Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxysteroiden mittels hydroxylierender Enzyme verschiedener Arten von Mikroorganismen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von Hydroxylgruppen (Hydroxylie- rung) in ein Steroidmolekül, indem Desoxysteroide der Einwirkung bestimmter Mikroorganismen bzw. bestimmter Enzyme solcher Mikroorganismen aus gesetzt werden.
Die Entdeckung der bemerkenswerten therapeu tischen Eigenschaften von Kortison, Hydrokortison und verwandter Verbindungen hat ein weites Inter esse wachgerufen, um einfachere und wirtschaft- lichere Verfahren zum Herstellen dieser Verbin dungen zu finden. Bis jetzt wurden letztere haupt sächlich erzeugt mittels sehr komplizierter Synthese, die eine beträchtliche Anzahl von verschiedenen Operationen benötigte, wobei diese Anzahl not wendigerweise vom Ausgangsmaterial abhängt. So erfordert z. B. eine typische Synthese von Hydro- kortison aus relativ billiger Desoxycholsäure etwa 40 getrennte Reaktionen.
Der schwierigste Schritt bei der Synthese dieser Verbindungen ist die Ein führung von Sauerstoff in verschiedene Stellungen des Steroidmoleküls, insbesondere von Hydroxy- gruppen in die 11-, 17- und 21-Stellung. Wegen der Schwierigkeit des Einführens dieser Hydroxygruppen sind die richtige Auswahl des Ausgangsmaterials, die Reihenfolge und Anzahl von Operationen wichtige Faktoren.
Für die Auswahl des Ausgangsmaterials müssen die Kosten und die Leichtigkeit der Hy- droxylierung gegeneinander abgewogen werden, und eine ausgedehnte Forschung ist erforderlich, um fest zustellen, welche Ausgangsmaterialien am meisten Aussicht haben.
Es ist vor kurzem vorgeschlagen worden, die Hydroxylierung von Steroiden mittels Gärverfahren durch die Einwirkung von speziellen hydroxylieren- den Stämmen von Mikroorganismen oder ihrer hy- droxylierenden Enzyme durchzuführen.
Die in der Literatur bekanntgewordenen Verfahren zum Erzeu gen von vielfach hydroxylierten Produkten, das heisst von Produkten, die in mehreren Stellungen des Steroidmoleküls hydroxyliert werden, ergaben je doch zahlreiche andere, unerwünschte, hydroxylierte Produkte, auch Mischungen von Stereo- und Stel- lungsisomeren, jedoch nur eine geringe Menge von jedem einzelnen Stoff. Die Erträge an den ge wünschten Einzelprodukten sind sehr niedrig, und zufolge der verschiedenen erhaltenen Arten von Mi schungen sind ausserordentlich komplizierte Extrak tionsverfahren erforderlich,
um sie voneinander zu trennen. Es ergibt sich somit die praktische Un möglichkeit, vielfach hydroxylierte Steroide in kom merziell interessanten Mengen mittels dieser Ver fahren herzustellen.
Es ist somit sehr erwünscht, mittels eines Gär- verfahrens ein vielfach hydroxyliertes Steroid mit gutem Ertrag herstellen zu können, insbesondere ein Steroid, das in denjenigen speziellen Stellungen hy- droxyliert ist, die für die Herstellung wertvoller Hormone Oxygruppen aufweisen müssen. Ein sol ches Verfahren würde die Ausmerzung vieler kom plexer Schritte ermöglichen, die bis jetzt als nötig erachtet wurden, um als Hormone wirkende Steroide hervorzubringen.
Ferner würde ein solches Ver fahren, was möglicherweise noch wichtiger ist, die Notwendigkeit einer sorgfältigen Wahl des Aus gangsmaterials ausschalten. In einem solchen Fall würde die Benützung von billigen Substanzen er möglicht, die bislang für die Erzeugung von Hor monen nicht in Betracht kamen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist nicht den Schwierigkeiten unterworfen wie die vorher zur Ver fügung stehenden Verfahren. Ferner kann mit diesem Verfahren die Herstellung von vielfach hydroxylier- ten Steroiden mit wirtschaftlich interessanten Erträ- gen und ohne Bildung von unerwünschten Neben produkten erreicht werden. Es ist zudem möglich, durch das vorliegende Verfahren die 11-, 17- und 21-Kohlenstoffatome in Steroiden direkt zu hydroxy- lieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ver fahren zur Herstellung von Polyhydroxysteroiden, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Steroid der Einwirkung mindestens zweier ver schiedener, nicht von der gleichen Mikroorganismen art stammender Hydroxygruppen einführender En zyme ausgesetzt wird, wobei jedes der Enzyme in einer andern Stellung des Steroids Hydroxygruppen einführt und mindestens zeitweise die Enzyme von mindestens zwei Mikroorganismenarten in dem Re aktionsgemisch vorhanden sind.
Gemäss vorliegender Erfindung kann die Viel- fach-Hydroxylierung von Steroiden in einer einzigen Gäroperation ausgeführt werden, indem die Steroide der Einwirkung von mehreren hydroxylierenden Stämmen von Mikroorganismen oder von diesen er zeugten hydroxylierenden Enzymen gleichzeitig aus gesetzt werden, von denen jeder einzelne selektiv in erster Linie in einer bestimmten Stellung des Steroid- moleküls hydroxyliert. Es wird dadurch möglich, zwei oder mehrere Stellungen eines Steroidmoleküls zu hydroxylieren,
ohne dass gleichzeitig auch eine grosse Anzahl von unerwünschten, hydroxylierten Produkten, wie z. B. Stereo- und Stellungsisomere, gebildet werden, die den Ertrag an den gewünsch ten Produkten herabsetzen und mittels komplizierter Extraktionsverfahren von den gewünschten Pro dukten abgetrennt werden müssen.
Die Fähigkeit des vorliegenden Verfahrens, erwünschte vielfach hy- droxylierte Steroide mit gutem Ertrag zu erzeugen, ist ein neues und unerwartetes Resultat, da man er warten würde, dass die verschiedenen, im gleichen Verfahren benützten Mikroorganismenarten einander gegenseitig beeinträchtigen und damit den Ertrag an gewünschten Produkten reduzieren würden, entweder dadurch, dass ein oder mehrere dieser Mikroorga- nismenarten die andern vergiften, oder dass sich eine andere gegenseitige Einwirkung ergibt, die zur Zer störung der Organismen führt.
Es hat sich jedoch ganz im Gegenteil gezeigt, dass es durch Verwenden bestimmter Mikroorganismenarten bzw. ihrer Enzyme für die Hydroxylierung der verschiedenen Kohlen- -,toffatome möglich wird, eine strenge Kontrolle der Hydroxylierung des Steroids auszuüben und dadurch einen hohen Ertrag am gewünschten, vielfach hy- droxylierten Produkt zu erzielen.
Diese Möglichkeit einer Kontrolle der Vielfach-Hydroxylierung ist sehr wichtig, da dies bisher unmöglich war.
Da gemäss vorliegender Erfindung die Vielfach- Hydroxylierung nur mit einer einzigen Gäroperation stattfinden kann, ist es nicht mehr nötig, die Kompo nenten nach jeder Hydroxylierungsperiode voneinan der zu trennen, wie dies nötig wäre, wenn jeder Hydroxylierungsschritt für sich durchgeführt würde.
Dies ist ein Vorteil, da dadurch der Ertrag stark er- höht wird; denn bei Verfahren, die für jeden Hy- droxylierungsschritt eine besondere Gäroperation er fordern, geht immer ein bedeutsamer Teil des ge wünschten hydroxylierten Steroids durch das zu seiner Abtrennung aus den Gärbrühen benützte Ver fahren verloren. Beim Verfahren nach vorliegender Erfindung hat es sich gezeigt, dass der infolge der Isolierungsprozedur erlittene Verlust beträchtlich verringert wird. Werden z.
B. zwei Kohlenstoffatome hydroxyliert, so wird der Verlust um etwa 50'% ver- ringert,
und bei Hydroxylierungen von drei Kohlen stoffatomen in einem einzigen Reaktionsgemisch um etwa 67'%. Wegen der hohen Kosten der erzeugten Verbindungen besitzt jede Verlustverringerung einen beträchtlichen wirtschaftlichen Wert. Es ist aber auch möglich, Mikroorganismenstämme zu verwen den, die, obschon sie vom Standpunkt der Hydroxy- lierung aus etwas weniger wirkungsvoll sind, aus an dern Gründen, z.
B. wegen der Nährerfordernisse, der Stabilität und der Erhältlichkeit, wünschenswer ter sind.
Zur Durchführung des Verfahrens nach vorlie gender Erfindung kommen verschiedene Arbeits weisen in Frage. Die verschiedenen Stämme der Mi kroorganismen können alle auf einmal zugegeben werden oder kontinuierlich oder in unregelmässigen Intervallen während der Gärperiode. Ebenso kann nur eine einzige Mikroorganismenart zu Beginn der Gärperiode oder kontinuierlich oder in unregel mässigen Intervallen während derselben beigegeben werden, und am Ende der Gärperiode oder im Ver laufe des Gärzyklus kann die nächste Mikroorga- nismenart zugegeben werden. Es kann aber auch irgendeine Kombination dieser beiden Vorgehen benützt werden.
