Verfahren zur Durchführung mikrobiologischer Synthesen Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf mikro biologische Synthesen durch während der Gärung entstandene Sporen. Die erfindungsgemäss erzielbare Verbesserung besteht darin, dass die Sporen bei der Synthesereaktion im wesentlichen frei von vegeta tiven Wuchsstoffen wie Mycel und Gärbrühe sind und in einem im wesentlichen nährstofffreien, wäs serigen Medium vorliegen. Das Verfahren eignet sich z.
B. für die Einführung von Sauerstoff in Steroide oder in Steroidzwischenprodukte, zur Einführung von Doppelbindungen in Steroide oder deren Zwi schenprodukte, für die Umwandlung von Fettsäuren in Ketone usw.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Durch führung mikrobiologischer Synthesen vermittels Sporen, welche mit vegetativem Wuchsmaterial wäh rend der Gärung in einem Nährmedium entstehen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Sporen von dem vegetativen Wuchsmaterial und von dem Nährstoff, der in dem Gärungsmedium enthalten ist, abtrennt und dass die mikrobiologische Synthese mit den Sporen in einem wässrigen Medium durchgeführt wird, welches im wesentlichen von vegetativen Wuchsstoffen und Nährstoffen frei ist.
Bisher wurde die mikrobiologische Synthese chemischer Verbindungen vom Steroidtyp meistens in einem Nährmedium, wie Maisquellwasser, Sojaboh nenmehl u. a., zusammen mit Melasse, Sucrose, usw. durchgeführt, um assimilierbare Quellen sowohl für Stickstoff als auch für Kohlenstoff zu haben, ferner in Gegenwart des sich während der Gärung bildenden Mycels und der Gärbrühe. (Vgl. hierzu US-Patente Nrn. 2 753 290 und 2 793 l62). Die mikrobiologi sche Synthese von Steroiden wurde ferner sowohl unter Verwendung des Mycels allein als auch der Gärbrühe allein durchgeführt.
Auch die Verwendung der über zerkleinertem Mycel überstehenden Flüssig- keit wurde bereits vorgeschlagen, vgl. Muray et a1. US-Patent Nr. 2 602 769, insbesondere Beispiel 18. Wie in diesem Beispiel ausgeführt, ergab die über stehende Flüssigkeit (S11) eine erhebliche Umwand lung, die Gärbrühe (BF) bessere und der Mycel- rückstand eine vollständige Umwandlung.
Bei der sogenannten Oxydationsaktivität, die für die Um wandlung massgebend war, spielen auch die Enzyme eine Rolle, wie dies in dem Murray et a1. Patent ge zeigt wurde. Auch die während der Gärung herge stellten Enzyme sind dafür bekannt, dass sie sowohl mit dem Mycelium als, auch mit dem Bier assoziiert sind.
Die Isolierung der Umsetzungsprodukte (Ste- roide u. dgl.) aus einem komplexen Gärungsmedium gab natürlich Probleme auf. Auch gab es Probleme, wenn man eine Isolierung in guter Ausbeute aus den pflanzlichen Wuchsstoffen vornahm, die Mycelium enthielten, oder aus dem Bier, in dem organische Nährstoffe enthalten und die beide mit Gärungs nebenprodukten verseucht sind. Angesichts dieses Standes der Technik war man bestrebt, andere Iso- lierungsmethoden (z. B.
Extraktion) zu erforschen und nach Mitteln für die Durchführung der Um wandlung zu suchen, bei denen sowohl von Mycelium als auch von Bier freie Enzyme zur Anwendung ge langen konnten. Bezüglich der zuletzt genannten wurde von keinem befriedigenden Enzymextrakt be richtet, mit welchem eine adäquate Umwandlung er zielt wird, und als Folge davon wird in der Technik entweder ein vollständiges, ausgegorenes Medium verwendet, das sowohl Mycelium als auch Bier ent hält oder welches entweder das Mycelium allein oder das Bier allein verwendet, welches durch Filtration des- gegorenen Mediums erhalten wurde.
Während unserer Untersuchung bezüglich der Umwandlung von Fetten, z. B. Milchfett, zu äusserst würzigen Kompositionen mit Pilzen des Penicillin- Typs, z. B.
P. roqueforbi, wurde bemerkt, dass die Gärungsperiode bei Verwendung eines pflanzlichen Inoculums (Schimmelpilzzellen in Mycelium-Form mit einem nahrhaften Wachstumsmedium) relativ kurz war (etwa zwei Tage) verglichen mit einer Gärungszeit von etwa 4 Tagen, wenn Schimmelpilz- conidia oder -conidio Sporen verwendet wurden. Weiterhin wurde bemerkt, dass die Gärungszeit bei Verwendung 7 Tage alter Sporen,
die vegetatives Inoculum oder die Sporen allein enthielten, länger war als die Zeit, die z. B. mit 2 Tage altem, im we sentlichen von Sporen freiem, vegetativem Inoculum erzielt wurde. Dies schien die Annahme zu bestäti- gen, dass die Sporen für sich - verglichen mit den metabolisch sehr aktiven, starken und jungen Myce- liumzellen - ziemlich inaktiv, relativ träge und er schöpft sind. Diese bei zahlreichen Untersuchungen unterstellte Arbeitshypothese erwies sich insofern als unrichtig, als das Fett in der Milch fettspaltenden Enzymen, z.
B. Lipase, ausgesetzt war, während die Sporen für sich in unerwarteter Weise imstande waren, die entstandenen freien Fettsäuren in ein paar Stunden in Ketone umzuwandeln. Bei dieser Reaktion führen die Sporen am C-Atom 2 die -CD-Gruppe ein und decarboxylieren die Fettsäure. Dies kann etwa wie folgt dargestellt werden:
EMI0002.0033
Sporen
<tb> R-CH2-CH2-CH2COOH
<tb> RCH2--CO-CH3; hierin ist R eine Alkylgruppe mit z.
