DE1107225B

DE1107225B - Process for the production of 1, 4, 17 (20) -Pregnatrienes

Info

Publication number: DE1107225B
Application number: DEF29102A
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Lindner; Dr Josef Schmidt-Thome; Dr Rudolf Junk; Dr Georg Nesemann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1959-08-05
Filing date: 1959-08-05
Publication date: 1961-05-25
Also published as: GB908976A

Description

Verfahren zur Herstellung von 1,4,17(20)-Pregnatrienen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1,4,17(20)-Pregnatrienen durch mikrobiologische Dehydrierung von 4,17(20)-Pregnadienen. 1-Dehydrosteroide haben in der letzten Zeit zunehmende Bedeutung als hochaktive Substanzen mit Nebennierenrindenhormonwirksamkeit erlangt. Wichtige Zwischenprodukte bei der Herstellung solcher Steroide sind Verbindungen des nachstehenden Typs worin R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkvlgruppe und X die Gruppe bedeutet. Die genannten 1,4,17(20)-Triene lassen sich als 21-Acetate durch oxydative Hydroxylierung in 1,4-Dien-17cx,21-dihydroxy-20-on-21-acetate, z. B. Prednisolon- und 6.x-Methylprednisolonacetat überführen (J. A. Hogg, F. H. Lincoln, A. H. Nathan, A. R. Hanze, W. P. Schneider, P. F. Beal, R. W. Jackson, B. J. Magerlein: J. Am. Chem. Soc., 77 [1955], S.4436; G. B. Spero, J. L. Thompson, B. J. Magerlein, A. R. Hanze, H. C. Murray, O. K. Sebek, J. A. Hogg: J. Am. Chem. Soc., 78 [1956], S. 6213).Process for the Production of 1,4,17 (20) -Pregnatrienes The invention relates to a process for the production of 1,4,17 (20) -Pregnatrienes by microbiological dehydration of 4,17 (20) -Pregnadienes. 1-Dehydrosteroids have recently gained increasing importance as highly active substances with adrenal hormone activity. Important intermediates in the manufacture of such steroids are compounds of the following type wherein R is a hydrogen atom or a lower alkyl group and X is the group means. The 1,4,17 (20) -trienes mentioned can be converted into 21-acetates by oxidative hydroxylation in 1,4-dien-17cx, 21-dihydroxy-20-one-21-acetate, e.g. B. prednisolone and 6.x-methylprednisolone acetate (JA Hogg, FH Lincoln, AH Nathan, AR Hanze, WP Schneider, PF Beal, RW Jackson, BJ Magerlein: J. Am. Chem. Soc., 77 [1955], 4436; GB Spero, JL Thompson, BJ Magerlein, AR Hanze, HC Murray, OK Sebek, JA Hogg: J. Am. Chem. Soc., 78 [1956], p. 6213).

Die 1,4,17(20)-Triene sind aus den entsprechenden 4,17(20)-Dienen durch mikrobiologische Dehydrierung mit Hilfe von Schimmelpilzen der Gattung Septomyxa, speziell mit Septomyxa affinis hergestellt worden (A. Weintraub, S. H. Eppstein, P. D. Meister [deutsche Patentschrift 1021845] und G. B. Spero und Mitarbeiter [a. a. O.]). Die Ausbeute beträgt hierbei etwa 50 bis 60 °/o. Es wurde nun gefunden, daß man 1,4,17(20)-Pregnatriene der allgemeinen Formel worin R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und X die Gruppe bedeutet, durch mikrobiologische Dehydrierung unter aeroben Bedingungen in der Weise herstellen kann, daß man zur Dehydrierung von 4,17(20)-Pregnadienen der allgemeinen Formel worin R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkyl- 2o gruppe und X die Gruppe bedeutet, Bakterien der Gattung Corynebacterium oder der Art Bacillus sphaericus, deren Varianten oder Mutanten bzw. die von diesen gebildeten Fermente in Gegenwart eines reichen Nährbodens, zweckmäßig unter Zusatz von Methanol bzw. Phenyl-ß-naphthylamin, verwendet und aus der Kulturlösung die Dehydrierungsprodukte in an sich bekannter Weise isoliert.The 1,4,17 (20) -trienes have been produced from the corresponding 4,17 (20) -dienes by microbiological dehydration with the help of molds of the genus Septomyxa, especially with Septomyxa affinis (A. Weintraub, SH Eppstein, PD Meister [German patent specification 1 021845] and GB Spero and coworkers [loc. cit.]). The yield here is about 50 to 60%. It has now been found that 1,4,17 (20) -Pregnatrienes of the general formula wherein R is a hydrogen atom or a lower alkyl group and X is the group means, can be prepared by microbiological dehydration under aerobic conditions in such a way that one can dehydrate 4,17 (20) -pregnadienes of the general formula wherein R is a hydrogen atom or a lower alkyl group and X is the group means bacteria of the genus Corynebacterium or the species Bacillus sphaericus, their variants or mutants or the ferments formed by them in the presence of a rich nutrient medium, expediently with the addition of methanol or phenyl-ß-naphthylamine, and the dehydration products in the culture solution in isolated in a known manner.

