DE1005961B

DE1005961B - Process for the production of polyoxysteroids of the pregnane series

Info

Publication number: DE1005961B
Application number: DEM25196A
Authority: DE
Inventors: Eugene Lambert Dulaney; William Mcaleer
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1953-12-04
Filing date: 1954-11-16
Publication date: 1957-04-11

Description

Verfahren zur Herstellung von Polyoxysteroiden der Pregnanreihe Die Entdeckung der bemerkenswerten therapeutischen Eigenschaften von Cortison, Hydrocortison und ähnlichen verwandten Verbindungen hat ein starkes Bedürfnis zur Auffindung solcher Verbindungen hervorgerufen. Bisher wurden diese Verbindungen in erster Linie durch äußerst verwickelte Synthesen hergestellt, die eine erhebliche Anzahl von Trennungsstufen erforderten, wobei die Anzahl der Stufen naturgemäß von dem Ausgangsstoff abhing. So erfordert z. B. eine Synthese von Hydrocortison aus der verhältnismäßig billigen Desoxycholsäure etwa vierzig verschiedene Reaktionen. Die schwierigsten Verfahrensstufen bei der Synthese dieser Verbindungen liegen in der Einführung von Sauerstoffsubstituenten in verschiedene Stellungen des Steroidmoleküls, besonders in die 11-, 17-und 21-Stellung. Wegen der Schwierigkeit der Einführung dieser Sauerstoffsubstituenten ist die richtige Auswahl des Ausgangsstoffes und die Reihenfolge und Anzahl der Verfahrensstufen von besonderer Wichtigkeit. Die Auswahl des Ausgangsstoffs erfordert eine richtige Abwägung der Kosten gegen die Leichtigkeit der Sauerstoffeinführung, und es ist daher erhebliche Forschungsarbeit nötig, um zu bestimmen, welches die am meisten Erfolg versprechenden Ausgangsstoffe sind.Process for the preparation of polyoxysteroids of the Pregnan series Discovery of the remarkable therapeutic properties of cortisone, hydrocortisone and similar related compounds are in great need of discovery Connections created. So far these connections have been made primarily through extremely intricate syntheses involving a significant number of stages of separation required, the number of stages naturally depending on the starting material. So requires z. B. a synthesis of hydrocortisone from the relatively cheap Deoxycholic acid has about forty different reactions. The most difficult procedural stages in the synthesis of these compounds lie in the introduction of oxygen substituents in different positions of the steroid molecule, especially in the 11, 17 and 21 positions. Because of the difficulty of introducing these oxygen substituents, this is the correct one Selection of the starting material and the sequence and number of process stages of particular importance. The selection of the starting material requires a correct one Weigh the cost against the ease of oxygen introduction, and it is therefore, considerable research is needed to determine which is the most Promising starting materials are.

In der letzten Zeit wurde die Substitution von Steroiden mit Sauerstoff mit Hilfe von Fermentationsverfahren durch die Wirkung besonderer, Sauerstoff einführender Stämme von Mikroorganismen oder ihrer Sauerstoff einführenden Enzyme vorgeschlagen. Die im Schrifttum veröffentlichten Verfahren zur Herstellung mehrfach sauerstoffsubstituierter Produkte (d. h. Produkte, die an zwei oder mehreren Stellen des Steroidmoleküls durch Sauerstoff substituiert sind) führen jedoch zur Bildung vieler anderer unerwünschter Sauerstoffsubstitutionsprodukte, wie Steroisomere und Stellungsisomere, statt zur Bildung nennenswerter Mengen eines einzigen Produkts. Die Ausbeuten an den einzelnen jeweils gewünschten Erzeugnissen sind sehr gering, und infolge der verschiedenen Arten von Gemischen, die man dabei erhält, sind äußerst umständliche Extraktionsverfahren erforderlich, um die Bestandteile voneinander zu trennen. Es ist daher nicht lohnend, mehrfach durch Sauerstoff substituierte Steroide in technischem Maßstab nach diesen bekannten Verfahren herzustellen.Lately there has been the substitution of steroids with oxygen with the help of fermentation processes through the action of special, oxygen-introducing Strains of microorganisms or their oxygen scavenging enzymes have been suggested. The processes published in the literature for the production of multiply oxygen-substituted Products (i.e. products that are present in two or more locations on the steroid molecule substituted by oxygen), however, lead to the formation of many other undesirable ones Oxygen substitution products, such as steroid isomers and positional isomers, instead of the Formation of significant quantities of a single product. The yields of each each desired products are very small, and as a result of the different Types of mixtures obtained are extremely cumbersome extraction processes required to separate the components from each other. It is therefore not worthwhile multiply by oxygen substituted steroids on an industrial scale according to these known processes.

Das Bedürfnis nach der Möglichkeit der Herstellung mehrfach durch Sauerstoff substituierter Steroide in guter Ausbeute und besonders zur Herstellung solcher Verbindungen, bei denen bestimmte Stellungen durch Sauerstoff substituiert sind und die zur Weiterverarbeitung auf wertvolle Hormone erforderlich sind, liegt auf der Hand. Ein solches Verfahren würde die Ausschaltung vieler verwickelter Verfahrensstufen gestatten, die bisher zur Herstellung von als Hormone wirksamen Steroiden unerläßlich waren, und würde, was vielleicht noch wichtiger ist, die sorgsame Auswahl des Ausgangsstoffes überflüssig machen und damit die Verwendung billiger Ausgangsstoffe zu diesem Zweck ermöglichen, die bisher für die Herstellung von Hormonen als unverwendbar galten.The need for the ability to manufacture multiple times Oxygen substituted steroids in good yield and especially for manufacturing those compounds in which certain positions are substituted by oxygen and which are required for further processing on valuable hormones On the hand. Such a process would eliminate many involved procedural steps allow the hitherto indispensable for the production of steroids effective as hormones were, and would, what is perhaps more important, the careful selection of the starting material make superfluous and thus the use of cheap raw materials for this purpose that were previously considered unusable for the production of hormones.

Ein Hauptzweck der Erfindung ist die Herstellung von Oxysteroiden nach einem Verfahren, bei dem sich nicht die Schwierigkeiten ergeben, die die bisher bekannten Verfahren mit sich bringen. Ein weiterer Zweck ist die Herstellung mehrfach durch Sauerstoff substituierter Steroide nach einem Fermentationsverfahren in wirtschaftlich tragbaren Ausbeuten ohne Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Ein weiterer Zweck ist die direkte Bindung von Sauerstoff an die 11-, 17- und 21ständigen Kohlenstoffatome des Steroidmoleküls durch ein einfaches und wirksames Fermentationsverfahren. Weitere Zwecke und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.A primary purpose of the invention is the manufacture of oxysteroids according to a process that does not give rise to the difficulties that have previously arisen bring known procedures with it. Another purpose is to make multiple oxygen-substituted steroids after a fermentation process in economical acceptable yields without the formation of undesired by-products. Another purpose is the direct bond of oxygen to the 11, 17 and 21 carbon atoms of the steroid molecule through a simple and effective fermentation process. Further Purposes and advantages of the invention emerge from the following description.

Erfindungsgemäß wird die Einführung mehrerer Sauerstoffsubstituenten in das Steroidmolekül in einfacher Weise in einem einzigen Fermentationsverfahren erreicht, indem man Steroide nacheinander der Wirkung von zwei oder mehreren Sauerstoff einführenden Kulturen von Mikroorganismen oder der von diesen Mikroorganismen hervorgebrachten, Sauerstoff einführenden Enzyme aussetzt, wobei jeder Mikroorganismus bzw. jedes Enzym selektiv in erster Linie in eine bestimmte Stellung des Steroidmoleküls Sauerstoff einführt. Ein Kennzeichen dieses Verfahrens besteht darin, daß es eine Möglichkeit schafft, Sauerstoff in zwei oder mehrere Stellungen eines Steroidmoleküls einzuführen, ohne daß dabei eine große Anzahl unerwünschter Sauerstoffsubstitionsprodukte, wie Stereoisomere und Stellungsisomere, entstehen, die zu geringen Ausbeuten an dem gewünschten Produkt führen und umständliche Extraktionsverfahren zur Abscheidung des gewünschten Produkts von den unerwünschten Produkten erforderlich machen. Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, mehrfach durch Sauerstoff substituierte Steroide in guter Ausbeute hervorzubringen, ist ein neues und überraschendes Ergebnis, da zu erwarten war, daß die verschiedenen in dem gleichen Verfahren angewandten Mikroorganismen sich gegenseitig stören und dadurch zu geringen Ausbeuten an den gewünschten Produkten führen würden, indem entweder einer oder mehrere der Organismen den oder die anderen vergiftet oder infolge einer sonstigen gegenseitigen Beeinflussung, die zur Zersetzung der Organismen führen könnte. Im Gegensatz dazu wurde gefunden, daß es bei Verwendung bestimmter Mikroorganismen zur Bindung von Sauerstoff an verschiedene Kohlenstoffatome möglich ist, die Sauerstoffsubstitution des Steroids unter strenger Kontrolle zu halten und hohe Ausbeuten an dem gewünschten, mehrfach durch Sauerstoff substituierten Produkt zu erzielen. Die Möglichkeit der Regelung der Einführung von Sauerstoff in mehrere Stellungen ist von großer Bedeutung, da eine solche Regelung nach den bisher bekannten Verfahren zur mehrfachen Sauerstoffsubstitution unmöglich war.The introduction of several oxygen substituents is in accordance with the invention into the steroid molecule in a simple manner in a single fermentation process achieved by taking steroids sequentially the action of two or more oxygen importing cultures of microorganisms or those produced by these microorganisms, Exposing any microorganism or microorganism to oxygen-introducing enzymes Enzyme selectively oxygenates primarily in a certain position of the steroid molecule introduces. One of the hallmarks of this process is that there is a possibility manages to introduce oxygen into two or more positions of a steroid molecule, without a big one Number of undesired oxygen substitution products, such as stereoisomers and positional isomers, arise that lead to low yields lead to the desired product and cumbersome extraction processes for separation of the desired product from the undesired products. the Ability of the method according to the invention, multiply substituted by oxygen Bringing steroids out in good yield is a new and surprising result, as it was to be expected that the different applied in the same process Microorganisms interfere with each other and this leads to low yields of the desired products would result by either one or more of the organisms poisoned the other or as a result of some other mutual influence, which could lead to the decomposition of the organisms. In contrast, it was found that when certain microorganisms are used to bind oxygen to different ones Carbon atoms is possible, the oxygen substitution of the steroid under more severe Maintain control and high yields of the desired, multiple times through oxygen to achieve substituted product. The possibility of regulating the introduction of oxygen in multiple positions is of great importance as such regulation impossible according to the previously known processes for multiple oxygen substitution was.