In welcher Reihenfolge die verschiedenen Mikro organismen zur Hydroxylierung der verschiedenen Stellungen des Steroids zugegeben werden, ist gleichgültig. Es wäre zu erwarten, dass die Verwen dung gewisser Mikroorganismen des adaptiven Typs, das heisst solcher Mikroorganismen, die erst in Be rührung mit einem geeigneten Steroid das betreffende Enzym produzieren, wegen unerwünschter Anpas sung zur Bildung von unerwünschten hydroxy- lierten Steroiden führen oder die Gegenwart ge wisser Gruppen der Hydroxylierung entgegenarbeiten würde.
Welche Typen von Mikroorganismen benützt werden, ist aber nicht von Belang, ausgenommen, dass vorteilhaft ein Mikroorganismus verwendet wird, der für die spezielle, zu hydroxylierende Stel lung in hohem Grade selektiv ist, das heisst einen solchen, der einen Ertrag von wenigstens 30'%, vor- zugsweise aber wenigstens 501/o, vom gewünschten hydroxylierten Steroid ergibt.
Dieser Ertrag variiert jedoch gemäss dem ver wendeten Gärboden, und eine kleine Senkung der angeführten Erträge kann in Kauf genommen wer den, wenn dafür die Verwendung gewisser Nähr böden erleichtert wird. Die Tabelle 1 zeigt eine Liste von Mikroorga nismen, die in der 11-Stellung hydroxylieren, und die spezielle Konfiguration, in der diese 11-Hydroxy- lierung stattfindet:
EMI0003.0005
EMI0003.0006
Für die Hydroxylierung der 11-Stellung wird die Verwendung eines hydroxylierenden Stammes von Fungis der Familie Dematiaceae oder von hydroxy- lierenden, von diesen Mikroorganismen erzeugten Enzymen vorgezogen, da diese Organismen selektiv hydroxylieren. Eine speziell wirkungsvolle Gruppe gehört zur Gattung Spondylocladium. Für die Ein führung der Hydroxygruppe in 11-Stellung in der ss-Konfiguration,
wie sie beim Hydrokortison vor liegt, ist der Stamm F4-1568 der bevorzugte Orga nismus. Die Verwendung der Species Aspergillus ochraceus des Genus Aspergillus ist ebenfalls hoch erwünscht für die Hydroxylierung, da diese Species in lla-Stellung hydroxylierte Produkte mit hohem Ertrag ergibt.
Die Verwendung der andern in der Tabelle 1 angeführten Mikroorganismen zur Einführung einer Hydroxygruppe in die 11-Stellung ist, obschon diese für das Verfahren nach der Erfindung geeignet sind, doch weniger wünschenswert, da sie nicht das. selek tive Qualitätsmerkmal der Familie Dematiaceae und der Species A. ochraceus aufweisen, und deshalb bei ihrer Verwendung einige unerwünschte Produkte entstehen. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass viele von diesen andern hydroxylierenden Mikro- organismen, wie z.
B. verschiedene Species der Mucorales, in ihren Nähranforderungen sehr spezi fisch und daher die zum Züchten solcher Mikro organismen geeigneten Nährböden beschränkt sind. Ebenso werden die Sporen mancher Phycomyceten, einschliesslich der Mucorales, durch den Gefrier trocknungsprozess zerstört, wodurch sich grosse Schwierigkeiten für das Beibehalten ihrer wünschens werten Eigenschaften ergeben, da die Kulturen dege nerieren.
Ferner wachsen die Mucorales sehr schwer im untergetauchten Zustand und, wenn sich auf der Oberfläche der Gärflüssigkeit Schaum an sammeln kann, so sammeln sie sich im Schaum an und entwickeln sich in der Form eines Häutchens auf der Oberfläche der Kulturflüssigkeit.
Diese Bil dung eines Oberflächenhäutchens ist unerwünscht, da dieses den Mikroorganismus an der engen Be rührung mit dem im Hauptteil der Gärbrühe ent- haltenen Steroid hindert. Unter solchen Umständen sind daher grosse Mengen von Schaumschutzmitteln erforderlich, wodurch jedoch die Isolation der ge wünschten hydroxylierten Steroide erschwert wird.
Die Tabelle 2 führt eine Reihe von Mikro organismen an, die in der 17-Stellung hydroxylieren. Es sind aber auch andere Species der Gattung Tri- choderma für die Hydroxylierung des 17-Kohlen- stoffatoms geeignet.
EMI0004.0013
<I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb> <U>Mikroorganismus <SEP> Stellung</U>
<tb> Glicoladium <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> lignorum <SEP> 17a
<tb> <SEP> F5-1688 <SEP> 17a
<tb> <SEP> album <SEP> 17a
<tb> <SEP> glaucum <SEP> 17a
<tb> <SEP> nigrovirena <SEP> 17a
<tb> <SEP> königi <SEP> 17a
<tb> <SEP> viride <SEP> 17a
<tb> <SEP> nunbergii <SEP> 17a
<tb> <SEP> narcissi <SEP> 17a Die Tabelle 3 führt eine Reihe von Mikroorga nismen an, die die 21-Stellung hydroxylieren. Ausser den genannten sind aber auch noch andere Species der Familie Sphaeroidaceae und insbesondere die jenigen des Genus Wojnowicia geeignet.
EMI0004.0019
<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> <U>Mikroorganismus <SEP> Stellung</U>
<tb> Sphaeroidaceae <SEP> 21
<tb> Wojnowicia <SEP> 21
<tb> <SEP> graminis <SEP> (MF-2419) <SEP> 21
<tb> Hendersonia <SEP> 21
<tb> <SEP> acicola <SEP> 21
<tb> <SEP> herpotricha <SEP> 21
<tb> <SEP> phragmitis <SEP> 21
<tb> rubi <SEP> 21
<tb> <SEP> aberrans <SEP> 21
<tb> <SEP> abietus <SEP> 21
<tb> Ceratopyonis <SEP> 21
<tb> Eriosporina <SEP> 21
<tb> Prosthemium <SEP> 21
<tb> Cryptostictes <SEP> 21
<tb> Dilophosphora <SEP> 21
<tb> Uroconis <SEP> 21
<tb> Phoma <SEP> 21
<tb> <SEP> umicola <SEP> 21
<tb> <SEP> hibernica <SEP> 21
<tb> betae <SEP> 21
<tb> Pyrenochaeta <SEP> 21
<tb> <SEP> decipiens <SEP> 21
<tb> Coniothyrium <SEP> fuchelü <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> aesculi <SEP> 21
<tb> Phopsis <SEP> citri <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> apü <SEP>
21
<tb> lycopersici <SEP> 21 Die Hydroxylierung der 6-Stellung kann mittels gewisser Stämme des Genus Rhisopus, z. B. arrhisus und RH-176, ausgeführt werden. Verschiedene an dere Stellungen des Steroids, z. B. die 7,8- und 14-Kohlenstoffatome, können auch mittels anderer, bekannter Mikroorganismen hydroxyliert werden.
Die oben angeführten Mikroorganismen können von bekannten Quellen bezogen werden, z. B. von den Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois, von der American Type Culture Collection in Washington, D. C. oder vom Centraal- bureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland. Sie können aber auch mittels bekannter Techniken aus natürlichen Quellen gewonnen werden. Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt z. B.
unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium und in enger Berührung mit dem zu hydroxylierenden Steroid, wobei das Züchten des Mikroorganismus fortgesetzt wird, bis die ge wünschte Hydroxylierung eingetreten ist.
Das Ver fahren kann aber auch ausgeführt werden mittels von ihrem Nährboden getrennter, homogen verteil ter Zellen, indem zuerst der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Gärmedium gezüch tet, die Zellen vom Nährmedium getrennt und diesen fastenden Zellen das Steroid beigefügt wird, worauf die aeroben Bedingungen genügend lang fort gesetzt werden, bis die gewünschte Hydroxylierung eingetreten ist.
Das Steroid kann dem Nährmedium als eine Suspension in einem Mittel, z. B. Wasser, zugefügt werden, oder als eine Lösung in einem Lösungs mittel, z. B. Aceton, Propylglykol, Dimethylform- amid oder Dimethylacetamid, oder in feinverteilter Form, z. B. als festes, sehr feines Pulver. Im all gemeinen ist es wünschenswert, dass das Steroid in sehr feinverteilter Form vorliegt, damit ein maxi maler Kontakt mit dem hydroxylierenden Kultur medium ermöglicht und die Vollendung der Reak tion gewährleistet wird.
Das vorliegende Verfahren kann sowohl in Ober flächenkulturen wie in untergetauchten Kulturen, von unter aeroben Bedingungen wachsenden Mikro organismen ausgeführt werden, obschon es für praktische Zwecke am besten durch Züchten der Mikroorganismen im untergetauchten Zustand in einem wässerigen, das Steroid enthaltenden Gär- medium ausgeführt wird.
