both mycelium and alcoholic fermentation liquor or the mycelium or the alcoholic fermentation liquor alone obtained by filtering of the fermented medium has been obtained has been used.

Bei Versuchen zur Umwandlung von Fetten, z. B. von Milchfett, in stark schmeckende Mittel mit hilfe von Pilzen vom Stamm Penicillium, z. B. P.roqueforti, wurde festgestellt, daß die Gärzeit bei Verwendung einer vegetativen Pilzkultur (Pilzzellen in Mycelform mit Nährstoffwachstumsmedium) z. B. 2 Tage betrug und somit verhältnismäßig kurz war im Vergleich zu der Gärzeit von z. B. 4 Tagen, die bei der Verwendung von Sporen nötig war. Es wurde ferner festgestellt, daß die Gärzeit bei Verwendung von z. B. 7 Tage alte Sporen. enthaltenden vegetativen Pilzkulturen oder von Sporen allein länger als die mit jungen, z. B. 2 Tage alten, praktisch sporenfreien vegetativen Pilzkulturen erforderliche Gärzeit war. Das schien die seit langem vertretene Ansicht zu bestätigen, daß dit:Sporen als solche im Vergleich zu den im Hinblick auf den Stoffwechsel sehr aktiven, jungen Mycelzellcn; praktisch inaktiv, d. h. verhältnismäßig inert oder tot sind. Bei weiteren Versuchen erwies sich allerdings diese Annahme insofern als ungenau, als nach der Einwirkung von fettspaltenden Enzymen, wie Lipase, auf das Fett in Milch gefunden wurde, daß nun die Sporen unerwarteterweise selbst die erhaltenen freien Fettsäuren im Verlauf weniger Stunden in Ketone umwandelten. Bei dieser Umsetzung wird durch die Sporen an dem Kohlenstoff atom 2 eine Ketongruppe (C = O) eingeführt, worauf die Fettsäure decarboxyliert wird. Diese Umsetzung kann durch die folgende Gleichung wiedergegeben werden wobei R eine Alkylgruppe ist, die z. B. 1 bis 18 Kohlenstoffatorne oder mehr enthält. Wenn die Gruppe R eine Butylgruppe (- C,H9) ist, kann die Umsetzung durch die folgende Gleichung wiedergegeben werden Diese Entdeckung der Sporenaktivität gegenüber Fettsäuren führte zu der weiteren Entdeckung, daß Sporen, die von dem vergorenen Medium, zu dem sowohl das Mycel als auch die alkoholische Gärflüssigkeit gehört, frei sind, als solche zum Modifizieren von Verbindungen nach verschiedenartigen Verfahren verwendet werden können, die unten erläutert werden.When trying to convert fats, e.g. B. of milk fat, in strong-tasting means with the help of mushrooms from the strain Penicillium, z. BProqueforti, it was found that the fermentation time when using a vegetative fungal culture (fungal cells in mycelium form with nutrient growth medium) z. B. was 2 days and thus was relatively short compared to the fermentation time of z. B. 4 days, which was necessary when using spores. It was also found that the fermentation time when using z. B. 7 day old spores. containing vegetative fungal cultures or from spores alone longer than those with young, z. B. 2 day old, practically spore-free vegetative fungal cultures required fermentation time. This seemed to confirm the long held view that the spores as such in comparison with the young mycelial cells, which are very active with regard to metabolism; practically inactive, ie relatively inert or dead. In further experiments, however, this assumption turned out to be imprecise, as after the action of fat-splitting enzymes such as lipase on the fat in milk it was found that the spores themselves unexpectedly converted the free fatty acids obtained into ketones in the course of a few hours. In this reaction, a ketone group (C = O) is introduced by the spores on carbon atom 2, whereupon the fatty acid is decarboxylated. This conversion can be represented by the following equation where R is an alkyl group which e.g. B. contains 1 to 18 carbon atoms or more. When the group R is a butyl group (-C, H9), the reaction can be represented by the following equation This discovery of spore activity towards fatty acids led to the further discovery that spores, free from the fermented medium, which includes both the mycelium and the alcoholic fermentation liquor, can be used as such to modify compounds in a variety of ways explained below.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroiden und Fettsäuren mit Hilfe von Sporen, die während der Züchtung in einem Nährstoffmedium durch vegetatives Wachstumsmaterial gebildet worden sind, vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Sporen von dem vegetativen Wachstumsmaterial und dem Nährstoffe enthaltenden Züchtungsmedium abgetrennt werden und die mikrobiologische Umwandlung mit Hilfe der Sporen in einem von vegetativem Wachstumsmaterial und von Nährstoffen praktisch freien wäßrigen Medium unter Belüftung oder in Gegenwart von reinem Sauerstoff, gegebenenfalls unter Rühren und erhöhtem Druck, durchgeführt wird.According to the invention, a method for microbiological conversion is provided of steroids and fatty acids with the help of spores that are created during breeding in one Nutrient medium formed by vegetative growth material, suggested which is characterized in that the spores from the vegetative growth material and the culture medium containing nutrients are separated and the microbiological Transformation with the help of spores in one of vegetative growth material and of Nutrients practically free aqueous medium with aeration or in the presence of pure oxygen, optionally with stirring and elevated pressure, carried out will.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sporen können leicht aus vegetativen Zellen (Mycel) erhalten werden, die in einer untergetauchten Kultur in einem wäßrigen Maisquellflüssigkeit-Lactosemedium oder in einem anderen Nährstoffmedium, das in bekannter Weise für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sorgt, unter Belüftung (z. B. durch Schütteln) 4 bis 6 Tage gezüchtet worden sind. Die von den alten vegetativen Zellen gebildeten Sporen werden gewonnen, indem sie zwecks Entfernung des größten Teils des Mycels durch ein Tuch gepreßt und dann zwecks Entfernung des restlichen Mycels durch Glaswolle filtriert werden. Die in dem Filtrat enthaltenen und durch Zentrifugieren gewonnenen Sporen werden dann zwecks Entfernung etwa zurückgehaltener Nährstoffe mit Wasser gewaschen. Sie können in trockener Form gelagert oder erneut in destilliertem Wasser suspendiert und bei 4°C gehalten werden. Die Suspension kann standardisiert werden, so daß sie z. B. etwa 1 Milliarde Sporen je Kubikzentimeter enthält. Die Sporen können auch auf einer Oberflächenkultur, z. B. einer Nährstoffagarplatte, gezüchtet, dann abgeschabt uud in Wasser suspendiert werden, worauf sie, wie oben beschrieben, durch Abfiltrieren, Zentrifugieren u. dgl. in praktisch reiner Form gewonnen werden können. Eine Oberflächenkultur sollte verwendet werden, wenn die Organismen in einer untergetauchten Kultur keine oder nur schlecht Sporen bilden. Die Pilzarten der Reihe Mucorales, z. B. Rhizopus nigricans, bilden in einer untergetauchten Kultur keine Sporen; Sporen dieses Pilzes sollten deshalb, wie oben angegeben, durch Oberflächenkulturen hergestellt werden. Wenn das beste Verfahren zur Erzielung einer hohen Sporenbildung nicht bekannt ist, kann es durch Vorversuche leicht ermittelt werden.The spores used in the method according to the invention can can easily be obtained from vegetative cells (mycelium) that are submerged in a Culture in an aqueous corn steep liquor-lactose medium or other Nutrient medium known in a manner for assimilable carbon and nitrogen provided, have been grown with ventilation (e.g. by shaking) for 4 to 6 days. The spores formed by the old vegetative cells are obtained by using them for the purpose of removing most of the mycelium pressed through a cloth and then for the purpose of Remove the remaining mycelium by filtering through glass wool. The one in the filtrate The spores contained and obtained by centrifugation are then used for removal any retained nutrients are washed with water. You can in dry form stored or resuspended in distilled water and kept at 4 ° C. The suspension can be standardized so that it can contain e.g. B. about 1 billion spores contains per cubic centimeter. The spores can also be grown on a surface culture, z. B. a nutrient agar plate, grown, then scraped and suspended in water are, whereupon, as described above, by filtration, centrifugation and the like. Like. Can be obtained in practically pure form. A surface culture should used when the organisms in a submerged culture have no or spores only poorly. The mushroom species of the Mucorales series, e.g. B. Rhizopus nigricans, do not spore in a submerged culture; Spores of this fungus should therefore, as indicated above, can be made by surface culture. if The best method for achieving high sporulation is unknown, may it can easily be determined by preliminary tests.