Nach der Erfindung kann die mehrfache Sauerstoffsubstitution in einem einzigen Fermentationsverfahren durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit der Abscheidung der Komponenten nach jeder einzelnen Sauerstoffsubstitutionsstufe entfällt, wie sie erforderlich wäre, falls man jede Sauerstoffsubstitutionsstufe einzeln durchführen wollte. Dies ist ein Vorteil, da die Ausbeute hierdurch weit über diejenige hinaus gesteigert wird, die bei Anwendung einzelner aufeinanderfolgender Fermentationsverfahren erzielt wird, weil im letzteren Falle immer eine erhebliche Menge des sauerstoffsubstituierten Steroid, sauf das das Verfahren abzielt, im Laufe der Gewinnung und Abtrennung von der Fermentationsbrühe verlorengeht. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der durch die Gewinnung des Produkts bedingte Verlust erheblich herabgesetzt. Werden z. B. 2 Kohlenstoffatome durch Sauerstoff substituiert, so wird der Verlust um ungefähr 50 °% und bei der Substitution von 3 Kohlenstoffatomen um ungefähr 67 O% herabgesetzt. Jede Herabsetzung des durch die Gewinnung bedingten Verlustes ist wegen der hohen Kosten der erzeugten Verbindungen von erheblichem wirtschaftlichem Wert. Dieses besondere Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist auch deswegen von besonderem Vorteil, weil die Herabsetzung des Verlustes bei der Gewinnung auch zu einer Erhöhung der Ausbeute führt und daher die Verwendung von Stämmen von Mikroorganismen gestattet, die zwar vom Gesichtspunkt der Sauerstoffeinführung etwas weniger wirksam, jedoch aus anderen Gründen, wie z. B. wegen ihres Nahrungsbedarfs, ihrer Beständigkeit und. ihrer Verfügbarkeit, größere Vorteile bieten.According to the invention, the multiple oxygen substitution in one single fermentation process can be carried out, eliminating the need for There is no separation of the components after each individual oxygen substitution stage, as would be required if one performed each oxygen substitution step individually wanted to. This is an advantage, since it results in the yield well above that is increased when using individual successive fermentation processes is achieved because in the latter case there is always a considerable amount of the oxygen-substituted Steroid that the procedure is aimed at in the course of the extraction and separation of the fermentation broth is lost. In the method according to the invention, the Loss caused by the extraction of the product is significantly reduced. Will z. B. 2 carbon atoms substituted by oxygen, the loss is about 50% and with the substitution of 3 carbon atoms reduced by about 67%. Any reduction in the loss due to extraction is because of the high Cost of the connections produced of considerable economic value. This A special feature of the method according to the invention is therefore also special Advantage because the decrease in the loss in extraction also increases the yield and therefore allows the use of strains of microorganisms, which are somewhat less effective from the point of view of oxygen introduction, however for other reasons, such as B. because of their need for food, their persistence and. their availability, offer greater benefits.

Die Art, in der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, ist nicht ausschlaggebend. Die verschiedenen Kulturen der Mikroorganismen werden nacheinander zugesetzt.The way in which the method according to the invention is carried out is not decisive. The different cultures of the microorganisms will be added one after the other.

Eines der ungewöhnlichsten und überraschendsten Kennzeichen der Erfindung besteht darin, daß die Reihenfolge der Einführung der verschiedenen Mikroorganismen zur Einführung von Sauerstoff in die verschiedenen Stellungen des Steroidmoleküls unerheblich ist. Die Substitution durch Sauerstoff in den verschiedenen Stellungen kann in jeder beliebigen Reihenfolge erfolgen, indem man einfach die jeweiligen Mikroorganismen in der gewünschten Reihenfolge zusetzt. Es wäre zu erwarten gewesen, daß die Verwendung gewisser anpassungsfähiger Mikroorganismen infolge unerwünschter Anpassung zur Bildung unerwünschter Sauerstoffsubstitutionsprodukte der Steroide führen würde oder daß die Anwesenheit bestimmter Gruppen die Sauerstoffsubstitution hindern würde.One of the most unusual and surprising features of the invention consists in that the order of introduction of the various microorganisms to introduce oxygen into the various positions of the steroid molecule is irrelevant. The substitution by oxygen in the various positions can be done in any order by simply listing the respective Adds microorganisms in the desired order. It would have been expected that the use of certain adaptable microorganisms as a result of undesirable Adaptation to the formation of unwanted oxygen substitution products of the steroids or that the presence of certain groups would lead to oxygen substitution would hinder.

Auch die besondere Art des nach der Erfindung verwendetenMikroorganismus ist nicht wichtig, sofern man nur einen Mikroorganismus verwendet, der bezüglich der Einführung von Sauerstoff in die gewünschte Stellung hoch selektiv ist. Unter einem selektiven Mikroorganismus ist ein solcher zu verstehen, der das gewünschte Oxysteroid in einer Ausbeute von mindestens 30 0/a, vorzugsweise von mindestens 50 0/" hervorbringt. Die Ausbeute an dem gewünschten Produkt ändert sich j edoch mit dem jeweils verwendetenFermentationsmedium, und es kann von Vorteil sein, diese prozentualen Ausbeuten etwas herabzusetzen, um die Verwendung bestimmter Medien zu ermöglichen.Also the particular type of microorganism used in accordance with the invention is not important if only one microorganism is used that is related to the introduction of oxygen in the desired position is highly selective. Under a selective microorganism is to be understood as one that has the desired Oxysteroid in a yield of at least 30 0 / a, preferably of at least 50%. The yield of the desired product changes, however with the particular fermentation medium used, and it may be advantageous to use these Percentage yields decrease somewhat to the use of certain media to enable.

