DE1179944B

DE1179944B - Process for the preparation of a blood substitute

Info

Publication number: DE1179944B
Application number: DEF38892A
Authority: DE
Inventors: Dr Gustav Pieper; Dr Christian Gloxhuber
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1963-02-01
Filing date: 1963-02-01
Publication date: 1964-10-22

Description

Verfahren zur Herstellung eines Blutersatzmittels Wäßrige Lösungen= hochmolekularer Polypeptidderivate können unter gewissen Voraussetzungen als Ersatz für Blutplasma therapeutisch verwendet werden und haben gegenüber Vollblut oder Serumkonserven den Vorteil, daß die Ausgangsmaterialien reichlich zur Verfügung stehen, die fertige Flüssigkeit sterilisiert werden kann und vor der Anwendung keine Blutgruppenbestimmung erforderlich ist.Process for the preparation of a blood substitute Aqueous solutions = High molecular weight polypeptide derivatives can be used as a substitute under certain conditions to be used therapeutically for blood plasma and have compared to whole blood or Canned serum have the advantage that the starting materials are abundantly available stand, the finished liquid can be sterilized and none before use Blood typing is required.

Andere Lösungen für Blutplasmaersatz sind z. B. bekannt aus der deutschen Auslegeschrift 1038 239 und aus Arzneimittelforschung, Bd. 12 [1962], S. 378 bis 382.Other solutions for blood plasma replacement are e.g. B. known from the German Auslegeschrift 1038 239 and from Arzneimittelforschung, Vol. 12 [1962], pp. 378 to 382.

Derartige Lösungen müssen auch bei Verabfolgung großer Mengen gut verträglich sein, dürfen bei wiederholter Verabreichung nicht zu allergischen Reaktionen führen und sollen in ihrer Viskosität und ihrem kolloidosmotischen Druck dem Serum möglichst ähnlich sein. Lösungen partiell hydrolysierter Gelatine erfüllen diese Voraussetzungen weitgehend und sind auch für derartige Zwecke bereits verwendet worden. Jedoch werden diese Präparate im Blutkreislauf sehr schnell abgebaut und- ausgeschieden. Man hat daher versucht, durch die Umsetzung der Gelatine oder ihrer Hydrolyseprodukte mit Dicarbonsäureanhydriden, Glyoxal oder Diisocyanaten Präparate mit längerer Verweilzeit im Organismus zu erhalten, mußte dabei aber eine Verlagerung des Isoelektrischen Punktes der Gelatine und damit eine Änderung der Löslichkeitsverhältnisse oder die Bildung unbiologischer Gruppierungen im Gelatinemolekül in Kauf nehmen. Zusätzlich Schwierigkeiten machten dabei die vollständige Entfernung eines Überschusses der angewendeten Reagenzien, wie etwa des Glyoxals oder der Diisocyanate.Such solutions must also be good when large amounts are administered be tolerated, must not cause allergic reactions with repeated administration lead and should in their viscosity and their colloid osmotic pressure the serum be as similar as possible. Solutions of partially hydrolyzed gelatin meet these requirements Requirements largely and have already been used for such purposes been. However, these preparations are broken down very quickly in the bloodstream and- eliminated. Attempts have therefore been made to implement the gelatin or its Hydrolysis products with dicarboxylic acid anhydrides, glyoxal or diisocyanate preparations However, to maintain it with a longer residence time in the organism, it had to be relocated of the isoelectric point of the gelatin and thus a change in the solubility ratios or accept the formation of unbiological groups in the gelatin molecule. The complete removal of an excess caused additional difficulties the reagents used, such as glyoxal or diisocyanates.

Auch sind bereits Verfahren bekannt, bei denen man natürliche Eiweißstoffe; z. B. Casein, Pepsin, Sturin und Eialbumin, oder ihre Hydrolyseprodukte, z. B. Tyrosin, Histidin, Tryptophan, mit salpetriger Säure umsetzt (vgl. z. B. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie; Bd. 78 11912], S. 402- bis 413, insbesondere S. 407; The Biochemical Journal, Bd. 32 [1938], S: 542 bis 551;-The Proteins, Vol. I., Part B, New York [1953], S. 934 bis 936, und Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft, Bd.43 [19l0], S. 3170 bis 3181).Processes are also already known in which natural proteins are used; z. B. casein, pepsin, sturin and egg albumin, or their hydrolysis products, e.g. B. tyrosine, Histidine, tryptophan, reacts with nitrous acid (see e.g. Hoppe-Seyler's magazine for Physiological Chemistry; Vol. 78 11912], pp. 402 to 413, especially p. 407; The Biochemical Journal, Vol. 32 [1938], S: 542 to 551; -The Proteins, Vol. I., Part B, New York [1953], pp. 934 to 936, and reports from the German Chemical Society, Vol. 43 [1910], pp. 3170 to 3181).