Es ist von Wichtigkeit, dass ein Gärmedium aus gesucht wird, welches für das Züchten aller verwen deten Mikroorganismenarten geeignet ist, und die Bedingungen, unter welchen jede Mikroorganismen art wirkungsvoll hydroxyliert, müssen während seiner Hydroxylierungsperiode aufrechterhalten wer den. Da die Steroide sowohl nacheinander wie auch miteinander mit Erfolg hydroxyliert werden können, gestattet das erfindungsgemässe Verfahren eine gute Kontrolle der für jeden hydroxylierenden Organis mus günstigsten Bedingungen.
Die Verwendung einer Kombination von Mikro organismen im vorliegenden Verfahren ermöglicht einen wirkungsvollen Gebrauch des Nährmediums, indem die Ausnützung desselben vollständig sein kann. In andern Gärverfahren ist die Ausnützung des Nährmediums unvollständig. Dieser Faktor wirkt sich in einer Reduktion der Kosten der Ausführung des Verfahrens aus und ermöglicht somit eine wei tere Wirtschaftlichkeit.
Zum Züchten der hydroxylierenden Stämme des Mikroorganismus geeignete wässrige Nährmedia müssen Quellen von assimilierbarem Kohlen- und Stickstoff enthalten sowie Spuren anorganischer Salze. Irgendwelche der gewöhnlichen Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, z. B. Dextrose, Cerelose, Invertmelasse, Glukose und dergleichen, die in Gär- medien verwendet werden, können verwendet wer den. Ebenso können komplexe Stickstoffquellen, wie sie gewöhnlich in kommerziellen Gärprozessen ver wendet werden, auch für die vorliegenden Zwecke gebraucht werden, wie z.
B. Laktalbumin-Auszug ( Edamin ) und Maisaufbrühflüssigkeit, oder anor ganische Stickstoffquellen, z. B. dibasisches Ammo- niumphosphat, Ammoniumnitrat und dergleichen, Spuren von andern Substanzen, z. B. Nikotinamid oder anorganischen Salzen, z.
B. von löslichen Salzen von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, stehen gewöhnlich in komplexen Quellen von Kohlen- und Sauerstoff zur Verfügung oder können dem Gärmedium beigefügt werden, um ein maximales Wachstum des hydroxylierenden Mikro organismus anzuregen.
Nachfolgend sind Beispiele von wässrigen Nähr medien aufgeführt, die im vorliegenden Verfahren benützt werden können.
EMI0005.0020
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 1</I>
<tb> Handelsgängige <SEP> Dextrose <SEP> (Cerelose) <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Handelsgängiger <SEP> Laktalbuminauszug <SEP> (Edamin) <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0021
<I>Medium <SEP> Nr.2</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> <B>100</B> <SEP> g
<tb> Handelsgängiger <SEP> Laktalbuminauszug <SEP> (Edamin)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0022
<I>Medium <SEP> Nr.3</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> <B>100</B> <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0023
<I>Medium <SEP> Nr.4</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
EMI0005.0024
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 5</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> <B>6,3-</B>
<tb> <B>C</B>
EMI0005.0025
<I>Medium <SEP> Nr.
<SEP> 6</I>
<tb> Dextrose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> (NH4)2HP0 <SEP> 7,5 <SEP> g
<tb> <B>K2HPO4</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> ZnS04-7H <SEP> 20 <SEP> 0,01 <SEP> g Alle Medien Nr. 1-6 werden mit destilliertem Wasser auf 1 Liter Nährflüssigkeit ergänzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 festgesetzt.
EMI0005.0029
<I>Medium <SEP> Nr.7</I>
<tb> Kubanische <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Melasse <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g Destilliertes Wasser wird zugegeben bis zu einem Totalvolumen von 1 Liter Nährflüssigkeit und das PH mit Natriumhydroxyd auf 5,9 festgesetzt.
EMI0005.0031
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 8</I>
<tb> Kubanische <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Melasse <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g Destilliertes Wasser wird zugegeben bis zu einem Totalvolumen von 1 Liter Nährflüssigkeit und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,8 festgesetzt.
Die Zugabe von kleineren Mengen von Schaum schutzmitteln ist, obschon nicht unbedingt erforder lich; bei einigen Gärmedien angebracht. So hat sich gezeigt, dass die Zugabe eines substituierten Oxazalins zu gewissen Gärmedien besonders geeignet ist zur Verringerung der Schaummenge, obschon auch an dere Schaumschutzmittel verwendet werden können. Oxazalin ist ein nichtflüchtiges, kationisches, ober flächenaktives Mittel vom Amintyp, das unter dem Namen Alkaterg C im Handel erhältlich ist.
Durch das vorliegende Verfahren können die Betriebskosten gesenkt werden. Insbesondere trifft dies zu für den dabei beteiligten Zeitfaktor, die Re duktion der benötigten Ausrüstung und den Kraft verbrauch. Beim Ausüben des vorliegenden Ver fahrens ist nur ein Gärbottich erforderlich, wo bis jetzt zwei oder mehr benötigt wurden. Die Sterili sation des Gärmediums kann in einem Schritt aus geführt werden, wodurch sich eine weitere Wirt schaftlichkeit ergibt.
Das Verfahren nach der Erfindung eignet sich besonders zur Umwandlung von 4-Pregnen-3,20- dion, einem relativ billigen Material, in 4-Pregnen- 11,ss,17a,21-triol-3,20-dion durch die Einführung von 11f"-, 17a- und 21-Hydroxygruppen. Es können aber auch andere Steroide hydroxyliert werden, wo durch Hormone bzw. Zwischenstufen für die Her stellung solcher erzeugt werden.
Das vorliegende Verfahren ist daher allgemein anwendbar auf ge sättigte und ungesättigte Zyklopentanpolyhydrophen- anthrene. Diese können Substituenten enthalten, z. B. Keto, Hydroxyl, Acyloxy, Halogen, Alkyl und dergleichen, in verschiedenen Stellungen des Zyklo- pentanpolyhydrophenanthrenkerns. Ausserdem kön nen solche Verbindungen eine Keto-, eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-, eine Karbon säure-Seitenkette in 17-Stellung aufweisen.
Beispiele von Klassen solcher Zyklopentanpolyhydrophen- anthrene sind: Pregnane, Pregnene; Allopregnene, Allopregnane, Androstane, Gallensäuren und deren Ester, Sterine, Sapogenine und deren Derivate.
Es können also in den Stellungen 11, 17, 21, 6 und in verschiedenen andern zwecks Gewinnung der ent sprechenden Polyhydroxy-Derivate folgende wichtige Steroide hydroxyliert werden:
EMI0006.0016
4-Pregnen-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion-21-acetat;
<tb> Desoxykortikosteron;
<tb> 4-Pregnen-17a-21-diol-3,20-dion;
<tb> 3-Keto-cholsäure;
<tb> Lithocholsäure;
<tb> Diosgenin;
<tb> 5,6-Dichlor-diosgenin;
<tb> 4-Pregnen-3f-ol-20-on;
<tb> 5,6-Dichlor-pregnan-3iss-ol-20-on;
<tb> 5,6-Dichlor-pregnan-21-ol-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-6-a-3,20-dion <SEP> usw.
Beispielsweise kann ein 11-, 17-, 21-Desoxy- pregnen gemäss folgendem Vorgehen hydroxyliert werden: Drei Muster eines sterilen Kulturmediums, wie sie oben angeführt sind, werden zuerst je mit einer verschiedenen Mikroorganismenart, von denen die erste selektiv in 21-, die zweite in 17- und die dritte in 11-Stellung hydroxyliert, geimpft, indem eine kleine Menge von Sporensuspension oder einer vege tativen Züchtung des Organismus eingeführt wird.
Das mit dem in 21-Stellung hydroxylierenden Mikro organismus geimpfte Nährmedium wird dann bei einer Temperatur von etwa 20-45 C bebrütet, während es in Gegenwart von Sauerstoff für eine Periode von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen umgerührt wird. Dann wird eine Lösung eines in 11-, 17- und 21-Stellung keinen Sauerstoff aufwei senden Pregnens in einem Lösungsmittel, z.
B. Pro- pylglykol, dem Gärmedium zugesetzt und das Um rühren und Belüften für etwa 5-30 Stunden oder bis die Hydroxylierungsaktion fertig ist, fortgesetzt. Während dieser Gärperiode wird das zweite, den in der 17-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus enthaltende Medium bei einer Temperatur von etwa 20-45 C bebrütet, wobei es in Gegenwart von Sauerstoff für eine Periode von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen umgerührt wird. Dieses Medium wird dann dem vergärten pregnenhaltigen Medium zugesetzt und das Umrühren und Belüften für etwa 5-30 Stunden fortgesetzt.
Dann wird der in 11-Stel- lung hydroxylierende Mikroorganismus zugesetzt, der in gleicher Weise bebrütet worden ist, und die Gärung für etwa 5-30 Stunden fortgesetzt. Ist diese Hydroxylierung vollständig, so kann das 11-, 17-, 21-Trihydroxy-pregnen aus der Gärbrühe durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden.
