DE1902865A1

DE1902865A1 - Substituted insulin derivatives, processes for their production and their use in pharmaceutical preparations

Info

Publication number: DE1902865A1
Application number: DE19691902865
Authority: DE
Inventors: Harvey Alburn; Howard Grant; Pa Wynnewood
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1968-02-01
Filing date: 1969-01-21
Publication date: 1969-09-11
Also published as: JPS4910516B1; FR2001142A1; GB1260963A

Description

DR. EULE DR. BERG D1PL.-ING. STAPFDR. EULE DR. BERG D1PL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE 1902Β65PATENT LAWYERS 1902-65

8 MÜNCHEN 2. HILBLESTRASSE 2O *" 8 MUNICH 2. HILBLESTRASSE 2O * "

Dr. Eule Dr. Barg Dipl.-Ing. Stapf. 8 MOnchen 2, Hilblertrofl« 20 ·Dr. Owl dr Barg Dipl.-Ing. Stapf. 8 Munich 2, Hilblertrofl «20 ·

Ihr Zeichen Unser Zeichen Datum 91 JanYour reference Our reference Date 9 1 Jan

Anwalts-Akte 18 072
Be/Sch Attorney file 18 072
Be / Sch

American Home Products Corporation, New York I7/USAAmerican Home Products Corporation, New York I7 / USA

"Substituierte Insulin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen" "Substituted insulin derivatives, processes for their production and their use in pharmaceutical preparations"

Diese Erfindung betrifft Insulin-Derivate mit therapeutischer Wirksamkeit, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen enthalten. This invention relates to insulin derivatives having therapeutic activity, a process for their preparation and pharmaceutical preparations containing these compounds.

Die Verwendung von Insulin als Mittel zur BlutzuckerSenkung und zur Kontrolle von Diabetes ist allgemein bekannt und im Gebrauch.Es ist gedoch das Insulin selbst unstabil und Do-The use of insulin as a means of lowering blood sugar and for the control of diabetes is well known and in use. However, the insulin itself is unstable and do-

AHP-4^r>92 -2-AHP-4 ^r > 92 -2-

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sierungseinheiten, die es enthalten, müssen gekühlt und durch Zugabe von Materialien stabilisiert werden, die ihrerseits nachteilige Nebenreaktionen bei manchen empfindlichen Personen' herbeiführen können. Außerdem hat Insulin eine ziemlich kurze Wirkungsdauer, von nur ungefähr sechs bis acht Stunden, sodaß eine mehrfache Verabfolgung im Verlauf des Tages notwendig ist. Das Insulinhormon wurde bisher unter Bildung von Derivaten modifiziert, wie Zink- und Pr otaminzinkkomplexen, die tatsächlich eine längere Dauer der Wirksamkeit aufweisen, aber schwierig herzustellen sind, weil die Teilchengröße die Dauer der Wirksamkeit beeinflußt und sie schwierig zu verwenden sind, weil es notwendig ist, den Wirkstoff vor der Verabfolgung zu dispergieren. Zusätzlich werden viele Diabetiker nicht ohne weiteres auf gleichbleibenden Dosen der derzeitigen Insulinforaien gehalten. Einige entwickeln einen Zustand, der eine Insulinresistenz zu sein scheint und dies ist nur dadurch zu überwinden, daß man unüblich hohe Dosen der derzeitigen Insulinarten verabfolgt. Die Resistenz scheint das Ergebnis der Entwicklung von Antikörpern zu sein, die die derzeitigen Insulinarten zu inaktivieren scheinen. Es besteht daher ein Bedürfnis nach Insulinformen, die als hypoglykämische Mittel zur Behandlung von Diabetes in hoher Weise wirksam sind, lange Wirksamkeitsdauer gekuppelt mit schnellem larlaingsbeginn haben, von Patienten gut vertragen werden uad vorzugsweise weniger Antigen-bildend sind als die derzeitigen Insulintypen. sation units that contain it must be cooled and be stabilized by adding materials, which in turn have adverse side reactions in some sensitive People 'can bring about. Also, insulin has a fairly short duration of action, from only about six to eight hours, so that multiple administrations are necessary in the course of the day. The insulin hormone was previously under Modified formation of derivatives, such as zinc and protamine zinc complexes, which actually have a longer duration of effectiveness but are difficult to manufacture, because the particle size affects the duration of the effectiveness and they are difficult to use because of the need to disperse the active ingredient before administration. Additionally Many diabetics are not easily kept to consistent doses of the current insulin foraien. Some develop what appears to be a condition of insulin resistance and this can only be overcome by that unusually high doses of the current types of insulin are administered. The resistance seems to be the result of development of antibodies that appear to inactivate current types of insulin. There is therefore a need after forms of insulin used as hypoglycemic agents for treatment of diabetes are highly effective, long duration of effectiveness coupled with a rapid onset of larlaings are well tolerated by patients and preferably are less antigen-forming than current types of insulin.

