DE1029824B

DE1029824B - Process for the preparation of 11β-hydroxysteroids

Info

Publication number: DE1029824B
Application number: DE1954P0011582
Authority: DE
Inventors: Jacok White Davisson; Donald Albert Kita; Gilbert Malcolm Shull
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1953-04-21
Filing date: 1954-03-20
Publication date: 1958-05-14

Description

Verfahren zur Herstellung von 11 ß-Hydroxysteroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 11 ß-Hydroxysteroiden durch Behandlung eines entsprechenden 11-Desoxysteroids mit Kulturen von oxydierend wirkenden Mikroorganismen der Gattung Curvularia oder den daraus erhältlichen oxydierend wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen und Abtrennung der erhaltenen 11 ß-Hydroxysteroide, z. B. durch Extraktion. Das Verfahren eignet sich besonders gut zur Umwandlung der Reichsteinschen Substanz S (17-Oxy-11-desoxycorticosteron) in Kendalls Verbindung F (17-Oxycorticosteron).Process for the preparation of 11 β-hydroxysteroids The present The invention relates to a process for the preparation of 11 ß-hydroxysteroids by treating an appropriate 11-deoxy steroid with cultures of oxidizing acting microorganisms of the genus Curvularia or the oxidizing ones obtainable therefrom acting enzymes under aerobic conditions and separation of the 11 ß-hydroxysteroids obtained, z. B. by extraction. The process is particularly suitable for converting the Reichstein's substance S (17-oxy-11-deoxycorticosterone) in Kendall's compound F (17-oxycorticosterone).

Die Herstellung biologisch wirksamer Steroidverbindungen, wie Cortison und Verbindung F, ist mit Schwierigkeiten verbunden. Eines der schwierigsten Probleme ist die Einführung von Sauerstoffatomen in wichtige Stellungen, insbesondere in die 11-Stellung des Steroidkerns. Die Verbindung S läßt sich nach bekannten synthetischen Verfahren aus verschiedenen in der Natur vorkommenden, verhältnismäßig billigen Ausgangsstoffen, z. B. den pflanzlichen Steroiden, gewinnen. Die Verbindung F dagegen, die insbesondere für die Behandlung von Gelenkrheumatismus und bestimmten anderen Leiden des menschlichen Körpers sehr wertvoll ist, ist wesentlich schwieriger herstellbar. Daher ist jedes Verfahren, nach dem sich die Verbindung S mit guter Ausbeute und ohne übermäßige Kosten in die Verbindung F umwandeln läßt, von großer Bedeutung für die pharmazeutische Industrie und für die Allgemeinheit.The manufacture of biologically active steroid compounds such as cortisone and compound F, is fraught with difficulty. One of the hardest problems is the introduction of oxygen atoms in important positions, especially in the 11 position of the steroid nucleus. The compound S can be synthesized according to known synthetic methods Process from various naturally occurring, relatively cheap Starting materials, e.g. B. the herbal steroids win. Compound F, on the other hand, those in particular for the treatment of rheumatoid arthritis and certain others Suffering of the human body is very valuable, is much more difficult to produce. Therefore, any process by which the compound S is in good yield and can be converted into the compound F without undue cost is of great importance for the pharmaceutical industry and for the general public.

Es sind bereits Verfahren bekannt, nach denen die Reichsteins Substanz S mittels Organismen, die von den erfindungsgemäß verwendeten Organismen vollkommen verschieden sind, in Kendells Verbindung F umgewandelt werden kann. In der USA.-Patentschrift 2 602 769 ist die Verwendung von Cunninghamella blakesleena (aus der Gattung der Mucorales) und in einer Veröffentlichung im Journal of the American Chemical Society (Band 74, S.2381 [1952]) ist die Verwendung von Streptomyces fradiae beschrieben. Eine große Zahl von Mikroorganismen ist auf ihre Wirksamkeit bei der Umwandlung von Reichsteins Substanz S in Kendalls Verbindung F geprüft worden. Bei den meisten zeigte sich keine 1.1 ß-Hydroxylierung. Eine beträchtliche Zahl Kulturen von Organismen der Mucorales-Gattung wurde auf die gleiche Reaktion hin untersucht, wobei sich nur bei wenigen von ihnen zeigte, daß in geringem Maße eine Umwandlung stattfindet.Processes are already known by which the Reichstein's substance S by means of organisms that are completely different from the organisms used according to the invention are different, can be converted into Kendell's compound F. In the U.S. Patent 2 602 769 is the use of Cunninghamella blakesleena (from the genus Mucorales) and in a publication in the Journal of the American Chemical Society (Volume 74, p.2381 [1952]) describes the use of Streptomyces fradiae. A large number of microorganisms is critical of their effectiveness in converting of Reichstein's Substance S in Kendall's Compound F. Most of them there was no 1.1 ß-hydroxylation. A considerable number of cultures of organisms of the Mucorales genus was examined for the same response, with only a few of them showed that there was little conversion taking place.