Zwecks schneller Umwandlung durch die Sporen sollte die Verbindung eine feine Teilchengröße aufweisen. Dies kann leicht erfolgen, indem z. B. das Steroid in einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem niederen Alkohol (Methanol, Äthanol u. dgl.), mit Wasser mischbaren Glykolen, Aceton od. dgl., gelöst und die organische Lösung einer wäßrigen Suspension der Sporen zugesetzt wird. Dabei fällt das Steroid in der gewünschten Form als feine Suspension aus der Lösung aus. Die Gewinnung des umgewandelten Steroids in der gewünschten hohen Ausbeute mit organischen Lösungsmitteln, in denen das Steroid löslich ist, erfolgt ohne Schwierigkeiten, weil vegetatives Wachstum (Mycel) und die alkoholische Gärflüssigkeit mit den restlichen Nährstoffen wie auch die während der Gärung gebildeten komplexen Nebenprodukte nicht zugegen sind. Das beanspruchte Verfahren zeichnet sich besonders dadurch aus, daß die Sporen nach der Verwendung leicht zurückgewonnen und erneut verwendet werden können. Dazu wird das Steroid in dem Umsetzungsgemisch vorzugsweise mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Propylenglykol, löslich gemacht, worauf das erhaltene Gemisch zwecks Gewinnung der Sporen zentrifugiert und das sporenfreie Medium, wie oben angegeben, zwecks Gewinnung des Steroids mit einem Lösungsmittel extrahiert wird. Die vorzugsweise mit Wasser gewaschenen Sporen können dann erneut verwendet werden, wenn sie in einem Medium gehalten werden, dem ein oder mehrere Nährstoffe fehlen und das die Sporen vor dem Keimen bewahrt. Das Verfahren, bei dem nur Sporen verwendet werden, und die Tatsache, daß diese erneut verwendet werden können, stellen gegenüber den bisher verwendeten Gärverfahren große Verbesserungen dar.For the purpose of rapid conversion by the spores, the connection should have a fine particle size. This can easily be done by e.g. B. the steroid in an inert, water-miscible organic solvent, e.g. B. a lower one Alcohol (methanol, ethanol, etc.), water-miscible glycols, acetone or the like. Like., dissolved and added the organic solution to an aqueous suspension of the spores will. The steroid falls out of the desired form as a fine suspension Solution. Obtaining the converted steroid in the desired high yield with organic solvents, in which the steroid is soluble, is done without difficulty, because vegetative growth (mycelium) and the alcoholic fermentation liquor with the rest Nutrients as well as the complex by-products formed during fermentation are present. The claimed method is particularly characterized in that the spores are easily recovered and reused after use can. For this purpose, the steroid is preferably in the conversion mixture with a Water-miscible solvents, such as propylene glycol, are made soluble, whereupon the The resulting mixture is centrifuged to obtain the spores and the spore-free Medium as indicated above for the purpose of recovering the steroid with a solvent is extracted. The spores, preferably washed with water, can then again be used when kept in a medium to which one or more There is a lack of nutrients and that keeps the spores from germinating. The procedure at that only spores are used, and the fact that they are reused can represent major improvements over the previously used fermentation processes represent.