B. 1-18 oder mehr C-Atomen. Ist R Butyl (C4H3), so kann man den Reaktionsverlauf wie folgt darstellen:
EMI0002.0041
Sporen
<tb> CHiCH2CH2CH2CHL,CH2CH2-COOH <SEP> <B>D</B> <SEP> -CH3-(CH2)4-<B>CO</B>-CH3 <SEP> (Amylmethylketon) Diese Entdeckung des Verhaltens der Sporen gegenüber Fettsäuren führte zu der weiteren Ent deckung, dass vom vergärten Medium freie Sporen (frei von Mycelium und Bier) als solche dazu ver wendet werden können, chemische Verbindungen auf verschiedene Weise umzuwandeln.
Die erfindungsgemäss zur Verwendung gelangen den Sporen können leicht aus vegetativen Zellen (Mycelium) erhalten werden, die man in einer sub- mersen Kultur unter Belüftung während 4-6 Tagen wachsen liess, und zwar in einem Kornmaische-Lak- tose-Medium oder einem anderen Nährmedium, in welchem assimilierbarer Kohlenstoff und Stickstoff enthalten ist.
Die aus den alten vegetativen Zellen hergestellten Sporen werden in der Weise geerntet, dass man sie durch Käserinde lässt, um den grössten Teil des Myceliums möglichst weitgehend zu ent fernen, wonach das restliche Mycelium durch Filtra tion durch Glaswolle entfernt wird. Die im Filtrat befindlichen Sporen werden durch Zentrifugieren ge wonnen und werden dann zwecks Entfernung zu rückgehaltenen Nährstoffs mit Wasser gewaschen.
Sie können trocken aufbewahrt oder auch in Was ser wieder suspendiert und bei 4 C aufbewahrt wer den. Man kann die Suspension so standardisieren, dass sie z. B. 1 Billion Sporen/ml enthält. Man kann die Sporen auch auf einer Oberflächenkultur wach sen lassen, z. B. auf Agar, und, nachdem man die Sporen abgeschabt und in Wasser suspendiert hat, sie z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren praktisch rein erhalten.
Oberflächenkulturen sollten dann ver wendet werden, wo der Organismus sporuliert oder wo er dies gut in submersen Kulturen tut. Die Fungusspezies Murcorales, z. B. Rhizopus nigricans, sporulieren in submersen Kulturen nicht, weswegen sie auf Oberflächenkulturen gezüchtet werden soll ten.
Das jeweils geeignetste Verfahren für die Spo- renproduktion kann durch einen Vorversuch leicht ermittelt werden.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.
<I>Beispiel I</I> Ein Glukose-Neopepton-Medium (Sabourauds- Medium), welches mit 2 % Agar verfestigt worden war,
wurde zunächst mit Aspergillus Ochraceos nach den üblichen Methoden inoculiert und bei etwa 30 5 Tage lang bebrütet. Die während dieser Zeit pro duzierten Sporen wurden von der Oberfläche des resultierenden pflanzlichen Myceliumwuchses mit destilliertem Wasser weggewaschen.
Die sich er gebende wässrige Suspension, die mit etwas. Mycelium angesteckt wurde sowie mit einem Nährmedium, wurde durch Glaswolle filtriert, um das Mycelium zusammen mit unlöslichem Nährstoff zu entfernen, sodann, noch zentrifugiert, um die Sporen zu gewin nen.
Die löslichen Nährstoffe im Medium, die von den Sporen zurückgehalten wurden, wurden zunächst durch Suspendieren der Sporen in destilliertem Was ser entfernt, worauf durch Zentrifugieren die Sporen gewonnen werden. Das Waschen (Suspendieren der Sporen in Wasser und Zentrifugieren) kann ge- wünschtenfalls wiederholt werden, damit man sicher ist, dass die Sporen im wesentlichen frei sind von an steckendem Nährstoff und von Mycelium.
Die so erhaltenen Sporen wurden in destilliertem Wasser suspendiert, welches mit einem 1 % igen Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 6,5-7 ge bracht wurde, worauf man eine Suspension erhielt, die etwa 1-10 Billionen Sporen pro ml enthielt.
Zu etwa 20 mal dieser Suspension, die sich in einem 125-mI-Erlenmeyerkolben befand, wurde dann 1 mg Progesteron gegeben, welches in 1 ml Propylen- glykol aufgelöst war. Da das Glykol mit dem Wasser mischbar war, das Progesteron aber im Wasser un- löslich ist, so wird das Progesteron unlöslich und fällt in Form einer feinen Suspension an, wenn man das Ganze zu einer gepufferten wässrigen Suspen sion gibt.
Die resultierende Sporen-Progesteron- Suspension wurde sodann durch Schütteln auf einem Drehschüttler belüftet, und zwar bei einer Umdre hungszahl von etwa<B>150</B> Umdrehungen pro Minute um einen 6,35-mm-Radiuls und während eines ZeitL raumes von etwa 12 Stunden bei 25 .
Am Ende dieses Zeitraumes wurde die Suspen sion, in der sich die Sporen und das Steroid befand, mit Chloroform extrahiert, wonach das Extrakt zwecks Entfernung des unlöslichen Materials und der wässrigen Phase aus dem Chloroform zentrifu giert wurde. Die so erhaltene sporenfreie klare Extraktlösung enthält das gewünschte 11 a-Hydroxy- progesteron, wonach das Steroid leicht durch Ab saugen des Chloroforms bei vermindertem Druck gewonnen werden kann.
Die Prüfung des Produktes durch Vergleich mit einer bekannten echten Probe des lla-Hydroxyprogesterons ergab, dass praktisch <B>100%</B> des Progesterons in das gewünschte l la-Hy- droxyderivat umgewandelt worden war.