Bei der Übertragung des Dehydrierungsverfahrens der genannten Verbindungen mit Septomyxa auf ein solches mit Bakterien war nicht vorauszusehen, ob die Reaktion in gleicher Weise verlaufen würde, vielmehr lag die Annahme nahe, daß die ungesättigte Seitenkette abgebaut würde, zumal bekannt ist, daß z. B. Corynebacterium simplex sehr aktive Fermente enthält. Tatsächlich verläuft die Umsetzung in Nährböden, bestehend aus 0,10/, Difco Hefeextrakt und einem Puffer von pA 6,9 (vgl. J. Am. Chem. Soc., 77 [1955], S. 41ß4), in denen die Dehydrierung von Cortison und Hydrocortison fast quantitativ vor sich geht, nur sehr unvollständig. 2 bis 3 Stunden nach der Zugabe der 4,17(20)-Diene hört die Reaktion vollständig auf, so daß nur 20 bis 30 °/o an Trien gebildet werden. Anschließend beginnen die Bakterien, die Steroide abzubauen, so daß - je nach Durchsatz - 12 bis 24 Stunden nach der Zugabe die gesamten Steroide aus der Kulturlösung verschwunden sind. Durch Zugabe größerer Mengen von Alkoholen, z. B. Äthanol oder Methanol, oder anderen Lösungsmitteln, z. B. Dimethylformamid, Triäthylenglykol oder Aceton, läßt sich der Abbau zwar zum Teil verringern oder verhindern, jedoch ist die Umsetzung zu den Trienen eher schlechter als besser, zum Teil treten sogar neue Umsetzungsprodukte auf.When transferring the dehydration process of the compounds mentioned with Septomyxa to one with bacteria, it was not possible to foresee whether the reaction would proceed in the same way. B. Corynebacterium simplex contains very active ferments. The conversion actually takes place in nutrient media consisting of 0.1% , Difco yeast extract and a buffer of pA 6.9 (cf. J. Am. Chem. Soc., 77 [1955], p. 4134), in which the Dehydration of cortisone and hydrocortisone is almost quantitative, only very incomplete. The reaction stops completely 2 to 3 hours after the addition of the 4,17 (20) -dienes, so that only 20 to 30% of triene are formed. The bacteria then begin to break down the steroids so that - depending on the throughput - all of the steroids have disappeared from the culture solution 12 to 24 hours after the addition. By adding larger amounts of alcohols, e.g. B. ethanol or methanol, or other solvents, e.g. B. dimethylformamide, triethylene glycol or acetone, the degradation can be reduced or prevented in part, but the conversion to the trienes is worse than better, and sometimes even new reaction products occur.

Erst die Anwendung eines reicheren Nährbodens, der Glucose als Kohlenstoffquelle und Caseinpepton und Fleischextrakt als Stickstoffquelle sowie Hefe-und Leberextrakt als Quelle für Wirkstoffe und essentielle Aminosäuren enthält, führt zu einer über viele Stunden anhaltenden Enzymaktivität, 'die es gestattet, einige Stunden nach der Zugabe der zu dehydrierenden 4,17(20)-Diene weitere Nachgaben an Steroid vorzunehmen und so einen Durchsatz von 0,5 bis 0,7 g pro Liter Kulturlösung und mehr zu erreichen.Only the use of a richer nutrient medium, glucose, as a carbon source and casein peptone and meat extract as a nitrogen source, as well as yeast and liver extract as a source of active ingredients and essential amino acids, leads to an over Enzyme activity lasting many hours, which allows a few hours after the addition of the 4,17 (20) -dienes to be dehydrated to make further additions to steroid and thus to achieve a throughput of 0.5 to 0.7 g per liter of culture solution and more.

Das genannte Verfahren besitzt gegenüber dem bisher beschriebenen Septomyxaverfahren eine Reihe von Vorzügen. 1. Zur Aufarbeitung kann die gesamte Kulturlösung ohne Filtration direkt extrahiert werden. Bei Anwendung von Schimmelpilzen muß dagegen die Kulturlösung zunächst filtriert und dann das Filtrat und das Mycel gesondert extrahiert werden.The above-mentioned method has advantages over the one previously described Septomyxa procedure has a number of benefits. 1. The entire Culture solution can be extracted directly without filtration. When using mold on the other hand, the culture solution must first be filtered and then the filtrate and the mycelium extracted separately.