909837/158 7909837/158 7

Die vorliegende Erfindung betrifft drei nsiie I^ali-Car ^re.-The present invention relates to three nsiie I ^ ali-Car ^ re.-

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

te, nämlich i-Aminocyclopentan-carbonyl-insulin, 1-Aminocyclohexan-carbonyl-insulin und L-Tryptophyl-insulin.te, namely i-aminocyclopentane-carbonyl-insulin, 1-aminocyclohexane-carbonyl-insulin and L-tryptophyl insulin.

Die durch die Erfindung zur Verfügung gestellten Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Insulin mit einem eine Aminoacylgruppe enthaltenden Acylierungsmittel acyliert, um das Insulin mit einer Gruppe der nachfolgenden Formel zu verbinden.The compounds provided by the invention can be prepared by taking insulin with an acylating agent containing an aminoacyl group acylated to link the insulin to a group of the formula below.

LJH-LJH-

o^?-o ^? -

allerall

CH.CH.

O ι/ CH- ΧO ι / CH- Χ

Das Verbinden wird vorzugsweise dadurch bewirkt, daß man Insulin mit einem Aminoacylierungsmittel umsetzt, das einen Aminoacylrest der oben angegebenen allgemeinen Formel, wie bzw. als ein N-Garboxyanhydrid, enthält. Die ablaufende Reaktion kann wie folgt scheraatisch dargestellt werden:The linking is preferably effected by taking insulin reacts with an aminoacylating agent which has an aminoacyl radical of the general formula given above, such as or as an N-carboxy anhydride. The expiring The reaction can be represented as follows:

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ORIGINAL INSPECTEDORIGINAL INSPECTED

<c_<c_

HM-HM-

._cy>. _c y>

Η» Ν —Η »Ν -

c ι c ι

O
' ^U O
' ^U

— C—-NH- insulin - C- -NH- insulin

t· CO.t · CO.

wobei"H₂N-Insulin" ein Insulinmolekül ist, die ßeste E und R¹ zusammen -OH₂COH₂ )₂ ^GE2~ ^oder -^σΗ2^^0Η2^3°^Η2" ^{sind oder R} Wasserstoff und R^ ein J-Indolylmethylrest ist der Formel:where "H ₂ N-insulin" is an insulin molecule, the ßeste E and R ¹ together -OH ₂ COH ₂ ) ₂ ^GE 2 ~ ^or - ^σΗ 2 ^ ^0Η 2 ^ 3 ° ^Η 2 " ^{or R are} hydrogen and R ^ a J-Indolylmethylrest is of the formula:

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Verbindungen können die Formel (I) haben. Vorzugsweise sind die gesamten freien Aminogruppen in dem Insulin im wesentlichen vollständig durch die Reaktion mit einem Reagenz, das geeignet ist, die Aminoacylgruppe zu bilden, substituiert. Dem Fachmann ist die Tatsache bekannt, daß obgleich das Insulin ein komplexes Molekül mit einem reaktiv hohen Molekulargewicht (ungefähr 24 000 bei einem pH von ungefähr 7,5)The compounds obtained by the process according to the invention can have the formula (I). Preferably they are all free amino groups in the insulin essentially completely by reaction with a reagent that is appropriate is to form the aminoacyl group is substituted. Those skilled in the art are aware of the fact that although the insulin a complex molecule with a reactively high molecular weight (about 24,000 at a pH of about 7.5)