Es wurde nun gefunden, daß die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Curvularia oder der daraus erhältlichen Enzyme für das erfindungsgemäße Verfahren zu sehr günstigen Ergebnissen führt und die Herstellung von Produkten, wie Kendalls Verbindung F, in Ausbeuten von bis zu 40 °/o oder mehr ermöglicht. Außerdem lassen sich die Reaktionen unter solchen Bedingungen durchführen, daß die Produkte verhältnismäßig leicht und mit hoher Reinheit isoliert werden können. Dadurch wird die praktische Herstellung von Substanzen, wie Kendalls Verbindung F, auf biochemischem Wege zum ersten Male in großem Umfang möglich.It has now been found that the use of microorganisms of the Genus Curvularia or the enzymes obtainable therefrom for the inventive Process leads to very favorable results and the manufacture of products, like Kendall's compound F, in yields of up to 40% or more. In addition, the reactions can be carried out under such conditions that the Products can be isolated relatively easily and with high purity. Through this becomes the practical manufacture of substances, such as Kendall's compound F, on biochemical basis Paths possible for the first time on a large scale.

Die erfindungsgemäß verwendeten Organismen sind oxydierend wirkende Fungi der Art der Curvularia, die zur Gattung Moniliales der Klasse Fungi imperfecti gehört. Diese Einteilung beruht auf der Klassifizierung von Saccardo, P. A., Sylloge, Fungorum, Bd. B. Besonders wertvoll sind Stämme der Arten Curvularia falcata, C. brachyspora, C. lunata und C. pallescens. Es können auch andere Mikroorganismen der Gattung Curvularia, die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, durch einfache, unten ausführlicher beschriebene Versuche gefunden werden. Viele dieser Organismen sind in öffentlichen Kulturensammlungen erhältlich, und andere lassen sich aus natürlichen Materialien, wie z. B. Erde, nach den üblichen, den Mykologen bekannten Verfahren isolieren.The organisms used according to the invention are oxidizing Fungi of the type of Curvularia belonging to the genus Moniliales of the class Fungi imperfecti heard. This classification is based on the classification of Saccardo, P. A., Sylloge, Fungorum, Vol. B. Strains of the species Curvularia falcata, C. brachyspora, C. lunata and C. pallescens. Other microorganisms can also be present of the genus Curvularia, which are suitable for carrying out the method according to the invention suitable can be found by simple experiments described in more detail below. Many of these organisms are available in public cultural collections, and others can be made from natural materials such as B. Earth, according to the usual, isolate methods known to the mycologist.

Die verfahrensgemäß eingesetzten Ausgangsstoffe können in der 17-Stellung des Kernes verschiedene Seitenketten und in der 3-Stellung Keto- oder Hydroxylgruppen tragen. Sie können ferner an verschiedenen Stellen des Kerns, z. B. in 3(4)- oder 5(6)-Stellung, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen besitzen. Die Ausbeute des oxydierten Produkts hängt in gewissem Maße von der Art des als Ausgangsmaterial verwendeten Steroids, von dem verwendeten Curvularia-Stamm sowie von den Reaktionsbedingungen (d. h. Temperatur, Zeit, pn-Wert, Nährmedium, Zeit, in der die Verbindung dem Mikroorganismus zugesetzt wird usw.) ab. Außerdem kann ein gegebener oxydierend wirkender Mikroorganismus der bevorzugten Art bei verschiedenen Steroiden verschiedene Wirkungen zeigen. Die Anwesenheit einer 21ständigen Hydroxylgruppe in den Ausgangsverbindungen, soweit diese der Pregnanreihe angehören, kann für eine gute Ausbeute an 11ß-Oxyverbindung besonders förderlich sein.The starting materials used according to the process can be in the 17-position different side chains of the core and keto or hydroxyl groups in the 3-position wear. You can also at different points of the core, for. B. in 3 (4) - or 5 (6) position, have carbon-carbon double bonds. The yield of the oxidized product depends to some extent on the nature of the raw material used Steroids, from the Curvularia strain used as well on the reaction conditions (i.e. temperature, time, pn value, nutrient medium, time, in which the compound is added to the microorganism, etc.). Also can a given oxidizing microorganism of the preferred species in various Steroids show different effects. The presence of a 21 hydroxyl group in the output connections, insofar as they belong to the Pregnan series, for a a good yield of 11ß-oxy compound can be particularly beneficial.