2. Die Extraktion eines Mycels bereitet große technische Schwierigkeiten, da die so gewonnenen Extrakte eine große Zahl von Nebenprodukten enthalten, die aus dem Mycel stammen und die Kristallisation der Reaktionsprodukte erschweren. Im Gegensatz dazu ist bei Bakterienkulturen das Bakterienmaterial mengenmäßig in einem so geringen Anteil vorhanden, und die Bakterien sind in der Lösung so weitgehend suspendiert, daß sich eine Abtrennung erübrigt. Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen darin, daß bei der Extraktion wesentlich weniger Nebenprodukte anfallen und die 1,4.17(20)-Triene in großer Reinheit entstehen.2. The extraction of a mycelium causes great technical difficulties, because the extracts obtained in this way contain a large number of by-products that originate from the mycelium and make the crystallization of the reaction products difficult. In contrast, in bacterial cultures, the bacterial material is quantitatively in in such a small proportion, and the bacteria are so largely in the solution suspended so that separation is unnecessary. Particular advantages of the invention Process are that there are significantly fewer by-products in the extraction arise and the 1,4.17 (20) -trienes arise in great purity.

3. Die Ausbeuten bei der Dehydrierung mit Bakterien liegen höher als bei der mit Schimmelpilzen. Bei Anwendung von z. B. Corynebacterium simplex erhält man bis zu 90"/, an Trien.3. The yields from bacterial dehydration are higher than the one with mold. When using z. B. Corynebacterium simplex receives one up to 90 "/, at trienes.

4. Die Umsetzungsgeschwindigkeit ist bei Anwendung von Bakterien, speziell von Corynebacterium simplex, erheblich größer und damit die Fermentationszeit kürzer als bei Septomyxa affinis. Die Herstellung der Kulturlösung erfolgt unter Verwendung einer reichen Nährlösung, die z. B. für Corynebacterium simplex 10/, Glucose, 0,4 °/o Casein-Pepton, -0,4"/, Fleischextrakt, 0,1"/, Leberextrakt, 0,1°/o Hefeextrakt und 0,25°/o Kochsalz enthält. Arbeitet man mit ärmeren Nährböden, so sind, wie oben schon ausgeführt, die Ausbeuten geringer, da ein Teil des zugesetzten Steroids abgebaut wird.4. The conversion rate is when using bacteria, especially from Corynebacterium simplex, considerably larger and thus the fermentation time shorter than with Septomyxa affinis. The culture solution is prepared under Using a rich nutrient solution, e.g. B. for Corynebacterium simplex 10 /, Glucose, 0.4% casein peptone, -0.4 "/, meat extract, 0.1" /, liver extract, 0.1% Contains yeast extract and 0.25% table salt. If you work with poorer breeding grounds, so are, as already stated above, the yields lower, since part of the added Steroid is broken down.

Der auch in reicheren Nährböden unter Umständen noch mögliche Abbau läßt sich durch Zusatz von Hemmstoffen weitgehend verhindern. Besonders bewährt hat sich ein Zusatz von Methanol in einer Menge von 5 bis 10 Volumprozent der Kulturlösung bzw. die Zugabe des Steroids in Methanollösung bis zu der genannten Konzentration.The degradation that may still be possible in richer nutrient media can be largely prevented by adding inhibitors. Particularly proven has an addition of methanol in an amount of 5 to 10 percent by volume of the culture solution or the addition of the steroid in methanol solution up to the concentration mentioned.

Als abbauhemmend hat sich auch der Zusatz von Phenyl-ß-naphthylamin erwiesen, wobei die günstigste Menge etwa 1 mg auf 100 ml Kulturlösung beträgt.The addition of phenyl-ß-naphthylamine has also proven to inhibit degradation proven, the cheapest amount being around 1 mg per 100 ml of culture solution.

Wegen der Schwerlöslichkeit der zu dehydrierenden Diene empfiehlt sich ein fraktionierter Zusatz über einen längeren Zeitraum. Andernfalls kristallisieren die Diene leicht aus der Kulturlösung aus und entziehen sich so der Dehydrierungsreaktion. Gibt man aber zunächst nur geringe Mengen Dien - etwa 0,1 bis 0,2 mg pro Milliliter - zu der Kultur, so bleibt das Steroid in Lösung, und die Dehydrierung verläuft praktisch vollständig. Das gebildete Trien kristallisiert dann häufig zum Teil aus der Kultur- Lösung aus. Wenn die Dehydrierung vollendet ist, kann man portionsweise weitere Zusätze an Steroid vornehmen, ohne daß das gebildete Trien abgebaut wird.Recommended because of the poor solubility of the dienes to be dehydrated a fractionated addition over a longer period of time. Otherwise crystallize the dienes are easily removed from the culture solution and thus escape the dehydration reaction. But first only give small amounts of diene - about 0.1 to 0.2 mg per milliliter - to the culture, the steroid remains in solution and dehydration proceeds practically complete. The triene formed then often partially crystallizes out the culture- Solution. When dehydration is complete, can you can make further additions of steroid in portions, without the triene formed is dismantled.