Es wurde nun gefunden, daß man ein Blutersatzmittel durch die Umsetzung von Hydrolyseprodukten natürlicher Eiweißstoffe mit salpetriger Säure dadurch herstellen kann, daß man eine wäßrige Lösung von partiell bis zum Molekulargewicht zwischen 20 000 und 80 000 abgebauter Gelatine mit salpetriger Säure in etwas überschüssiger Menge, auf die angewandte Gelatinemenge bezogen, bei Temperaturen zwischen 0 und +20°C und pH-Werten von 2 bis 4 umsetzt.It has now been found that you can obtain a blood substitute by the implementation of hydrolysis products of natural proteins with nitrous acid can that one an aqueous solution of partial up to the molecular weight between 20,000 and 80,000 degraded gelatin with nitrous acid in a little excess Amount, based on the amount of gelatin used, at temperatures between 0 and + 20 ° C and pH values from 2 to 4.

Die Umsetzung erfolgt unter sehr milden Bedingungen und verläuft unter Stickstoffentwicklung. Es ist anzunehmen, daß dabei lediglich die primären Aminogruppen des Polypeptids in Hydroxylgruppen umgewandelt werden. Diese geringfügige und zu keinerlei biologisch unverträglichen Gruppen führende Änderung des natürlichen Eiweißmoleküls bewirkt überraschenderweise eine wesentliche Verringerung' der Geschwindigkeit des Abbaus dieser Substanzen im Organismus, ohne diesen jedoch ganz zu verhindern. Auch ihre Ausscheidung ist verlangsamt.The implementation takes place under very mild conditions and runs under Nitrogen evolution. It can be assumed that only the primary amino groups of the polypeptide are converted into hydroxyl groups. This minor and too No change in the natural protein molecule leading to any biologically incompatible groups surprisingly causes a substantial reduction in the speed of the Degradation of these substances in the organism without completely preventing it. Even their excretion is slowed.

Das Durchschnittsmolekulargewicht der partiell abgebauten Gelatine muß über 20 000 liegen, da sonst erfahrungsgemäß keine ausreichende Verweilzeit im Organismus erzielt werden kann. Andererseits sind Eiweißabbauprodukte mit einem Molekulargewicht oberhalb 80 000 im allgemeinen wegen der großen Viskosität der Lösungen und des bei gleicher Konzentration geringeren kolloidosmotischen Drucks als Blutersatzmittel weniger vorteilhaft. Besonders gut als Ausgangsmaterial geeignet ist partiell hydrolysierte Gelatine mit einem Molekulargewicht zwischen 30 000 und 50 000.The average molecular weight of the partially degraded gelatin must be more than 20,000, otherwise experience has shown that the residence time is insufficient can be achieved in the organism. On the other hand, protein breakdown products are with a Molecular weight above 80,000 in general because of the high viscosity of the Solutions and the lower colloid osmotic pressure at the same concentration less beneficial as a blood substitute. Particularly suitable as a starting material is partially hydrolyzed gelatin with a molecular weight between 30,000 and 50,000.

Die Umsetzung mit der--salpetrigen Säure wird in wäßriger Lösung bei Temperaturen- zwischen 0. und -1--20°C durchgeführt. Der pH-Wert der Lösung wird dabei durch den Zusatz von Salzsäure oder einer anderen starken Säure auf 2 bis 4 eingestellt und gehalten. Man verwendet zweckmäßig einen kleinen Überschuß an salpetriger Säure, der nach der Beendigung der Umsetzung durch die Zugabe von Harnstoff unter Bildung von -Stickstoff und Kohlensäure in bekannter Weise zerstört wird. Überschüssiger Harnstoff ist in den in Frage kommenden Mengen physiologisch unbedenklich und kann in der Lösung verbleiben. Man kann auch die salpetrige Säure aus Natriumnitrit und Salzsäure erzeugen, da das als Nebenprodukt dabei entstehende Natriumchloridebenfalls nicht abgetrennt zu werden braucht, sondern lediglich beim späteren Verdünnen der Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung berücksichtigt werden muß.The reaction with the - nitrous acid is in aqueous solution Temperatures between 0 and -1-20 ° C. The pH of the solution becomes by adding hydrochloric acid or another strong acid to 2 bis 4 set and held. It is advisable to use a small excess nitrous acid, which after the completion of the reaction by the addition of urea is destroyed in a known manner with the formation of nitrogen and carbonic acid. Excess urea is physiologically harmless in the quantities in question and can remain in the solution. One can also get the nitrous acid from sodium nitrite and produce hydrochloric acid, as that as By-product resulting from this Sodium chloride also does not need to be separated, but only when later dilution of the solution with physiological saline solution is taken into account must become.