Dies trifft insbesondere zu für Reichsteins Substanz S und Desoxycorticosteron. Zur Bewertung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte kann man z. B. die Menge des erhaltenen Produktes durch Bestimmung der Wirkung auf Mäuse ohne Nebenniere oder auf die eminophile Zahl von Versuchstieren feststellen. Außerdem kann man die durch Uydroxylierung erzeugten reinen Produkte nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren abtrennen.This is especially true for Reichstein's Substance S and deoxycorticosterone. To evaluate the products produced by the method according to the invention, one z. B. the amount of product obtained by determining the effect on mice without adrenal gland or on the eminophilic number of experimental animals. aside from that the pure products obtained by hydroxylation can be obtained by following the procedure below the procedure described.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann z. B. das Ausgangssteroid bei Impfung des Mediums unter sterilen Bedingungen mit einer Kultur des Mikroorganismus oder nach beendigtem Wachstum des Organismus zugesetzt -werden. In manchen Fällen kann der Zusatz des Steroids nach beendigtem Wachstum des Mikroorganismus in dem Nährmedium unter aeroben Bedingungen zweckmäßig sein. Dies gilt insbesondere dann, wenn während der Anfangsstufen des Wachstums des Mikroz)rganismus die Neigung zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte aus dem Steroidsubstrat besteht. An Stelle des Ausgangssteroidalkohols selbst kann man auch dessen Acetat oder einen anderen Ester verwenden, obwohl dies zuweilen zu einer merklich geringeren Ausbeute an hydroxyliertem Produkt führt. Bei einer andren Durchführungsform des Verfahrens kann man Enzympräparate vom Wachstum eines geeigneten oxydierenden Organismus von der Art der Curvularia zur Durchführung des Verfahrens verwenden. Sehr geeignet ist auch ein Verfahren, bei dem der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in Abwesenheit des Steroids auf einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird. Danach kann das Mycel von der Brühe abfiltriert und, falls gewünscht, mit destilliertem Wasser gewaschen werden. Anschließend wird das Mycel in destilliertem Wasser suspendiert, welches das Steroidsubstrat enthält.To carry out the method according to the invention, for. B. the parent steroid when the medium is inoculated under sterile conditions with a culture of the microorganism or added after the organism has finished growing. In some cases can the addition of the steroid after the growth of the microorganism in the Nutrient medium may be appropriate under aerobic conditions. This applies in particular if if during the initial stages of growth of the microorganism there is a tendency to Formation of unwanted by-products consists of the steroid substrate. Instead of The starting steroid alcohol itself can also be its acetate or another ester use, although this sometimes results in a noticeably lower yield of hydroxylated Product leads. Another way of carrying out the process is to use enzyme preparations from the growth of a suitable oxidizing organism of the type of Curvularia use to perform the procedure. A method is also very suitable in which the microorganism is aerobic in the absence of the steroid is grown on a suitable nutrient medium. After that, the mycelium can be removed from the broth filtered off and, if desired, washed with distilled water. Afterward the mycelium is suspended in distilled water, which is the steroid substrate contains.

Das Rühren der Mischung und die Belüftung werden etwa 12 bis 48 Stunden fortgesetzt und danach die Reaktionsprodukte gewonnen. Dieses Verfahren hat den Vorteil der leichten Gewinnung des oxydierten Steroids, da die verschiedenen, ursprünglich für das Wachstum des Mikroorganismus verwendeten Nährmaterialien sowie die verschiedenen anfänglich von den wachsenden Organismen ausgeschiedenen Stoffe nur abwesend sind. Nach diesem Verfahren erhält man bei einigen Stämmen der Art Curvularia sogar bessere Gesamtausbeuten an oxydierten Produkten als bei direktem Zusatz des Steroids zu Beginn oder später zur gesamten Gärbrühe. Das Verhältnis der Produkte und die Oxydationsgeschwindigkeit sowie die Art der erhaltenen Nebenprodukte können je nach Verwendung der gesamten Gärbrühe oder des isolierten gewaschenen Mycels verschieden sein.Stirring the mixture and ventilating will take about 12 to 48 hours continued and then recovered the reaction products. This procedure has the Advantage of easy extraction of the oxidized steroid, since the various, originally nutrient materials used for the growth of the microorganism, as well as the various substances initially excreted by the growing organisms are only absent. With this method, even better strains are obtained from some strains of the species Curvularia Overall yields of oxidized products than with direct addition of the steroid Beginning or later for the entire fermentation broth. The ratio of the products and the rate of oxidation as well as the nature of the by-products obtained can vary depending on the use of the whole Fermentation broth or the isolated washed mycelium may be different.

Im allgemeinen verwendet man bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Konzentration von nicht über 1 bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht des Substrats. Es können jedoch bisweilen auch ändere Konzentrationen vorteilhafter verwendet werden.In general, one will use in practicing the invention Process a concentration of not more than 1 to 2 percent by weight, based on the total weight of the substrate. However, other concentrations can sometimes also be used can be used more advantageously.