Dies zeigt, dass die 12stündige Umwandlungsperiode passend war und ist ein Indiz, dass möglicherweise noch kürzere Zeiten verwendet werden konnten, um die Einführung der Hydroxygruppe in das Progesteron mit Sporen von A. ochraceus in einem von Myce- lium und Nährstoff freien Medium zu vervollstän digen. In. der Praxis kann das Verhältnis Zeit-Kon- zentration der Sporen den gewünschten Verhältnissen angepasst werden.
<I>Beispiel 11</I> Man arbeitet wie in Beispiel I und verwendet Sporen, die man aus einer 10-14 Tage Kultur von Septomyxa affinis und Reichsteins Verbindung S in einem Phosphatpuffer bei pH 7 erhalten hat. Nach 24 Stunden wurde das resultierende ö-1-Produkt (Verbindung S mit einer 1-2 Doppelbindung) in der in Beispiel I beschriebenen Weise isoliert.
In diesem Beispiel untergeht dais Steroidmolekül eine Dehydrie- rung und es entsteht im Molekül eine Doppelbin dung. Diesbezüglich besteht ein Unterschied zum Beispiel I, gemäss welchem Sauerstoff in das Mole kül eingeführt worden war.
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die Umwandlung von Fettsäuren in Ketone, wobei im übrigen die oben erwähnten Arbeitsweisen angewen det wurden. <I>Beispiel 111</I> Zu einer 1 % igen wässrigen Mischung von Octan- säure, die mit einem Phosphatpuffer auf einen pH- Wert von 6,5 gebracht wurde, gab man Conidia- oder Conidio-Sporen des P.
Roqueforti, welches im wesentlichen von pflanzlichem Inokulum und Nähr stoffen frei war. Darin befanden sich etwa 100 Mil lionen Sporen/3 ml der wässrigen Octansäure- mischung. Die Mischung wird dann unter Belüften bei 25 etwa 2 Stunden lang gerührt. Das entstehende Methyl-Amylketon kann auf an sich bekannte Weise, z. B. durch Destillation, isoliert werden.
<I>Beispiel</I> IV Es wird wie in Beispiel III gearbeitet, man be nützt aber Hexansäure, Nonansäure und Decan- säure für die Herstellung des Methylpropylketons;
man erhält auch Methyl , Hexylketon und. Methyl- Heptylketon. Wählt man die geeignete Fettsäure aus, die wenigstens 4 Kohlenstoffatome besitzt, so können auf ähnliche Weise andere Ketone hergestellt werden, und zwar unter Verwendung von Sporen, die, wie bereits beschrieben, keine pflanzlichen Inokula oder Nährstoffe enthalten.
Um durch die Sporen eine möglichst rasche Um- setzung zu gewährleisten, soll die Ausgangsverbin dung in feiner Verteilung vorliegen. Dies kann leicht dadurch bewerkstelligt werden, dass man das Steroid beispielsweise in einem inerten, mit Wasser misch baren organischen Lösungsmittel auflöst. Man ver wendet hierzu niedere Alkohole (Methanol, Äthanol usw.), mit Wasser mischbare Glykole, Aceton oder ähnliche und gibt dann die organische Lösung zu der wässrigen Suspension der Sporen.
Wenn man dies tut, so fällt das Steroid aus der Lösung in feiner Suspension aus. Auch die Isolierung des umgewan delten Steroids in hoher Ausbeute durch Gebrauch organischer Lösungsmittel, in denen das Steroid lös= lich ist, kann leicht vollzogen werden, und zwar dank der Abwesenheit vegetativen Wuchses (Mycelium) und des Biers mit den zurückbleibenden Nährstoffen und dank der Abwesenheit komplexer Nebenpro dukte, die sich während der Gärung bilden.
Es ist hierbei von ausserordentlicher Wichtigkeit, dass die Sporen nach ihrem Gebrauch wiedergewonnen und wieder verwendet werden können. Für diesen Zweck wird das Steroid in der Reaktionsmischung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Propylenglykol, aufgelöst, wonach die resultierende Mischung zwecks. Gewinnung der Sporen durch Lö- sungsmittelextraktion des sporenfreien Mediums und zwecks Isolierung des Steroides zentrifugiert wird.
Die gewonnenen Sporen, die man zweckmässig mit Was ser wäscht, können dann wiederum verwendet wer den, wenn sie in einem Medium gehalten werden, in welchem es an einem oder mehreren Nährstoffen fehlt, wodurch die Sporen vom Keimen abgehalten werden. Dieser Prozess, bei welchem ausschliesslich Sporen verwendet werden, und die Entdeckung, dass sie wiederum verwendet werden können, bedeutet eine ganz erhebliche Verbesserung bisher bekannter Gärungsverfahren.
Das Verfahren kann unter Verwendung reinen Sauerstoffs und von Luft durchgeführt werden, wobei die Umwandlung der Steroide gleich gut vor sich geht. Die Belüftung kann auch durch Rühren mit sauerstoffhaltigen Gasen unter Druck ausgeführt wer den. Eine kleine Menge KCN (0,65 Mol) oder CO können dem Sporenmedium während der Umwand lung ebenso zugegeben werden wie Glucose (z. B.
0,5 no. Im allgemeinen wird die Ausbeute durch Zugabe kleiner Mengen oxydierbarer Materialien, wie Glukose, Essigsäure, Milchsäure und ähnlicher, er höht:
Diese Abänderungen können die Geschwindig- keit ebenso wie die Vollständigkeit der Umwandlung der Steroide im günstigen Sinne unterstützen; wenn man jedoch Glukose oder ähnliches benützt, ist es wichtig, das Medium von Stickstoff frei zu halten, damit man die Keimtätigkeit verhindert.
Auf ähnliche Weise wie oben können von Myce- lium und Nährmedium freie Sporen von verschie denen Organismen erhalten und für die mikro- biologische Herstellung chemischer Verbindungen verwendet werden.
Zum Beispiel kann man damit verschiedene Gruppen und Doppelbindungen in die verschiedensten Steroide und deren Zwischenprodukte einführen. Anstatt die Organismen, die in dem noch folgenden Schrifttum erwähnt wurden und welche danach dazu verwendet werden, eine Gruppe oder Doppelbindung auf dem Gärungswege in das.