Die erhaltenen Lösungen werden gegebenenfalls durch Filtrieren oder Zentrifugieren geklärt und dann durch die Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung oder anderen isotonischen Salzlösungen auf die gewünschte Konzentration (vorzugsweise 2 bis 5010) verdünnt. Zur Sterilisation erhitzt man die abgefüllte Lösung in der verschlossenen Ampulle auf 100 bis 120°C. Es ist auch ohne Schwierigkeiten möglich, z. B. durch Sprühtrocknung oder Fällungsverfahren aus den konzentrierten wäßrigen Lösungen Trockenpräparate herzustellen, die auch ohne Sterilisation längere Zeit lagerfähig sind und bei Bedarf im sterilen, pyrogenfreien Wasser aufgelöst werden können.The solutions obtained are optionally clarified by filtration or centrifugation and then diluted to the desired concentration (preferably 2 to 5010) by adding physiological saline or other isotonic saline solutions. For sterilization, the filled solution is heated in the sealed ampoule to 100 to 120 ° C. It is also possible without difficulty, e.g. B. by spray drying or precipitation processes from the concentrated aqueous solutions to produce dry preparations that can be stored for a long time without sterilization and can be dissolved in sterile, pyrogen-free water if necessary.

Beispiel l 100g abgebaute Gelatine, die aus 500 g Rinderknochen-Photogelatine (isoelektrischer Punkt pH 4,5, Molekulargewicht 60 000 bis 120 000) durch das Lösen bei 80°C in 750 ccm Wasser unter Rühren, Zusatz von 25 ccm konzentrierter Natronlauge und weiteren 10 Minuten langem Rühren bei 80°C, Neutralisation mit Salzsäure, Fällen des Abbauproduktes durch Eingießen in Alkohol und Trocknen hergestellt worden ist [vgl. Tabelle unter (a)], werden bei -1-10°C in 250 ccm Wasser gelöst und die Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Man tropft unter Rühren eine Lösung von 2,5 g Natriumnitrit in 10 ccm Wasser so lange zu, bis mit Jodkali-Stärke-Papier freie salpetrige Säure nachweisbar ist. Nach der Zugabe von etwa 7 ccm Natriumnitritlösung bleibt die Blaufärbung des Indikatorpapiers bestehen. Der Überschuß an salpetriger Säure wird nach einer halben Stunde in bekannter Weise durch die Zugabe von 0,5 g Harnstoff und kurzes Erwärmen auf 80°C entfernt und das Polypeptid durch das Eingießen in Alkohol als Pulver isoliert. Ausbeute: 102.g zeit den in der Tabelle unter (b) angegebenen Eigenschaften. Beispiel 2 100 g hydrolysierte Gelatine, die aus 500 g Kalbshaut-Photogelatine (isoelektrischer Punkt pI1 8z6; Molekulargewicht 70 000 bis 140 000),, wie im Beispiel 1 beschrieben, und durch 15 Minuten lange Hydrolyse mit Natronlauge bei 80°C hergestellk worden ist [vgl. Tabelle unter (c)], werden nach dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren mit salpetriger Säure. umgesetzt. Es werden 81 g eines schwach gelblichen Pulvers mit. den in der Tabelle unter (d) angegebenen Eigenschaften erhalten. Eiweiß- 1171 Halbwerts- abbau- in 0,9°/Qiger ' £'#° erogen- zeit der produke NaCI=Lösung g/kg malte Ausscheidung (a) 0,243 15,0 - - - 1 Stunde (b)- 0,245 10,0 -(-,-)- 2 Stunden (c) 0,148 15,7 - - - 50 Minuten. (d). 0;148 15,0. - - - 2 Stunden Erläuterungen der Tabelle LDso: Weiße Maus, intravenös.Example 1 100 g of degraded gelatine, which is made from 500 g of bovine bone photo gelatine (isoelectric point pH 4.5, molecular weight 60,000 to 120,000) by dissolving at 80 ° C. in 750 cc of water with stirring, adding 25 cc of concentrated sodium hydroxide solution and others Stirring for 10 minutes at 80 ° C., neutralization with hydrochloric acid, precipitation of the degradation product by pouring into alcohol and drying has been prepared [cf. Table under (a)], are dissolved in 250 ccm of water at -1-10 ° C and the solution is adjusted to pH 3 with concentrated hydrochloric acid. A solution of 2.5 g of sodium nitrite in 10 cc of water is added dropwise with stirring until free nitrous acid can be detected with potassium iodide starch paper. After adding about 7 cc of sodium nitrite solution, the blue color of the indicator paper remains. The excess of nitrous acid is removed after half an hour in a known manner by adding 0.5 g of urea and briefly warming to 80 ° C. and the polypeptide is isolated as a powder by pouring it into alcohol. Yield: 102 g with the properties given in the table under (b). Example 2 100 g of hydrolyzed gelatin, which has been produced from 500 g of calf skin photogelatin (isoelectric point pI1 8z6; molecular weight 70,000 to 140,000) as described in Example 1 and by hydrolysis with sodium hydroxide solution at 80 ° C. for 15 minutes [see. Table under (c)], are according to the procedure given in Example 1 with nitrous acid. implemented. There are 81 g of a pale yellowish powder with. obtained the properties given in the table under (d). Protein 1171 half-life degradation in 0.9 ° / Qiger '£'# ° erogenous time of products NaCI = solution g / kg painted excretion (a) 0.243 15.0 - - - 1 hour (b) - 0.245 10.0 - (-, -) - 2 hours (c) 0.148 15.7 - - - 50 minutes. (d). 0; 148 15.0. - - - 2 hours Explanations of the table LDso: White mouse, intravenous.