Für die sen Zweck geeignete Lösungsmittel sind: Chloroform, Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylpyridin, organische Säureester, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ketone und Amide usw. Die das hydroxylierte Steroid ent haltende Lösung kann dann verdampft werden, wo bei das gewünschte Produkt zurückbleibt, das durch Umkristallisation oder andere bekannte Verfahren weiter gereinigt werden kann.
Das Verfahren nach der Erfindung kann aber auch so durchgeführt werden, dass nur die hydroxy- lierenden, durch die Gärung der Mikroorganismen erzeugten Enzyme mit dem zu hydroxylierenden Steroid in Berührung gebracht werden. Dies kann geschehen durch Abtrennung der hydroxylierenden Enzyme aus der Gärbrühe gemäss bekanntem Vor gehen und indem diese Enzyme mit einem Steroid in einem wässrigen Mittel in enge Berührung gebracht werden, auf ähnliche Art und Weise wie beim oben angeführten Vorgehen mit einem Gärmedium.
Auf ähnliche Weise wie oben angeführt kann das 11-, 17-, 21-Trihydroxy-pregnen, bevor es vom Me dium getrennt wird, mit andern Mikroorganismen weiter vergärt werden zwecks Hydroxylierung an derer Stellungen. Es kann z. B. das oben angeführte Vorgehen fortgesetzt werden mit einem Mikroorga nismus, der in 6-Stellung hydroxyliert, z. B. mit Rhizopus arrhizus, und das 6,11,17,21-Tetrahy- droxy-pregnen wird dann von der Gärbrühe getrennt.
<I>Beispiel 1</I> Vier Muster von etwa 50 cm- eines Nähr mediums, wie es oben unter Nr. 1 angegeben ist, wurden während 20 Minuten bei 170 C in 250-cm'- Flaschen sterilisiert. Jedes dieser Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer vegetativen Züchtung der Kultur MF-2419 geimpft. Die geimpften Mischun gen wurden dann mittels eines mit 220 U. p. M. um laufenden Rührers während etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3,20-dion in 5 cm3 Propylen wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der glei chen Tourenzahl für etwa 48 Stunden fortgesetzt.
Dann wurden 50 cms einer Kultur, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm?- einer vegetativen Züchtung F4-1568 enthielt, jeder Flasche zuge setzt. Diese Kultur wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganismus für drei Tage im genannten Medium. Die etwa 100 cm-- enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzelne Flaschen entfernt nach 12, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen getüpfelt und mit dem Lösungs system Benzol/Formamid nach der von Zaffaroni Science 111, 6 (1950) angegebenen Technik ent wickelt.
Es wurde dabei ein Ultraviolett absorbie rendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt gebildet, das den gleichen Beweglichkeitsgrad aufwies wie 4-Pregnen-11.,ss,21-diol-3,20-dion. Ein Band des Oxy dationsproduktes wurde vom Papier eluiert und das Ultraviolettspektrum seines Schwefelsäure-Chromo- gens erhalten.
Es stellte sich als identisch heraus mit demjenigen von 4-Pregnen-llss,21-diol-3,20-dion. <I>Beispiel 2</I> Sechs Muster von etwa 50 cms eines Nährmit tels gemäss Nährmedium Nr. 1 wurden für 20 Mi nuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer vegetativen Züchtung von MF-2419 geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer mit einer Tourenzahl von 220 während etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Eine sterile Lö sung von 10 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglykol wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der gleichen Tourenzahl für etwa 48 Stunden fortgesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 em3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Medium Nr. 1 und 5 cm3 einer vegetativen Züch tung F4-1568 enthielt, zugesetzt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mi kroorganismus in diesem Medium während drei Tagen.
Die je etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzelne Flaschen nach 6 bzw. 12, 24, 48, 72 und 98 Stunden Inkubation ent fernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papierstreifen auf getragen und mit dem Lösungssystem Benzol-Form- amid entwickelt.
Es wurde ein Ultraviolett absorbie rendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt gefun den, das die gleiche Beweglichkeit aufwies wie 4-Pregnen-1 lss,21-diol-3,20-dion. <I>Beispiel 3</I> Sechs Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens ,mit der Zusammensetzung des Mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Fla- schen sterilisiert. Jedes dieser Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 Vegetativzüchtung von Kultur F4-1568 geimpft.
Die geimpften Muster wurden dann mit einem Rührer und einer Tourenzahl von 220 für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglycol wurde jeder Flasche zugesetzt und für weitere 24 Stunden mit der gleichen Touren zahl umgerührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Medium Nr. 1 und 5 cm-' einer Vegetativzüch- tung MF-2419 enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganis mus in diesem Medium für drei Tage.
Die etwa 100 em3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und die einzelnen Flaschen nach 6 bzw. 12, 24, 48, 72 und 96 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde gegenüber 4-Pregnen-llss,17a,21-triol- 3,20-dion ein Umsetzungsprodukt beobachtet, das Ultraviolettstrahlen absorbierte und Tetrazollum re duzierte.
Das Ultraviolettspektrum des Produktes in konzentrierter Schwefelsäure stellte sich als iden tisch heraus mit demjenigen von 4-Pregnen- l lss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 4</I> Fünf Muster von je etwa 50 cms einer Kultur mit der Zusammensetzung von Medium Nr.
1 wur den für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung der Kultur MF-2419 geimpft. Mit einem Rührer von der Tourenzahl 220 wurden dann die geimpften Mischungen für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 10 mg von 4-Pregnen- 3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglykol zugesetzt und für weitere 48 Stunden mit der gleichen Drehzahl umge rührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die anfänglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm?, einer Vegetativzüchtung F5-1688 enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch dreitägiges Entwickeln des Mikro organismus in diesem Medium.
Die je etwa<B>100</B> cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum mit der selben Tourenzahl und derselben Temperatur wäh rend 72 Stunden umgerührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung F4-1568 enthielt. Diese Züchtung wurde auf ähnliche Art und Weise wie die andere erhalten. Die jetzt etwa 150 cm3 enthalten den Flaschen wurden umgerührt und je nach 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert.
Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Ein Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzieren des Produkt wurde beobachtet, dessen Rf und Schwe- felsäurespektrum identisch waren mit 4-Pregnen- 11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 5</I> Fünf Muster von je etwa 50 em3 eines Nähr bodens von der Zusammensetzung des Mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3- Flaschen sterilisiert.
Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Aspergillus niger geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer von 220 U. p. M. während etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid wurde dann jeder Flasche zugesetzt und für weitere 48 Stunden um gerührt.
Dann wurde jeder Flasche eine Kultur züchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung Trichoderma albuni enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganis mus im Medium für 48 Stunden. Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und nach 48 Stunden entfernt. Eine der Flaschen wurde mit Chloroform extrahiert und als Flecken auf einen Papierstreifen aufgebracht.
Der Flecken war in der Region von 4-Pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, enthaltend 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Hendersonia acicola im Nährmedium Nr. 1, wurden jeder der übrigen Fla schen zugesetzt. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzeln je nach 24 bzw. 48, 72 und 96 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und mit dem Lö sungssystem Benzol / Formamid entwickelt.
Die Flecken befanden sich in der Region von 4-Pregnen- 11 a,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 6</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens gemäss dem Nährmedium 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm- einer Vegetativzüchtung einer Kultur von Trichoderma glaucum geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Drehrührer mit der Tourenzahl 220 für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der gleichen Tourenzahl für etwa 60 Stunden fortgesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 cms einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Wojnowicia gramines enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde er halten durch dreitägige Entwicklung des Mikroorga nismus im genannten Nährmedium.
Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden mit dersel ben Geschwindigkeit für 48 Stunden umgerührt. Eine dieser Flaschen wurde mit Chloroform extra hiert und der Extrakt als Flecken auf einen Papier streifen aufgetragen. Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. Jeder der übrigen Flaschen wurden 50 cm3 einer Kultur züchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Cunninghamella blackesleana enthielt.
Diese Kulturzüchtung wurde durch eintägiges Entwickeln des Mikroorganismus im genannten Nährmedium er halten. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Fla schen wurden umgerührt und einzeln nach 12 bzw. 24, 48 und 72 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt.
Die Flecken befanden sich in der Region von 4-Pregnen- 11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 7</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 6 einge schlagen, ausgenommen, dass am Anfang die Kultur Wojnowicia graminis und dann die Kultur Tricho- derma glaucum verwendet wurde, gefolgt von Cun- ninghamella blackesleana. Die Ergebnisse waren die gleichen wie beim Beispiel 6.
<I>Beispiel 8</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 des Nähr mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 em3 einer Vegetativzüchtung einer Kultur von Penicillium adametzi geimpft. Die ge impften Mischungen wurden dann mit einem Dreh- rührer mit 220 U. p.
M. für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid zugesetzt und das Um rühren mit derselben Drehzahl für 48 Stunden fort gesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Trichoderma lignorum enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium.
Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum mit derselben Drehzahl und Temperatur während 60 Stunden umgerührt. Eine dieser Flaschen wurde mit Chloroform extrahiert und der Extrakt als Flecken auf einen Papierstreifen aufgetragen. Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Wojnowicia graminis enthielt, wurden jeder der übrigen Flaschen zugesetzt.
Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum umgerührt und nach 24 bzw. 48, 72 und 96 Stunden Inkuba tion entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid- Methanol entwickelt.
Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 9</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass die Kultur von Wojno- wicia graminis anfänglich verwendet wurde, dann die Kultur Trichoderma lignorum und zum Schluss Penicillium adametzi. Die Ergebnisse waren diesel ben wie bei Beispiel B.
<I>Beispiel 10</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass anfänglich die Kultur Trichoderma lignorum, dann die Kultur Wojnowicia graminis und zum Schluss Penicillium adametzi ver wendet wurden. Das Ergebnis war dasselbe wie beim Beispiel B.
<I>Beispiel 11</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass die Kultur von Penicil- lium adametzi zuerst, dann die Kultur Wojnowicia graminis und zum Schluss Trichoderma lignorum verwendet wurde. Das Ergebnis deckte sich mit demjenigen nach Beispiel B. <I>Beispiel 12</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert.
Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung F5-1688 geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer mit der Tourenzahl 220 während etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylform- amid zugesetzt und das Umrühren für etwa 48 Stun- nen fortgesetzt.
Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüch- tung Wojnowicia graminis enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Medium. Die jetzt etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wur den mit derselben Drehzahl für 48 Stunden umge rührt. Eine dieser Flaschen wurde dann mit Chloro form extrahiert und als Flecken auf einen Papier streifen aufgetragen.
Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Omphalistra lucida (MF-22101) enthielt, wur den jeder der übrigen Flaschen zugesetzt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch siebentägiges Entwickeln des Mikroorganismus im genannten Nährmedium. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen, wurden wiederum umgerührt und nach 12 bzw. 24, 48 und 72 Stunden Imkubation weggenom men und mit Chloroform extrahiert.
Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde ein Tetrazolium reduzierender Flecken in der Region von 4-Pregnen,-11P, "17a,21-triol-3,20- dion beobachtet. Mit einem Teil des Rückstandes wurde das Ultraviolettspektrum in konzentrierter H.S04 erhalten, das sich als demjenigen von 4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion ähnlich erwies.
Ein zweiter Teil des Extraktes wurde wiederum als Flecken auf Papier aufgetragen und dann mit Di- chromat in Eisessig oxydiert. Das Papier wurde ent wickelt und zeigte einen Flecken von derselben Be weglichkeit wie 4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion. Ein weiterer Teil wurde nach dem Eosinophil-Test als aktiv befunden.
<I>Beispiel 13</I> Fünf Muster von je etwa 50 cms des Nähr mediums Nr. 1 wurden in 250-cm3-Flaschen für 20 Minuten bei 120 C sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm?, einer Vegetativzüchtung von Hendersonia rubi geimpft. Diese geimpften Mischun gen wurden dann mit einem Drehrührer mit einer Drehzahl von 220 für etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 3 cm3 Pro pylglyco, zugesetzt und für weitere 48 Stunden um gerührt.
Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Trichoderma nigrovirens enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium. Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden mit der gleichen Drehzahl für 48 Stunden umgerührt. Der Inhalt einer der Flaschen wurde dann mit Chloroform extrahiert und der Extrakt in Form eines Fleckens auf einen Papierstreifen auf getragen.
Dieser Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. Jeder der übrigen Flaschen wurden 50 cm3 einer Kulturzüch tung zugesetzt, die anfänglich die das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Stig- mina platani (MF-2395) enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wieder für 24 Stunden umgerührt und mit Chloroform extrahiert.
Die Lösungen wur den zusammengeschüttet, bis fast zur Trockenheit verdampft, als Flecken auf Papierstreifen aufgetra gen und entwickelt. Es wurde eine Tetrazolium re duzierende Komposition an der Stelle von 4-Pregnen- 11p,17a,21-triol-3,20-dion gefunden.
Process for the production of polyhydroxysteroids by means of hydroxylating enzymes of different types of microorganisms. The present invention relates to a process for introducing hydroxyl groups (hydroxylation) into a steroid molecule by exposing deoxysteroids to the action of certain microorganisms or certain enzymes of such microorganisms.
The discovery of the remarkable therapeutic properties of cortisone, hydrocortisone, and related compounds has generated widespread interest in finding simpler and more economical methods of making these compounds. Up to now the latter have mainly been produced by means of very complicated synthesis which required a considerable number of different operations, this number not necessarily depending on the starting material. So requires z. B. a typical synthesis of hydrocortisone from relatively cheap deoxycholic acid about 40 separate reactions.
The most difficult step in the synthesis of these compounds is the introduction of oxygen into different positions of the steroid molecule, in particular of hydroxyl groups in the 11, 17 and 21 positions. Because of the difficulty in introducing these hydroxy groups, the proper selection of starting materials, the order and number of operations are important factors.
The choice of starting material must weigh the cost and ease of hydroxylation, and extensive research is required to determine which starting materials have the most prospect.
It has recently been proposed to carry out the hydroxylation of steroids by fermentation processes through the action of special hydroxylating strains of microorganisms or their hydroxylating enzymes.
The processes that have become known in the literature for generating multiply hydroxylated products, that is to say products which are hydroxylated in several positions of the steroid molecule, however, gave numerous other, undesired, hydroxylated products, including mixtures of stereoisomers and positional isomers only a small amount of each individual substance. The yields of the desired individual products are very low and, as a result of the various types of mixtures obtained, extremely complicated extraction processes are required.
to separate them from each other. This results in the practical impossibility of producing multiply hydroxylated steroids in commercially interesting amounts using this method.
It is therefore very desirable to be able to produce a multiply hydroxylated steroid with good yield by means of a fermentation process, in particular a steroid which is hydroxylated in those special positions which must have oxy groups for the production of valuable hormones. Such a process would allow the eradication of many of the complex steps that have heretofore been deemed necessary to produce hormone-acting steroids.
Furthermore, and perhaps more importantly, such a method would eliminate the need for careful selection of the starting material. In such a case, the use of cheap substances would be made possible that were previously out of the question for the production of hormones.
The method according to the invention is not subject to the difficulties as the previously available methods. In addition, this process can be used to produce multiple hydroxylated steroids with economically interesting yields and without the formation of undesired by-products. It is also possible to hydroxylate the 11, 17 and 21 carbon atoms in steroids directly using the present process.
The present invention relates to a process for the production of polyhydroxysteroids, which process is characterized in that a steroid is exposed to the action of at least two ver different, non-originating from the same microorganism species hydroxyl-introducing enzymes, each of the enzymes in a different position of the steroid introduces hydroxyl groups and at least intermittently the enzymes of at least two types of microorganisms are present in the reaction mixture.
According to the present invention, the multiple hydroxylation of steroids can be carried out in a single fermentation operation by simultaneously exposing the steroids to the action of several hydroxylating strains of microorganisms or of these hydroxylating enzymes produced by them, each of which is primarily selective hydroxylated in a certain position of the steroid molecule. This makes it possible to hydroxylate two or more positions of a steroid molecule,
without a large number of undesirable, hydroxylated products such. B. stereo and positional isomers are formed, which reduce the yield of the requested products and must be separated from the desired Pro products by means of complicated extraction processes.
The ability of the present process to produce desirable multiple hydroxylated steroids with good yield is a new and unexpected result as one would expect the various types of microorganisms used in the same process to interfere with one another and thus the yield of desired products would be reduced, either by one or more of these types of microorganisms poisoning the other, or by another mutual effect which leads to the destruction of the organisms.
On the contrary, it has been shown that by using certain types of microorganisms or their enzymes for the hydroxylation of the various carbon atoms, it is possible to exercise strict control of the hydroxylation of the steroid and thus a high yield of the desired, often hy - to achieve a hydroxylated product.
This ability to control multiple hydroxylation is very important because it has previously been impossible.
Since, according to the present invention, the multiple hydroxylation can only take place with a single fermentation operation, it is no longer necessary to separate the components from one another after each hydroxylation period, as would be necessary if each hydroxylation step were carried out separately.
This is an advantage because it greatly increases the yield; because in processes that require a special fermentation operation for each hydroxylation step, a significant part of the desired hydroxylated steroid is always lost due to the process used to separate it from the fermentation broth. The method of the present invention has been found to significantly reduce the loss incurred as a result of the isolation procedure. Are z.
B. hydroxylated two carbon atoms, the loss is reduced by about 50%,
and with hydroxylation of three carbon atoms in a single reaction mixture by about 67%. Because of the high cost of the connections created, any loss reduction has significant economic value. But it is also possible to use strains of microorganisms which, although they are somewhat less effective from the point of view of hydroxylation, for other reasons, e.g.
B. because of nutritional requirements, stability and availability, are more desirable.
To carry out the method according to the present invention, various working methods are possible. The different strains of the microorganisms can all be added at once or continuously or at irregular intervals during the fermentation period. Likewise, only a single type of microorganism can be added at the beginning of the fermentation period or continuously or at irregular intervals during the same, and the next type of microorganism can be added at the end of the fermentation period or in the course of the fermentation cycle. However, any combination of these two approaches can also be used.