Steroid- molekül einzuführen, und zwar in einem vegetativen Inokulum, das in einem wässrigen Nährmedium ent halten ist, kann man auch die Sporen für sich aus demselben Organismus dazu verwenden, dieselbe Gruppe oder Doppelbindung in dasselbe Steroidmole kül einzuführen.
Die folgenden Modifikationen von Steroiden seien nachstehend angeführt: 1. Reduktion des Progesterons zum d4-Pregnen- 20ss - o1 - 3 - an mit Stroeptomyces, lavendulae (Fried, J. et a1., J. Am. Chem. Soc. <I>75:</I> 5764 [1953]).
2. Dehydrierung sekundärer Alkohole.
a) d5-Androsten-3ss,17ss-diol zum Testosteron mit Proactinomyces erjthropolis. Turfitt G. E., Biochem. D. 40: 79 [1946] ).
b) Östradiol zu östron mit Sireptomyces albus.. (Welsch, M et a1., Compt. rend. Soc. Biol. 142: 1074 [1948]).
3. Hydroxylierung in 1-Stellung. d4-Androsten- 3,17-dion zu d4-Androsten-la-ol-3,17-dion mit Peni- cillium sp., (Dodson, R. M. et a1., J. Am. Chem. Soc. 79: 392<B>1</B> [1957]).
4. Hydroxylierung in 2-Stellung. d4-Pregnen- 17a,21-diol-3,20-dion zum d4-Pregnen-2ss,17a,21- triol-3,20-dion mit Streptomyces sp. (Herzog, H. L. et a1., Journal Am. Chem. Soc. 79: 3922 [1957]).
5. Hydroxylierung in. 6-Stellung. Progesteron zum d4-Pregnen-6ss-ol-3,20-dion mit Streptomyces aureo- faciens [Fried, J. et a1. Recent Progr. Hormone Res. 11: 157 (1955); siehe auch Dulanaz, E.
L. et a1., Mycologia 47: 464 (1955); Fried, J. et a1. Journ. Am. Chem. Soc. 74: 3962 (1952); Meister P. D. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 75: 416 (1953); Eppstein, S.
H. et a1. Journ. Am. Chem. Soe. 75: 408 (1953)] einschliesslich der Mikroorganismen Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger und Ricopus arrhizus.
6. Hydroxylierung in 7-Stellung. Progesteron zum d4-Pregnen-7a-ol-3,20-dion mit Phigomyces blakes- leanus. Fried et a1., US-Pat. Nr. 2 753 290; siehe auch Meystre, C. et a1., Helv. Chem. Act. 38:
381 (1955) unter Verwendung einer Peziza-Spezies für die Durchführung ähnlicher Reaktionen mit dem Desoxy- corticosteron.
7. Hydroxylierung der 10-, 11- oder 12-Stel- lungen.
a) 19-nor-Progesteron zum l0E-Hydroxyl-19-nor- Progesteron mit Rhizopus nigricans. Pederson, R. L. et a1., Journ. Am. Chem. 78: 1512 (1956).
b) Progesteron zum d4-Pregnen-lla-ol-3,20-dion mit Reizopus arrhizus. Peterson, D.H. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 74: 1871 (1952) und Journ. Am. Chem. Soe. 75: 412 (1953).
c) Reichsteins-Verbindung S (d4-Pregnen-17a,21- diol 3,20-dion) zu Hydrokortison mit Cunninghamela blakesleeana. Hanson, F. L. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 75: 5369 (1953) siehe auch Schull G.
M. et al., Journ. Am. Chem. Soc. 77: 763 (1955) sowie Thoma et a1., US-Patent Nr. 2 793 162, in welchem auch ähnliche Reaktionen mit Curvularia lunata, Tricho- tecium roseum und Coniothyrium helleborine be schrieben sind.
d) Progesteron zum d4-Pregnen-12ss-ol-3,20- dion und dem analogen 12ss,15ss-diol mit Calnectria decora. Schubert, A. et a1., Ber. 90: 2576 (1957).
B. Hydroxylierung in anderen Stellungen be schreibt Meister, P. D. et a1., Absts. 123 rd Meeting Am. Chem. Soc. (1953); Fried et al., US-Patent Nr. 2 753 290; Kamerino, B. et a1., Gaz. Chem. Ital. <I>86:</I> 1226 (1956); Meystre, C. et a1., Helv. Chim. Acta.<I>38:</I> 38 (1955);
Perlinan D. et a1., J. Am. Chem. Soc. 74: 2126 (1952); Thoma R. W. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 79: 4818 (1957); Dulaney E. L. et a1., Appl. Microbiol. 3: 372 (1955); Meystre C. et a1., Helv. Chim. Acta<I>37:</I> 1548 (1954); McAleer W.
J. et a1., Arch. RTI ID="0004.0238"WI="6" HE="4" LX="1422" LY="1606"> Bio. Chem. Biopys. 62: 109 (1956).
9. Dehydrierung. Hydrocortison zum d4-Pregna- dien-11ss,17a-21-triol-3,20-dion mit Streptomyces lavendulae. Fried, et al., US-Patent Nr. 2 793 164;
siehe auch Mobile, A. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. <I>77:</I> 4184 (1955); Vischer E. et a1., Helv. Chim Acta <I>38:</I> 835 und<I>38:</I> 1502 (1955) unter Verwendung von Alternaria sp. und Didymella lycoperizi. Vgl. auch Sper et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 78:
6213 (1956) unter Verwendung von Septomyxa affinis, wie dies in Beispiel II für die Einführung der 1-2-Doppel- bindung beschrieben wurde.