Nach Beendigung der Hydroxylierung kann man das Produkt durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren, Lösungsmittel gewinnen. Hierzu eignen sich chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, Ketone und Alkohole, wie Chloroform, Methylenchlorid, Trichloräthan oder Äthylendichlorid. Die Verwendung von heißem Äthylendichlorid, d. h. mit einer Temperatur von etwa 40 bis 80° C, für die Extraktion der Steroidprodukte wird besonders bevorzugt. Zur Erzielung eines festen Produktes kann man den Extrakt des Produktes und des nicht umgesetzten Ausgangsmaterials auf ein kleines Volumen oder zur Trockne konzentrieren, De Reinigung des Produktes kann auf verschiedene Arten erfolgen. Am zweckmäßigsten wird das Produkt vom Ausgangsmaterial und anderen Produkten, wie z. B. höheroxydierten Stoffen, die sich während der Reaktion bilden, chromatographisch abgetrennt. Adsorptionsmittel, wie z. B. Kieselerdegel oder entsprechende andere Adsorptionsmittel, eignen sich besonders für diesen Zweck. Es wurde nun gefunden, daß sich eine aus einer Mischung von Kieselerdegel und einem niederen Alkohol; insbesondere Äthanol, hergestellte Säule für die Abtrennung der Steroidausgangsmaterialienbesonders eignet. Die Steroidgemische können auf Säulen aus Adsorptionsmitteln, wie z. B. Kieselerdegel, in konzentrierter Chloroform- oder Methylenchloridlösung gegeben werden. Danach kann man die Säule mit zusätzlichen Mengen des Lösungsmittels zur Entfernung von. Verunreinigungen, wie z. B. Fetten und Pigmenten, waschen. Das absorbierte Gemisch wird sodann durch allmähliche Zugabe einer Mischung des Lösungsmittels mit einem kleineren Prozentsatz, z. B. 1 bis 5 °/o, eines niederen Alkohols (Methanol, Äthanol usw.) abgetrennt. Die Stoffe können getrennt werden und die getrennten Verbindungen unter Verwendung einer Mischung aus Lösungsmitteln mit allmählich steigender Polarität nach und nach aus der Säule ausgewaschen werden. Hierzu eignet sich z, B: eine Mischung aus Methylenchlorid und eine kleinere; allmählich gesteigerte Menge Äthanol.After the hydroxylation has ended, the product can be extracted win with a suitable, water-immiscible solvent. For this are suitable chlorinated lower hydrocarbons, ketones and alcohols such as chloroform, Methylene chloride, trichloroethane or ethylene dichloride. The use of hot Ethylene dichloride, d. H. at a temperature of about 40 to 80 ° C, for the extraction the steroid products are particularly preferred. To achieve a solid product you can use the extract of the product and the unreacted starting material a small volume or concentrate to dryness, de cleaning the product can can be done in different ways. Most conveniently, the product becomes from the starting material and other products such as B. more highly oxidized substances that occur during the reaction form, separated by chromatography. Adsorbents, such as. B. silica gel or other corresponding adsorbents are particularly suitable for this purpose. It has now been found that a mixture of silica gel and a lower alcohol; in particular ethanol, produced column for the separation of the Steroid starting materials are particularly suitable. The steroid mixtures can be on pillars from adsorbents, such as. B. silica gel, in concentrated chloroform or Methylene chloride solution are given. After that you can add additional Amounts of solvent to remove. Impurities such as B. Fats and pigments, wash. The absorbed mixture is then gradually added a mixture of the solvent in a smaller percentage, e.g. B. 1 to 5 ° / o, a lower alcohol (methanol, ethanol, etc.) separated. The fabrics can separated and the separated compounds using a mixture from solvents with gradually increasing polarity gradually out of the column be washed out. For example, a mixture of methylene chloride is suitable for this and a smaller one; gradually increased amount of ethanol.