The order in which the various microorganisms are added to hydroxylate the various positions of the steroid does not matter. It would be expected that the use of certain microorganisms of the adaptive type, that is to say those microorganisms which only produce the enzyme in question in contact with a suitable steroid, lead to the formation of undesired hydroxylated steroids due to undesired adaptation or the presence would work against certain groups of hydroxylation.
What types of microorganisms are used, however, is not important, with the exception that a microorganism is advantageously used which is highly selective for the specific position to be hydroxylated, i.e. one which has a yield of at least 30% , but preferably at least 501 / o, of the desired hydroxylated steroid.
However, this yield varies according to the fermentation soil used, and a small reduction in the yields listed can be accepted if the use of certain nutrient media is made easier. Table 1 shows a list of microorganisms that hydroxylate in the 11-position and the specific configuration in which this 11-hydroxylation takes place:
EMI0003.0005
EMI0003.0006
For the hydroxylation of the 11-position, the use of a hydroxylating strain of fungis of the Dematiaceae family or of hydroxylating enzymes produced by these microorganisms is preferred, since these organisms hydroxylate selectively. A particularly effective group belongs to the genus Spondylocladium. For the introduction of the hydroxyl group in the 11-position in the ss configuration,
as is the case with hydrocortisone, the F4-1568 strain is the preferred organism. The use of the species Aspergillus ochraceus of the genus Aspergillus is also highly desirable for hydroxylation since this species gives high yield products hydroxylated in the Ila position.
The use of the other microorganisms listed in Table 1 to introduce a hydroxyl group into the 11-position is, although these are suitable for the process according to the invention, but less desirable because they are not the selective quality characteristic of the Dematiaceae family and the species A. ochraceus and therefore some undesirable products arise from their use. One difficulty is that many of these other hydroxylating microorganisms, such as
B. different species of Mucorales, very specific fish in their nutritional requirements and therefore the nutrients suitable for growing such microorganisms are limited. Likewise, the spores of some Phycomycetes, including the Mucorales, are destroyed by the freeze-drying process, as a result of which there are great difficulties in maintaining their desirable properties as the cultures degrade.
Furthermore, the mucorales grow very difficult in the submerged state and, if foam can accumulate on the surface of the fermentation liquid, they accumulate in the foam and develop in the form of a membrane on the surface of the culture liquid.
This formation of a surface membrane is undesirable since this prevents the microorganism from coming into close contact with the steroid contained in the main part of the fermentation broth. In such circumstances, large amounts of foam protection agents are therefore required, which, however, make it difficult to isolate the desired hydroxylated steroids.
Table 2 lists a number of microorganisms which hydroxylate in the 17-position. However, other species of the genus Trichoderma are also suitable for the hydroxylation of the 17-carbon atom.
EMI0004.0013
<I> Table <SEP> 2 </I>
<tb> <U> microorganism <SEP> position </U>
<tb> Glicoladium <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> lignorum <SEP> 17a
<tb> <SEP> F5-1688 <SEP> 17a
<tb> <SEP> album <SEP> 17a
<tb> <SEP> glaucum <SEP> 17a
<tb> <SEP> nigrovirena <SEP> 17a
<tb> <SEP> Königi <SEP> 17a
<tb> <SEP> viride <SEP> 17a
<tb> <SEP> nunbergii <SEP> 17a
<tb> <SEP> narcissi <SEP> 17a Table 3 lists a number of microorganisms which hydroxylate the 21-position. Besides these, other species of the Sphaeroidaceae family and especially those of the Wojnowicia genus are suitable.
EMI0004.0019
<I> Table <SEP> 3 </I>
<tb> <U> microorganism <SEP> position </U>
<tb> Sphaeroidaceae <SEP> 21
<tb> Wojnowicia <SEP> 21
<tb> <SEP> graminis <SEP> (MF-2419) <SEP> 21
<tb> Hendersonia <SEP> 21
<tb> <SEP> acicola <SEP> 21
<tb> <SEP> herpotricha <SEP> 21
<tb> <SEP> phragmitis <SEP> 21
<tb> rubi <SEP> 21
<tb> <SEP> aberrans <SEP> 21
<tb> <SEP> abietus <SEP> 21
<tb> Ceratopyonis <SEP> 21
<tb> Eriosporina <SEP> 21
<tb> Prosthemium <SEP> 21
<tb> Cryptostictes <SEP> 21
<tb> Dilophosphora <SEP> 21
<tb> Uroconis <SEP> 21
<tb> Phoma <SEP> 21
<tb> <SEP> umicola <SEP> 21
<tb> <SEP> hibernica <SEP> 21
<tb> betae <SEP> 21
<tb> Pyrenochaeta <SEP> 21
<tb> <SEP> decipiens <SEP> 21
<tb> Coniothyrium <SEP> fuchelü <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> aesculi <SEP> 21
<tb> Phopsis <SEP> citri <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> apü <SEP>
21st
<tb> lycopersici <SEP> 21 The hydroxylation of the 6-position can be carried out by means of certain strains of the genus Rhisopus, e.g. B. arrhisus and RH-176. Various other positions of the steroid, e.g. B. the 7,8- and 14-carbon atoms, can also be hydroxylated by means of other, known microorganisms.
The microorganisms listed above can be obtained from known sources, e.g. B. from the Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois, from the American Type Culture Collection in Washington, D. C. or from the Centraalbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland. However, they can also be obtained from natural sources using known techniques. The cultivation of the microorganisms takes place z. B.
under aerobic conditions in a suitable nutrient medium and in close contact with the steroid to be hydroxylated, the cultivation of the microorganism being continued until the desired hydroxylation has occurred.
The process can also be carried out by means of homogeneously distributed cells separated from their nutrient medium, by first growing the microorganism in a fermentation medium under aerobic conditions, separating the cells from the nutrient medium and adding the steroid to these fasting cells, whereupon the aerobic conditions are established be continued sufficiently long until the desired hydroxylation has occurred.
The steroid can be added to the nutrient medium as a suspension in an agent, e.g. B. water, may be added, or as a solution in a solvent, e.g. B. acetone, propyl glycol, dimethylformamide or dimethylacetamide, or in finely divided form, z. B. as a solid, very fine powder. In general, it is desirable that the steroid is in a very finely divided form so that maximum contact with the hydroxylating culture medium is possible and the completion of the reaction is ensured.
The present method can be carried out in both surface and submerged cultures of aerobic microorganisms, although for practical purposes it is best carried out by growing the microorganisms submerged in an aqueous fermentation medium containing the steroid.
It is important that a fermentation medium be selected which is suitable for growing all types of microorganisms used, and the conditions under which each species of microorganism is efficiently hydroxylated must be maintained during its hydroxylation period. Since the steroids can be hydroxylated successively as well as with one another, the method according to the invention allows good control of the conditions which are most favorable for each hydroxylating organism.
The use of a combination of micro-organisms in the present method enables the nutrient medium to be used effectively, in that its utilization can be complete. In other fermentation processes the use of the nutrient medium is incomplete. This factor has the effect of reducing the cost of carrying out the method and thus enables further economic efficiency.
Aqueous nutrient media suitable for growing the hydroxylating strains of the microorganism must contain sources of assimilable carbon and nitrogen as well as traces of inorganic salts. Any of the common sources of assimilable carbon, e.g. B. dextrose, cerelose, invert molasses, glucose and the like, which are used in fermentation media, can be used. Likewise, complex nitrogen sources, as they are usually used in commercial fermentation processes, can also be used for the present purposes, such as.
B. lactalbumin extract (edamin) and corn brewing liquid, or inorganic nitrogen sources, e.g. B. dibasic ammonium phosphate, ammonium nitrate and the like, traces of other substances, e.g. B. nicotinamide or inorganic salts, e.g.
B. of soluble salts of magnesium, zinc, potassium, sodium, phosphorus and iron are usually available in complex sources of carbon and oxygen or can be added to the fermentation medium to stimulate maximum growth of the hydroxylating microorganism.
Below are examples of aqueous nutrient media that can be used in the present method.
EMI0005.0020
<I> Medium <SEP> No. <SEP> 1 </I>
<tb> Commercially available <SEP> Dextrose <SEP> (Cerelose) <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Commercially available <SEP> lactalbumin extract <SEP> (Edamin) <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0021
<I> Medium <SEP> No. 2 </I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invert molasses <SEP> <B> 100 </B> <SEP> g
<tb> Commercially available <SEP> lactalbumin extract <SEP> (Edamin)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0022
<I> Medium <SEP> No. 3 </I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invert molasses <SEP> <B> 100 </B> <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0023
<I> Medium <SEP> No. 4 </I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invert molasses <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 20 <SEP> g
EMI0005.0024
<I> Medium <SEP> No. <SEP> 5 </I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invert molasses <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> <B> 6,3- </B>
<tb> <B> C </B>
EMI0005.0025
<I> Medium <SEP> No.
<SEP> 6 </I>
<tb> Dextrose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> (NH4) 2HP0 <SEP> 7.5 <SEP> g
<tb> <B> K2HPO4 </B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> '<SEP> 7H20 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> '<SEP> 7H20 <SEP> 0.01 <SEP> g
<tb> ZnS04-7H <SEP> 20 <SEP> 0.01 <SEP> g All media No. 1-6 are supplemented with distilled water to make 1 liter of nutrient liquid and the pH is set to 6.5 with sodium hydroxide.