Die Umwandlung des Steroids kann sowohl mit reinem Sauerstoff als auch mit Luft erfolgen. Die Belüftung kann auch unter Rühren und dem Druck von Sauerstoffgasen erfolgen. Eine geringe Menge KCN (0,65 Mol) oder CO wie auch eine geringe Menge Glucose (wie 0;5°/0) kann dem Sporenmedium während der Umwandlung zugesetzt werden. Es ist gefunden worden, daß durch die Zugabe einer geringen Menge eines oxydierbaren Materials, wie Glucose, Essigsäure, Milchsäure u. dgl., die Ausbeuten erhöht werden. Diese Modifizierungen können sowohl die schnelle als auch die vollständige Umwandlung der Steroide unterstützen; wenn jedoch Glucose oder eine ähnliche Substanz verwendet wird, ist es wichtig, daß das Medium - zwecks Verhinderung des Keimens - von assimilierbarem Stickstoff frei ist.The conversion of the steroid can be done with pure oxygen as well can also be done with air. Aeration can also be done with stirring and the pressure of oxygen gases take place. A small amount of KCN (0.65 moles) or CO as well as a small amount Glucose (such as 0.50 / 0) can be added to the spore medium during the conversion. It has been found that by adding a small amount of an oxidizable Material such as glucose, acetic acid, lactic acid and the like, the yields can be increased. These modifications can be both quick and full conversion support of steroids; but if glucose or a similar Substance is used, it is important that the medium - in order to prevent the Germination - is free of assimilable nitrogen.

Nach dem oben angegebenen Verfahren können Sporen, die von Mycel und Nährstoffmedium frei sind, aus verschiedenartigen Organismen gewonnen und zur mikrobiologischen Herstellung chemischer Verbindungen, z. B. zum Einführen verschiedenartiger Gruppen und von Doppelbindungen in verschiedenartige Steroidmoleküle, verwendet werden. An Stelle der in den unten angegebenen Literaturstellen erläuterten Organismen, die zum Einführen einer Hydroxygruppe oder einer Doppelbindung in ein Steroidmolekül durch Gärung einer vegetativen Pilzkultur in einem wäßrigen Nährstoffmedium verwendet werden, können die : Sporen des gleichen Organismus, die von dem Mycel und Nährstoffen frei sind, als solche erfindungsgemäß zum Einführen der gleichen Gruppe oder einer Doppelbindung in das gleiche Steroidmolekül verwendet werden.Following the above procedure, spores caused by mycelium and Nutrient medium are free, obtained from various organisms and used for microbiological purposes Manufacture of chemical compounds, e.g. B. to introduce diverse groups and of double bonds in various steroid molecules. Instead of the organisms explained in the literature references below, those for introducing a hydroxyl group or a double bond into a steroid molecule used by fermentation of a vegetative fungal culture in an aqueous nutrient medium can be the: spores of the same organism that the mycelium and nutrients are free as such according to the invention for introducing the same group or one Double bond can be used in the same steroid molecule.

Die folgenden mikrobiologischen Umwandlungen sind hierfür Beispiele: 1. Reduktion von Progesteron zu d 4-Pregnen-20ß-ol-3-on mit Streptomyces lavendulae (vgl. J. F r i e d u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, S. 5764 [1953]).The following microbiological conversions are examples of this: 1. Reduction of progesterone to d 4-pregnen-20β-ol-3-one with Streptomyces lavendulae (see J. Fri e d et al., J. Am. Chem. Soc., 75, p. 5764 [1953]).

2. Dehydrierung von sekundären Alkoholen.2. Dehydration of secondary alcohols.

a) d5-Androsten-3ß,17ß-diol zu Testosteron mit Proactinomyces erythropolis (vgl. G. E. T u r f i t t, Biochem. J., 40, S.79 [1946]).a) d5-androstene-3ß, 17ß-diol to testosterone with Proactinomyces erythropolis (cf. G. E. T u r f i t t, Biochem. J., 40, p.79 [1946]).

b) Östradiol zu Östron mit Streptomyces albus (vgl. M. W e 1 s c h u. a., Compt. rend. soc. biol., 142, S.1074 [l948]).b) Oestradiol to oestrone with Streptomyces albus (cf. M. W e 1 s c h inter alia, Compt. rend. soc. biol., 142, p.1074 [1948]).

3. Hydroxylierung in Stellung 1.3. Hydroxylation in position 1.

d 4-Androsten-3,17-dion zu d 4-Androsten-l a-ol-3,17-dion mit Penicillium sp., (vgl. R. M. D o ds o n u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S. 3921 [1957]).d 4-Androstene-3,17-dione to d 4-Androstene-la-ol-3,17-dione with Penicillium sp., (see R. M. Dodson et al., J. Am. Chem. Soc., 79, p. 3921 [1957]).

4. Hydroxylierung in Stellung 2.4. Hydroxylation in position 2.

A4 -Pregnen-17oc,21-diol-3,20-dion zu d 4-Pregnen-2ß,17a,21-triol-3,20-dion mit Streptomyces 5p. (vgl. H. L. H e r z o g u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S.3922 [19571). A4- Pregnen-17oc, 21-diol-3,20-dione to d 4-Pregnen-2β, 17a, 21-triol-3,20-dione with Streptomyces 5p. (cf. HL H erzog et al., J. Am. Chem. Soc., 79, p.3922 [1957 1 ).