Fraktionen des ausgewaschenen Materials aus chromatographischen Säulen können auf die Natur des Produktes hin untersucht werden, indem man kleine Mengen der Lösungen papierchromatographisch prüft. Verfahren, die sich für diese Trennung und Analyse besonders eignen, sind in der USA.-Patentschrift 2 602 769 und in einer Veröffentlichung von Shull u. a. in den »Archives of Biochemistry«, Bd. 37, S. 186 (1952), ausführlich beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich außerdem gut zur Bestimmung der Verwendbarkeit neuer Stämme von Mikroorganismen in dem erfindungsgemäßen Verfahren: Die Gärbehandlung kann im kleinen Versuch mit dem entsprechenden Steroidsubstrat durchgeführt und der gesamte Extrakt des Gärgemisches konzentriert und der Papierchromatographie unterworfen werden. Durch Verwendung bekannter Vergleichsproben ist es möglich zu bestimmen, ob sich der ausgewählte Mikroorganismus für das erfindungsgemäße Verfahren eignet.Fractions of the leached material from chromatographic columns can be examined for the nature of the product by taking small amounts the solutions are checked by paper chromatography. Procedures in favor of this separation and analysis are particularly useful in U.S. Patent 2,602,769 and U.S. Patent No. 2,602,769 Publication by Shull et al. in the "Archives of Biochemistry", vol. 37, p. 186 (1952), described in detail. This method is also well suited for determination the usability of new strains of microorganisms in the method according to the invention: The fermentation treatment can be carried out in a small experiment with the appropriate steroid substrate carried out and the entire extract of the fermentation mixture concentrated and paper chromatography be subjected. By using known comparison samples, it is possible to determine whether the selected microorganism is suitable for the inventive method suitable.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 Eine Kultur eines aus der Kulturensammlung des Quartermaster Corps in Philadelphia erhaltenen und als Curvilaria falcata QM 120 h bezeichneten Organismus wurde auf einem Agar-Nährmedium fortgepflanzt. Es wurde nun gefunden, daß dieser Organismus nicht zur Art der C. falcata, sondern zur Art der C. lunata gehört. Es wird daher in dieser Beschreibung mit Curvularia lunata (QM 120 h) bezeichnet. Eine lebende Kultur dieses Organismus wurde der Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, übergeben und in ihrer ständigen Sammlung als NRRL-2380 aufgenommen. Der Organismus wurde unter sterilen Bedingungen von dem Agarschrägnährboden in ein steriles Medium der folgenden Zusammensetzung gespült Malzextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50/ 0 Saccharose ........................ 10/0 Natriumnitrit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20/0 Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/0 Magnesiumsulfat-heptahydrat . . . . . . . . 0,050/, Eisensulfat-heptahydrat . . . . . . . . . . . . . 0,051)/, saures Dikaliumphosphat ........... 0,10/0 destilliertes Wasser, mit Kaliumhydroxyd auf einen p11-Wert von 7,0 eingestellt. In mehreren 300-ccm-Kolben wurden jeweils 100 ccm dieses Mediums verwendet. In jeden Kolben gab man 50 mg der in einem kleinen Volumen Aceton. gelösten Reichsteinschen Substanz S. Während dieser Vorgänge wurde das Gärgemisch unter sterilen Bedingungen gehalten. Danach schüttelte man das Gemisch 7 Tage bei einer Temperatur von etwa 28° C. Der Inhalt der Kolben wurde vereinigt und mehrere Male mit Äthylendichlorid extrahiert, indem man jeweils ein Fünftel des Volumens der wäßrigen Phase verwendete. Die vereinigten Äthylendichloridextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und nach Entfernung des Trockenmittels wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 1 bis 2 ccm konzentriert und eine Probe dieser Lösung der Papierchromatographie unterworfen, wobei man ein Lösungsmittelsystem, das 50 Volumprozent Äther und 50 Volumprozent Hexan enthielt, und ein zweites System mit einer Wasser-Benzol-Mischung verwendete. Durch Prüfen der Papierchromatogramme mit einer Probe von Kendalls Verbindung F als Kontrolle wurde bewiesen, daß das Produkt diese Verbindung enthielt. Außerdem ergaben sich Hinweise auf höher oxydierte Produkte.The following examples explain the process according to the invention. Example 1 A culture of an organism obtained from the culture collection of the Quartermaster Corps in Philadelphia and designated as Curvilaria falcata QM 120 h was propagated on a nutrient agar medium. It has now been found that this organism does not belong to the species of C. falcata, but to the species of C. lunata. It is therefore referred to in this description as Curvularia lunata (QM 120 h). A live culture of this organism was given to the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois and included in their permanent collection as NRRL-2380. The organism was rinsed under sterile conditions from the agar slant into a sterile medium of the following composition: malt extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50/0 10/0 sucrose ........................ sodium nitrite. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.20 / 0 potassium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.050 / 0 magnesium sulfate heptahydrate. . . . . . . . 0.050 /, iron sulfate heptahydrate. . . . . . . . . . . . . 0.051) /, acidic dipotassium phosphate ........... 0.10 / 0 distilled water, adjusted to a p11 value of 7.0 with potassium hydroxide. 100 cc of this medium was used in each of several 300 cc flasks. To each flask was added 50 mg of that in a small volume of acetone. dissolved Reichstein's substance S. During these processes, the fermentation mixture was kept under sterile conditions. The mixture was then shaken for 7 days at a temperature of about 28 ° C. The contents of the flasks were combined and extracted several times with ethylene dichloride, each time using one fifth of the volume of the aqueous phase. The combined ethylene dichloride extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and, after removal of the drying agent, the solvent was removed in vacuo. The solution was concentrated to a volume of 1 to 2 cc and a sample of this solution was subjected to paper chromatography using a solvent system containing 50 volume percent ether and 50 volume percent hexane and a second system comprising a water-benzene mixture. By examining the paper chromatograms with a sample of Kendall's Compound F as a control, the product was shown to contain this compound. There were also indications of more highly oxidized products.