Tabelle 1 ist eine Liste von Mikroorganismen, die Sauerstoff in die 11-Stellung einführen, mit Angabe der jeweiligen Konfigurationen, in der die Sauerstoffsubstitution in der 11-Stellung stattfindet. Tabelle 1 Mikroorganismus Stellung Spondylocladium ...................... 11 Acrothicium nigrum ................. Il a Acrothicium lunatum ................ Il a Acrothicium robustrum ............... Il a Acrothicium aerenarium . ............ 11 a SI-1711............................. 11a SI-547 .............................. Il a SI-697.............................. 11a SI-549.............................. 11a SI-475 .............................. l i a SI-1709............................. 11a F 20-1179 .......................... Il a F 4-1568 ........................... 11ß Helminthosporium ..................... 11 Brachysporium ........................ 11 Heterosporium......................... 11 Napicladium .......................... 11 Diplococium........................... 11 Alternaria............................. 11 Stemphylium .......................... 11 Aspergillus............................ 11 Aspergillus clavatus ................. 11a Aspergillus fischeri................... 11a Aspergillus flavus .................... Il a Aspergillus itaconicus ................ Il a Aspergillus luchuensis ............... 11 a Aspergillus nidulans.................. lla Aspergillus niger..................... 11a Aspergillus ochraceus ................ 11a Aspergillus ustus .................... Il a Aspergillus wenti.................... 11a Streptomyces ......................... 11 Streptomyces fradiae ................ lla Streptomyces endus ................. 11a Penicillium ........................... 11 Penicillium admetzi .................. Il a Penicillium raistrickii ................ 11 a Penicillium urticae .................. 11 a Penicillium luteum................... Il a Penicillium expansum ............... Il a Penicillium notatum ................. 11 a Penicillium lilacinum ................ 11 a Penicillium brevi-compactum ......... Il a Mikroorganismus Stellung Penicillium citrinum ................. 11 a Penicillium thomii .................. 11 a Penicillium janthinellum.............. lla Penicillium nigricans ................ 11 a Penicillium oxalicum ................. 1 l a Curvularia ............................ 11 Curvularia falcata ................... 11 Curvularia brachyspora............... 11 Curvularia lunata ................... llß Curvularia pallescens ................ 11ß Rhizopus ............................. 11 RH 176 ............................ lla ATCC 6227b ........................ 1 l a Cunninghamella ....................... 11 blackesleana......................... llß Mucor................................ 11 Omphalia ..............:............. 11 Omphalia tralucida .................. 11 ß Stigmina ............................. 11 Stigmina platani..................... 11ß Zur Einführung von Sauerstoff in die 11-Stellung wird die Verwendung einer Sauerstoff einführenden Pilzkultur der Familie der Dematiaceen oder eines durch diese Mikroorganismen hervorgebrachten, Sauerstoff einführenden Enzyms bevorzugt, da diese Organismen die Sauerstoffsubstitution selektiv bewirken. Eine Gruppe, die sich als besonders wirksam erwiesen hat, ist das Genus Spondylocladium. Zur Einführung der Hydroxylgruppe in die 11-Stellung in ß-Konfiguration, wie sie beim Hydrocortison vorliegt, wird der Stamm F4-1568 bevorzugt. Auch die Verwendung der Sorte Aspergillus ochraceus des Genus Aspergillus ist von großem Vorteil zur Einführung von Sauerstoff, da diese Sorte eine Sauerstoffsubstitution in 11 a-Stellung in sehr hoher Ausbeute bewirkt.Table 1 is a list of microorganisms that introduce oxygen to the 11-position, with details of the configurations in which oxygen substitution occurs at the 11-position. Table 1 Microorganism position Spondylocladium ...................... 11 Acrothicium nigrum ................. Il a Acrothicium lunatum ................ Il a Acrothicium robustrum ............... Il a Acrothicium aerenarium. ............ 11 a SI-1711 ............................. 11a SI-547 .............................. Il a SI-697 .............................. 11a SI-549 .............................. 11a SI-475 .............................. lia SI-1709 ............................. 11a F 20-1179 .......................... Il a F 4-1568 ........................... 11ß Helminthosporium ..................... 11 Brachysporium ........................ 11 Heterosporium ......................... 11 Napicladium .......................... 11 Diplococium ........................... 11 Alternaria ............................. 11 Stemphylium .......................... 11 Aspergillus ............................ 11 Aspergillus clavatus ................. 11a Aspergillus fischeri ................... 11a Aspergillus flavus .................... Il a Aspergillus itaconicus ................ Il a Aspergillus luchuensis ............... 11 a Aspergillus nidulans .................. lla Aspergillus niger ..................... 11a Aspergillus ochraceus ................ 11a Aspergillus ustus .................... Il a Aspergillus wenti .................... 11a Streptomyces ......................... 11 Streptomyces fradiae ................ lla Streptomyces endus ................. 11a Penicillium ........................... 11 Penicillium admetzi .................. Il a Penicillium raistrickii ................ 11 a Penicillium urticae .................. 11 a Penicillium luteum ................... Il a Penicillium expansum ............... Il a Penicillium notatum ................. 11 a Penicillium lilacinum ................ 11 a Penicillium brevi-compactum ......... Il a Microorganism position Penicillium citrinum ................. 11 a Penicillium thomii .................. 11 a Penicillium janthinellum .............. lla Penicillium nigricans ................ 11 a Penicillium oxalicum ................. 1 la Curvularia ............................ 11 Curvularia falcata ................... 11 Curvularia brachyspora ............... 11 Curvularia lunata ................... llß Curvularia pallescens ................ 11ß Rhizopus ............................. 11 RH 176 ............................ lla ATCC 6227b ........................ 1 la Cunninghamella ....................... 11 blackesleana ......................... llß Mucor ................................ 11 Omphalia ..............: ............. 11 Omphalia tralucida .................. 11 ß Stigmina ............................. 11 Stigmina platani ..................... 11ß To introduce oxygen to the 11-position, it is preferred to use an oxygen-introducing fungal culture of the Dematiaceae family or an oxygen-introducing enzyme produced by these microorganisms, since these organisms selectively effect oxygen substitution. One group that has been found to be particularly effective is the genus spondylocladium. The strain F4-1568 is preferred for introducing the hydroxyl group in the 11-position in the β-configuration, as is the case with hydrocortisone. The use of the cultivar Aspergillus ochraceus of the genus Aspergillus is also of great advantage for introducing oxygen, since this cultivar causes oxygen substitution in the 11 a position in a very high yield.

Die Verwendung der anderen Mikroorganismen zur Einführung von Sauerstoff in die 11-Stellung ist bei dem Verfahren nach der Erfindung zwar möglich, jedoch weniger vorteilhaft, da diese nicht die selektiven Eigenschaften der Familie der Dematiaceen und der Sorte A. ochraceus besitzen und ihre Verwendung daher zu einer gewissen Bildung unerwünschter Produkte führt. Eine andere Schwierigkeit liegt darin, daß viele dieser Sauerstoff einführenden Mikroorganismen, wie z. B. verschiedene Sorten der Mucorales, sehr wählerisch hinsichtlich ihres Nahrungsbedarfs sind und daher die zur Züchtung derartiger Mikroorganismen geeigneten Kulturmedien beschränkt sind. Ferner werden die Sporen vieler Phycomyceten, einschließlich der Mucorales, durch das Lyophilisierungsverfahren zerstört. Daraus ergibt sich eine große Schwierigkeit, die gewünschten Eigenschaften dieser Stämme zu erhalten, da die Kulturen der Entartung unterliegen. Außerdem verläuft das Wachstum der Mucorales in Submerskultur sehr schlecht, und wenn man die Ansammlung von Schaum an der Oberfläche der Fermentationsflüssigkeit zuläßt, so sammeln sich die Mucorales in dem Schaum an und bilden eine sich über die Oberfläche des Kulturmediums ausbreitende Haut. Diese Bildung einer Oberflächenhaut ist unerwünscht, weil der Mikroorganismus dadurch daran gehindert wird, mit dem in der Hauptmenge der Fermentationsbrühe enthaltenen Steroid in innige Berührung zu kommen. Unter solchen Bedingungen muß man daher große Mengen von Schaumverhinderungsmitteln zusetzen, wodurch die Isolierung der gewünschten sauerstoffsubstituierten Steroide erschwert wird.The use of the other microorganisms to introduce oxygen in the 11-position is possible in the method according to the invention, however less beneficial as these do not have the selective properties of the family of Dematiaceae and the cultivar A. ochraceus and their use therefore becomes one certain formation of undesirable products. Another difficulty is that many of these oxygen introducing microorganisms, such as. B. different Cultivars of the Mucorales, are very picky about their nutritional needs and therefore, the culture media suitable for growing such microorganisms are limited are. Furthermore, the spores of many Phycomycetes, including the Mucorales, destroyed by the lyophilization process. This creates a great difficulty to maintain the desired properties of these strains as the cultures degenerate subject. In addition, the growth of the mucorales in submerged culture is very much bad, and if you look at the accumulation of foam on the surface of the fermentation liquid allows the mucorales to collect in the foam and form one over the other skin spreading over the surface of the culture medium. This formation of a surface skin is undesirable because it prevents the microorganism from interacting with the in the main amount of the fermentation broth contained steroid in intimate contact get. Large amounts of anti-foaming agents must therefore be used under such conditions add, thereby isolating the desired oxygen-substituted steroids is made more difficult.

In Tabelle 2 ist eine Anzahl von Mikroorganismen aufgeführt, die Sauerstoff in die 17-Stellung einführen. Auch andere Sorten des Genus Trichoderma eignen sich zu Einführung von Sauerstoff in die 17-Stellung. Tabelle 2 Mikroorganismus Stellung Gliocladium .......................... 17a Trichoderma .......................... 17a lignorum ........................... 17a F5-1688 ............................ 17a album ............................. 17a glaucum ............................ 17a nigrovirens.......................... 17a konigi.............................. 17a viride .............................. 17a nunbergii ........................... 17a narcissi ............................ 17a Tabelle 3 gibt eine Zusammenstellung von Mikroorganismen, die Sauerstoff in die 21-Stellung einführen. Zu dem gleichen Zwecke können auch andere Sorten der Familie der Sphaeroidaceen und besonders diejenigen des Genus Wojnowicia Verwendung finden. Tabelle 3 Mikroorganismus Stellung Sphaeroidaceae ........................ 21 Wojnowicia ......................... 21 graminis (MF-2419) ................ 21 Hendersonia......................... 21 acicola............................ 21 herpotricha ....................... 21 phragmitis........................ 21 rubi ............................. 21 aberrans ......................... 21 abietus ........................... 21 Ceratopycnis ........................ 21 Eriosporina ......................... 21 Prosthemium ....................... 21 Cryptostictes ....................... 21 Dilophospora ....................... 21 Uroconis ........................... 21 Phoma ............................. 21 umicola .......................... 21 hibernica ......................... 21 betae ............................ 21 Pyrenochaeta ....................... 21 decipiens........ .................. 21 Coniothyrium fuchelii ................ 21 Septoria aesculi ..................... 21 Phopsis citri ......................... 21 Septoria apii ........................ 21 Septoria lycopersici .................. 21 Die Sauerstoffsubstitution in 6-Stellung kann durch gewisse Stämme des Genus Rhizopus, wie z. B. arrhizus und RH 176, erfolgen. Es kann auch Sauerstoff in verschiedene andere Stellungen des Steroids, z. B. in die 7-, 8- und 14-Stellung, mit Hilfe anderer, an sich bekannter Mikroorganismen eingeführt werden.Table 2 lists a number of microorganisms that introduce oxygen to the 17-position. Other varieties of the genus Trichoderma are also suitable for introducing oxygen into the 17-position. Table 2 Microorganism position Gliocladium .......................... 17a Trichoderma .......................... 17a lignorum ........................... 17a F5-1688 ............................ 17a album ............................. 17a glaucum ............................ 17a nigrovirens .......................... 17a konigi .............................. 17a viride .............................. 17a nunbergii ........................... 17a narcissi ............................ 17a Table 3 gives a compilation of microorganisms that introduce oxygen to the 21-position. Other varieties of the Sphaeroidaceae family and especially those of the Wojnowicia genus can be used for the same purpose. Table 3 Microorganism position Sphaeroidaceae ........................ 21 Wojnowicia ......................... 21 graminis (MF-2419) ................ 21 Hendersonia ......................... 21 acicola ............................ 21 herpotricha ....................... 21 phragmitis ........................ 21 rubi ............................. 21 aberrans ......................... 21 abietus ........................... 21 Ceratopycnis ........................ 21 Eriosporina ......................... 21 Prosthemium ....................... 21 Cryptostictes ....................... 21 Dilophospora ....................... 21 Uroconis ........................... 21 Phoma ............................. 21 umicola .......................... 21 hibernica ......................... 21 betae ............................ 21 Pyrenochaeta ....................... 21 decipiens ........ .................. 21 Coniothyrium fuchelii ................ 21 Septoria aesculi ..................... 21 Phopsis citri ......................... 21 Septoria apii ........................ 21 Septoria lycopersici .................. 21 The oxygen substitution in the 6-position can be caused by certain strains of the genus Rhizopus, such as. B. arrhizus and RH 176. It can also deliver oxygen to various other positions of the steroid, e.g. B. in the 7-, 8- and 14-position, with the help of other, per se known microorganisms are introduced.