10. Seitenkettenabbau. Progesteron zum d4- Androstadien-3,20-dion mit Streptomyces lavendulae. Peterson G.
E. et a1., J. Bact. 74: 684 (1957) ver gleiche auch Vischer, E. et a1., Bericht über Fusarium solani und F. Caucasicum in Experientia 9: 371 (1953), wo eine S-2-Doppelbindung mit Seitenketten abspaltung beschrieben wird. Vergleiche auch Turfit, G. E. Biochem. Journ. 42: 376 (1948).
Vergleiche auch die USA-Patente Nrn. 2 602 669, 2649400, 2649401,<B>2695260, 2735800,</B> <B>2753290, 2762747, 2768928, 2789940,</B> <B>2802775, 2809919, 2812285, 2830937,</B> in denen auch Mikroorganismen bildende Sporen beschrieben sind, die gleichfalls in von pflanzlichen Wuchs- und Nährstoffen freien Medien verwendet werden können.
Wie bereits bemerkt, werden die Verfahren so ausgeführt, wie sie in den oben zitierten Literatur stellen (1) beschrieben wurden, allerdings mit der Ausnahme, dass das dort mitverwendete vegetative Wuchsmaterial durch Sporen ersetzt wird, und zwar durch Sporen, die im wesentlichen von vegetativem Wuchsmaterial frei sind, und (2) wobei auch das wässrige Nährmedium oder Bier, welches gemäss der obigen Literaturstelle verwendet wird, durch ein wässriges Medium ersetzt wird, welches im wesent lichen frei ist von einem Nährstoff.
Die für die voll ständige Umwandlung erforderliche Zeit bei Ver wendung von Sporen (wobei diese Zeit zuvor durch einen Blindversuch festgestellt werden kann) kann im Vergleich zu bekannten Verfahren gewöhnlich wesentlich verkürzt und die Ausbeute stark erhöht werden.
Neben dem Zeitfaktor jedoch ist auch die Isolierung der chemisch umgewandelten Verbindun gen in guter Ausbeute viel günstiger (sie kann gleichfalls nach den Methoden der obigen Literatur stellen durchgeführt werden), weil die Reaktions mischung relativ reine Reaktionsprodukte enthält, wohingegen bekannte Gärungsmischungen vegetative Wuchsstoffe, organische Nährmittel sowie Gärungs nebenprodukte enthalten. Die Reinigung der erhal tenen Verbindung nach ihrer Isolierung ist gleich falls viel leichter als bei bekannten Verfahren.
Es ist offensichtlich, dass das Verfahren der vor liegenden Erfindung unter Verwendung von Sporen überall dort verwendet werden kann, wo man Myce- lium und Bier, das während der Gärung entsteht, benützt. Die Verwendung eines Steroids mit einer 11-Methylengruppe und von mit Aspergillus erhal tenen Sporen (US-Patent Nr. 2 649 402) [und von Penicillium (US-Patent Nr. 2 649 402)] und von Organismen, wie Septomyxa affinis, welche eine 1-2- Doppelbindung einführen, werden bevorzugt.
Zwei Zwischenumwandlungen können durch Ver wendung von Sporen verschiedener Fungi gleichzeitig ermöglicht werden; der Unterschied kann so gering sein wie der Unterschied der Beanspruchung dessel ben Fungus oder so gross wie der Unterschied in der Klasse. Daräberhinaus kann dieser Unterschied durch Mutation eines besonderen Organismus induziert wer den.
Zusätzlich können ausser Steroiden und verwand ten Zwischenprodukten sowie von Fettsäuren auch noch andere chemische Verbindungen im Kern und in der Seitenkette mit den Sporen auf die obige Weise modifiziert werden. Beispielsweise seien ange führt in der Natur vorkommende Alkaloide, wie z. B. Rauwolfia Alkaloide usw. ebenso wie synthetische Stoffe, wie z. B. Levallorphan (l. Lorphan) und ähnliche. Vergleiche hierzu Pan. S. C. et a1., J. A. C. S. Seite 4749 r. (Sept. 5, 1958); Godtfresen et a1., Exp. 14: 88 (1958).
In allen Fällen werden die Verbindungen durch die Sporen in einem Medium verändert, welches praktisch frei von ansteckenden Stoffen, wie vegetativem Wuchsmaterial (Mycelium), Nährstoffen, insbesondere Gärungsnährstoffen, ist, in denen die Sporen keimen können und die auch frei von Nebenprodukten der Gärung sind. Dies ist erfor derlich, damit man in den Genuss des Vorteils einer einfachen und erleichterten Isolierung und Reinigung kommt.
Method of Carrying Out Microbiological Syntheses The present invention relates to microbiological syntheses by fermentation spores. The improvement that can be achieved according to the invention consists in the fact that the spores in the synthesis reaction are essentially free from vegetative growth substances such as mycelium and fermentation broth and are present in an essentially nutrient-free, aqueous medium. The method is suitable for.
B. for the introduction of oxygen into steroids or steroid intermediates, for the introduction of double bonds in steroids or their intermediates, for the conversion of fatty acids into ketones, etc.
The method according to the invention for carrying out microbiological syntheses by means of spores which arise with vegetative growth material during fermentation in a nutrient medium, is characterized in that the spores are separated from the vegetative growth material and from the nutrient contained in the fermentation medium and that the microbiological synthesis is carried out with the spores in an aqueous medium which is essentially free of vegetative growth substances and nutrients.
So far, the microbiological synthesis of chemical compounds of the steroid type was mostly in a nutrient medium, such as corn steep liquor, soybean flour and. a., carried out together with molasses, sucrose, etc., in order to have assimilable sources of both nitrogen and carbon, furthermore in the presence of the mycelium which forms during fermentation and the fermentation broth. (See U.S. Patent Nos. 2,753,290 and 2,793,162). The microbiological synthesis of steroids was also carried out using both the mycelium alone and the fermentation broth alone.
The use of the liquid protruding from the crushed mycelium has also already been proposed, cf. Muray et a1. US Pat. No. 2,602,769, in particular Example 18. As stated in this example, the supernatant liquid (S11) gave a considerable conversion, the fermentation broth (BF) better and the mycelium residue a complete conversion.