Das Äthylendichloridkonzentrat wurde auf eine chromatographische Säule gegeben, die aus einem Gemisch aus Kieselsäuregel und einem kleinen Volumen Äthanol (1 ccm Lösungsmittel pro g Kieselerdegel) bestand. Die Säule wurde mit einer Mischung von 97 Volumteilen Methylenchlorid und 3 Volumteilen 950/0igen Äthanols entwickelt. Die aus der Säule ausströmenden Stoffe wurden in kleinen Fraktionen von gleichen Volumen gesammelt und in gleichmäßigen Abständen papierchromatographisch untersucht, um die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen abzutrennen. Sämtliche Fraktionen wurden vereinigt und zur Gewinnung des festen Produktes unter Vakuum zur Trockene konzentriert. Durch Vergleich mit einer bekannten Probe von Kendalls Verbindung F wurde festgestellt, daß das erhaltene Produkt der gleiche Stoff war. Ausbeute: 410/0; F. 215 bis 217° C. Beispiel 2 Eine Kultur Curvularia lunata (QM 120 h) wurde in Kolben gezüchtet, die das im Beispiel 1 beschriebene Medium enthielten. 100 ccm dieses Impfstoffes setzte man unter sterilen Bedingungen 2 1 des folgenden Mediums zu: Saccharose ........................ 10/0 enzymatisches Proteinabbauprodukt .. l0/0 Natriumnitrat ..................... 0,20/0 Dikaliumphosphat .................. 0,10/0 Magnesiumsulfat-heptahydrat . . . . . . . . 0,050/, Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0/0 Eisensulfat-heptahydrat ............. 0,0010/0 Diese Mischung wurde mit Schwefelsäure auf einen px-Wert von 7 gestellt; vor der Sterilisation der Mischung setzte man 0,25 °/a Calciumcarbonat zu. Das geimpfte Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung pro Minute bei einer Temperatur von 27 bis 28° C 24 Stunden belüftet. Während dieser Zeit wurde das Gemisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 1700 Umdrehungen pro Minute gerührt. 0,5 g Reichsteins Substanz S in Form des Alkohols wurde in 20 ccm 950/0igem Äthanol gelöst. Die Lösung wurde dem Gärgemisch unter sterilen Bedingungen zugesetzt. Danach wurde die Reaktion unter genau den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, weitere 24 Stunden fortgesetzt.The ethylene dichloride concentrate was applied to a chromatographic column which consisted of a mixture of silica gel and a small volume of ethanol (1 cc of solvent per g of silica gel). The column was developed with a mixture of 97 parts by volume of methylene chloride and 3 parts by volume of 950/0 ethanol. The substances flowing out of the column were collected in small fractions of equal volumes and analyzed by paper chromatography at regular intervals in order to separate the fractions containing the desired product. All fractions were combined and concentrated to dryness under vacuum to recover the solid product. By comparison with a known sample of Kendall's Compound F, it was found that the product obtained was the same material. Yield: 410/0; F. 215 to 217 ° C. Example 2 A culture of Curvularia lunata (QM 120 h) was grown in flasks containing the medium described in Example 1. 100 ccm of this vaccine was added under sterile conditions to 2 liters of the following medium: sucrose ........................ 10/0 enzymatic protein degradation product .. l0 / 0 sodium nitrate ..................... 0.20 / 0 dipotassium phosphate .................. 0.10 / 0 Magnesium sulfate heptahydrate. . . . . . . . 0.050 /, potassium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 0/0 iron sulfate heptahydrate ............. 0.0010 / 0 This mixture was adjusted to a px value of 7 with sulfuric acid; before the mixture was sterilized, 0.25% calcium carbonate was added. The inoculated medium was aerated at a rate of about 0.5 to 1 volume of air per volume of solution per minute at a temperature of 27 to 28 ° C for 24 hours. During this time the mixture was stirred at a speed of about 1700 revolutions per minute. 0.5 g of Reichstein's substance S in the form of alcohol was dissolved in 20 cc of 950/0 ethanol. The solution was added to the fermentation mixture under sterile conditions. Thereafter, the reaction was continued for a further 24 hours under exactly the same conditions as described above.