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ist, jedes Molekül dieses Hormons 12 freie Aminogruppen enthält. Diese §ind die Aminogruppen, die mit dem Aminoacylierungsmittel, beispielsweise dem N-Carboxyanhydrid (NOA) der Formel (II) reagieren können und die neuen Verbindungen enthalten daher vorzugsweise ungefähr 12 Aminoacylgruppen pro Molekül Insulin.is, every molecule of this hormone contains 12 free amino groups. These are the amino groups associated with the aminoacylating agent, for example, the N-carboxyanhydride (NOA) of the formula (II) can react and contain the new compounds therefore preferably about 12 aminoacyl groups per molecule of insulin.

Es ist jedoch besonders darauf hinzuweisen, daß wenn hier und in den Ansprüchen die Bezeichnung "Aminoacyl-substituiert" verwendet wird, dies sowohl mono-(Aminoacyl>- als auch poly(Aminoacyl)-substituierte Insuline bezeichnet, wobei "mono" in diesem Üinne eine, und "poly" beispielsweise von ungefähr 2 bis ungefähr 9 und sogar mehr Aminoacylgruppen bezeichnet, die mit jeder Insulingruppe verbunden sind.It should be noted, however, that when here and in the claims the term "aminoacyl-substituted" is used, this is both mono- (aminoacyl> - and denotes poly (aminoacyl) -substituted insulins, with "mono" in this meaning one, and "poly" for example from denotes from about 2 to about 9 and even more aminoacyl groups associated with each insulin group.

Im allgemeinen sind die Bedingungen zur Umwandlung des NOA der Formel (II) zu den vorliegenden Aminoacyl-substituierten Insulinen.der Formel (I) nicht kritisch. Es ist zweckmäßig beispielsweise von 1/20 bis 1/2 Gew.Teil NGA pro Gew.Teil Insulin zu verwenden (wodurch man einen stöchiometrischen Überschuß des Aminoacylierungsmittels bildet, weil das Insulin ein Molekulargewicht von 24 000 bei dem pH der Reaktionsbedingungen hat und jedes Molekül dieser Größe 12 Aminogruppen enthält). Die .Reaktion verläuft glatt und vollständig bei einem pH von 7»5 bis 8,5 in einem Puffer, wie 0,1 M Kaliumphosphat und sogar bei O⁰O, vorzugsweise in einer Stickstoffatmosphäre. Während das Aminoacylierungsmit-In general, the conditions for converting the NOA of formula (II) to the present aminoacyl-substituted insulins of formula (I) are not critical. It is expedient to use, for example, from 1/20 to 1/2 part by weight of NGA per part by weight of insulin (thereby forming a stoichiometric excess of the aminoacylating agent because the insulin has a molecular weight of 24,000 at the pH of the reaction conditions and each molecule this size contains 12 amino groups). The reaction proceeds smoothly and completely at a pH of 7-5 to 8.5 in a buffer such as 0.1 M potassium phosphate and even at ^{0 0} O, preferably in a nitrogen atmosphere. While the aminoacylation agent

tel insgesamt auf einmal (anfangs) zugegeben werden kann, 909837/1587 tel can be added all at once (initially), 909837/1587

wird es jedoch vorgezogen es portionsweise, in Zwischenräumen von ungefähr 15 Minuten, zuzuführen, bis die Gesamtmenge zugegeben ist. Das Produkt kann dann, vorzugsweise nach Einstellen des pH au* 8,6 bis 9,2, isoliert werden, wozu man das Reaktionsgemisch gefriertrocknet (lyophylisiert), den Rückstand in Wasser aufnimmt, dann gegenüber Wasser dialysiert und das Zurückgebliebene gefriertrocknet, wodurch man das Produkt als Rückstand erhält.however, it is preferred in portions, in between of about 15 minutes until the total amount is added. The product can then, preferably after adjusting the pH to 8.6 to 9.2, isolated, including the reaction mixture is freeze-dried (lyophilized), the residue is taken up in water, then dialyzed against water and the residue freeze-dried, whereby the product is obtained as a residue.