Besonders bewährt hat sich z. B. bei einem 10-1-Ansatz eine anfängliche Zugabe von 2 g Dien, der nach einigen Stunden Umsetzungszeit weitere Zugaben von je 1 g in Abständen von einigen Stunden folgen.Has proven particularly successful z. B. in a 10-1 approach, an initial one Addition of 2 g of diene, which after a few hours of reaction time further additions of Follow each 1 g at intervals of a few hours.

Der Reaktionsablauf läßt sich sehr gut verfolgen, indem man in regelmäßigen Abständen Proben entnimmt, mit Methylenchlorid extrahiert und papierchromatographisch untersucht. Besonders eignet sich für eine rasche Übersicht die Rundfilterchromatographie und die Beobachtung der Steroidzonen durch ihre Fluoreszenzlöschung des Papiers, wie sie von F. Lindner, R. Junk, G. Nesemann, J. Schmidt-Thom6 (Medizin und Chemie, VI [1958], S. 198), beschrieben worden ist. Für quantitative Untersuchungen ist die Papierchromatographie auf Papierstreifen nach Zaffaroni besser geeignet (A. Zaffaroni, R. B. Burton, E. H. Keutmann: Science, 111 [1950] S. 6; J. Biol. Chem., 188 [1951], S.763).The course of the reaction can be followed very well by taking regular Samples are taken at intervals, extracted with methylene chloride and by paper chromatography examined. Round filter chromatography is particularly suitable for a quick overview and the observation of the steroid zones by their fluorescence quenching of the paper, as described by F. Lindner, R. Junk, G. Nesemann, J. Schmidt-Thom6 (medicine and chemistry, VI [1958], p. 198). For quantitative studies is paper chromatography on paper strips according to Zaffaroni is more suitable (A. Zaffaroni, R.B. Burton, E. H. Keutmann: Science, 111 [1950] p. 6; J. Biol. Chem., 188 [1951], p.763).