Zur Einführung von Sauerstoff in zwei oder mehrere Stellungen des Steroidmoleküls kann ein einziger Mikroorganismus in einer oder mehreren Verfahrensstufen verwendet werden; im allgemeinen ist ein solcher Mikroorganismus jedoch unvorteilhaft, da Mikroorganismen, die in zwei gewünschten Stellungen mit Sauerstoff substituieren, meist auch eine große Anzahl anderer Produkte mit verschiedenen Graden von Sauerstoffsubstitution bilden. Die Verwendung solcher Mikroorganismen macht es daher schwierig, die Sauerstoffsubstitution unter Kontrolle zu halten. Die oben aufgeführten Mikroorganismen können aus bekannten Quellen, wie z. B. aus den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, V. St. A., der American Type Culture Collection, Washington, D. C., oder vom Centraalbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland, bezogen werden. Andererseits können sie auch nach bekannten mikrobiologischen Verfahren aus natürlichen Quellen erhalten werden.To introduce oxygen in two or more positions of the The steroid molecule can be a single microorganism in one or more process steps be used; in general, however, such a microorganism is disadvantageous, since microorganisms that substitute in two desired positions with oxygen, usually a large number of other products with varying degrees of oxygen substitution form. The use of such microorganisms therefore makes it difficult for oxygen substitution to keep under control. The microorganisms listed above can be obtained from known sources such as B. from Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, V. St. A., the American Type Culture Collection, Washington, D. C., or from Centraalbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland. On the other hand, they can also be derived from natural microbiological processes using known microbiological methods Sources are preserved.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Steroid, in das Sauerstoff eingeführt werden soll, der Wirkung des Sauerstoff einführenden Enzyms ausgesetzt, welches durch Züchtung einer Sauerstoff einführenden Kultur von Pilzen hervorgebracht wird. Dies geschieht am besten durch Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Nährlösung in inniger Berührung mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid, wobei man die Züchtung des Mikroorganismus fortsetzt, bis die gewünschte Substitution durch Sauerstoff stattgefunden hat. Wahlweise kann das Verfahren auch unter Verwendung homogenisierter ruhender Zellen ausgeführt werden, indem man zunächst den Mikroorganismus in einem geeigneten Fermentationsmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, sodann die Zellen von dem Fermentationsmedium abtrennt und schließlich das Steroid zu diesen ruhenden Zellen zusetzt und die aeroben Bedingungen lange genug bestehenläßt, um die gewünschte Einführung von Sauerstoff zu erreichen.When carrying out the method according to the invention, the steroid, into which oxygen is to be introduced, the effect of the oxygen introducing Enzyme, which is produced by growing an oxygen-introducing culture of Mushrooms is spawned. This is best done by growing the microorganism under aerobic conditions in a suitable nutrient solution in intimate contact with the steroid to be substituted by oxygen, whereby one cultivates the microorganism continues until the desired substitution by oxygen has taken place. Optional the method can also be carried out using homogenized resting cells by first placing the microorganism in a suitable fermentation medium grows under aerobic conditions, then removes the cells from the fermentation medium separates and finally adds the steroid to these dormant cells and the aerobic ones Conditions long enough to allow the desired introduction of oxygen to reach.

Das Steroid kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, als Lösung in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Propylenglykol, Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, oder in feinzerteilter Form, z. B. als staubfeines Pulver, zugesetzt werden. Im allgemeinen soll das Steroid in sehr fein verteilter Form zugegeben sein, damit der größtmögliche Kontakt mit dem Sauerstoff einführenden Kulturmedium ; stattfindet und die Reaktion vollständig verläuft.The steroid can be used as a suspension in a suitable nutrient medium Solvent, such as water, as a solution in a solvent such as acetone, propylene glycol, Dimethylformamide or dimethylacetamide, or in finely divided form, e.g. B. as fine as dust Powder. Generally, the steroid is said to be very finely divided Form be added to allow the greatest possible contact with the oxygen introducing Culture medium; takes place and the reaction proceeds to completion.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl mit stationären Kulturen als auch mit Submerskulturen von unter aeroben Bedingungen züchtbaren Mikroorganismen ausgeführt werden; für praktische Zwecke wird es jedoch am vorteilhaftesten ausgeführt, indem man die Mikroorganismen unter submersen Bedingungen in einem das Steroid enthaltenden geeigneten wäßrigen Fermentationsmedium züchtet.The method according to the invention can be used both with stationary cultures as well as with submerged cultures of microorganisms that can be cultivated under aerobic conditions to be executed; however, for practical purposes it is most advantageously carried out by placing the microorganisms under submerged conditions in a containing the steroid suitable aqueous fermentation medium grows.

Es ist jedoch im Rahmen der Erfindung wesentlich, daß man ein Fermentationsmedium wählt, welches für die Züchtung eines jeden der Mikroorganismen geeignet ist, und daß die Bedingungen, unter denen ein jeder der Mikroorganismen die Sauerstoffsubstitution in wirksamer Weise zustande bringt, während der gesamten Dauer des Verfahrens eingehalten werden. Da die Mikroorganismen sowohl nacheinander als auch gleichzeitig zur Einführung von Sauerstoff verwendet werden können, ermöglicht das Verfahren eine sorgsame Regelung der für jeden Sauerstoff einführenden Organismus günstigsten Bedingungen.However, it is essential within the scope of the invention that a fermentation medium is used selects which is suitable for the cultivation of each of the microorganisms, and that the conditions under which each of the microorganisms undergo oxygen substitution effectively brings about, complied with throughout the duration of the proceedings will. As the microorganisms introduce both sequentially and simultaneously of oxygen can be used, the method allows careful control the most favorable conditions for each oxygen-introducing organism.

Die Verwendung einer Kombination von Mikroorganismen im Rahmen der Erfindung ermöglicht eine wirksame und vollständige Ausnutzung des Nährmediums, während bei anderen Fermentationsverfahren das Nährmedium nur unvollständig ausgenutzt wird. Hierdurch werden die i Betriebskosten verringert, was eine weitere Einsparung bedeutet.The use of a combination of microorganisms under the Invention enables effective and complete utilization of the nutrient medium, while in other fermentation processes the nutrient medium is only partially used will. This reduces the operating costs, which is a further saving means.

Wäßrige Nährmedien, die zur Züchtung Sauerstoff einführender Stämme der Mikroorganismen geeignet sein sollen, müssen sowohl assimilierbaren Kohlenstoff und f Stickstoff als auch geringe Mengen anorganischer Salze enthalten. Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff können alle zu diesem Zwecke üblichen Stoffe verwendet werden, wie Dextrose, Cerelose, Glukose oder invertierte Melasse. Ebenso sind die üblicherweise in Fermentations- 7 verfahren verwendeten komplexen Quellen für Stickstoff, wie angedautes Lactalbumin (»Edamine«) und Maismaischflüssigkeit, oder anorganische Quellen für Stickstoff, wie sek. Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat u. dgl., auch zur Verwendung in den Fermentationsmedien nach der Erfindung geeignet. Geringe Mengen anderer Stoffe, wie Nicotinamid oder anorganische Salze, z. B. geeignete lösliche Salze von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, sind gewöhnlich in komplexen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten oder können in geringen Mengen dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, um das schnellste Wachstum des Sauerstoff einführenden Mikroorganismus zu fördern.Aqueous culture media used for the cultivation of oxygen-introducing strains The microorganisms to be suitable must have both assimilable carbon and f contain nitrogen as well as small amounts of inorganic salts. As sources all substances customary for this purpose can be used for assimilable carbon such as dextrose, cerelose, glucose or inverted molasses. So are they complex nitrogen sources commonly used in fermentation processes, like partially digested lactalbumin ("Edamine") and corn mash liquid, or inorganic ones Sources of nitrogen, such as sec. Ammonium phosphate, ammonium nitrate and the like, too suitable for use in the fermentation media according to the invention. Small quantities other substances such as nicotinamide or inorganic salts, e.g. B. suitable soluble Salts of magnesium, zinc, potassium, sodium, phosphorus, and iron, are common Contained in complex sources of carbon and nitrogen or may be in low levels Quantities are added to the fermentation medium to achieve the fastest growth of the Promote oxygen-introducing microorganism.