In the so-called oxidation activity, which was decisive for the conversion, the enzymes also play a role, as shown in Murray et al. Patent was shown. The enzymes produced during fermentation are also known to be associated with both mycelium and beer.
The isolation of the reaction products (steroids and the like) from a complex fermentation medium naturally posed problems. There were also problems with isolating in good yield from the plant growth substances that contained mycelium or from the beer, which contained organic nutrients and both of which were contaminated with fermentation by-products. In view of this state of the art, efforts were made to use other insulation methods (e.g.
Extraction) and to look for means of carrying out the conversion in which enzymes free from both mycelium and beer could be used. Regarding the latter, no satisfactory enzyme extract was reported with which an adequate conversion it is aimed, and as a result, either a complete, fermented medium is used in the art, which contains both mycelium and beer, or which either contains the mycelium used alone or the beer alone, which was obtained by filtration of the fermented medium.
During our research into the conversion of fats, e.g. B. milk fat, extremely spicy compositions with mushrooms of the penicillin type, z. B.
P. roqueforbi, it was noted that the fermentation period when using a plant inoculum (mold cells in mycelium form with a nutritious growth medium) was relatively short (about two days) compared to a fermentation time of about 4 days when using mold conidia or conidio Spores were used. It was also noted that the fermentation time when using 7 day old spores,
containing the vegetative inoculum or the spores alone was longer than the time taken e.g. B. with 2 days old, we sentlichen spore-free, vegetative inoculum was achieved. This seemed to confirm the assumption that the spores on their own - compared to the metabolically very active, strong and young mycelium cells - are rather inactive, relatively sluggish and exhausted. This working hypothesis, which has been assumed in numerous studies, has proven to be incorrect insofar as the fat in milk contains fat-splitting enzymes, e.g.
B. lipase, while the spores were unexpectedly able to convert the resulting free fatty acids into ketones in a few hours. In this reaction, the spores on C atom 2 introduce the -CD group and decarboxylate the fatty acid. This can be represented as follows:
EMI0002.0033
Spurs
<tb> R-CH2-CH2-CH2COOH
<tb> RCH2 - CO-CH3; herein R is an alkyl group with e.g.
B. 1-18 or more carbon atoms. If R is butyl (C4H3), the course of the reaction can be shown as follows:
EMI0002.0041
Spurs
<tb> CHiCH2CH2CH2CHL, CH2CH2-COOH <SEP> <B> D </B> <SEP> -CH3- (CH2) 4- <B> CO </B> -CH3 <SEP> (amyl methyl ketone) This discovery of behavior of spores versus fatty acids led to the further discovery that free spores (free from mycelium and beer) from the fermented medium can be used as such to convert chemical compounds in various ways.
The spores used according to the invention can easily be obtained from vegetative cells (mycelium) which were allowed to grow in a submerged culture with aeration for 4-6 days, namely in a corn-mash-liquorice medium or another Nutrient medium in which assimilable carbon and nitrogen are contained.
The spores produced from the old vegetative cells are harvested in such a way that they are left through the cheese rind in order to remove most of the mycelium as much as possible, after which the remaining mycelium is removed by filtration through glass wool. The spores in the filtrate are obtained by centrifugation and are then washed with water to remove retained nutrients.
They can be stored dry or resuspended in water and stored at 4 ° C. You can standardize the suspension so that it z. B. contains 1 trillion spores / ml. You can also let the spores grow on a surface culture, z. B. on agar, and after scraping the spores and suspending them in water, they z. B. obtained practically pure by filtration, centrifugation.
Surface cultures should then be used where the organism sporulates or where it does well in submerged cultures. The fungus species Murcorales, e.g. B. Rhizopus nigricans, do not sporulate in submerged cultures, which is why they should be grown on surface cultures.
The most suitable method for spore production can easily be determined through a preliminary test.
The invention is explained in more detail in the following examples.
<I> Example I </I> A glucose neopeptone medium (Sabourauds medium) which had been solidified with 2% agar,
was first inoculated with Aspergillus ochraceos according to the usual methods and incubated at about 30 for 5 days. The spores produced during this time were washed away from the surface of the resulting plant mycelium growth with distilled water.
The resulting aqueous suspension with something. Mycelium was infected and with a nutrient medium, was filtered through glass wool in order to remove the mycelium together with insoluble nutrient, then centrifuged to win the spores.
The soluble nutrients in the medium that were retained by the spores were first removed by suspending the spores in distilled water, whereupon the spores are recovered by centrifugation. The washing (suspending the spores in water and centrifuging) can be repeated, if desired, in order to be sure that the spores are essentially free of adherent nutrients and of mycelium.
The spores thus obtained were suspended in distilled water which was brought to a pH of 6.5-7 with a 1% phosphate buffer, whereupon a suspension was obtained which contained about 1-10 billion spores per ml.
About 20 times this suspension, which was located in a 125 ml Erlenmeyer flask, was then given 1 mg of progesterone, which was dissolved in 1 ml of propylene glycol. Since the glycol was miscible with the water, but the progesterone is insoluble in the water, the progesterone becomes insoluble and is obtained in the form of a fine suspension when the whole is added to a buffered aqueous suspension.
The resulting spore-progesterone suspension was then aerated by shaking on a rotary shaker, namely at a speed of about 150 revolutions per minute around a 6.35 mm radial pulse and for a period of about 12 hours at 25.
At the end of this period, the suspension containing the spores and the steroid was extracted with chloroform, after which the extract was centrifuged to remove the insoluble material and the aqueous phase from the chloroform. The resulting spore-free clear extract solution contains the desired 11 a-hydroxy-progesterone, after which the steroid can easily be obtained by sucking off the chloroform under reduced pressure.
The testing of the product by comparison with a known real sample of IIa-hydroxyprogesterone showed that practically 100% of the progesterone had been converted into the desired Ila-hydroxy derivative.