5. Hydroxylierung in Stellung 6.5. Hydroxylation in position 6.

Progesteron zu d 4-Pregnen-6ß-ol-3,20-dion mit Streptomyces aureofaciens (vgl. J. F r i e d u. a., Recent Progr. Hormone Res., 11, S.157 [1955]. Vergleiche auch E. L. D u 1 a n e y u. a., Mycologia, 47, S.464 [1955]; J. F r i e d u. a., J. Am. Chem. Soc., 74, S.3962 [1952]; P. D. M e i s t e r u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, S.416 [1953]; und S. H. E p p s t e i n u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, S.408 [1953] betreffend die Mikroorganismen Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger und Rhizopus arrhizus).Progesterone to d 4-pregnen-6β-ol-3,20-dione with Streptomyces aureofaciens (cf. J. F r i e d et al., Recent Progr. Hormone Res., 11, p.157 [1955]. Compare also E. L. D u 1 a n e y et al., Mycologia, 47, p.464 [1955]; J. F r i e d u. A., J. Am. Chem. Soc., 74, p.3962 [1952]; P. D. M e i s t e r et al., J. Am. Chem. Soc., 75, p.416 [1953]; and S. H. E p p s t e i n et al., J. Am. Chem. Soc., 75, p.408 [1953] concerning the microorganisms Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger and Rhizopus arrhizus).

6. Hydroxylierung in Stellung 7.6. Hydroxylation in position 7.

Progesteron zu d4-Pregnen-7a-ol-3,20-dion mit Phycomyces blakesleanus (vgl. J. F r i e d u. a., USA.-Patentschrift 2 753 290. Vergleiche auch C. M e y s t r e u. a., Helv. Chim. Acta, 38, S.381 [1955]; hier wird eine Art von Peziza für einen ähnlichen. Umsetzungstyp bei Desoxycorticosteron verwendet). 7. Hydroxylierung in Stellung 10, 11 oder 12.Progesterone to d4-pregnen-7a-ol-3,20-dione with Phycomyces blakesleanus (See J. F r i e d et al., U.S. Patent 2,753,290. See also C. M e y s t r e et al., Helv. Chim. Acta, 38, p.381 [1955]; here is some kind of peziza for a similar one. Implementation type used in deoxycorticosterone). 7. hydroxylation in position 10, 11 or 12.

ä) 19-NQr-progesteron zu 10-@-Hydroxy-19-norprogesteron mit Rhizopus nigricans (vgl. R. L. P e d e r s o: n, u. a., J. Am. Chem. Soc., 78, S.1512 [1956]).ä) 19-NQr-progesterone to 10 - @ - hydroxy-19-norprogesterone with Rhizopus nigricans (cf. R. L. P e d e r s o: n, inter alia, J. Am. Chem. Soc., 78, p.1512 [1956]).

b) Progesteron zu d4-Pregnen-lla-ol-3,20-dion mit Rhizopus arrhizus (vgl. D. H. P e t er -s o n u. a., J. Am: Chem. Soc., 74, S.1871 [1952]. Vergleiche auch D. H. P e t e r s o n u. a.,: J. Am: Chem. Soc., 75, S.412 [1953]).b) Progesterone to d4-pregnen-lla-ol-3,20-dione with Rhizopus arrhizus (cf. D. H. P e t er -s o n et al., J. Am: Chem. Soc., 74, p.1871 [1952]. Compare also D. H. P e t e r s o n et al.,: J. Am: Chem. Soc., 75, p. 412 [1953]).

c)' Reichsteinsche Verbindung S (d 4-Pregnen-17a,21- diö1= 3,20 - dion) zu Hydrocortison (d4-Pregneri-Ilß,17a,21-triol-3,20-dion) mit Cunninghamella blakesleeana (vgl. F. R. H a n s o n- u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, `S. 5369 [1953}: Vergleiche auch G. M. S h u 11 u. a., J: Am. Chem. Soc.; 77, S.763 [1955], und T h o m a u. a., USA: Patentschrift 2 793 162, `betreffend ähnliche Umsetzungen mit Curvularia lunata, Trichothecium roseum und Coniothyrium helleborine.c) 'Reichstein connection S (d 4-Pregnen-17a, 21-diö1 = 3.20 - dione) to hydrocortisone (d4-Pregneri-Ilß, 17a, 21-triol-3,20-dione) with Cunninghamella blakesleeana (cf. F. R. H a n s o n u. a., J. Am. Chem. Soc., 75, `S. 5369 [1953}: See also G. M. S h u 11 et al., J: Am. Chem. Soc .; 77, p.763 [1955], and T h o m a et al., USA: Patent specification 2,793,162, `regarding similar reactions with Curvularia lunata, Trichothecium roseum and Coniothyrium helleborine.

d) Progesteron zu d 4-Pregnen-12ß-ol-3,20-dion und das dazugehörige 12ß,15ß-Diol mit Calnectria decora (vgl. A. S c h u b e r t u. a. Ber., 90, S.2576 [1957]). B. Die Hydroxylierung in anderen Stellungen sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben worden: P. D. M e i s t e r u. a., Absts. 123rd meeting Am. Chem. Soc. [1953]; F r i e d u. a., USA.-Patentschrift 2 753 290; B. C a m e r i n o u.. a., Gazz. chim. ital., 86, S.1226 [1956]; C. M e y s t r e u. a., Helv. Chim. Acta, 38, S. 381 [1955] ; D. P e r 1 m a n u. a., J. Am. Chem. Soc., 74, S.2126 [1952]; R. W. T h o m a u. a., J. Am. Chem. Soc., 79, S.4818 [1957]; E. L. D u 1 a n e y u. a., Appl. Microbiol., 3, S.372 [1955]; C. M e y s t r e u. a., Helv. Chim. Acta, 37, S. 1548 [1954]; W. J. Mc A 1 e e r u. a., Arch: Biochem. Biophys., 62, S.129 [1956]). 9. Dehydrierungen.d) Progesterone to d 4-pregnen-12ß-ol-3,20-dione and the associated 12ß, 15ß-diol with Calnectria decora (cf. A. S c h u b e r t et al. Ber., 90, p.2576 [1957]). B. The hydroxylation in other positions are in the following references has been described: P. D. M e i s t e r et al., Absts. 123rd meeting at. Chem. Soc. [1953]; F r i e d et al., U.S. Patent 2,753,290; B. C a m e r i n o u .. a., Gazz. chim. ital., 86, p.1226 [1956]; C. M e y s t r e et al., Helv. Chim. Acta, 38, p. 381 [1955]; D. P e r 1 m a n et al., J. Am. Chem. Soc., 74, p.2126 [1952]; R. W. Tho, et al., J. Am. Chem. Soc., 79, p.4818 [1957]; E. L. D u 1 a n e y et al., Appl. Microbiol., 3, p.372 [1955]; C. M e y s t r e et al., Helv. Chim. Acta, 37, p. 1548 [1954]; W. J. McA 1 e r et al., Arch: Biochem. Biophys., 62, p.129 [1956]). 9. Dehydrations.