Im folgenden werden Beispiele für wäßrige Nährmedien angegeben, die in dem vorliegenden Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Verwendung finden können. Medium Nr. 1 Handelsübliche Dextrose (»Cerelose«) . . 50,0 g Handelsübliches angedautes Lactalbumin (»Edaminea) ................. 20,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 2 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Handelsübliches angedautes Lactalbumin (»Edaminea) ................. 20,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 3 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 4 Invertierte Melasse .................. 100,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 20,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 5 Invertierte Melasse .................. 50,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 6,3 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pa mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 6 Dextrose .......................... 50,0 g (NH4)2HP0........................ 7,5 g K,HP04 .......................... 1,0 g MgS04 - 7 11,0 .................... 0,5 g KCl............................... 0,5g Fe S 04 - 7 HI O ..................... 0,01 g Zn S 04 . 7 H20 ..................... 0,01 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das p. mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt. Medium Nr. 7 Invertierte cubanische Melasse ....... 50,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,9 eingestellt. Medium Nr. 8 Invertierte cubanische Melasse ....... 100,0 g Maismaischflüssigkeit ................ 5,0 g Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,8 eingestellt. Bei manchen Fermentationsmedien ist der Zusatz von Schaumverhinderungsmitteln, wenn auch nicht wesentlich, so doch von Vorteil. Es hat sich herausgestellt, daß im Falle gewisser Fermentationsmedien der Zusatz eines substituierten Oxazalins, eines nicht flüchtigen, kationischen oberflächenaktiven Amins, welches im Handel unter dem Namen »Alkaterge C« erhältlich ist, die Menge des Schaumes besonders stark herabsetzt; man kann jedoch auch andere Schaumverhinderungsmittel verwenden, die sich für diesen Zweck nützlich erwiesen haben.Examples of aqueous nutrient media which can be used in the present process for introducing oxygen into steroids are given below. Medium No. 1 Commercial dextrose ("Cerelose"). . 50.0 g commercially available partially digested lactalbumin (»Edaminea) ................. 20.0 g corn mash liquid ................ 5 , 0 g of distilled water is added to make up to a total volume of 1 liter of nutrient medium and the pH is adjusted to 6.5 with sodium hydroxide. Medium No. 2 Inverted molasses .................. 100.0 g of commercially available partially digested lactalbumin (»Edaminea) ............... .. 20.0 g maize mash liquid ................ 5.0 g distilled water is added to make up to a total volume of 1 liter of nutrient medium and the pH is adjusted to 6.5 with sodium hydroxide . Medium No. 3 Inverted molasses .................. 100.0 g corn mash liquid ................ 5.0 g distilled Water is added to make up to a total volume of 1 liter of nutrient medium and the pH is adjusted to 6.5 with sodium hydroxide. Medium No. 4 Inverted molasses .................. 100.0 g corn mash liquid ................ 20.0 g distilled Water is added to make up to a total volume of 1 liter of nutrient medium and the pH is adjusted to 6.5 with sodium hydroxide. Medium No. 5 Inverted molasses .................. 50.0 g corn mash liquid ................ 6.3 g distilled Water is added to make up to a total volume of 1 liter of nutrient medium and the pa is adjusted to 6.5 with sodium hydroxide. Medium No. 6 Dextrose .......................... 50.0 g (NH4) 2HP0 ........... ............. 7.5 g K, HP04 .......................... 1.0 g MgS04 - 7 11.0 .................... 0.5 g KCl ................... ............ 0.5g Fe S 04 - 7 HI O ..................... 0.01 g Zn S 04 . 7 H20 ..................... 0.01 g of distilled water is added to make up a total volume of 1 liter of nutrient medium and the p. adjusted to 6.5 with sodium hydroxide. Medium No. 7 Inverted Cuban Molasses ....... 50.0 g corn mash liquor ................ 5.0 g distilled water is used to make up to a total volume of 1 1 Nutrient medium was added and the pH was adjusted to 5.9 with sodium hydroxide. Medium No. 8 Inverted Cuban Molasses ....... 100.0 g corn mash liquid ................ 5.0 g distilled water is used to make up to a total volume of 1 1 Nutrient medium was added and the pH was adjusted to 5.8 with sodium hydroxide. In some fermentation media, the addition of anti-foaming agents is beneficial, if not essential. It has been found that in the case of certain fermentation media the addition of a substituted oxazaline, a non-volatile, cationic surface-active amine, which is commercially available under the name "Alkaterge C", reduces the amount of foam particularly strongly; however, other antifoaming agents which have been found useful for this purpose can be used.

Die Anwendung dieser Verfahren bringt auch viele andere Einsparungen an Betriebskosten mit sich. Eine derartige Ersparnis liegt in der Zeit, woraus sich eine Einsparung in der erforderlichen Anlage und im Kraftbedarf ergibt. Bei der Anwendung dieser Verfahren ist nur ein Fermenter erforderlich, während man bisher zwei oder mehrere Fermenter brauchte. Auch die Sterilisierung des Fermentationsmediums kann in einer einzigen Verfahrensstufe erfolgen, wodurch eine weitere Einsparung erzielt wird.Using these techniques brings many other savings as well in operating costs with itself. Such a saving is in the time of what results in a saving in the required system and in the power requirement. In the Applying this process, only one fermenter is required while one hitherto needed two or more fermenters. Also the sterilization of the fermentation medium can be done in a single process step, which means a further saving is achieved.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Einführung von Sauerstoff in 4-Pregnen-3,20-dion, einen verhältnismäßig billigen Ausgangsstoff, welcher hierbei durch Einführung von Hydroxylgruppen in die 11ß-, 17a- und 21-Stellung in 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion übergeführt wird. Nach dem Verfahren können auch andere Steroide der Pregnanreihe durch Sauerstoff substituiert werden, wobei man Hormone oder Zwischenprodukte zur Herstellung von Hormonen erhält. So kann man beispielsweise nach dem vorliegenden Verfahren außer 4-Pregnen-3, 20-dion weitere Steroide der Pregnanreihe, wie 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion, 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion-21-acetat, Desoxycorticosteron, 4-Pregnen-17 a, 21-diol-3, 20-dion, 4-Pregnen-3ß-ol-20-on, 5, 6-Dichlorpregnan-3ß-ol-20-on, 5, 6-Dichlorpregnan-21-ol-3, 20-dion oder 4-Pregnen-6-ol-3, 20-dion in der 11-, 17- und 21-Stellung durch Sauerstoff substituieren, wobei man die entsprechenden Polyoxyderivate erhält.The method according to the invention is particularly suitable for introduction of oxygen in 4-pregnene-3,20-dione, a relatively cheap starting material, which here by introducing hydroxyl groups in the 11ß-, 17a and 21-position is converted into 4-pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dione. After the procedure other steroids of the pregnancy series can also be substituted with oxygen, whereby hormones or intermediates for the production of hormones are obtained. So you can, for example, according to the present process, in addition to 4-pregnen-3, 20-dione other steroids of the Pregnan range, such as 4-pregnen-17 a-ol-3, 20-dione, 4-pregnen-17a-ol-3, 20-dione-21-acetate, deoxycorticosterone, 4-pregnen-17 a, 21-diol-3, 20-dione, 4-pregnen-3ß-ol-20-one, 5, 6-dichloropregnan-3ß-ol-20-one, 5, 6-dichloropregnan-21-ol-3, 20-dione or 4-pregnen-6-ol-3, Substitute 20-dione in the 11-, 17- and 21-position by oxygen, whereby one the corresponding polyoxy derivatives are obtained.