This shows that the 12 hour conversion period was appropriate and is an indication that possibly even shorter times could possibly be used to complete the introduction of the hydroxyl group into the progesterone with A. ochraceus spores in a medium free of mycelium and nutrients . In. In practice, the time-concentration ratio of the spores can be adapted to the desired ratios.
<I> Example 11 </I> The procedure is as in Example I and spores which have been obtained from a 10-14 day culture of Septomyxa affinis and Reichstein's compound S in a phosphate buffer at pH 7 are used. After 24 hours the resulting δ-1 product (compound S with a 1-2 double bond) was isolated in the manner described in Example I.
In this example, the steroid molecule undergoes dehydration and a double bond is created in the molecule. In this regard, there is a difference from example I, according to which oxygen was introduced into the molecule.
The following examples relate to the conversion of fatty acids into ketones, with the remainder of the procedures mentioned above being used. <I> Example 111 </I> To a 1% aqueous mixture of octanoic acid, which had been brought to a pH value of 6.5 with a phosphate buffer, were added Conidia or Conidio spores of P.
Roqueforti, which was essentially free of vegetable inoculum and nutrients. This contained about 100 million spores / 3 ml of the aqueous octanoic acid mixture. The mixture is then stirred with aeration at 25 for about 2 hours. The resulting methyl amyl ketone can in a known manner, for. B. can be isolated by distillation.
<I> Example </I> IV The procedure is as in Example III, but hexanoic acid, nonanoic acid and decanoic acid are used for the preparation of the methyl propyl ketone;
one also receives methyl, hexyl ketone and. Methyl heptyl ketone. If the appropriate fatty acid is selected, which has at least 4 carbon atoms, other ketones can be prepared in a similar manner, using spores which, as already described, do not contain any vegetable inocula or nutrients.
In order to ensure the fastest possible conversion by the spores, the starting compound should be finely distributed. This can easily be accomplished by dissolving the steroid, for example, in an inert, water-miscible organic solvent. For this purpose, lower alcohols (methanol, ethanol, etc.), water-miscible glycols, acetone or similar are used and the organic solution is then added to the aqueous suspension of the spores.
When you do this, the steroid precipitates out of solution in a fine suspension. The isolation of the converted steroid in high yield by using organic solvents in which the steroid is soluble can also be carried out easily thanks to the absence of vegetative growth (mycelium) and the beer with the remaining nutrients and thanks to the absence complex by-products that form during fermentation.
It is extremely important that the spores can be recovered and reused after use. For this purpose, the steroid in the reaction mixture with a water-miscible solvent, such as. B. propylene glycol, after which the resulting mixture for the purpose. Obtaining the spores by solvent extraction of the spore-free medium and centrifuging for the purpose of isolating the steroid.
The spores obtained, which are conveniently washed with what water, can then in turn be used if they are kept in a medium in which one or more nutrients are lacking, whereby the spores are prevented from germinating. This process, in which only spores are used, and the discovery that they can be used in turn, means a very significant improvement in previously known fermentation processes.
The procedure can be carried out using pure oxygen and air, with the conversion of the steroids going on equally well. Aeration can also be carried out by stirring with oxygen-containing gases under pressure. A small amount of KCN (0.65 mol) or CO can be added to the spore medium during conversion, as can glucose (e.g.
0.5 no. In general, the yield is increased by adding small amounts of oxidizable materials such as glucose, acetic acid, lactic acid and the like:
These changes can favor the speed as well as the completeness of the conversion of the steroids; However, if you use glucose or the like, it is important to keep the medium free of nitrogen in order to prevent germination.
In a similar way as above, spores free of mycelium and nutrient medium can be obtained from various organisms and used for the microbiological production of chemical compounds.
For example, it can be used to introduce different groups and double bonds into a wide variety of steroids and their intermediates. Instead of the organisms that were mentioned in the following literature and which are then used to put a group or double bond into the.
To introduce a steroid molecule into a vegetative inoculum that is contained in an aqueous nutrient medium, the spores from the same organism can also be used to introduce the same group or double bond into the same steroid molecule.
The following modifications of steroids are listed below: 1. Reduction of progesterone to d4-pregnen-20ss-o1-3 -an with Stroeptomyces, lavendulae (Fried, J. et a1., J. Am. Chem. Soc. <I> 75: </I> 5764 [1953]).
2. Dehydrogenation of secondary alcohols.
a) d5-androstene-3ss, 17ss-diol to testosterone with Proactinomyces erjthropolis. Turfitt G. E., Biochem. D. 40: 79 [1946]).
b) Oestradiol to oestrone with Sireptomyces albus .. (Welsch, M et a1., Compt. rend. Soc. Biol. 142: 1074 [1948]).
3. Hydroxylation in the 1-position. d4-Androstene-3,17-dione to d4-Androsten-la-ol-3,17-dione with Penicillium sp., (Dodson, RM et a1., J. Am. Chem. Soc. 79: 392 < B> 1 </B> [1957]).
4. Hydroxylation in the 2-position. d4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione to d4-pregnen-2ss, 17a, 21-triol-3,20-dione with Streptomyces sp. (Herzog, H. L. et al., Journal Am. Chem. Soc. 79: 3922 [1957]).
5. Hydroxylation in the 6-position. Progesterone to d4-pregnen-6ss-ol-3,20-dione with Streptomyces aureofaciens [Fried, J. et al. Recent Progr. Hormone Res. 11: 157 (1955); see also Dulanaz, E.
L. et al., Mycologia 47: 464 (1955); Fried, J. et al. Journ. At the. Chem. Soc. 74: 3962 (1952); Master P. D. et al., Journ. At the. Chem. Soc. 75: 416 (1953); Eppstein, S.
H. et a1. Journ. At the. Chem. Soe. 75: 408 (1953)] including the microorganisms Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger and Ricopus arrhizus.