Das gesamte Gärgemisch wurde aus dem Gärgefäß entfernt. Das Gemisch wurde zweimal mit einem gleichen Volumen Äthylendichlorid bei einer Temperatur von 70° C extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zur Trockne verdampft. Die trockenen Feststoffe wurden in einem kleinen Volumen Methylenchlorid gelöst; die Lösung wurde auf eine Säule aus Kieselerdegel gegeben. Die Säule aus Kieselerdegel war hergestellt worden, indem man das Kieselerdegel pro Gramm mit 1 ccm 950/0igem Äthanol behandelte. Diese Mischung wurde in Methylenchlorid suspendiert und in eine chromatographische Säule gegossen. Nach Einführung des Steroidgemisches in die Säule wurde mehrere Male zur Entfernung von Fetten und Pigmenten mit Methylenchlorid gewaschen. Danach wurde die Säule entwickelt, indem man eine Mischung von 97 Volumen Methylenchlorid und 3 Volumen Äthanol zusetzte. Das Eluat wurde in eine Reihe von kleinen Fraktionen geteilt. Teile dieser Fraktionen wurden, wie oben beschrieben, papierchromatographisch analysiert und die Fraktionen, welche die gleiche Verbindung enthielten, vereinigt. Es wurde gefunden, daß der erste Stoff, der die Säule verließ, die Reichsteins Substanz S war. Dieser Stoff läßt sich wiedergewinnen und erneut verwenden. Der zweite Stoff, der die Säule verließ, war ein nicht identifiziertes Steroid. Der dritte Stoff, der die Säule verließ; wurde gewonnen und erwies sich als Kendalls Verbindung F. Durch Entfernung des Lösungsmittels aus den vereinigten Fraktionen, die Kendalls Verbindung F enthielten, erhielt man eine Ausbeute von über 35 0/0 eines trockenen Produktes, das sich leicht noch weiter reinigen läßt. Die Umkristallisation ergab in 300/0iger Ausbeute ein Produkt vom Schmelzpunkt 216 bis 218° C. Beispiel 3 Eine wie im Beispiel 1 verwendete Kultur Curvularia lunata (QM 120 h) wurde auf dem im Beispiel 1 beschriebenen Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Das nach 22stündigem Wachstum von 2 1 einer derartigen Mischung erhaltene Mycel wurde filtriert, mit einem kleinen Volumen destillierten Wassers gewaschen und danach in 2 1 destillierten Wassers suspendiert. Dem Gemisch wurde 0,5 g Reichsteins Substanz S zugesetzt. Dieses Präparat wurde gerührt und mit einer Geschwindigkeit von einem halben Volumen Luft pro Volumen des Gemisches pro Minute 16 Stunden belüftet. Danach wurde das Gemisch mit einem halben Volumen Chloroform dreimal extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden auf ein kleines Volumen konzentriert und das Steroidgemisch durch Säulenchromatographie auf Kieselerdegel gereinigt. Es wurde eine Ausbeute von etwa 35 0/0 der reinen Verbindung F von Kendall erzielt. Außerdem wurden etwa 100/0 der als Ausgangsmaterial verwendeten Substanz S von Reichstein in reiner Form wiedergewonnen. Beispiel 4 Eine Kultur eines von den Laboratorien des Quatermaster Corps in Philadelphia unter der Bezeichnung Curvularia sp. QM 371 d erhältlichen Organismus wurde unter aeroben Bedingungen auf dem im Beispiel 1 beschriebenen Medium in Kolben gezüchtet. Es wurde sichergestellt, daß dieser Organismus der Art der C. pallescens angehört, so daß er in der vorliegenden Erfindung mit Curvularia pallescens (QM 371 d) bezeichnet wird. Eine lebende Kultur dieses Organismus wurde der Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria Illinois überlassen und in deren Sammlung von Mikroorganismen als NRRL-2381 aufgenommen. Nach 24stündigem Wachstum verwendete man 100 ccm dieser Mischung zur Impfung von 2 1 des im Beispiel 2 beschriebenen Mediums. Nach 24stündigem Wachstum der 2 1-Mischung unter aeroben Bedingungen setzte man dem Gärgemisch 0,5 g Reichsteins Substanz S unter sterilen Bedingungen zu. Das Gemisch wurde weitere 20 Stunden bei 28° C gerührt, belüftet und geschüttelt. Das .Gemisch wurde aus dem Gefäß entfernt, in dem die Gärung stattgefunden hatte, und dreimal mit je einem halben Volumen Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und auf ein kleines Volumen konzentriert. Danach wurde das Gemisch auf eine Säule aus Kieselerdegel gegeben, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden war. Die Kieselerdegelsäule wurde mit Methylenchlorid gewaschen und danach mit einer Lösung von Äthanol in Methylenchlorid entwickelt. Aus der Säule wurde ein Teil der als Ausgangsmaterial verwendeten Reichsteinschen Substanz S sowie das entsprechende 11 ß-Oxyprodukt, Kendalls Verbindung F, gewonnen. Das isolierte Produkt wurde gereinigt und sein Schmelzpunkt sowie seine anderen physikalischen Eigenschaften mit denen einer reinen synthetischen Probe verglichen. Sie erwiesen sich als identisch. Außerdem untersuchte man die auf diese Weise hergestellte Verbindung F von Kendall auf ihre Wirksamkeit bei dem Glykogenspeicherungsversuch bei Mäusen, denen man die Nebenniere entfernt hatte. Die Verbindung erwies sich als höchst aktiv. Die Ausbeute betrug 25 %. Beispiel 5 Eine Kultur Curvularia lunata (QM 120 h) wurde nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gezüchtet, mit der Ausnahme, daß man an Stelle der Verbindung S Desoxycorticosteron verwendete. Nach beendigter Gä- rung wurde das rohe Prcdukt mit Methylisobutylketon extrahiert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das restliche Produkt wurde auf seine Wirksamkeit bei der Glykogenablagerung in der Leber von Mäusen ohne Nebenniere untersucht, und das positive Ergebnis zeigte die Einführung einer 11ß-ständigen Hydroxylgruppe in das Steroid. Durch säulenchromatographische Reinigung erhielt man eine Ausbeute von etwa 280/, einer kristallinen Verbindung, die sich auf Grund ihrer physikalischen Konstanten als Corticostercn erwies.The entire fermentation mixture was removed from the fermentation vessel. The mixture was extracted twice with an equal volume of ethylene dichloride at a temperature of 70.degree. The extracts were combined and evaporated to dryness. The dry solids were dissolved in a small volume of methylene chloride; the solution was applied to a column of silica gel. The silica gel column was prepared by treating the silica gel per gram with 1 cc of 950/0 ethanol. This mixture was suspended in methylene chloride and poured into a chromatographic column. After the steroid mixture had been introduced into the column, it was washed several times with methylene chloride to remove fats and pigments. The column was then developed by adding a mixture of 97 volumes of methylene chloride and 3 volumes of ethanol. The eluate was divided into a number of small fractions. Parts of these fractions were analyzed by paper chromatography, as described above, and the fractions which contained the same compound were combined. It was found that the first substance to leave the column was Reichstein's Substance S. This material can be recovered and used again. The second substance that left the column was an unidentified steroid. The third fabric that left the pillar; was recovered and found to be Kendall's Compound F. Removal of the solvent from the pooled fractions containing Kendall's Compound F resulted in a yield of over 35% of a dry product which is easily further purified. Recrystallization gave a product with a melting point of 216 ° to 218 ° C. in a yield of 300/0. Example 3 A Curvularia lunata culture (QM 120 h) used as in Example 1 was grown on the medium described in Example 1 under aerobic conditions. The mycelium obtained after 22 hours of growth of 2 liters of such a mixture was filtered, washed with a small volume of distilled water and then suspended in 2 liters of distilled water. 0.5 g of Reichstein's Substance S was added to the mixture. This preparation was stirred and aerated at a rate of one-half volume of air per volume of mixture per minute for 16 hours. Thereafter, the mixture was extracted three times with half a volume of chloroform. The combined chloroform extracts were concentrated to a small volume and the steroid mixture was purified by column chromatography on silica gel. A yield of about 35% of the pure Kendall Compound F was obtained. In addition, about 100/0 of the substance S used as the starting material was recovered from Reichstein in pure form. Example 4 A culture of one of the laboratories of the Quatermaster Corps in Philadelphia under the designation Curvularia sp. The organism obtainable from QM 371 d was cultured in flasks on the medium described in Example 1 under aerobic conditions. It has been ascertained that this organism belongs to the species of C. pallescens, so that it is referred to in the present invention as Curvularia pallescens (QM 371 d). A living culture of this organism was given to the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria Illinois and included in their collection of microorganisms as NRRL-2381. After 24 hours of growth, 100 cc of this mixture was used to inoculate 2 liters of the medium described in Example 2. After the 2 l mixture had grown for 24 hours under aerobic conditions, 0.5 g of Reichstein's substance S was added to the fermentation mixture under sterile conditions. The mixture was stirred, vented and shaken at 28 ° C. for an additional 20 hours. The mixture was removed from the vessel in which fermentation had taken place and extracted three times with half a volume of chloroform each time. The extracts were combined and concentrated to a small volume. The mixture was then applied to a column of silica gel prepared by the method described above. The silica gel column was washed with methylene chloride and then developed with a solution of ethanol in methylene chloride. Part of Reichstein's substance S used as the starting material and the corresponding 11β-oxy product, Kendall's compound F, were obtained from the column. The isolated product was purified and its melting point and other physical properties compared to those of a pure synthetic sample. They turned out to be identical. Kendall's Compound F, prepared in this way, was also tested for effectiveness in the glycogen storage experiment in mice from which the adrenal gland had been removed. The connection turned out to be highly active. The yield was 25%. Example 5 A culture of Curvularia lunata (QM 120 h) was grown according to the method described in Example 1, with the exception that deoxycorticosterone was used in place of compound S. After the fermentation had ended, the crude product was extracted with methyl isobutyl ketone and the solvent was removed in vacuo. The remaining product was tested for its effectiveness in glycogen deposition in the liver of mice without an adrenal gland, and the positive result indicated the introduction of an 11β-hydroxyl group into the steroid. Purification by column chromatography gave a yield of about 280%, a crystalline compound which, on the basis of its physical constants, turned out to be corticosters.