Man kann z. B. ein 11, 17, 21-Desoxypregnen nach dem folgenden Verfahren mit Sauerstoff substituieren: Drei Proben eines sterilen Kulturmediums, z. B. eines der obigen Medien, werden zunächst jedes mit einem verschiedenen Mikroorganismus beimpft, welcher Sauerstoff selektiv in die 11-, 17- bzw. 21-Stellung einführt, indem man eine geringe Menge einer Sporensuspension oder eines vegetativen Wachstums des Organismus zusetzt. Das mit dem in 21-Stellung substituierenden Mikroorganismus beimpfte Nährmedium wird dann bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45° bebrütet, wobei es in Gegenwart von Sauerstoff über einen Zeitraum von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen in Bewegung gehalten wird. Dann setzt man eine Lösung des 11, 17, 21-Desoxypregnens in einem Lösungsmittel, wie Propylenglykol, zu dem Fer-3 mentationsmedium zu und fährt mit der Bewegung und Belüftung des Nährmediums noch etwa 5 bis 30 Stunden, oder bis die Sauerstoffsubstitution vollständig ist, fort. Während dieser Fermentationsdauer wird das zweite, mit dem in 17-Stellung substituierenden Mikroorganismus beimpfte Medium bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45° bebrütet, wobei es ebenfalls in Gegenwart von Sauerstoff für eine Zeitdauer von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen in Bewegung gehalten wird. Sodann wird dieses Medium zu dem mit dem Desoxypregnen versetzten fermentierten Medium zugegeben und die Bewegung und Belüftung weitere 5 bis 30 Stunden fortgesetzt. Sodann gibt man den zuvor in ähnlicher Weise bebrüteten, in 11-Stellung substituierenden Mikroorganismus zu und setzt die Fermentation noch 5 bis 30 Stunden fort. Wenn die Einführung des Sauerstoffes beendet ist, kann das 11, 17, 21-Trioxypregnen aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungmittel gewonnen werden. Zu diesem Zweck geeignete Lösungsmittel sind z. B. Chloroform, Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylpyridin, Ester organischer Säuren, aromatische Koblenwasserstoffe, Ketone oder Amide. Die Lösung des durch Sauerstoff substituierten Steroids kann dann eingedampft werden, wobei man das gewünschte Produkt erhält, welches durch Umkristallisieren oder andere übliche Verfahren gereinigt werden kann.You can z. B. a 11, 17, 21 deoxypregnation according to the following procedure Substitute with oxygen: Three samples of sterile culture medium, e.g. B. one of the above media, each are initially with a different microorganism inoculates, which introduces oxygen selectively in the 11-, 17- or 21-position, by adding a small amount of a spore suspension or a vegetative growth of the organism. The one with the microorganism substituting in the 21-position inoculated nutrient medium is then incubated at a temperature of around 20 to 45 °, taking it in the presence of oxygen for a period of up to a few hours kept moving for several days. Then you put a solution of the 11, 17,21 deoxy-rain in a solvent such as propylene glycol to the fermentation medium and continues with the movement and aeration of the nutrient medium for another 5 to 30 hours, or continue until oxygen substitution is complete. During this fermentation period the second is inoculated with the microorganism substituting in the 17-position Medium incubated at a temperature of about 20 to 45 °, and it is also in Presence of oxygen for a period from a few hours to several Days is kept moving. Then this medium becomes the one with the deoxypregnation mixed fermented medium was added and the agitation and aeration continued Continued for 5 to 30 hours. Then give the previously incubated in a similar way, in the 11-position substituting microorganism and the fermentation continues Continue for 5 to 30 hours. When the introduction of oxygen is finished, it can 11, 17, 21-Trioxypregnen from the fermentation broth by extraction with a suitable, organic solvents which are immiscible with water can be obtained. To this Purpose suitable solvents are, for. B. chloroform, methylene chloride, 2-methyl-5-ethylpyridine, Esters of organic acids, aromatic hydrocarbons, ketones or amides. the Solution of the steroid substituted by oxygen can then be evaporated, obtaining the desired product, which by recrystallization or others Usual procedure can be cleaned.

Wahlweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch so ausgeführt werden, daß man das Sauerstoff einführende Enzym, welches durch Fermentation der Mikroorganismen erzeugt wurde, mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid in Berührung bringt. Dies kann erfolgen, indem man die Sauerstoff einführenden Enzyme aus der Fermentationsbrühe nach an sich bekannten Verfahren gewinnt und sie mit dem Steroid in einem wässerigen Medium in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, in innige Berührung bringt.Optionally, the method according to the invention can also be carried out in such a way that that one the oxygen-introducing enzyme, which by fermentation of the microorganisms was generated in contact with the steroid to be substituted by oxygen brings. This can be done by removing the oxygen introducing enzymes from the Fermentation broth wins according to methods known per se and it with the steroid in an aqueous medium in a manner similar to that described above, in intimate contact brings.

Ähnlich kann ein 11, 17, 21-Trioxypregnen vor seiner Abtrennung von dem Medium mit anderen Mikroorganismen weiterfermentiert werden, um noch andere Stellungen mit Sauerstoff zu substituieren. Beispielsweise kann das obige Verfahren mit einem Mikroorganismus, wie z. B. Rhizopus arrhizus, fortgesetzt werden, der Sauerstoff in die 6-Stellung einführt, worauf man das so gewonnene 6, 11, 17, 21-Tetraoxypregnen von der Fermentationsbrühe abscheidet.Similarly, an 11, 17, 21-Trioxypregnen before its separation from the medium can be further fermented with other microorganisms to produce still others Substitute positions with oxygen. For example, the above procedure with a microorganism, such as. B. Rhizopus arrhizus, the Introduces oxygen into the 6-position, whereupon the 6, 11, 17, 21-Tetraoxypregnen thus obtained separates from the fermentation broth.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1 Vier Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 170° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Jedes der Medien wurde dann mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis (MF-2419) beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Zu jedem der Kolben wurde dann eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 5 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Mischungen wurden mit der gleichen Geschwindigkeit noch etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten. Dann wurden zu jedem der Kolben je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm einer vegetativen Zucht von Spondylocladium F 4-1568 bestand. Diese Zucht wurde durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden in Bewegung gehalten und nach 12-, 24-, 48- bzw. 72stündiger Bebrütung aus der Vorrichtung herausgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen chromatographiert und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid nach dem Verfahren von Zaffaroni (Science 111, 1950, S. 6) entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt erhalten, welches die gleiche chromatographische Beweglichkeitbesaß wie 4-Pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dion. Ein Streifen des Oxydationsproduktes wurde aus dem Papier eluiert und das UV-Spektrum seines Schwefelsäurechromogens festgestellt. Dieses erwies sich als identisch mit dem Spektrum von 4-Pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dion. Beispiel 2 Sechs Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis (MF-2419), beimpft. Die beimpften Mischungen wurden dann auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20e dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt und die Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit etwa 48 Stunden fortgesetzt. Hierauf wurden in jeden Kolben 50 ccm, einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Spondylocladium F 4-1568 bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und nach 6-, 12-, 24-, 48-, 72- bzw. 96stündiger Bebrütung aus der Vorrichtung entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen chromatographiert und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt erhalten, das die gleiche chromatographische Beweglichkeit besaß wie 4-Pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dion. Beispiel 3 Sechs Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr.1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Spondylocladium F 4-1568 beimpft. Die beimpften Mischungen wurden dann auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Kolben wurden mit der gleichen Geschwindigkeit weitere 24 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis (MF-2419) bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und dann jeweils nach Bebrütungszeiten von 6, 12, 24, 48, 72 bzw. 96 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett absorbierendes und Tetrazolium reduzierendes Umwandlungsprodukt auf dem Papier an einer Stelle gegenüber 4-Pregnen-1lß, 17a-21-triol-3, 20-dion beobachtet. Das UV-Spektrum des Produkts in konzentrierter Schwefelsäure erwies sich beim Vergleich als identisch mit demjenigen von 4-Pregnen-11 ß, 17 a-21-triol-3, 20-dion. Die Ausbeute betrug etwa 45 °/o.The following examples serve to illustrate the invention. example 1 Four samples of about 50 ccm each of culture medium no. 1 were stored for 20 minutes at 170 ° sterilized in 250 cc flasks. Each of the media then became approximately 5 cc vegetative growth of the culture Wojnowicia graminis (MF-2419) inoculated. The inoculated Mixtures were made on a rotating shaker at one speed of 220 rev / min. kept moving for about 72 hours, with a temperature of 28 ° was observed. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 5 cc of propylene glycol was added and the mixtures were added kept moving at the same speed for about 48 hours. then were added to each of the flasks 50 cc of a culture originally from the medium No. 1 and 5 cc of a vegetative cultivation of Spondylocladium F 4-1568 duration. This cultivation was carried out by cultivating the microorganism for 3 days obtained in the medium. The approximately 100 cc flasks were in motion held and removed from the device after incubation for 12, 24, 48 or 72 hours and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper strips and with the benzene-formamide solvent system according to the Zaffaroni method (Science 111, 1950, p. 6). An ultraviolet absorbing, Tetrazolium reducing product obtained, which has the same chromatographic Mobility possessed like 4-pregnen-11β, 21-diol-3, 20-dione. A strip of the oxidation product was eluted from the paper and the UV spectrum of its sulfuric acid chromogen established. This turned out to be identical to the spectrum of 4-pregnen-11 β, 21-diol-3, 20-dione. Example 2 Six samples of about 50 cc each of the culture medium No. 1 was sterilized in 250 cc flasks at 120 ° for 20 minutes. Then each became Medium with about 5 cc of a vegetative growth of the culture Wojnowicia graminis (MF-2419), inoculated. The inoculated mixtures were then placed on a rotating shaker at a speed of 220 rev / min. kept moving for about 48 hours, a temperature of 28 ° was maintained. Then became each of the flasks a sterile solution of 10 mg of 4-pregnen-3, 20e dione in 2.5 cc of propylene glycol was added and the movement continued at the same speed for about 48 hours. On that were placed in each flask with 50 cc, a culture originally from the Medium No. 1 with 5 cc of vegetative growth of Spondylocladium F 4-1568 duration. This culture was obtained by culturing the microorganism in the medium for 3 days been received. The approximately 100 cc flasks continued to move held and after 6-, 12-, 24-, 48-, 72- or 96-hour incubation out of the device removed and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper strips and developed with the solvent system benzene-formamide. It became one in the ultraviolet absorbent, tetrazolium reducing product obtained that has the same chromatographic Possessed mobility like 4-pregnen-11 ß, 21-diol-3, 20-dione. Example 3 Six samples Each of about 50 ccm of culture medium No. 1 was placed in 250 ccm flasks at 120 ° for 20 minutes sterilized. Then each of the media became about 5 cc of vegetative growth inoculated into the culture Spondylocladium F 4-1568. The inoculated mixtures were then on a rotating shaker at a speed of 220 rpm. kept moving for about 48 hours, maintaining a temperature of 28 ° became. A sterile solution of 10 mg of 4-pregnen-17 was then added to each of the flasks a-ol-3, 20-dione in 2.5 cc propylene glycol was added and the flasks were filled with the kept moving at the same speed for a further 24 hours. Thereupon were 50 cc of a culture originally taken from the medium was added to each flask No. 1 consisted of 5 cc of a vegetative growth of Wojnowicia graminis (MF-2419). This culture was obtained by culturing the microorganism in the medium for 3 days been. The approximately 100 cc flasks were kept moving and then removed after incubation times of 6, 12, 24, 48, 72 or 96 hours and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper and developed with the chloroform-formamide-methanol system. It became one in the ultraviolet absorbent and tetrazolium reducing conversion product on the paper one site opposite 4-pregnen-1lß, 17a-21-triol-3, 20-dione was observed. The UV spectrum of the product in concentrated sulfuric acid was found to be identical when compared with that of 4-pregnen-11 ß, 17 a-21-triol-3, 20-dione. The yield was about 45 per cent.