Zur Aufarbeitung wird die gesamte Kulturlösung in üblicher Weise mit einem mit Wasser nicht öder nur begrenzt mischbaren Lösungsmittel ausgeschüttelt, z. B. mit Essigester, Butylacetat, Butanol, Chloroform, Methylenchlorid, Äthylenchlorid u. a., wobei sich Methylenchlorid besonders bewährt hat. Nach dem Einengen kristallisiert beim Stehenlassen in den meisten Fällen das gebildete Trien aus und kann dann nach bekannten Methoden weiter gereinigt werden. Beispiel 1 Man füllt 300-ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml einer Nährlösung, die 10/, Glucose, 0,4 °/o Casein-Pepton, 0,4°/o Fleischextrakt, 0,10/, Leberextrakt, 0,1 % Hefeextrakt und 0,25°/o Kochsalz enthält und einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 zeigt. Die Kolben werden sterilisiert und mit 2m1 einer Kultur von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) beimpft, die 100m1 einer 24 Stunden bei 28'C geschüttelten Kultur dieser Mikroorganismen in 0,10/, Difco-Hefeextrakt, 0,310/, Nag H P 0, und 0,19 °/o K H2 P 04 entnommen werden. Nach 8stündigem Schütteln bei 28'C auf einer Maschine mit 200 Umdrehungen pro Minute und 10 cm Amplitude werden zu jedem der Kolben je 20 mg 4,17(20)-Pregnadien-l 1ß,21-diol-3-on, in Methanolmengen von 3 bis 7 ml gelöst, zugegeben. In einem weiteren Ansatz wird eine Lösung in 3 ml Methanol angewandt und außerdem 1 mg Phenyl-ß-naphthylamin zugesetzt. Nach 15 Stunden Inkubationszeit werden die Ansätze je dreimal mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, die vereinigten Extrakte über Natriumsulfat getrocknet und die Lösungen bis nahe zur Trockne eingeengt. Ein aliquoter Teil wird auf Papierstreifen papierchromatographisch nach der Methode von Zaffaroni untersucht. Die Zonen werden durch UV-Fotografie festgelegt, mit Äthanol extrahiert und bei 240 m#t in einem UV-Spektralfotometer quantitativ ausgemessen.For work-up, the entire culture solution is shaken out in the customary manner with a solvent which is not or only limited miscible with water, e.g. B. with ethyl acetate, butyl acetate, butanol, chloroform, methylene chloride, ethylene chloride and others, with methylene chloride being particularly effective. After concentration, in most cases the triene formed crystallizes out when left to stand and can then be further purified by known methods. EXAMPLE 1 300 ml Erlenmeyer flasks are filled with 100 ml of a nutrient solution containing 10% glucose, 0.4% casein peptone, 0.4 % meat extract, 0.10 %, liver extract, 0.1% % Yeast extract and 0.25% sodium chloride and has a pH of 6.8 to 7.0. The flasks are sterilized and inoculated with 2 ml of a culture of Corynebacterium simplex (ATCC 6946) , the 100 ml of a culture of these microorganisms shaken for 24 hours at 28 ° C. in 0.10 /, Difco yeast extract, 0.310 /, Nag HP 0, and 0 , 19 ° / o K H2 P 04 can be taken. After 8 hours of shaking at 28'C on a machine at 200 revolutions per minute and 10 cm amplitude, 20 mg of 4.17 (20) -pregnadien-11, 21-diol-3-one, in methanol amounts of 3 to 7 ml dissolved, added. In a further approach, a solution in 3 ml of methanol is used and 1 mg of phenyl-β-naphthylamine is also added. After an incubation time of 15 hours, the batches are extracted three times each time with 100 ml of methylene chloride, the combined extracts are dried over sodium sulfate and the solutions are concentrated to near dryness. An aliquot is examined on paper strips by paper chromatography according to the Zaffaroni method. The zones are determined by UV photography, extracted with ethanol and measured quantitatively at 240 m # t in a UV spectrophotometer.