Hydrocortison zu d14-Pregnadien-llß,17a-21-triol-3,20-dion mit Streptomyces lavendulae (vgl. F r i e d u. a.; USA.-Patentschrift 2 793 164. Vergleiche auch A. N o b i 1 e u. a., J. Am. Chem, Soc., 77, S.4184 [1955],; E. V i s c h e r u. a., Helv. Chim. Acta, 38, S.835, und 38, S..1502 [19551,- wobei Alternaria sp. bzw. Didyg#clla lycoperici. verwendet', wurde. Vergleiche ,, huch S p e r o u. a., J. Soc., 78, S: 6213.[1a56], wobei Septomyxa: affinis, wie in df.;okg gen Beispiel II, zur Einführung einer ;].(2.L>Qppelbindung verwendet worden ist).Hydrocortisone to d14-pregnadiene-llß, 17a-21-triol-3,20-dione with Streptomyces lavendulae (cf. F r i e d et al .; U.S. Patent 2,793,164. See also A. N o b i 1 e et al., J. Am. Chem, Soc., 77, p. 4184 [1955]; E. V i s c h e r u. a., Helv. Chim. Acta, 38, p.835, and 38, p.1502 [19551, - where Alternaria sp. respectively. Didyg # clla lycoperici. was used. Compare ,, huch S per o u. A., J. Soc., 78, S: 6213. [1a56], where Septomyxa: affinis, as in df .; okg example II, to introduce a;]. (2. L> Qppel bond has been used).

10: Abbau der Seitenkette: Progesteron> Zu- di4-Andröstadien 3,17-dxö47 mit Streptomyces laendulae (vgl. G. E. P e t e r s ö n u., a., J.. Bactl., 74,#, S. 684 [1957]. Vergleiche auch E. V i s c. h e x ü. , Experientia, 9, S.371 [1953], wobei durch Üusarium solani und F. caucasicum bei einer. Spaltung der Seitenkette eine 1(2)-Doppelbindung eing@fülirt wird. Vergleiche auch G. E. T: u r ;f i t t, Biochem. J., 42,S.376 [1948]).10: Degradation of the side chain: progesterone> zu-di4-andröstadiene 3,17-dxö47 with Streptomyces laendulae (cf. G. E. P e t e r s ö n u., a., J .. Bactl., 74, #, P. 684 [1957]. Compare also E. V i s c. h e x ü. , Experientia, 9, p.371 [1953], whereby by Üusarium solani and F. caucasicum in one. Cleavage of the side chain a 1 (2) double bond is inserted. Compare also G. E. T: u r; f i t t, Biochem. J., 42, p.376 [1948]).

Sporen bildende ;@ikioorgänisinen, deren Sporen in einem von vegetäriivenä Wachstu_ tn und Nährstoffen freien Medium _ erfindunsgemaß verwendet; werden können, sind auch in den USA.-Patentschriften 2 602 769, 2 649 400, 2 649 401, 2 649 402, 2 695 260, 2 735 800, 2 753 290, 2 762 747, 2 768 928, 2 789 940, 2 802 775, 2 809 919, 2 812 285 und 2 830 937 beschrieben worden.Spore-forming; @ ikioorgänisinen, the spores of which in one of vegetäriivenä Growth and nutrient-free medium used according to the invention; will can, are also in U.S. Patents 2,602,769, 2,649,400, 2,649,401, 2,649,402, 2 695 260, 2 735 800, 2 753 290, 2 762 747, 2 768 928, 2 789 940, 2 802 775, 2 809 919, 2,812,285 and 2,830,937.

Die zur Durchführung der Umwandlung mit Sporen benötigte Zeit (die in jedem Fall durch Vorversuche leicht bestimmt werden kann) ist gewöhnlich gegenüber der bei bekannten Verfahren erforderlichen Zeit wesentlich kürzer, wobei noch eine erhöhte Ausbeute erzielt wird. Von der kürzeren Zeitdauer abgesehen, ist die Gewinnung der modifizierten Verbindung (die auch nach den Verfahren der Literaturstellen erfolgen kann) in guten Ausbeuten aus dem verhältnismäßig reinen Umsetzungsgemisch des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich leichter als die Gewinnung aus den bisher verwendeten Gärungsgemischen, die vegetatives Wachstum, organische Nährstoffe, Nebenprodukte derselben u. dgl. enthalten. Die Reinigung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifizierten Verbindung nach der Abtrennung ist ebenfalls wesentlich einfacher als die Reinigung der stark verunreinigten Gemische, die nach den bekannten Verfahren erhalten worden sind.The time required to carry out the conversion with spores (the in any case can easily be determined by preliminary tests) is usually opposite the time required in known methods is significantly shorter, with one more increased yield is achieved. Apart from the shorter period of time, the extraction the modified compound (which are also carried out according to the procedures of the literature references can) in good yields from the relatively pure reaction mixture of the invention Process much easier than the extraction from the fermentation mixtures used so far, the vegetative growth, organic nutrients, by-products of the same and the like. contain. The purification of the modified by the process according to the invention Connection after disconnection is also much easier than cleaning the highly contaminated mixtures obtained by the known processes are.