Die N-Carboxyanhydride der Aminosäuren der Formel (II) können nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Hier wird beispielsweise auf die Phosgenierung der I-Aminocyclopentancarbonsäure, I-Aminocyclohexancarbonsäure und von L-Tryptophan hingewiesen, die im einzelnen in der U. S.-Pat ent schrift 3 268 513 und in dem Abschnitt "Chemistry of Amino Acids", 1961, Band 11 von Greenstein und Winitz im Zusammenhang mit N-Carboxyaminosäureanhydride beschrieben sind.The N-carboxyanhydrides of the amino acids of the formula (II) can be prepared by methods known to those skilled in the art. Here, for example, the phosgenation of I-aminocyclopentanecarboxylic acid, I-aminocyclohexanecarboxylic acid and referenced by L-tryptophan, which is detailed in U.S. Patent 3,268,513 and in the section "Chemistry of Amino Acids ", 1961, Volume 11 by Greenstein and Winitz in connection with N-carboxyamino acid anhydrides are.

Die neuen Verbindungen, die nach der Erfindung hergestellt werden können, weisen Blutzucker-senkende Wirksamkeit auf und können in einer Vielzahl von Inoizierungsdosierungsformen verabfolgt werden. Wie bei Insulin bestimmt die Verabfolgungsweise die Dauer und Schnelligkeit der Wirkung. -The new compounds which can be prepared according to the invention have blood sugar-lowering effectiveness and can be administered in a variety of dosage dosage forms. As with insulin, the method of administration determines the duration and speed of the effect. -

Die Erfindung schafft daher ebenso eine pharmazeutische Zubereitung, die zur Injizierung geeignet ist_s wobei dias©The invention therefore also provides a pharmaceutical preparation which is suitable for injection _s where dias ©

9Q9837/158?9Q9837 / 158?

eine Verbindung der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Träger enthält. Die Injektionen können aseptisch subkutan verabfolgt werden, obgleich intravenöse oder intramuskuläre Injektionen zur Sicherstellung einer schnellen Einwirkung verwendet werden können. Eine geeignete Stelle zur subkutanen Verabfolgung ist der Oberschenkel· a compound of the invention and a pharmaceutically acceptable liquid carrier. The injections can Aseptically administered subcutaneously, although intravenous or intramuscular injections for safety can be used with a rapid action. A suitable site for subcutaneous administration is the thigh

Die erforderliche tägliche Dosis ändert sich mit der jeweiligen verwendeten Zubereitung, der Schwere der vorhandenen Symptome, und mit dem Patienten, (wobei dieser sowohl ein Tier wie ein wertvolles Haustier, oder ein Versuchstier wie eine Maus, Ratte oder ein Affe sein kann) der behandelt werden soll. Die Dosierung ändert sich ebenso mit der Größe des Patienten. Die Dosierung wird auf Einheitsbasis in der gleichen Weise wie die Dosierung von kristallinem Zinkinsulin errechnet. B-ei einem Sauger von ungefähr 70 kg Körpergewicht liegt beispielsweise die gewöhnlich wirksame Dosis im Bereich von 1 bis 200 Einheiten pro Tag. "Einheiten" sind U.S.P.-Insulineinheiten. Natürlich ist es, wie im Falle von Insulin, notwendig, fiir jeden Patienten durch individuelle Untersuchung die wirksamste Zeit, Anzahl, und Menge der einzelnen täglichen Dosen zu bestimmen. Wie bei Insulin bilden Blutzucker-und Urinzuckeruntersuchungen die Grundlage für die Therapie mit den Zubereitungen der Erfindung, wobei das therapeutische Ziel sein wird, den Blutzuckerstand auf normal zu senken und ihn dabei zu halten.The daily dose required will vary with each individual preparation used, the severity of the symptoms present, and with the patient, (this being both a Animal such as a valuable pet, or an experimental animal such as a mouse, rat or monkey) that is treated shall be. The dosage also changes with the size of the patient. Dosage is given on a unit basis in the the same way as the dosage of crystalline zinc insulin is calculated. B-with a teat weighing approximately 70 kg for example, the usually effective dose is in the range of 1 to 200 units per day. "Units" are U.S.P. units of insulin. Of course, as in the case of insulin, it is necessary for each patient on an individual basis Investigate the most effective time, number, and amount of each daily dose. As with insulin blood sugar and urine sugar tests form the basis for therapy with the preparations of the invention, the therapeutic goal will be to bring the blood sugar level down to normal and to keep it there.