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß mit steigender Methanolkonzentration der bakterielle Abbau des Diens mehr und mehr unterdrückt wird und die Ausbeute dementsprechend steigt. Die gleiche Wirkung erzielt man auch durch Zusatz von Phenyl-ß-naphthylamin. Abhängigkeit der Ausbeute an Trien von der zugesetzten Menge Methanol bzw. Phenyl-ß-naphthylamin. Einsatz von je 20 mg Dien auf 100 ml Kulturlösung Beispiel 2 Ein Fermentierungsgefäß von 301 Inhalt, das mit Rührer, Lufteinleitungsrohr und Zugabestutzen mit Kapsenberg-Verschluß versehen ist, wird mit 101 einer Nährlösung, wie im Beispiel l beschrieben, unter Zufügen von 6m1 Silikonöl-Emulsion (Antischaum-Emulsion SE) gefüllt, sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 100 ml einer Kultur von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) (Anzucht wie im Beispiel l) beimpft. Nach 15stündigem Wachstum der Kultur bei 28°C, bei einer Belüftung von 1001 Luft pro Stunde, fügt man 2 g 4,17(20)-Pregnadienllß-21-diol-3-on in 400m1 Methanol hinzu und läßt die Kultur weiter laufen. Nach 4 Stunden wird eine Probe entnommen, analog Beispiel l extrahiert und papierchromatographisch ausgewertet. Sie ergibt 78 °/o Trien und 501, Dien, bezogen auf die eingesetzte Menge Dien. Direkt nach der Probenahme wird erneut 1 g Dien in 30 ml Methanol hinzugegeben. Entsprechend wird 61/2 und 9 Stunden nach der ersten Zugabe verfahren, wobei die jeweils vor der neuen Zugabe entnommenen Proben 72 bzw. 760/, Trien und 8 bzw. 9 °/o Dien ergeben. Nach der letzten Zugabe wird noch 5 Stunden weiter kultiviert, so daß die Gesamtinkubationszeit 14 Stunden beträgt. Dann wird die Fermentation abgebrochen und die Kulturlösung zweimal mit 21 Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Methylenchlorid bis auf ein kleines Volumen abdestilliert und ein aliquoter Teil zur papierchromatographischen Untersuchung entnommen. Die Probe ergibt einen Gehalt der Methylenchloridlösung von 76 °/o Trien. Aus der Methylenchloridlösung werden 3,2g reines 1;4,17(20)-Pregnatrien-I lß,21-diol-3-on kristallisiert erhalten. In der Mutterlauge befinden sich noch etwa 300 mg Trien.The results are summarized in the table, from which it can be seen that the bacterial degradation of the diene is more and more suppressed with increasing methanol concentration and the yield increases accordingly. The same effect can also be achieved by adding phenyl-ß-naphthylamine. Dependence of the yield of triene on the amount of methanol or phenyl-ß-naphthylamine added. Use of 20 mg diene per 100 ml culture solution EXAMPLE 2 A fermentation vessel with a capacity of 301, which is provided with a stirrer, air inlet tube and addition nozzle with Kapsenberg cap, is sterilized with 101 of a nutrient solution as described in Example 1 with the addition of 6 ml of silicone oil emulsion (antifoam emulsion SE) and after cooling with 100 ml of a culture of Corynebacterium simplex (ATCC 6946) (cultivation as in Example 1) inoculated. After the culture had grown for 15 hours at 28 ° C., with aeration of 100 liters of air per hour, 2 g of 4,17 (20) -Pregnadiene-21-diol-3-one in 400 ml of methanol were added and the culture was allowed to continue. After 4 hours, a sample is taken, extracted analogously to Example 1 and evaluated by paper chromatography. It gives 78% triene and 501 % diene, based on the amount of diene used. Immediately after taking the sample, another 1 g of diene in 30 ml of methanol is added. The same procedure is followed 61/2 and 9 hours after the first addition, the samples taken before the new addition giving 72 or 760 /, triene and 8 or 9% diene. After the last addition, cultivation is continued for a further 5 hours, so that the total incubation time is 14 hours. The fermentation is then stopped and the culture solution is extracted twice with 21% methylene chloride. After drying over sodium sulfate, the methylene chloride is distilled off to a small volume and an aliquot is removed for analysis by paper chromatography. The sample shows a content of the methylene chloride solution of 76% triene. 3.2 g of pure 1; 4,17 (20) -Pregnatrien-Iß, 21-diol-3-one are obtained in crystallized form from the methylene chloride solution. There are still about 300 mg of triene in the mother liquor.