Beispiel 4 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis (MF-2419) beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Darauf wurden in jeden Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma F 5-1688 bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter mit der gleichen Geschwindigkeit und bei der gleichen Temperatur noch 72 Stunden in Bewegung gehalten. Am Ende dieser Zeit wurden zu jedem der Kolben 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Spondylocladium F 4-1568 bestanden hatte. Diese Kultur war in ähnlicher Weise erhalten worden wie die anderen Kulturen. Die nunmehr etwa je 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungszeiten von 6, 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde ein im Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzierendes Oxydationsprodukt beobachtet, dessen R f-Wert und Spektrum in Schwefelsäurelösungmit den mit4-Pregnen-11 ß,17 a, 21-triol-3, 20-dion erhaltenen Werten identisch waren. Die Ausbeute betrug etwa 45 %. Beispiel 5 Fünf Proben von j e etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Aspergillus niger beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in '-/2 ccm Dimethylformamid zugesetzt, und die Kolben wurden etwa 48 Stunden weiter in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden der Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma album bestanden hatte. Die Kultur war durch 48stündige Entwicklung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und nach 48 Stunden abgenommen. Einer der Kolbeninhalte wurde mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der chromatographische Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-lla, 17a-diol-3, 20-dion. Zu den übrigen Kolben wurden je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Hendersonia acicola erhalten worden war. Die nunmehr etwa 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach 24-, 48-, 72- bzw. 96stündiger Bebrütung abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen chromatographiert und mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid entwickelt. Der hierbei erhaltene chromatographische Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-11a, 17a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 6 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm einer vegetativen Zucht der Kultur Trichoderma glaucum beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/Z ccm Dimethylformamid zugesetzt, und die Kolben wurden weitere 60 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden Kolben je 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis bestand. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Der Inhalt eines der Kolben wurde sodann mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion. Darauf wurden zu jedem der übrigen Kolben je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Cunninghamella blackesleana bestanden hatte. Diese Kultur war durch 1tägige Entwicklung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die nunmehr etwa 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach einer Bebrütungsdauer von 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Die hierbei erhaltenen Flecke lagen in der Gegend von 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 7 Es wurde nach Beispie16 mit dem Unterschied gearbeitet, daß zu Anfang die Kultur von Wojnowicia graminis, an zweiter Stelle die Kultur Trichoderma glaucum und zum Schluß diejenige von Cunninghamella blackesleana zugesetzt wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie im.Beispiel 6.Example 4 Five samples of about 50 ccm each of culture medium No. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° in 250 cc flasks. Then each medium was inoculated with about 5 cc of a vegetative growth of Wojnowicia graminis culture (MF-2419). The inoculated mixtures were on a rotating shaker at a speed of 220 rpm. kept in motion for about 48 hours, a temperature of 28 ° was maintained. A sterile solution of 10 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 2.5 cc of propylene glycol was then added to each of the flasks and the flasks were kept moving at the same rate for an additional 48 hours. Then 50 cc of a culture which originally consisted of the medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Trichoderma F 5-1688 were placed in each flask. This culture was obtained by culturing the microorganism in the medium for 3 days. The approximately 100 cc flasks were kept moving at the same speed and temperature for another 72 hours. At the end of this time, 50 cc of a culture originally composed of Medium No. 1 and 5 cc of vegetative growth of Spondylocladium F 4-1568 were added to each of the flasks. This culture was preserved in a similar way to the other cultures. The flasks, each containing about 150 cc, were kept moving and removed after incubation times of 6, 12, 24, 48 and 72 hours and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper and developed using the chloroform-formamide-methanol system. A tetrazolium-reducing oxidation product absorbing in the ultraviolet was observed, the R f value and spectrum of which in sulfuric acid solution were identical to the values obtained with 4-pregnene-11β, 17 a, 21-triol-3, 20-dione. The yield was about 45%. Example 5 Five samples of about 50 cc each of culture medium No. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° in 250 cc flasks. Then each medium was inoculated with about 5 cc of a vegetative growth of the Aspergillus niger culture. The inoculated mixtures were on a rotating shaker at a speed of 200 rpm. kept moving for about 48 hours, the temperature being kept at 28 °. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 1/2 cc of dimethylformamide was then added to each of the flasks and the flasks were kept moving for about 48 hours. 50 cc of a culture which originally consisted of medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Trichoderma album were then placed in each of the flasks. The culture was obtained by developing the microorganism in the medium for 48 hours. The approximately 100 cc flasks were kept moving and removed after 48 hours. One of the flask contents was extracted with chloroform and chromatographed on a strip of paper. The chromatographic spot was in the area of 4-pregnen-lla, 17a-diol-3, 20-dione. 50 cc of a culture obtained from medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Hendersonia acicola were added to each of the remaining flasks. The flasks, which now contained about 150 cc, were kept moving and removed after incubation for 24, 48, 72 and 96 hours and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper strips and developed with the benzene-formamide solvent system. The chromatographic spot obtained in this way was in the area of 4-pregnen-11a, 17a, 21-triol-3, 20-dione. Example 6 Five samples of about 50 cc each of culture medium no. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° in 250 cc flasks. Each medium was then inoculated with about 5 cc of a vegetative cultivar of the Trichoderma glaucum culture. The inoculated mixtures were on a rotating shaker at a speed of 220 rpm. kept in motion for about 48 hours, a temperature of 28 ° was maintained. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 1/2 cc of dimethylformamide was then added to each of the flasks, and the flasks were kept moving at the same rate for an additional 60 hours. Each flask was then given 50 cc of a culture which originally consisted of medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Wojnowicia graminis. This culture was obtained by culturing the microorganism in the medium for 3 days. The approximately 100 cc flasks were kept moving at the same rate for an additional 48 hours. The contents of one of the flasks were then extracted with chloroform and chromatographed on a strip of paper. The spot obtained in this way was in the area of 4-pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dione. Then 50 cc of a culture were added to each of the remaining flasks, which had originally consisted of medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Cunninghamella blackesleana. This culture was obtained by developing the microorganism in the medium for 1 day. The flasks, which now contained approximately 150 cc, were kept moving and after an incubation period of 12, 24, 48 and 72 hours, respectively, were removed and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper and developed using the chloroform-formamide-methanol system. The spots obtained in this way were in the region of 4-pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dione. Example 7 The procedure was as in Example 16 with the difference that the culture of Wojnowicia graminis was added at the beginning, the culture Trichoderma glaucum in the second place and that of Cunninghamella blackesleana at the end. The results were the same as in Example 6.

Beispiel 8 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Penicillium adametzi beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten, wobei eine Temperatur von 28° eingehalten wurde. Zu jedem der Kolben wurde dann eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/, ccm Dimethylformamid zugegeben, und die Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden der Kolben 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma lignorum bestanden hatte. Diese Kultur war durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere 60 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit und bei der gleichen Temperatur in Bewegung gehalten. Dann wurde der Inhalt eines der Kolben mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-11 a, 17a-diol-3, 20-dion. Sodann wurden zu jedem der übrigen Kolben je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis entwickelt worden war. Die nunmehr etwa 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungsdauer von 24, 48, 72 bzw. 96 Stunden abgenommen und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-11 a-17 a, 21-triol-3, 20-dion. Beispiel 9 Es wurde nach Beispiel ß gearbeitet mit dem Unterschied, daß zuerst die Kultur von Wojnowicia graminis, dann die Kultur von Trichoderma lignorum und zum Schluß die Kultur von Penicillium adametzi zugesetzt wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie nach Beispiel B. Beispiel 10 Es wurde nach Beispie18 gearbeitet mit dem Unterschied, daß zu Beginn die Kultur von Trichoderma lignorum, sodann diejenige von Wojnowicia graminis und als letzte Kultur die von Penicillium adametzi zugesetzt wurde. Die Ergebnisse waren die gleichen wie nach Beispiel B.Example 8 Five samples of approximately 50 cc each of culture medium no. 1 were sterilized in 250 cc flasks at 120 ° for 20 minutes. Then every medium became inoculated with about 5 cc of a vegetative growth of the culture Penicillium adametzi. The inoculated mixtures were on a rotating shaker with a Speed of 220 rev / min. kept moving for about 48 hours, with one Temperature of 28 ° was maintained. A sterile one was then added to each of the flasks Solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 1 /, ccm of dimethylformamide was added, and the flasks were kept moving at the same speed for an additional 48 hours held. Then 50 cc of a culture were placed in each of the flasks, the originally from medium no. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Trichoderma lignorum had passed. This culture was by culturing the microorganism for 3 days in the medium. The approximately 100 cc flasks became larger Moving at the same speed and temperature for 60 hours held. Then the contents of one of the flasks were extracted with chloroform and up chromatographed on a paper strip. The stain obtained in this way was in the area of 4-pregnen-11 a, 17a-diol-3, 20-dione. Then became each of the remaining flasks 50 cc each of a culture added from medium no. 1 and 5 cc of a vegetative Growth of Wojnowicia graminis had been developed. The now about 150 ccm Containing flasks were kept moving and each time after the incubation period taken from 24, 48, 72 and 96 hours and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper and using the chloroform-formamide-methanol system developed. The spot obtained here was in the area of 4-Pregnen-11 a-17 a, 21-triol-3, 20-dione. Example 9 Example ß was used with the difference that first the culture of Wojnowicia graminis, then the culture of Trichoderma lignorum and finally the culture of Penicillium adametzi was added. The results were the same as in Example B. Example 10 The procedure was as in Example 18 with the difference that at the beginning the culture of Trichoderma lignorum, then that of Wojnowicia graminis and the last culture of Penicillium adametzi added became. The results were the same as in Example B.