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— ο — -- ο - -

Für Dosierungen können die Verbindungen der Erfindung in einer Vielzahl weitgehend wäßriger Dosierungsformen, die verschiedene Elektrolyte, Puffer und Stabilisatoren enthalten, dargeboten werden. So kann beispielsweise eine wäßrige Suspension der neuen Verbindungen Natriumchlorid, Natriumacetat, Methyl-para-hydroxybenzoat, Glyzerin, zweibasisches Natriumphosphat, und geringe Stabilisierungsmengen von Phenol oder meta-Oresol enthalten. Eine besonders brauchbare Einheitsdosierung enthält 20, 40 oder 80 Einheiten/ml in steriler physiologischer Kochsalzlösung.For dosages, the compounds of the invention can be used in a variety of largely aqueous dosage forms, the contain various electrolytes, buffers and stabilizers. For example, an aqueous Suspension of the new compounds sodium chloride, sodium acetate, methyl para-hydroxybenzoate, glycerine, dibasic Contains sodium phosphate, and small stabilizing amounts of phenol or meta-oresol. A particularly useful one Unit dose contains 20, 40 or 80 units / ml in sterile physiological saline solution.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:The following examples explain the invention:

Beispiel 1
i-Aminocyclopentancarbonyl-insulin example 1
i-aminocyclopentanecarbonyl insulin

Eine Lösung von Insulin wurde dadurch hergestellt, daß man 500 mg in 250 ml 0,Q5 M Phosphatpuffer (pH 8,0) bei ungefähr } 22⁰O löste. 40 mg N-Carboxy-1-aminocyclopentancarbonsäureanhydrid (NGA) wurden zugegeben. Nach vollständiger Lösung wurde das Reaktionsgemisch auf 5°0 abgeschreckt und zusätzliche 40 mg NOA zugegeben. Das Gemisch wurde dann weitere 2 Stunden gerührt, Gefrier-getroeknet, der Rückstand in 50 ml Wasser wieder suspendiert und dann gegenüber einem drei 4-Liter Wasservolumen dialysiert. Das verbleibende Material wurde Gefrier-getrocknet (lyophilisiert) unter Bildung von 520 mg Produkt als Rückstand.A solution of insulin was prepared by mixing 500 mg in 250 ml 0, Q5 M phosphate buffer dissolved (pH 8.0) at about 22 ⁰ O}. 40 mg of N-carboxy-1-aminocyclopentanecarboxylic acid anhydride (NGA) was added. When the solution was complete, the reaction mixture was quenched to 5 ° and an additional 40 mg of NOA was added. The mixture was then stirred for a further 2 hours, freeze-dried, the residue resuspended in 50 ml of water and then dialyzed against a three 4 liter volume of water. The remaining material was freeze-dried (lyophilized) to give 520 mg of product as a residue.

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-9--9-

Beispiel 2
i-Aminocyclofiexancarbonyl-insulin Example 2
i-aminocyclofiexancarbonyl-insulin

Eine Lösung von Insulin wurde dadurch hergestellt, daß man 1,0 g mit 500 ml 0,05 M K₂HPO^-PUf f er mischte, den pH auf 9,5 einstellte bis die völlige Lösung erreicht war, und schließlich den pH wieder auf 8,0 einstellte. Bei Zimmertem peratur wurden dann 40 mg N-Carbqxy-i-aminocyclohexancarbon säureanhydrid (NOA) zu einem 250 ml Anteil der Lösung zügegeben. Nach Lösung des NGA wurden weitere 40 mg NCA zugegeben. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei 5°C gerührt und lyophilisiert. Es wurde in 50 ml Wasser neu gebildet, gegen ein drei 4-Liter Wasservolumen dialysiert, und das Zurückbleibende Gefrier-getrocknet, wodurch man das Produkt als Rückstand erhielt.A solution of insulin was prepared by mixing 1.0 g with 500 ml of 0.05 MK ₂ HPO ^ -PUf f, adjusting the pH to 9.5 until complete dissolution was achieved, and finally the pH again 8.0 set. At room temperature, 40 mg of N-carbqxy-i-aminocyclohexanecarboxylic acid anhydride (NOA) were then added to a 250 ml portion of the solution. After the NGA had dissolved, a further 40 mg of NCA were added. The mixture was then stirred at 5 ° C. for 2 hours and lyophilized. It was reformed in 50 ml of water, dialyzed against a three 4 liter volume of water, and the residue freeze-dried to give the product as a residue.