Es können auch zwei Umwandlungen gleichzeitig durchgeführt werden, wenn Sporen verschiedener Pilze verwendet werden; der Unterschied kann so gering wie der Unterschied zwischen den Stämmen des gleichen Pilzes oder so groß wie ein Unterschied zwischen den Klassen sein. Dieser Unterschied kann auch durch Mutation eines besonderen Organismus erreicht werden.Two conversions can also be carried out at the same time, when using spores of various mushrooms; the difference can be so small like the difference between the stems of the same mushroom or as big as one Difference between classes. This difference can also be due to mutation of a particular organism.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel I Ein Nährstoffmedium aus Glucose-Neopepton [sogenanntes Sabourauds-Medium, beschrieben in Difeo-Handbuch, S.200, 9.Auflage (1953)], das mit 20/0 Agar verfestigt worden war, wurde in bekannter Weise zunächst mit Aspergillus ochraceus angeimpft und dann bei einer Temperatur von etwa 30°C etwa 5 Tage lang bebrütet. Die während dieses Zeitraums gebildeten Sporen wurden von der Oberfläche des vegetativen Mycelwachstums mit destilliertem Wasser abgewaschen. Die erhaltene, mit etwas Mycel und Nährstoffmedium verunreinigte wäßrige Suspension wurde zwecks Entfernung des Mycels und unlöslicher Nährstoffe durch Glaswolle filtriert und dann zwecks Gewinnung der Sporen zentrifugiert. Die löslichen Nährstoffe in dem Medium, die von den Sporen zurückgehalten worden waren, wurden anschließend entfernt, indem die Sporen in destilliertem Wasser suspendiert und dann zwecks Gewinnung der Sporen zentrifugiert wurden. Diese Waschstufe (erneutes Suspendieren der Sporen in destilliertem Wasser und Abzentrifugieren) kann gegebenenfalls wiederholt werden, so daß die Sporen von allem verunreinigenden Nährstoffmaterial als auch vom Mycel praktisch frei sind.The following examples explain the process according to the invention. Example I A nutrient medium made from glucose neopeptone [so-called Sabourauds medium, described in Difeo-Handbuch, p.200, 9th edition (1953) ] , which had been solidified with 20/0 agar, was first treated in a known manner with Aspergillus ochraceus inoculated and then incubated at a temperature of about 30 ° C for about 5 days. The spores formed during this period were washed off the surface of the mycelial vegetative growth with distilled water. The resulting aqueous suspension, contaminated with some mycelium and nutrient medium, was filtered through glass wool to remove the mycelium and insoluble nutrients and then centrifuged to obtain the spores. The soluble nutrients in the medium that had been retained by the spores were then removed by suspending the spores in distilled water and then centrifuging them to collect the spores. This washing step (resuspension of the spores in distilled water and centrifugation) can optionally be repeated so that the spores are practically free from all contaminating nutrient material and from the mycelium.

Die in der oben angegebenen Weise erhaltenen Sporen wurden in destilliertem Wasser, das mit einer etwa l%igen Phosphatpufferlösung auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 gepuffert worden war, zwecks Herstellung einer Suspension suspendiert, die etwa 1 bis 10 Milliarden Sporen je Kubikzentimeter enthielt. Zu etwa 20 ccm dieser Suspension in einem 125 ccm fassenden Erlenmeyerkolben wurde dann eine Lösung von 1 mg Progesteron in 1 ccm Propylenglykol gegeben. Da das Glykol mit Wasser mischbar und das Progesteron in Wasser unlöslich ist, fällt das Progesteron in Form einer feinen Suspension aus der Lösung aus, wenn diese Lösung der gepufferten wäßrigen Suspension zugesetzt wird. Die erhaltene Suspension aus Sporen und Progesteron wurde dann durch Schütteln auf einer Drehschüttelvorrichtung, die bei einem Radius von 6,35 mm etwa 150 Umdrehungen je Minute machte, etwa 12 Stunden lang bei einer Temperatur von etwa 25°C belüftet.The spores obtained in the above manner were suspended in distilled water which had been buffered to a pH of 6.5 to 7.0 with an about 1% phosphate buffer solution to make a suspension containing about 1 to 10 billion Contained spores per cubic centimeter. A solution of 1 mg of progesterone in 1 cc of propylene glycol was then added to about 20 cc of this suspension in a 125 cc Erlenmeyer flask. Since the glycol is miscible with water and the progesterone is insoluble in water, the progesterone precipitates out of the solution in the form of a fine suspension when this solution is added to the buffered aqueous suspension. The resulting suspension of spores and progesterone was then aerated by shaking on a rotary shaker rotating about 150 revolutions per minute at a radius of 6.35 mm for about 12 hours at a temperature of about 25 ° C.