Beispiel 11 Es wurde nach Beispie18 gearbeitet mit dem Unterschied, daß zu Anfang die Kultur von Penicillium adametzi, sodann die Kultur von Wojnowicia graminis und als letzte die Kultur von Trichoderma lignorum zugesetzt wurde. Das Ergebnis war das gleiche wie nach Beispiel B.Example 11 The procedure was as in Example 18 with the difference that that at the beginning the culture of Penicillium adametzi, then the culture of Wojnowicia graminis and the last to be added was the culture of Trichoderma lignorum. That The result was the same as in Example B.

Beispiel 12 Fünf Proben von je 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Trichoderma F5-1688 beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Sodann wurde zu jedem der Kolben je eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 1/2 ccm Dimethylformamid zugesetzt, und die Kolben wurden weitere 48 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden in jeden Kolben je 50 ccm einer Kultur eingegeben, die ursprünglich aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Wojnowicia graminis bestanden hatte und durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden dann weiter mit der gleichen Geschwindigkeit 48 Stunden in Bewegung gehalten. Sodann wurde einer der Kolbeninhalte mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion. Zu den übrigen Kolben wurden je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Omphaliatra lucida (MF-22101) durch 7tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die nunmehr je 150 ccm enthaltenden Kolben wurden weiter in Bewegung gehalten und jeweils nach Bebrütungsdauer von 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden aus der Vorrichtung entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papier chromatographiert und mit dem System Chloroform-Formamid-Methanol entwickelt. Hierbei ergab sich ein Fleck, der Tetrazolium reduzierte und in der Gegend von 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion lag. Von einem Teil des Rückstandes wurde das UV-Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure festgestellt, und dieses erwies sich als ähnlich demjenigen von 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion. Ein zweiter Teil des Extraktes wurde wieder auf Papier chromatographiert und dann mit Dichromat in Eisessig oxydiert. Nach dem Entwickeln zeigte das Papier einen Fleck von der gleichen Beweglichkeit wie 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion. Ein weiterer Teil wurde auf Empfindlichkeit gegen Eosin untersucht und als aktiv befunden. Beispiel 13 Fünf Proben von je etwa 50 ccm des Kulturmediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde jedes der Medien mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Hendersonia rubi beimpft. Die beimpften Mischungen wurden auf einer Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Dann wurde zu jedem der Kolben eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 3 ccm Propylenglykol zugesetzt, und die Kolben wurden weitere 48 Stunden in Bewegung gehalten. Hierauf wurden zu jedem der Kolben 50 ccm einer Kultur zugegeben, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm eines vegetativen Wachstums von Trichoderma nigrovirens durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die je etwa 100 ccm enthaltenden Kolben wurden weitere 48 Stunden mit der gleichen Geschwindigkeit in Bewegung gehalten. Dann wurde einer der Kolbeninhalte mit Chloroform extrahiert und auf einem Papierstreifen chromatographiert. Der hierbei erhaltene Fleck lag in der Gegend von 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion. Zu jedem der übrigen Kolben wurden je 50 ccm einer Kultur zugesetzt, die aus dem Medium Nr. 1 und 5 ccm vegetativen Wachstums von Stigmina platani (MF-2395) durch 3tägige Züchtung des Mikroorganismus in dem Medium erhalten worden war. Die nunmehr je etwa 150 ccm enthaltenden Kolben wurden nochmals 24 Stunden in Bewegung gehalten und dann mit Chloroform extrahiert. Die Lösungen wurden vereinigt, zur Trockne gedampft, auf Papierstreifen chromatographiert und entwickelt. Hierbei ergab sich eine Tetrazolium reduzierende Verbindung an einer Stelle unmittelbar gegenüber 4-Pregnen-11ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion.Example 12 Five samples of 50 cc each of culture medium No. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° in 250 cc flasks. Then each of the media was inoculated with about 5 cc of a vegetative growth of the Trichoderma F5-1688 culture. The inoculated mixtures were on a rotating shaker at a speed of 220 rpm. kept moving for about 72 hours, the temperature being kept at 28 °. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 1/2 cc of dimethylformamide was then added to each of the flasks, and the flasks were kept moving for a further 48 hours. Then, 50 cc of a culture which originally consisted of medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Wojnowicia graminis and which had been obtained by culturing the microorganism in the medium for 3 days were placed in each flask. The approximately 100 cc flasks were then kept moving at the same rate for 48 hours. One of the contents of the flask was extracted with chloroform and chromatographed on a strip of paper. The spot obtained in this way was in the area of 4-pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dione. To each of the remaining flasks, 50 cc of a culture obtained from the medium No. 1 and 5 cc of a vegetative growth of Omphaliatra lucida (MF-22101) by culturing the microorganism in the medium for 7 days were added. The flasks, now each containing 150 ccm, were kept moving and after each incubation period of 12, 24, 48 and 72 hours, they were removed from the device and extracted with chloroform. The extracts were chromatographed on paper and developed using the chloroform-formamide-methanol system. This resulted in a spot which reduced tetrazolium and was in the area of 4-pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dione. The UV spectrum of a part of the residue was determined in concentrated sulfuric acid, and this was found to be similar to that of 4-pregnen-11β, 17a, 21-triol-3, 20-dione. A second part of the extract was chromatographed again on paper and then oxidized with dichromate in glacial acetic acid. After development, the paper showed a spot with the same mobility as 4-pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion. Another part was examined for sensitivity to eosin and found to be active. Example 13 Five samples of about 50 cc each of culture medium no. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° in 250 cc flasks. Then each of the media was inoculated with about 5 cc of a vegetative growth of the Hendersonia rubi culture. The inoculated mixtures were on a shaker at a speed of 220 rpm. kept moving for about 72 hours, the temperature being kept at 28 °. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3, 20-dione in 3 cc of propylene glycol was then added to each of the flasks and the flasks were kept moving for an additional 48 hours. Then, 50 cc of a culture obtained from No. 1 medium and 5 cc of vegetative growth of Trichoderma nigrovirus by culturing the microorganism in the medium for 3 days was added to each of the flasks. The flasks, each containing about 100 cc, were kept moving at the same speed for a further 48 hours. Then one of the flask contents was extracted with chloroform and chromatographed on a strip of paper. The spot obtained in this way was in the area of 4-pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dione. To each of the remaining flasks, 50 cc of a culture obtained from medium No. 1 and 5 cc of vegetative growth of Stigmina platani (MF-2395) by culturing the microorganism in the medium for 3 days were added. The flasks, each containing about 150 cc, were kept in motion for a further 24 hours and then extracted with chloroform. The solutions were combined, evaporated to dryness, chromatographed on paper strips and developed. This resulted in a tetrazolium-reducing compound at a point directly opposite 4-pregnene-11β, 17a, 21-triol-3, 20-dione.

Claims

PATENT CLAIMS2 1. Process for the production of polyoxysteroids the Pregnan series through biological oxidation with selectively acting fungal cultures or the oxidizing enzymes produced by them, characterized in that that a steroid which has no oxygen function in the 11-, 17- and 21-position, for the introduction of two or three OH groups with several selectively acting fungal cultures or by these generated oxidizing enzymes one after the other, but always, without the mushroom culture used in the previous oxidation phase or the through remove this generated oxidizing enzyme from the reaction mixture, oxidized.

2. The method according to claim 1, characterized in that one is used as a Microorganism one of the kind Wojnowicia and, as another, one of the Species Spondylocladium or Trichoderma and Wojnowicia or Aspergillus and Trichoderma or Penicillium and Trichoderma or Penicillium and Wojnowicia or Hendersonia and Trichoderma or Aspergillus niger and Trichoderma album or Wojnowicia graminis and Trichoderma glaucum or Penicillium adametzi and Trichoderma lignorum or Penicillium adametzi and Wojnowicia graminis or Hendersonia rubi and Trichoderma nigrovirens or Wojnowicia, Trichoderma and Spondylocladium or Aspergillus, Trichoderma and Hendersonia or Wojnowicia, Trichoderma and Cunninghamella or Penicillium, Trichoderma and Wojnowicia or Trichoderma, Wojnowicia and Omphaliatra or Trichoderma, Wojnowicia and Stigmina or Aspergillus niger, Trichoderma album and Hendersonia aeicola or Trichoderma glaucum, Wojnowicia graminis and Cunninghamella blackesleana or Penicillium adametzi, Trichoderma lignorum and Wojnowicia graminis or Trichoderma F5-1688, Wojnowicia graminis and Omphaliatra lucida or Hendersonia rubi, Trichoderma nigrovirens and Stigmina platani are used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that 4-pregnen-3, 20-dione or 4-pregnen-17a-ol-3, 20-dione used as a starting compound. Documents considered USA. Patent specification No. 2 602 769.