Beispiel $
L-Tryptophyl-insulin Example $
L-tryptophyl insulin

Eine Insulinlösuiig wurde dadurch hergestellt, daß man 100 mg in 50 ml M/16 NaHCO^ löste, wobei der pH auf 9/5 und später wieder auf zwischen 7iO und 7»5 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde auf O⁰G gekühlt und 6 mg N-Carboxy-L-tryptophananhydrid (NGA) gelöst in 0,5 ml Dioxan wurden zugegeben. Nach 15 Minuten wurden weitere 6 mg NCA in 0,5 ml Dioxan zugegeben. Das Gemisch wurde dann gründlich gegenüber Wasser dialysiert, dann lyophilisiert. Das zurückbleibende Material wurde Gefrier-getrocknet und das Produkt (der Rückstand) wog 98 mg. 909837/1587An insulin solution was prepared by dissolving 100 mg in 50 ml M / 16 NaHCO ^, the pH being adjusted to 9/5 and later again to between 70 and 7.5. The mixture was ^{cooled to 0 0} G and 6 mg of N-carboxy-L-tryptophan anhydride (NGA) dissolved in 0.5 ml of dioxane were added. After 15 minutes a further 6 mg of NCA in 0.5 ml of dioxane were added. The mixture was then dialyzed thoroughly against water, then lyophilized. The remaining material was freeze-dried and the product (residue) weighed 98 mg. 909837/1587

-10--10-

Zu den vorausgehend angegebenen Bewertungen der hypoglykämisehen Verbindungen der Erfindung und zur Erläuterung ihrer wertvollen Wirksamkeit wurden in vitro und in vivo Wirkungen der Verbindungen der Erfindung wie folgt geprüft:To the hypoglycaemic reviews given above Compounds of the invention and to illustrate their valuable potency have been used in vitro and in vivo Effects of the compounds of the invention tested as follows:

Die von der Aufquellwirksamkeit der Mitochondrien abhängige Konzentration der Aminoacyl-substituierten Insuline wurde als Index ihrer Aktivität verwendet.The concentration of aminoacyl-substituted insulins, which is dependent on the swelling efficiency of the mitochondria used as an index of their activity.

Rattenleber-Mitochondrien wurden in 0,25 M üaccharoselösung, die 0,001 M Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, nach einem standardisierten Differenzialzentrifugierungsverfahren hergestellt. Die Wirkung der neuen Insuline auf das Aufquellen der Mitochondrien in 0,125 M KGl-0,02M tris-(Hydroxymethylamino)-methan-0,1# teilhydrolysierter Gelatine lösung bei pH 7*3 wurde nach den Änderungen der Lichtabsorption bei 520 mji mit einem Beckmann Modell B üpektrophotometer gemessen. Hinsichtlich der Untersuchungen wird auf Fenichel, Bechman und Album, Biochemistry, 5»" 461 (1966) Bezug genommen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengefaßt.Rat liver mitochondria were in 0.25 M sucrose solution, containing 0.001 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) by a standardized differential centrifugation procedure manufactured. The effect of the new insulins on the swelling of the mitochondria in 0.125 M KGl-0.02M tris- (hydroxymethylamino) -methane-0.1 # partially hydrolyzed gelatin solution at pH 7 * 3 was after the changes in light absorption at 520 mji with a Beckmann Model B spectrophotometer measured. For investigations, see Fenichel, Bechman and Album, Biochemistry, 5 »" 461 (1966) referenced. The results are summarized in Table I.