6. Hydroxylation in the 7-position. Progesterone to d4-pregnen-7a-ol-3,20-dione with Phigomyces blakesleanus. Fried et al., U.S. Pat. No. 2,753,290; see also Meystre, C. et al., Helv. Chem. Act. 38:
381 (1955) using a Peziza species for carrying out similar reactions with the deoxycorticosterone.
7. Hydroxylation of the 10, 11 or 12 positions.
a) 19-nor-progesterone to 10E-hydroxyl-19-nor-progesterone with Rhizopus nigricans. Pederson, R.L. et al., Journ. At the. Chem. 78: 1512 (1956).
b) Progesterone to d4-pregnen-lla-ol-3,20-dione with irritopus arrhizus. Peterson, D.H. et a1., Journ. At the. Chem. Soc. 74: 1871 (1952) and Journ. At the. Chem. Soe. 75: 412 (1953).
c) Reichsteins compound S (d4-Pregnen-17a, 21-diol 3,20-dione) to hydrocortisone with Cunninghamela blakesleeana. Hanson, F. L. et al., Journ. At the. Chem. Soc. 75: 5369 (1953) see also Schull G.
M. et al., Journ. At the. Chem. Soc. 77: 763 (1955) and Thoma et al., US Pat. No. 2,793,162, in which similar reactions with Curvularia lunata, Trichotecium roseum and Coniothyrium helleborine are also described.
d) Progesterone to d4-pregnen-12ss-ol-3,20-dione and the analogous 12ss, 15ss-diol with Calnectria decora. Schubert, A. et al., Ber. 90: 2576 (1957).
B. Hydroxylation in other positions be writes Meister, P. D. et al., Absts. 123 rd Meeting Am. Chem. Soc. (1953); Fried et al., U.S. Patent No. 2,753,290; Kamerino, B. et al., Gaz. Chem. Ital. 86: 1226 (1956); Meystre, C. et al., Helv. Chim. Acta. 38: 38 (1955);
Perlinan D. et al., J. Am. Chem. Soc. 74: 2126 (1952); Thoma R.W. et al., Journ. At the. Chem. Soc. 79: 4818 (1957); Dulaney E.L. et al., Appl. Microbiol. 3: 372 (1955); Meystre C. et al., Helv. Chim. Acta 37: 1548 (1954); McAleer W.
J. et al., Arch. RTI ID = "0004.0238" WI = "6" HE = "4" LX = "1422" LY = "1606"> Bio. Chem. Biopys. 62: 109 (1956).
9. Dehydration. Hydrocortisone to d4-pregna- dien-11ss, 17a-21-triol-3,20-dione with Streptomyces lavendulae. Fried, et al., U.S. Patent No. 2,793,164;
see also Mobile, A. et al., Journ. At the. Chem. Soc. 77: 4184 (1955); Vischer E. et al., Helv. Chim Acta <I> 38: </I> 835 and <I> 38: </I> 1502 (1955) using Alternaria sp. and Didymella lycoperizi. See also Sper et al., Journ. At the. Chem. Soc. 78:
6213 (1956) using Septomyxa affinis, as described in Example II for the introduction of the 1-2 double bond.
10. Side chain degradation. Progesterone to d4-androstadiene-3,20-dione with Streptomyces lavendulae. Peterson G.
E. et al., J. Bact. 74: 684 (1957) also compare Vischer, E. et al., Report on Fusarium solani and F. Caucasicum in Experientia 9: 371 (1953), where an S-2 double bond with cleavage of side chains is described. See also Turfit, G. E. Biochem. Journ. 42: 376 (1948).
See also U.S. Patent Nos. 2 602 669, 2649400, 2649401, 2695260, 2735800, 2753290, 2762747, 2768928, 2789940, 2802775, 2809919, 2812285 , 2830937, in which microorganisms-forming spores are also described, which can also be used in media free of plant growth and nutrients.
As already noted, the methods are carried out as they have been described in the literature cited above (1), with the exception that the vegetative growth material used there is replaced by spores, specifically by spores that are essentially vegetative Growth material are free, and (2) the aqueous nutrient medium or beer, which is used according to the above literature reference, is also replaced by an aqueous medium which is essentially free of a nutrient.
The time required for complete conversion when using spores (this time can be determined beforehand by a blank test) can usually be shortened considerably and the yield can be increased considerably compared to known methods.
In addition to the time factor, however, the isolation of the chemically converted compounds in good yield is also much cheaper (it can also be carried out according to the methods of the literature above), because the reaction mixture contains relatively pure reaction products, whereas known fermentation mixtures contain vegetative growth substances, organic nutrients as well as fermentation by-products. The purification of the compound obtained after its isolation is also much easier than with known methods.
It is obvious that the method of the present invention using spores can be used wherever mycelium and beer, which is produced during fermentation, are used. The use of a steroid having an 11-methylene group and spores obtained from Aspergillus (US Pat. No. 2,649,402) [and Penicillium (US Pat. No. 2,649,402)] and organisms such as Septomyxa affinis, which introducing a 1-2 double bond are preferred.
Two intermediate transformations can be made possible by using spores from different fungi at the same time; the difference can be as small as the difference in the strain on the same fungus, or as great as the difference in the class. Furthermore, this difference can be induced by mutating a particular organism.
In addition to steroids and related intermediates and fatty acids, other chemical compounds in the core and in the side chain with the spores can also be modified in the above manner. For example, be leads naturally occurring alkaloids such. B. Rauwolfia alkaloids, etc. as well as synthetic substances such. B. Levallorphan (1. Lorphan) and the like. Compare Pan. S. C. et al., J. A. C. S. page 4749 r. (Sept. 5, 1958); Godtfresen et al., Exp. 14:88 (1958).
In all cases, the compounds are changed by the spores in a medium that is practically free of infectious substances such as vegetative growth material (mycelium), nutrients, in particular fermentation nutrients, in which the spores can germinate and which are also free from fermentation by-products . This is necessary so that you can enjoy the benefit of simple and easy isolation and cleaning.