EMI0005.0029
<I> Medium <SEP> No. 7 </I>
<tb> Cuban <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Molasses <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 5 <SEP> g of distilled water is added up to a total volume of 1 liter of nutrient liquid and the pH is set to 5.9 with sodium hydroxide.
EMI0005.0031
<I> Medium <SEP> No. <SEP> 8 </I>
<tb> Cuban <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Molasses <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Corn brewing liquid <SEP> 5 <SEP> g of distilled water is added up to a total volume of 1 liter of nutrient liquid and the pH is set to 5.8 with sodium hydroxide.
The addition of small amounts of foam protection agents is, although not absolutely necessary; appropriate for some fermentation media. It has been shown that the addition of a substituted oxazaline to certain fermentation media is particularly suitable for reducing the amount of foam, although other foam protection agents can also be used. Oxazalin is a non-volatile, cationic, surface-active agent of the amine type which is commercially available under the name Alkaterg C.
The present method can lower the operating costs. This applies in particular to the time factor involved, the reduction in the required equipment and the power consumption. In practicing the present process, only one fermentation vat is required where two or more have been required until now. The fermentation medium can be sterilized in one step, which makes it even more economical.
The method according to the invention is particularly suitable for converting 4-pregnene-3,20-dione, a relatively cheap material, into 4-pregnene-11, ss, 17a, 21-triol-3,20-dione by the introduction of 11f ", 17a and 21-hydroxy groups. However, other steroids can also be hydroxylated, where hormones or intermediate stages for the production of such are generated.
The present process is therefore generally applicable to saturated and unsaturated cyclopentane polyhydrophenanthene. These can contain substituents, e.g. B. keto, hydroxyl, acyloxy, halogen, alkyl and the like, in different positions of the cyclopentane polyhydrophenanthrene nucleus. In addition, such compounds can have a keto, a saturated or unsaturated hydrocarbon, a carbonic acid side chain in the 17-position.
Examples of classes of such cyclopentane polyhydrophenanthene are: Pregnane, Pregnene; Allopregnene, Allopregnane, Androstane, bile acids and their esters, sterols, sapogenins and their derivatives.
The following important steroids can therefore be hydroxylated in positions 11, 17, 21, 6 and in various others for the purpose of obtaining the corresponding polyhydroxy derivatives:
EMI0006.0016
4-pregnene-3,20-dione;
<tb> 4-pregnen-17a-ol-3,20-dione;
<tb> 4-pregnen-17a-ol-3,20-dione-21-acetate;
<tb> deoxycorticosterone;
<tb> 4-pregnene-17a-21-diol-3,20-dione;
<tb> 3-keto-cholic acid;
<tb> lithocholic acid;
<tb> diosgenin;
<tb> 5,6-dichloro-diosgenin;
<tb> 4-pregnen-3f-ol-20-one;
<tb> 5,6-dichloro-pregnan-3iss-ol-20-one;
<tb> 5,6-dichloro-pregnan-21-ol-3,20-dione;
<tb> 4-Pregnen-6-a-3,20-dione <SEP> etc.
For example, an 11-, 17-, 21-deoxy pregnene can be hydroxylated according to the following procedure: Three samples of a sterile culture medium, as listed above, are first each with a different type of microorganism, the first of which is selective in 21-, the the second hydroxylated in the 17- and the third in the 11-position, inoculated by introducing a small amount of spore suspension or a vegetative cultivation of the organism.
The nutrient medium inoculated with the microorganism hydroxylating in the 21-position is then incubated at a temperature of about 20-45 ° C. while it is stirred in the presence of oxygen for a period of a few hours to several days. Then a solution of one in 11-, 17- and 21-position no oxygen aufwei send Pregnens in a solvent, for.
B. propyl glycol, added to the fermentation medium and the stirring and aeration continued for about 5-30 hours or until the hydroxylation action is finished. During this fermentation period, the second medium containing the microorganism hydroxylating in the 17-position is incubated at a temperature of about 20-45 ° C., being stirred in the presence of oxygen for a period of a few hours to several days. This medium is then added to the fermented medium containing pregnene and stirring and aeration continued for about 5-30 hours.
Then the microorganism which is hydroxylated in the 11-position and which has been incubated in the same way is added, and fermentation is continued for about 5-30 hours. When this hydroxylation is complete, the 11-, 17-, 21-trihydroxy-pregnen can be isolated from the fermentation liquor by extraction with a water-immiscible organic solvent.
Suitable solvents for this purpose are: chloroform, methylene chloride, 2-methyl-5-ethylpyridine, organic acid esters, aromatic hydrocarbons, ketones and amides, etc. The solution containing the hydroxylated steroid can then be evaporated, where the desired product remains, which can be further purified by recrystallization or other known methods.
The method according to the invention can, however, also be carried out in such a way that only the hydroxylating enzymes produced by the fermentation of the microorganisms are brought into contact with the steroid to be hydroxylated. This can be done by separating the hydroxylating enzymes from the fermentation broth according to known procedures and by bringing these enzymes into close contact with a steroid in an aqueous medium, in a similar manner to the above-mentioned procedure with a fermentation medium.
In a manner similar to that mentioned above, the 11-, 17-, 21-trihydroxy-pregnen, before it is separated from the medium, can be further fermented with other microorganisms for the purpose of hydroxylation at their positions. It can e.g. B. the above procedure to be continued with a microorganism which is hydroxylated in the 6-position, z. B. with Rhizopus arrhizus, and the 6,11,17,21-tetrahydroxy-pregnen is then separated from the fermentation broth.
<I> Example 1 </I> Four samples of about 50 cm of a nutrient medium, as indicated above under No. 1, were sterilized for 20 minutes at 170 ° C. in 250 cm ′ bottles. Each of these specimens was then inoculated with approximately 5 cc of a vegetative strain of culture MF-2419. The inoculated mixtures were then purified using a 220 r.p.m. M. Stirred around the running stirrer for about 72 hours at 28 C. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnene-3,20-dione in 5 cc propylene was added to each bottle and stirring continued at the same speed for about 48 hours.
Then 50 cms of a culture originally containing nutrient medium No. 1 and 5 cm? - of a vegetative cultivation F4-1568 were added to each bottle. This culture was obtained by developing the microorganism for three days in the above medium. The approximately 100 cm bottles were stirred and individual bottles removed after 12, 24, 48 and 72 hours of incubation and extracted with chloroform. The extracts were spotted on paper strips and developed using the benzene / formamide solution system according to the technique given by Zaffaroni Science 111, 6 (1950).
An ultraviolet-absorbing, tetrazolium-reducing product was formed which had the same degree of mobility as 4-pregnen-11., Ss, 21-diol-3,20-dione. A band of the oxidation product was eluted from the paper and the ultraviolet spectrum of its sulfuric acid chromogen was obtained.
It was found to be identical to that of 4-pregnen-llss, 21-diol-3,20-dione. <I> Example 2 </I> Six samples of about 50 cms of a nutrient according to nutrient medium no. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles. Each specimen was then inoculated with approximately 5 cc of a vegetative strain of MF-2419. The inoculated mixtures were then stirred with a stirrer with a speed of 220 for about 48 hours at 28 ° C.
A sterile solution of 10 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 2.5 cc propyl glycol was added to each bottle and stirring continued at the same speed for about 48 hours. Then, 50 cubic meters of a culture originally containing No. 1 medium and 5 cc of a vegetative F4-1568 were added to each bottle. This cultivation was obtained by developing the microorganism in this medium for three days.
The bottles, each containing about 100 cm3, were stirred and individual bottles were removed after 6 or 12, 24, 48, 72 and 98 hours of incubation and extracted with chloroform. The extracts were applied in the form of spots to strips of paper and developed using the benzene-formamide solvent system.
An ultraviolet absorbing, tetrazolium reducing product was found which had the same mobility as 4-pregnen-1 lss, 21-diol-3,20-dione. <I> Example 3 </I> Six samples of approximately 50 cm3 each of a nutrient medium, with the composition of medium no. 1, were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles. Each of these specimens was then inoculated with approximately 5 cm3 of vegetative growth from culture F4-1568.
The inoculated swatches were then stirred with a stirrer rotating at 220 for about 48 hours at 28 ° C. A sterile solution of 10 mg of 4-pregnen-17a-ol-3,20-dione in 2.5 cm3 of propyl glycol was added to each bottle and stirred for a further 24 hours at the same number of revolutions. Then 50 cm 3 of a culture which originally contained medium No. 1 and 5 cm of a vegetative culture MF-2419 were added to each bottle. This culture was obtained by developing the microorganism in this medium for three days.
The bottles containing about 100 em3 were stirred and the individual bottles were removed after 6 or 12, 24, 48, 72 and 96 hours of incubation and extracted with chloroform. The extracts were applied to paper in the form of spots and developed in the chloroform / formamide-methanol system. A reaction product was observed with 4-pregnene-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione, which absorbed ultraviolet rays and reduced tetrazole.