2J Tabelle I 2J Table I.

oo Aufquellaktivität der Mitochondrien ^ durch Aminoacyl-insuline oo swelling activity of the mitochondria ^ by aminoacyl-insulins

-> A, Konzentration, 1 χ 10"·^ Bt -> A, concentration, 1 χ 10 "· ^ Bt

^{m Λ} 0. B. Spoil, bei 520 ^{m Λ} 0. B. Spoil, at 520

10' 20^ 30?-: - gesamt 10 '20 ^ 30? -: - total

1-Äminoeyclopentan-1-Äminoeyclopentan-

carbonyl-insulin 75 150 168 393carbonyl insulin 75 150 168 393

Tabelle I (Fortsetzung)Table I (continued)

B.B. 10'10 ' 20*20 * Spon. beiSpon. at 30'30 ' Gesamttotal 1-Amino cyclohexan-
c arb onyl-insulin1-amino cyclohexane
carb onyl insulin ΔΔ 8383 150150 20'20 ' 148148 381381 L-Tryptophyl-insulinL-tryptophyl insulin 115115 170170 164164 449449 Konz entration,Concentration, 5 x 10'⁶M5 x 10 ' ⁶ sts O.D.O.D. 520 πιμ520 πιμ 10'10 ' 30·30 · Gesamttotal

1—Aminoeyelopentancarbonyl-insulin 1 — Aminoeyelopentane carbonyl insulin

1-Aminoeyelohexancarbonyl-insulin 1-Aminoeyelohexanecarbonyl-insulin

L-Tryptophyl-insulinL-tryptophyl insulin

1-Aminoeyclopentancarbonyl-insulin 1-Aminoeyclopentanecarbonyl insulin

1-Aminocyclohexanc arb onyl—insulin1-aminocyclohexanecarb onyl-insulin

L-Tryptophyl-insulinL-tryptophyl insulin

1-Aminoeyelopentancarbonyl-insulin 571-Aminoeyelopentane carbonyl insulin 57

117117

320320

5353 9999 Spon. beiSpon. at 140140 292292 MM. 8080 162162 20'20 ' 155155 397397 C. Konzentration,C. Concentration, 2.5 x 10"⁶ 2.5 x 10 " ⁶ Gesamttotal /\ O.D./ \ O.D. 520 ιπμ520 ιπμ 10'10 ' 30»30 »

3535

6464

2020th 5959 Spon· beiSpon at 107107 186186 1515th 6969 20'20 ' 8585 169169 D.D. Konz entration·Conc entration 1.25 x1.25 x 10"⁶ M10 " ⁶ M. AA. O.D.O.D. 520 ημ520 ημ 10'10 ' 30'30 ' Gesamttotal

-14-14

909837/1587 -12- 909837/1587 -12-

ORlQJNAL INSPECTEDORlQJNAL INSPECTED

Table I (continued;)

10' 20' 50' Gesamt10 '20' 50 'total

1-Aminocyclohexan-1-aminocyclohexane

carbonyl-insulin 35 15 48 98 L-Tryptophyl-insulin 4 14 6 24carbonyl insulin 35 15 48 98 L-tryptophyl insulin 4 14 6 24

Die in der Tabelle I angegebenen Zahlen zeigen, daß die gesamten Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine gute Konzentrations-abhängige Wirksamkeit aufweisen, wobei das I-Aminocyclohexancarbonylinsulin bei der geringsten Konzentration, 1,25 x 10 M, gegenüber den beiden anderen die beste hat.The numbers given in Table I show that the total Compounds of the present invention have a good concentration-dependent activity, the I-aminocyclohexanecarbonylinsulin at the lowest concentration, 1.25 x 10 sts, has the best over the other two.

Weiterhin wurden in vivo Testversuche mit den neuen Aminoacylinsulinen (nach Alburn und Fenichel, Nature 213, 515 (1967)) durchgeführt.Furthermore, in vivo tests were carried out with the new aminoacylinsulins (after Alburn and Fenichel, Nature 213, 515 (1967)).