Anschließend wurde die die Sporen und das Steroid enthaltende Suspension mit Chloroform extrahiert und der Auszug zwecks Abtrennung des unlöslichen Materials und Trennung der wäßrigen Phase von dem Chloroform zentrifugiert. Der erhaltene, klare, sporenfreie Auszug enthielt das gewünschte 11 a-Hydroxyprogesteron, das durch Abziehen des Chloroforms unter verringertem Druck leicht gewonnen werden konnte. Die Untersuchung des Produkts, das durch Vergleich mit einer bekannten Probe von lla-Hydroxyprogesteron identifiziert worden war, ergab, daß praktisch 100% des Progesterons in das gewünschte 11 a-Hydroxyderivat umgewandelt worden waren. Dieses Ergebnis zeigt, daß die oben verwendete Umwandlungszeit von 12 Stunden angemessen war und daß möglicherweise eine noch kürzere Zeit verwendet werden kann, um die Einführung der Hydroxygruppe in Progesteron mit Sporen von A. ochraceus in einem von Mycel und Nährstoffen praktisch freien Medium zu vervollständigen. Bei der praktischen Durchführung des beanspruchten Verfahrens kann das Verhältnis von Zeitdauer zu Konzentration der Sporen zwecks Erreichung bestimmter Ziele eingestellt werden. Beispiel 1I Das im Beispiell beschriebene Verfahren wurde wiederholt, nur wurden Sporen aus einer 10 bis 14 Tage alten Kultur von Septomyxa affinis und die Reichsteinsche Verbindung S in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 verwendet. Nach 24 Stunden wurde die erhaltene d i-Reichsteinsche Verbindung S nach dem im Beispiel I beschriebenen Verfahren gewonnen.The suspension containing the spores and the steroid was then added extracted with chloroform and the extract to separate the insoluble material and separating the aqueous phase from the chloroform by centrifugation. The received, clear, spore-free extract contained the desired 11 a-hydroxyprogesterone, which by Stripping off the chloroform under reduced pressure could be easily obtained. Examination of the product obtained by comparison with a known sample of Ila-hydroxyprogesterone had been identified to be practically 100% of the progesterone had been converted into the desired 11 a-hydroxy derivative. This result shows that the conversion time of 12 hours used above was adequate and that possibly an even shorter time can be used for the introduction the hydroxy group in progesterone with A. ochraceus spores in one of mycelium and nutrients to complete practically free medium. In the practical Carrying out the claimed method can be the ratio of time to concentration the spurs can be set in order to achieve certain goals. Example 1I That The procedure described in the example was repeated, only spores from one 10 to 14 day old culture of Septomyxa affinis and the Reichstein connection S used in a phosphate buffer with a pH of 7. After 24 hours it was the obtained d i-Reichstein compound S according to that described in Example I. Procedure won.

Beispiel III Einem l%igen wäßrigen Gemisch von Caprylsäure, das mit einem Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 6,5 gepuffert worden war, werden Sporen von P.roqueforti, die von vegetativem Kulturmedium und von Nährstoffen praktisch frei sind, in einem Verhältnis von etwa 100 000 000 Sporen je 3 ccm des wäßrigen Caprylsäuregeniisches zugesetzt. Das Gemisch wird dann etwa 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 25°C unter Belüftung gerührt. Das erhaltene Methylamylketon kann dann durch Destillieren oder ähnliche bekannte Verfahren gewonnen werden.Example III A 1% strength aqueous mixture of caprylic acid with was buffered to pH 6.5 in a phosphate buffer, spores become of P.roqueforti, that of vegetative culture medium and nutrients practical are free, in a ratio of about 100,000,000 spores per 3 ccm of the aqueous Caprylic acid added. The mixture is then about 2 hours at a Stirred at a temperature of about 25 ° C with aeration. The obtained methyl amyl ketone can then be obtained by distillation or similar known methods.

Beispiel IV Das im Beispiel 111 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch jeweils Capronsäure, Pelargonsäure und Caprinsäure für die Herstellung von Methylpropylketon, Methylhexylketon bzw. Methylheptylketon verwendet wurden. Durch Auswahl der geeigneten Fettsäure, die mindestens 4 Kohlenstoff= atome enthält, können andere Ketone nach einem gleichen Verfahren mit Hilfe von Sporen hergestellt werden, die nach dem oben angegebenen Verfahren hergestellt worden sind und keine vegetative Pilzkultur oder Nährstoffe enthalten.Example IV The process described in Example 111 was repeated, but using caproic acid, pelargonic acid and capric acid in each case for the preparation of methyl propyl ketone, methyl hexyl ketone and methyl heptyl ketone, respectively. By selecting the appropriate fatty acid, which contains at least 4 carbon atoms, other ketones can be produced by the same process with the aid of spores which have been produced according to the above process and do not contain any vegetative fungal culture or nutrients.

Beispiel V Sporen von Fusarium solani wurden in einer 1°Ngen Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert, und zwar bis zu einer Endkonzentration von 4 - 108 Sporen je Milliliter. Zu 20 m1 dieser Suspension in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben wurden 10 mg der Reichsteinschen Verbindung S, die in 0,4m1 Methanol gelöst war, und 0,4m1 einer 25°/oigen Glukoselösung hinzugefügt. Diese Suspension wurde dann auf einer Drehschüttelvorrichtung mit 2,5 cm Hub bei 200 Umdrehungen je Minute 48 Stunden bei 280C belüftet.EXAMPLE V Fusarium solani spores were suspended in a 1% phosphate buffer solution of pH 7.0 to a final concentration of 4-108 spores per milliliter. 10 mg of Reichstein's compound S, which was dissolved in 0.4 ml of methanol, and 0.4 ml of a 25% glucose solution were added to 20 ml of this suspension in a 125 ml Erlenmeyer flask. This suspension was then aerated on a rotary shaker with a 2.5 cm stroke at 200 revolutions per minute for 48 hours at 280C .