In ähnlicher Weise ergibt die erfindungsgemäße Bebrütung von 17a-Oxyprogesteron mit Curvularia lunatä in 34°/oiger Ausbeute die entsprechende 11 ß-Oxyverbindung. Die Ausbeute an 11 ß-Oxyprogesteron aus Progesteron beträgt 20 % und die an Ccrticosteron aus Desöxycorticosteron 30 °(o.The incubation of 17a-oxyprogesterone according to the invention results in a similar manner with Curvularia lunatä the corresponding 11β-oxy compound in 34% yield. The yield of 11 ß-oxyprogesterone from progesterone is 20% and that of crticosterone from Desoxycorticosterone 30 ° (o.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the production of 11 ß-hydroxysteroids by treating an appropriate 11-deoxy steroid with cultures of oxidizing acting microorganisms or the oxidizing enzymes obtainable therefrom under aerobic conditions and separation of the 11 ß-hydroxysteroids obtained, e.g. B. by extraction, characterized in that one acts as an oxidizing fungus one of the genus Curvularia is used: 2. The method according to claim 1, characterized in that characterized that the oxidizing fungus Curvularia lunata (QM 120 h), Curvularia brachyspora or Curvularia pallescens (QM 371 d) used: 3rd method according to claim 1, characterized in that one Reichstein's compound S or De soxycorticosterone used as the starting compound.