Nach Entnahme einer Anfangsblutprobe von 0,1 ml aus den Herzen von leucht unter Äther gehaltenen männlichen "Sprague Dawley"-Ratten, die zur Blutzuckeranalyse 18 Stunden ohne Nahrung gehalten wurden, erhielten die Tiere intraperitonale Injektionen unterschiedlicher KonzentrationenAfter taking an initial blood sample of 0.1 ml from the Hearts of male "Sprague Dawley" rats kept under ether for blood sugar analysis for 18 hours were kept without food, the animals received intraperitoneal injections of various concentrations

co hinsichtlich der Einheiten/kg Körpergewicht der neuen Aminoacyl-insuline. Es wurden zusätzliche 0,1 ml Blutproben aus den Herzen dieser Tiere in regelmäßigen Zeitzwischenräumen zur Blutzuckeranalyse entnommen. Die mitiSeren Glukosewerteco in terms of the units / kg body weight of the new aminoacyl-insulins. An additional 0.1 ml blood samples were obtained from the hearts of these animals at regular intervals taken for blood sugar analysis. The mitiSer glucose levels

oo im Blut (als mg #) wurde als Ordinate gegenüber der Zeit als Abszisse in graphischen Darstellungen aufgetragen, die in den begleitenden Zeichnungen aufgezeigt sind*, worinoo in the blood (as mg #) was taken as the ordinate versus time plotted as the abscissa in the graphs shown in the accompanying drawings, where

Fig. 1 die Zahlenwerte für L-Tryptophyl-insulin, Fig. 2 für i-Aminocyclopentan-carbonyl-insulin, und Pig. 3 für i-Aminocyclohexancarbonyl-insulin angibt. Bei diesen drei Verbindungen wurde gefunden, daß sie den Blutzucker bedeutend als Ansprechen gegenüber der verabfolgten Dosis senken.1 shows the numerical values for L-tryptophyl insulin, FIG. 2 for i-aminocyclopentane-carbonyl-insulin, and Pig. 3 for i-aminocyclohexanecarbonyl-insulin. With these three Compounds have been found to significantly increase blood sugar as a response to the administered dose reduce.

Zusätzlich wurden L-Tryptophyl-insulin, 1-Aminocyclopentancarbonyl-insulin und 1-Aminocyclohexancarbonyl-insulin eingehend durch Immunversuche, Katten-Diaphragma- und Fettgewebeuntersuchungen geprüft. Es wurde gefunden, daß diese Insuline weniger antigen sind bei Immunversuchen als reines üchweineinsulin und daß sie wirksamer sind bei Ratten-Diaphragmen- und Fettgewebeuntersuchungen.In addition, L-tryptophyl-insulin, 1-aminocyclopentanecarbonyl-insulin and 1-aminocyclohexanecarbonyl insulin extensively through immune tests, cat diaphragm and adipose tissue examinations checked. It has been found that these insulins are less antigenic than pure insulins in immune tests ochweine insulin and that they are more effective in rat diaphragm and adipose tissue examinations.

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Claims

Patent claims:

1. Process for the preparation of new aminoacyl-substituted Insulins, characterized in that insulin is mixed with a suitable acylating agent containing aminoacyl groups acylated to the insulin with a group of the formula:

Dh-Dh-

^: CH- ^: CH-

otter

CH.CH.

CH
I.

OO uu CC.

to connect in a manner known per se, the connection preferably being effected using an N-Gärberöxyänhydride the general formula:

■λ■ λ

where the radicals R and R zuseäaöen ** öHp (GH ^ / gGHw- or -GH ₂ (GH ₂ ) 5GH ₂ - or R is hydrogen and R is an _{I-indolyl · »et ^ est. 90gS37 / 1587}

-15-

2. i-aminocyclopentanecartoonyl insulin.

3. 1-aminocyclohexanecarbonyl insulin.

4. L-tryptophyl insulin.

5. Medicines, especially those that affect blood sugar levels Properties characterized in that it is a reaction product according to the process of claim 1 contains.

6. Medicines, especially those that affect blood sugar levels Properties characterized in that it contains a compound according to one of Claims 2 to 4.

909837/1587

WSPECTED