Danach wurde die die Sporen und das Steroid enthaltende Suspension zweimal mit je 20 ml Äthylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Der trokkene Rückstand wurde auf Papier im Zaffaroni-System (Toluol-Propylenglykol) chromategraphiert, auf dem sich Spuren der uriumgesetzten Verbindung S und ein dem Standard-d 1-S entsprechender Hauptfleck zeigte. Eine eindeutige Identifizierung dieses Produktes wurde durch Herstellung größerer Mengen des Umwandlungsproduktes erzielt. Das Umwandlungsprodukt wurde von der Verbindung S durch aufeinanderfolgende Kristallisation aus Chloroform, Methanol und Aceton getrennt. Die physikalischen Daten des kristallinen Umwandlungsproduktes waren folgende: Schmelzpunkt: 246bis248°C; [all'. =-r-81,3 (10/, in Chloroform); E' j = 15,950 bei 244 m#t; das Infrarotspektrum war identisch mit demjenigen der authentischen 1-Dehydroverbindung-S. Beispiel VI In der gleichen Weise wie im vorstehenden Beispiel V wurde die Reichsteinsche Verbindung S der Umwandlung mittels Sporn von Fusarium metismoides und Septomyxa affinis unterworfen. In jedem der Fälle wurde eine fast vollständige Umwandlung der Verbindung S in die Verbindung d I-S erzielt. Beispiel VII Sporen von Didymella lycopersici wurden in einer 1°/oigen Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert, und zwar bis zu einer Endkonzentration von 3 - 108 Sporen je Milliliter. Zu dieser Suspension wurden 0,2 ml einer 25°/oigen Glukoselösung und 10 mg der in 0,4 ml Methanol gelösten Reichsteinschen Verbindung S hinzugefügt. Das Gemisch wurde wie im Beispiel V beschrieben belüftet. Nach 72 Stunden wurde das Gemisch aus Sporen und dem Steroid nach der im Beispiel V beschriebenen Arbeitsweise extrahiert und ein steroidhaltiger Rückstand gewonnen. Die Papierchromatographie zeigte, daß dieser Rückstand hauptsächlich zwei Umwandlungsprodukte enthielt, von denen eines die gleiche Beweglichkeit wie Epi-F (4-Pregnen-lla,l7a,21-triol-3,20-dion) hatte und das andere weniger polar war. Eine größere Menge der Umwandlungsprodukte wurde wie vorstehend beschrieben erhalten, und die Umwandlungsprodukte wurden an einer Aluminiumoxydsäule getrennt. Das polarere der beiden Umwandlungsprodukte mit einem Schmelzpunkt von 210 bis 212°C und einem mit Standard-Epi-F identischen IR-Spektrum wurde eindeutig als diese Verbindung identifiziert. Das weniger polare Produkt wurde noch weiter gereinigt, und es wurde gefunden, daß es Spuren von einem polyhydroxyherten 17-Keto-Produkt enthielt und hauptsächlich aus einem Stoff bestand, welcher nach der Acetylierung ein Diacetat mit einem Schmelzpunkt von 195 bis 196°C und einem mit Standard-20ß,21-Diacetoxy-l7a-hydroxy-4-pregnen-3-on identischen IR-Spektrum ergab. Das Hauptumwandlungsprodukt konnte also als 17ca,20ß, 21-Trihydroxy-4-pregnen-3-on identifiziert werden.The suspension containing the spores and the steroid was then extracted twice with 20 ml of ethylene chloride each time. The extract was evaporated to dryness under a stream of nitrogen. The dry residue was chromatographed on paper in the Zaffaroni system (toluene-propylene glycol), which showed traces of the urium-substituted compound S and a main stain corresponding to the standard d 1-S. A clear identification of this product was achieved by producing larger quantities of the conversion product. The conversion product was separated from the compound S by successive crystallization from chloroform, methanol and acetone. The physical data of the crystalline conversion product were as follows: Melting point: 246 to 248 ° C; [Alles'. = -r-81.3 (10 /, in chloroform); E 'j = 15.950 at 244 m # t; the infrared spectrum was identical to that of the authentic 1-dehydro compound-S. Example VI In the same manner as in Example V above, Reichstein's compound S was subjected to spur conversion from Fusarium metismoides and Septomyxa affinis. In each of the cases, almost complete conversion of compound S to compound d IS was achieved. EXAMPLE VII Didymella lycopersici spores were suspended in a 1% phosphate buffer solution of pH 7.0 to a final concentration of 3-108 spores per milliliter. 0.2 ml of a 25% glucose solution and 10 mg of Reichstein's compound S dissolved in 0.4 ml of methanol were added to this suspension. The mixture was aerated as described in Example V. After 72 hours, the mixture of spores and the steroid was extracted according to the procedure described in Example V and a steroid-containing residue was obtained. Paper chromatography showed that this residue contained mainly two conversion products, one of which had the same mobility as Epi-F (4-pregnen-IIIa, 17a, 21-triol-3,20-dione) and the other was less polar. A larger amount of the conversion products was obtained as described above, and the conversion products were separated on an alumina column. The more polar of the two conversion products with a melting point of 210 to 212 ° C and an IR spectrum identical to standard Epi-F was clearly identified as this compound. The less polar product was further purified and it was found that it contained traces of a polyhydroxyherated 17-keto product and consisted mainly of a substance which, after acetylation, was a diacetate with a melting point of 195 to 196 ° C and a with standard 20β, 21-diacetoxy-17α-hydroxy-4-pregnen-3-one gave an identical IR spectrum. The main conversion product could therefore be identified as 17ca, 20ß, 21-trihydroxy-4-pregnen-3-one.

Claims

Claim: Process for the microbiological conversion of steroids and fatty acids with the help of spores, which during cultivation in a nutrient medium have been formed by vegetative growth material, denoted by that the spores contain from the vegetative growth material and the nutrients Cultivation medium can be separated and the microbiological conversion with the help of spores in one of vegetative growth material and nutrients practically free aqueous medium with aeration or in the presence of pure oxygen, optionally with stirring and increased pressure.