Pyrogengehalt: Drei Kaninchen wurden je 50 ccm der 5°/oigen Lösung i. v. injiziert. Diese Dosis wurde ohne Fieberreaktion vertragen. Der geringe Anstieg bei einem Tier [unter (b), Beispiel 2] liegt unterhalb der Toleranz des DAB 6.Pyrogen content: three rabbits were each given 50 cc of the 5% solution i. v. injected. This dose was tolerated without a fever reaction. The slight increase in one animal [under (b), example 2] is below the tolerance of DAB 6.

Halbwertszeit der Ausscheidung Die Verweilzeit des Präparates im Blut und die Ausscheidung im Harn wurde an Kaninchen untersucht, die sich in Urethan-Narkose befanden und bei denen eine Harnfistel angelegt war. Die verabreichte Gelatinedosis betrug bei beiden Präparaten 20 ml/kg einer 50°/oigen Lösung. Im Urin und im Blut der Tiere wurde die ausgeschiedene bzw. noch vorhandene Gelatine nach der Hydroxyprolin-Methode (Deutsche Medizinische Wochenschrift, 8d. 87 [1962], S. 730 bis 737) bestimmt. Durch die Behandlung mit salpetriger Säure läßt sich die Halbwertszeit der Ausscheidung auf das Doppelte erhöhen.Elimination half-life The time the preparation remains in the blood and urinary excretion was studied in rabbits under urethane anesthesia and in which a urinary fistula was applied. The dose of gelatin administered was 20 ml / kg of a 50% solution for both preparations. In the urine and in the blood the excreted or still present gelatin of the animals was removed by the hydroxyproline method (German Medical Wochenschrift, 8d. 87 [1962], pp. 730 to 737). By Treatment with nitrous acid can reduce the half-life of excretion increase to double.

Die nach Beispiel 1 der deutschen Auslegeschrift 1038 239 hergestellte Lösung zeigt bei etwa gleicher Toxizität eine Halbwertszeit der Ausscheidung von einer Stunde. Sie wird also ebenso schnell ausgeschieden wie die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Gelatineausgangslösungen [vgl. Tabelle unter(a) und (c).], deren Herstellung nicht Gegenstand der Erfindung ist. Die erfindungsgemäß hergestellten Lösungen sind also den bekannten Lösungen von Blutplasmaersatzmitteln bezüglich der Verweilzeit im Organismus, überlegen.The solution prepared according to Example 1 of German Auslegeschrift 1038 239 shows an elimination half-life of one hour with approximately the same toxicity. It is excreted just as quickly as the gelatin starting solutions described in Examples 1 and 2 [cf. Table under (a) and (c).], The production of which is not the subject of the invention. The solutions produced according to the invention are therefore superior to the known solutions of blood plasma substitutes with regard to the residence time in the organism.

Claims

Claim: Process for the production of a blood substitute by reacting hydrolysis products of natural proteins with nitrous acid, characterized in that an aqueous solution of partially up to Molle, molecular weight between 20,000 and 80,000 . Degraded gelatin with nitrous acid in a slightly excess amount , based on the amount of gelatin used, at temperatures between 0 and -1-20 ° C and pH values of 2 to 4. Considered publications: Deutsche Auslegeschrift No. 1038 239; Reports of the German Chemical Society, Vol. 43 ( 1910), pp. 3170 to 3181; H o p. Pe - S ey 1 er's Zeitschrift für Physiologische Chemie, Vol. 78 (1912); pp. 402 to 413, especially p. 407; Pharmaceutical Research, Vol. 12 ( 1962), pp. 378 to 382; P. Karser, Textbook of Organic Chemistry; 1959, 13th edition, p. 255; Ab & 2 from below; Tue-Biochemical Journal, Vol. 32 (1938), pp. 542 bis 551; The Proteins, Vol. I, Part B, New York, 1953, pp. 934-93.