Beispiel 3 Ein Fermentierungsgefäß von 1001 Inhalt wird mit 501 einer Nährlösung wie im Beispie12 angesetzt. Man beimpft mit 11 einer wie im Beispiel l hergestellten Kultur von Corynebacterium simplex. Nach 15 Stunden Vorkultur bei 28'C und einer Durchlüftung mit 8001 Luft pro Stunde werden 10g 4,17(20)-Pregnadien-llß,21-diol-3-on, gelöst in 2,51 Methanol, hinzugegeben. Nach 31/2 Stunden zeigt eine entnommene Probe einen Gehalt von 55 0/0 Trien und 42 0/0 Ausgangsmaterial. Nun werden in Abständen von 21/2 Stunden noch dreimal je 5 g Dien in 150 ml Methanol zugegeben, und nach der letzten Zugabe läßt man noch weitere 4 Stunden fermentieren. Man arbeitet, wie vorstehend beschrieben, auf. Die papierchromatographische Messung einer Probe ergibt eine Ausbeute von 75°/a 1,4,17(20)-Pregnatrien-llß,21-diol-3-on und 100/0 Ausgangsmaterial. Aus dem Extrakt erhält man 18g eines Kristallisates mit einem Gehalt von 940/0 an 1,4,17(20)-Pregnatrien-11ß,21-diol-3-on. Beispiel 4 Ein Fermentierungsgefäß wie im Beispie12 wird mit 101 einer Nährlösung, enthaltend 0,501, Fleischpepton, 0,3°/o Fleischextrakt, 0,31°/o Na2HP04, 0,19 0/0K H2 P 0Q und 4 ml Silikonöl-Emulsion, gefüllt, sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 200m1 einer Kultur von Bacillus sphaericus, var. fusiformis (ATCC 7054) beimpft (Anzucht wie im Beispie12). Nach 16stündiger Kultivierung bei 28°C unter Durchleiten von 3501 Luft pro Stunde werden 2 g 4,17(20)-Pregnadien-11ß,21-diol-3-on, gelöst in 250 ml Methanol, steril hinzugegeben. Nach weiterer 48 Stunden langer Kultivierung unter den genannten Bedingungen wird die Kulturlösung wie im Beispiel 2 aufgearbeitet. Man erhält 0,71 g eines Kristallisates mit einem Gehalt von 78 0/0 an 1,4,17(20)-Pregnatrien-11ß,21-diol-3-on und 100/0 Ausgangsmaterial. Beispiel 5 Zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben werden mit 90 ml Nährlösung wie im Beispiel 1 gefüllt, sterilisiert und mit 10 lul einer Kultur von Corynebacterium simplex beimpft (Anzucht wie im Beispiel 1). Nach 8 Stunden Vorkultur bei 28' C auf einer Schüttelmaschine werden je 10 mg 6-x-Methyl-4,17(20)-pregnadien-1lß,21-diol-3-on, in 6,5 ml Methanol gelöst, steril hinzugegeben. Man kultiviert weitere 15 Stunden. Die Aufarbeitung und Untersuchung nach dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren ergibt eine Ausbeute von 79 bzw. 85 0/0 6x-Methyl-1,4,17(20)-pregnatrien-1 1ß,21-diol-3-on. Beispiel 6 Ein Fermentierungsgefäß wird mit 101 einer Nährlösung wie im Beispiel 2 angesetzt. Man beimpft mit 200 ml einer Kultur von Corynebacterium simplex (Anzucht wie im Beispiel 1) und läßt 20 Stunden bei 28"C unter Durchleiten von 1001 Luft pro Stunde fermentieren. Dann werden 0,5 g 6:x-Methyl-4,17(20)-pregnadien-11ß,21-diol-3-on, gelöst in 500 ml Methanol, steril zugegeben, und die Fermentation wird fortgesetzt. In Abständen von je einer Stunde werden weitere 0,5 g Substanz, gelöst in je 30 ml Methanol, zugegeben, bis der Fermenter 0,5g Steroid pro Liter Kulturlösung enthält. Nach der letzten Zugabe wird die Fermentation nach 5 Stunden fortgesetzt. Dann wird wie im Beispiel 2 aufgearbeitet. Eine papierchromatographisch ausgewertete Probe ergibt eine Ausbeute von 760/0 6x-Methyl-1,4,17(20)-pregnatrienllß.21-diol-3-on. Aus dem Extrakt erhält man 1,15 g eines Kristallisates mit einem Gehalt von 88 0/0 6a-Methyl-trien.Example 3 A fermentation vessel with a capacity of 100 liters is made up with 50 liters of a nutrient solution as in Example 12. One inoculates with 11 of a culture of Corynebacterium simplex prepared as in Example 1. After 15 hours of preculture at 28 ° C. and aeration with 800 l of air per hour, 10 g of 4.17 (20) -pregnadiene-11ß, 21-diol-3-one, dissolved in 2.5 l of methanol, are added. After 31/2 hours, a sample taken shows a content of 55% triene and 42% starting material. 5 g of diene in 150 ml of methanol are then added three times at intervals of 21/2 hours, and fermentation is continued for a further 4 hours after the last addition. You work on as described above. The paper chromatographic measurement of a sample gives a yield of 75 ° / yr 1,4,17 (20) -Pregnatriene-11ß, 21-diol-3-one and 100/0 starting material. The extract gives 18 g of crystals with a content of 940/0 of 1,4,17 (20) -Pregnatrien-11ß, 21-diol-3-one. Example 4 A fermentation vessel as in Example 12 is filled with 101 of a nutrient solution containing 0.501 meat peptone, 0.3% meat extract, 0.31% Na2HP04, 0.19 0 / 0K H2 P 0Q and 4 ml silicone oil emulsion, filled, sterilized and, after cooling, inoculated with 200 ml of a culture of Bacillus sphaericus, var. fusiformis (ATCC 7054) (cultivation as in Example12). After 16 hours of cultivation at 28 ° C. while passing 350 l of air per hour through it, 2 g of 4,17 (20) -pregnadiene-11β, 21-diol-3-one, dissolved in 250 ml of methanol, are added in a sterile manner. After cultivation for a further 48 hours under the conditions mentioned, the culture solution is worked up as in Example 2. 0.71 g of crystals containing 78% 1,4,17 (20) -Pregnatrien-11ß, 21-diol-3-one and 100/0 starting material are obtained. Example 5 Two 300 ml Erlenmeyer flasks are filled with 90 ml nutrient solution as in Example 1, sterilized and inoculated with 10 μl of a culture of Corynebacterium simplex (cultivation as in Example 1). After 8 hours of preculture at 28 ° C. on a shaking machine, 10 mg of 6-x-methyl-4,17 (20) -pregnadiene-11, 21-diol-3-one, dissolved in 6.5 ml of methanol, are added in a sterile manner . Cultivate for another 15 hours. Working up and testing according to the method given in Example 1 gives a yield of 79 or 85% 6x-methyl-1,4,17 (20) -pregnatrien-1 1β, 21-diol-3-one. Example 6 A fermentation vessel is made up with 101 of a nutrient solution as in Example 2. It is inoculated with 200 ml of a culture of Corynebacterium simplex (cultivation as in Example 1) and allowed to ferment for 20 hours at 28 ° C. while passing 100 l of air per hour through it. Then 0.5 g of 6: x-methyl-4,17 ( 20) -pregnadien-11ß, 21-diol-3-one, dissolved in 500 ml of methanol, added sterile, and the fermentation is continued.At intervals of one hour, a further 0.5 g of substance, each dissolved in 30 ml of methanol , until the fermenter contains 0.5 g of steroid per liter of culture solution. After the last addition, the fermentation is continued after 5 hours. Then it is worked up as in Example 2. A sample evaluated by paper chromatography gives a yield of 760/0 6x-methyl- 1,4,17 (20) -pregnatrienllß.21-diol-3-one. 1.15 g of crystals with a content of 88% 6a-methyltriene are obtained from the extract.