The ultraviolet spectrum of the product in concentrated sulfuric acid turned out to be identical to that of 4-pregnen-lss, 17a, 21-triol-3,20-dione. <I> Example 4 </I> Five samples of about 50 cms each of a culture with the composition of medium no.
1 was sterilized for 20 minutes at 120 C in 250 cm3 bottles. Each specimen was then inoculated with approximately 5 cc of a vegetative cultivar of culture MF-2419. The inoculated mixtures were then stirred at 28 ° C. for about 48 hours using a stirrer with a speed of 220.
A sterile solution of 10 mg of 4-pregnene-3,20-dione in 2.5 cm3 propylglycol was added to each bottle and the mixture was stirred at the same speed for a further 48 hours. Then 50 cm3 of a culture culture were added to each bottle, which initially contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm 3 of a vegetative culture F5-1688. This culture was obtained by developing the microorganism in this medium for three days.
The bottles, each containing about <B> 100 </B> cm3, were again stirred at the same number of revolutions and the same temperature for 72 hours. Then 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium no. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture F4-1568 were added to each bottle. This cultivation was obtained in a manner similar to the other. The bottles now containing around 150 cm3 were stirred and, depending on the 6, 12, 24, 48 and 72 hours of incubation, removed and extracted with chloroform.
The extracts were applied to paper in the form of spots and developed in the chloroform / formamide-methanol system. An ultraviolet absorbing, tetrazolium reducing product was observed whose Rf and sulfuric acid spectrum were identical to 4-pregnene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione. <I> Example 5 </I> Five samples of approximately 50 em3 each of a nutrient medium of the composition of medium no. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles.
Each specimen was then inoculated with approximately 5 cc of an Aspergillus niger vegetative variety. The inoculated mixtures were then mixed with a stirrer at 220 rpm. M. stirred for about 48 hours at 28 C. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 0.5 cc dimethylformamide was then added to each bottle and stirred for an additional 48 hours.
A culture was then added to each bottle which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative cultivation Trichoderma albuni. This culture was obtained by developing the microorganism in the medium for 48 hours. The approximately 100 cm3 bottles were stirred and removed after 48 hours. One of the bottles was extracted with chloroform and stained on a strip of paper.
The spot was in the region of 4-pregnen-lla, 17a-diol-3,20-dione. 50 cc of a culture culture containing 5 cc of a vegetative culture of Hendersonia acicola in nutrient medium No. 1 was added to each of the remaining bottles. The bottles, which now contain about 150 cm3, were stirred and removed individually after 24 or 48, 72 and 96 hours of incubation and extracted with chloroform. The extracts were applied as spots on paper and developed with the benzene / formamide solution system.
The spots were in the region of 4-pregnen-11 a, 17a, 21-triol-3,20-dione. <I> Example 6 </I> Five samples of approximately 50 cm3 each of a nutrient medium according to nutrient medium 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles. Each specimen was then inoculated with approximately 5 cm of a vegetative cultivar of Trichoderma glaucum. The inoculated mixtures were then stirred with a rotary stirrer with a speed of 220 for about 48 hours at 28 ° C.
A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 0.5 cc dimethylformamide was added to each bottle and stirring continued at the same speed for about 60 hours. Then 50 cms of a culture which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture of Wojnowicia gramines were added to each bottle. This cultivation was he hold by three days of development of the microorganism in the nutrient medium mentioned.
The approximately 100 cc bottles were stirred at the same speed for 48 hours. One of these bottles was extracted with chloroform and the extract was applied as stains on a strip of paper. The spot was in the region of 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione. 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium no. 1 and 5 cm3 of a vegetative cultivation of Cunninghamella blackesleana were added to each of the remaining bottles.
This culture was cultivated by developing the microorganism in the above-mentioned nutrient medium for one day. The bottles, which now contain about 150 cm3, were stirred and removed individually after 12 or 24, 48 and 72 hours of incubation and extracted with chloroform. The extracts were applied as spots on paper and developed in the chloroform / formamide-methanol system.
The spots were in the region of 4-pregnen-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione. <I> Example 7 </I> The procedure of Example 6 was followed, except that the Wojnowicia graminis culture was used at the beginning and then the Trichoderma glaucum culture, followed by Cunninghamella blackesleana. The results were the same as in Example 6.
<I> Example 8 </I> Five samples of about 50 cm3 each of the nutrient medium No. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles. Each specimen was then inoculated with about 5 em3 of a vegetative cultivar of Penicillium adametzi. The inoculated mixtures were then mixed with a rotary stirrer at 220 rpm.
M. stirred for about 48 hours at 28 C. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 0.5 cm3 of dimethylformamide was added to each bottle and stirring was continued at the same speed for 48 hours. Then 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture of Trichoderma lignorum were added to each bottle. This cultivation was obtained by developing the microorganism for three days in said nutrient medium.
The bottles containing about 100 cm3 were again stirred at the same speed and temperature for 60 hours. One of these bottles was extracted with chloroform and the extract was stained on a strip of paper. The spot was in the region of 4-pregnen-lla, 17a-diol-3,20-dione. 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture of Wojnowicia graminis were added to each of the remaining bottles.
The bottles, which now contain about 150 cm3, were again stirred and after incubation for 24 or 48, 72 and 96 hours, they were removed and extracted with chloroform. The extracts were applied to paper in the form of spots and developed in the chloroform / formamide-methanol system.
The spot was in the region of 4-pregnen-lla, 17a, 21-triol-3,20-dione. <I> Example 9 </I> The procedure according to Example 8 was followed, except that the culture of Wojnovicia graminis was used initially, then the culture Trichoderma lignorum and finally Penicillium adametzi. The results were the same as in Example B.
<I> Example 10 </I> The procedure of Example 8 was followed, with the exception that initially the culture Trichoderma lignorum, then the culture Wojnowicia graminis and finally Penicillium adametzi were used. The result was the same as in example B.
Example 11 The procedure of Example 8 was followed, except that the culture of Penicillium adametzi was used first, then the culture Wojnowicia graminis and finally Trichoderma lignorum. The result coincided with that according to Example B. <I> Example 12 </I> Five samples of about 50 cm3 each of a nutrient medium No. 1 were sterilized for 20 minutes at 120 ° C. in 250 cm3 bottles.
Each specimen was then inoculated with approximately 5 cc of an F5-1688 vegetative variety. The inoculated mixtures were then stirred with a 220 speed stirrer for about 72 hours at 28 ° C. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 0.5 cm 3 of dimethylformamide was added to each bottle and stirring was continued for about 48 hours.
Then 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium no. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture Wojnowicia graminis were added to each bottle. This cultivation was obtained by developing the microorganism for three days in the above medium. The bottles, which now contain about 100 cm3, were stirred at the same speed for 48 hours. One of these bottles was then extracted with chloroform and stained on a strip of paper.
The spot was in the region of 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione. 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative cultivation of Omphalistra lucida (MF-22101) were added to each of the remaining bottles. This cultivation was obtained by developing the microorganism in the above nutrient medium for seven days. The bottles, which now contain about 150 cm3, were again stirred and removed after 12, 24, 48 and 72 hours of incubation and extracted with chloroform.
The extracts were applied as spots on paper and developed in the chloroform / formamide-methanol system. A tetrazolium reducing spot was observed in the region of 4-pregnene, -11P, "17a, 21-triol-3,20-dione. With part of the residue, the ultraviolet spectrum was obtained in concentrated H.SO4, which turns out to be that of 4-pregnen-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione proved similar.
A second part of the extract was again applied as a spot on paper and then oxidized with dichromate in glacial acetic acid. The paper was developed and showed a spot of the same mobility as 4-pregnen-17a, 21-diol-3,11,20-trione. Another part was found to be active after the eosinophil test.
<I> Example 13 </I> Five samples of about 50 cms each of the nutrient medium No. 1 were sterilized in 250 cm3 bottles at 120 ° C. for 20 minutes. Each specimen was then inoculated with about 5 cm ?, a vegetative variety of Hendersonia rubi. These inoculated mixtures were then stirred with a rotary stirrer at a speed of 220 for about 72 hours at 28 ° C. A sterile solution of 20 mg of 4-pregnen-3,20-dione in 3 cm3 propylglyco was added to each bottle and stirred for a further 48 hours.
Then 50 cm3 of a culture which originally contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture of Trichoderma nigrovirens were added to each bottle. This cultivation was obtained by developing the microorganism for three days in said nutrient medium. The bottles containing about 100 cm3 were stirred at the same speed for 48 hours. The contents of one of the bottles was then extracted with chloroform and the extract was applied to a strip of paper in the form of a patch.
This spot was in the region of 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione. 50 cm3 of a culture which initially contained the nutrient medium No. 1 and 5 cm3 of a vegetative culture of Stigmina platani (MF-2395) were added to each of the remaining bottles. This cultivation was obtained by developing the microorganism for three days in said nutrient medium. The bottles, which now contain about 150 cm3, were again stirred for 24 hours and extracted with chloroform.
The solutions were poured together, evaporated to near dryness, applied as stains to strips of paper and developed. A tetrazolium-reducing composition was found in the place of 4-pregnene-11p, 17a, 21-triol-3,20-dione.