Beispiel 7 Es wird wie im Beispie15 verfahren, aber unter Verwendung von Corynebacterium hoagii. Die Auswertung ergibt eine Ausbeute von 64 bzw. 540/0 6,x-Methyl-1,4,17(20)-pregnatrien-1 Iß,21-diol-3-on. Beispiel 8 Ein Fermentierungsgefäß wie im Beispie12 wird mit 101 einer Nährlösung, die 0,50/0 Glucose, 0,20/0 Caseinpepton, 0,20/0 Fleischextrakt, 0,050/0 Leberextrakt, 0,05 0/0 Hefeextrakt und 0,1251)/, Kochsalz enthält, unter Zufügung von 6m1 Silicon-Emulsion gefüllt, sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 100m1 einer Kultur von Corynebacterium simplex (Anzucht wie im Beispiel l) beimpft. Man züchtet bei 28°C unter Durchleiten von 100l Luft pro Stunde und bei 150 Umdrehungen pro Minute. Nach 20 Minuten werden 2 g 4,17(20)-Pregnadien-21-ol-3,11-dion - hergestellt aus in 21-Stellung acetyliertem 4,17 (20)-Pregnadien-llß,21-diol-3-on durch Oxydation mit Chromsäure-Eisessig und anschließende Verseif unggelöst in 800 ml Methanol zur Kultur zugegeben. 4 Stunden nach der Zugabe enthält eine dem Fermenter entnommene Probe 90°/0 1,4,17(20)-Pregnatrien-21-ol-3,11-dion und l00/0 Ausgangssteroid. Nach weiteren 2 Stunden wird die Fermentation abgebrochen und, wie im Beispiel2 beschrieben, aufgearbeitet. Man erhält 1,81 g (920/0 der Theorie) 1,4,17 (20)-Pregnatrien-21-ol-3,11-dion mit einer papierchromatographisch gemessenen Reinheit von 98 0/0. Das Produkt schmilzt zunächst bei 1541 C, erstarrt dann wieder und zeigt schließlich den Fp.178°C [.,x]" = 188° (c = 1,0; CHCl3).Example 7 The procedure is as in Example 15, but using Corynebacterium hoagii. The evaluation shows a yield of 64 or 540/0 6, x-methyl-1,4,17 (20) -pregnatrien-1 Iß, 21-diol-3-one. Example 8 A fermentation vessel as in Example 12 is filled with 101 of a nutrient solution containing 0.50 / 0 glucose, 0.20 / 0 casein peptone, 0.20 / 0 meat extract, 0.050 / 0 liver extract, 0.05 0/0 yeast extract and 0, 1251) /, contains common salt, filled with the addition of 6m1 silicone emulsion, sterilized and, after cooling, inoculated with 100m1 of a culture of Corynebacterium simplex (cultivation as in Example 1). Cultivation is carried out at 28 ° C. while passing 100 l of air through it per hour and at 150 revolutions per minute. After 20 minutes, 2 g of 4,17 (20) -Pregnadien-21-ol-3,11-dione - prepared from 4,17 (20) -Pregnadien-11ß, 21-diol-3-one acetylated in the 21-position added undissolved to the culture by oxidation with chromic acid-glacial acetic acid and subsequent saponification in 800 ml of methanol. 4 hours after the addition, a sample taken from the fermenter contains 90 ° / 0 1,4,17 (20) -Pregnatrien-21-ol-3,11-dione and 100/0 starting steroid. After a further 2 hours, the fermentation is stopped and, as described in Example 2, worked up. 1.81 g (920/0 of theory) 1,4,17 (20) -Pregnatrien-21-ol-3,11-dione are obtained with a purity of 98%, measured by paper chromatography. The product initially melts at 1541 ° C., then solidifies again and finally has a melting point of 178 ° C. [., X] " = 188 ° (c = 1.0; CHCl3).

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the preparation of 1,4,17 (20) -Pregnatrienes of the general formula wherein R is a hydrogen atom or a lower alkyl group and X is the group means by microbiological dehydration under aerobic conditions, characterized in that the dehydrogenation of 4,17 (20) - pregnadienes of the general formula wherein R is a hydrogen atom or a lower alkyl group and X is the group means bacteria of the genus Corynebacterium or the species Bacillus sphaericus, their variants or mutants or the ferments formed by them in the presence of a rich nutrient medium, expediently with the addition of methanol or phenyl-ß-naphthylamine, and the dehydration products in the culture solution in isolated in a known manner.

2. The method according to claim 1, characterized in that the steroid is added in methanol solution, so that the final concentration of methanol in the culture solution is 5 to 100 / ", preferably 7%.

3. Procedure according to the Claims 1 and 2, characterized in that the addition of the steroid is fractionated undertakes. References considered: U.S. Patent No. 2,880,217.