DE1138509B

DE1138509B - Process for the manufacture of foot and mouth disease concentrate vaccines

Info

Publication number: DE1138509B
Application number: DEB55507A
Authority: DE
Inventors: Dr Max Schoenenberger; Dr Bernhard Schneider
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1959-11-12
Filing date: 1959-11-12
Publication date: 1962-10-25
Also published as: BE597049A; LU39322A1

Description

Verfahren zur Herstellung von Maul- und Klauenseuche-Konzentratvaccinen Es sind bereits Verfahren bekannt, die es ermöglichen, eine Maul- und Klauenseuche-Virussuspension von bakteriellen Verunreinigungen zu befreien, z. B. durch Sterilfiltration mit Asbestfilter, und zu einer Vaccine für die aktive Immunisierung gegen MKS zu verarbeiten. Diese Verfahren haben den Nachteil, daß bei der Filtration, insbesondere wenn der Rohvirusanteil (Rinderzungenaphthendecken und Lymphe) mehr als 18 0/, beträgt, wie es bei der Herstellung der trivalenten Konzentratvaccine der Fall ist, ein erheblicher Virusverlust auftritt und die Filterporen schnell verstopfen. Process for the manufacture of foot and mouth disease concentrate vaccines Methods are already known which enable a foot and mouth disease virus suspension to rid of bacterial contamination, e.g. B. by sterile filtration with Asbestos filters, and to be processed into a vaccine for active immunization against FMD. These methods have the disadvantage that during the filtration, especially when the The proportion of raw virus (beef tongue naphtha and lymph) is more than 18%, as it is the case with the manufacture of the trivalent concentrate vaccine, a considerable amount Virus loss occurs and quickly clogs the filter pores.

Man ist deshalb dazu übergegangen, für die bakterielle Entkeimung Stoffe mit bakterizider Wirkung zu benutzen, z. B. Phenol,Toluol (A. Zink, Schweiz. Z. Path.That is why we switched to bacterial disinfection To use substances with a bactericidal effect, e.g. B. phenol, toluene (A. Zink, Switzerland. Z. Path.

Bakt., 10,S. 169, 1947), Anisol(G.Vianello, La Clinica Veterinaria, 19, S. 3, 1941) und Chloroform (G. Pyl und H. Möhlmann, Arch. Exp. Vet. Med., 8, S. 442, 1954). Von den genannten Mitteln hat sich zur bakteriellen Entkeimung für die technische Herstellung einer MKS-Vaccine nur Chloroform durchgesetzt.Bakt., 10, p. 169, 1947), anisole (G.Vianello, La Clinica Veterinaria, 19, p. 3, 1941) and chloroform (G. Pyl and H. Möhlmann, Arch. Exp. Vet. Med., 8, P. 442, 1954). One of the means mentioned has been used for bacterial disinfection the technical production of an FMD vaccine only enforced chloroform.

Es sind aber erhebliche technische Einrichtungen erforderlich, um das Chloroform wieder abzutrennen und das bei der Impfstoffherstellung anwesende Personal vor den Chloroformdämpfen zu schützen.However, considerable technical facilities are required to to separate the chloroform again and that which is present in the production of the vaccine Protect personnel from chloroform vapors.

Cartwright und Thorne (J. Gen. Microbiology, 20, S. 61ff. [1959]) haben beobachtet, daß man Natriumdodecylsulfat vorteilhaft bei der Extraktion von MKS-Virus aus infizierten Zellen, bei der Elution des Virus aus Adsorbentien und zur Ausbeutesteigerung bei der Filtration und Ultrazentrifugierung von Virussuspensionen verwenden kann. Es stellte sich hierbei heraus, daß das MKS-Virus von dem genannten Netzmittel weder inaktiviert (a. a. O., S. 63) noch in seiner Antigenspecifität beeinflußt wird (a. a. O., S. 64) und vorwiegend auf Grund einer zellzerstörenden Wirkung (a. a. O., S. 67) ,die allerdings eine nachträgliche Entfernung für Arbeiten mit Zellkulturen, z. B. bei der Virusaussaat, verlangte (a. a. O., S. 72 unten), höhere Ausbeuten zu liefern vermag (a. a. O., S. 67). Die erwähnte zellzerstörende Wirkung von Natriumdodecylsulfat erfordere das Einhalten einer möglichst niedrigen Konzentration in den Inocula. Wenn Virus zur Vaccineherstellung dienen solle, könnten die obigen Verfahren zur Vermeidung von Verlusten bei der Aufarbeitung wertvoll sein (a. a. O., S. 75). Cartwright and Thorne (J. Gen. Microbiology, 20, pp. 61ff. [1959]) have observed that sodium dodecyl sulfate is advantageous in the extraction of FMD virus from infected cells, in the elution of the virus from adsorbents and to increase the yield in the filtration and ultracentrifugation of virus suspensions can use. It turned out that the foot-and-mouth disease virus from the named Wetting agent neither inactivated (ibid., P. 63) nor in its antigen specificity is influenced (op. cit., p. 64) and mainly due to a cell-destroying Effect (op. Cit., P. 67), which, however, requires subsequent removal for work with cell cultures, e.g. B. in virus sowing, requested (loc. Cit., P. 72 below), able to deliver higher yields (loc. cit., p. 67). The cell-destroying one mentioned The effect of sodium dodecyl sulfate must be kept as low as possible Concentration in the inocula. If virus were to be used to manufacture vaccines, they could the above methods are valuable in avoiding waste in the work-up his (op. cit., p. 75).

Einer Zugabe des Netzmittels zur Vaccine selbst bzw. sein Belassen in der als Vaccine dienenden Virussuspension wäre demnach auf Grund obiger Arbeiten wegen des beobachteten zellfeindlichen Verhaltens von Natriumdodecylsulfat zu entraten gewesen. Adding or leaving the wetting agent to the vaccine itself in the virus suspension serving as vaccine would therefore be based on the above work because of the observed anti-cell behavior of sodium dodecyl sulfate been.

Es wurde nun gefunden, daß man entgegen diesem Vorurteil eine MKS-Konzentratvaccine gewinnen kann, indem man bei der Aufarbeitung des MKS-Virus-haltigen Materials, z. B. bei dessen Extraktion, Filtration, Elution, Ultrazentrifugierung und/oder zur bakteriziden Behandlung, ein Fettalkoholsulfat, vorzugsweise Natriumdodecylsulfat, in der Konzentration von 0,5 bis 201o mitverwendet und das genannte bakterizide Netzmittel bei der Herstellung der Konzentratvaccine mittels üblicher Inaktivierungsverfahren, z. B. Behandlung mit konzentrierter wäßriger Formaldehydlösung unter Erwärmen, in der Virussuspension beläßt. It has now been found that, contrary to this prejudice, an FMD concentrate vaccine can be used to win can, by working up the FMD virus-containing material, for. B. during its extraction, filtration, elution, ultracentrifugation and / or for bactericidal treatment, a fatty alcohol sulfate, preferably sodium dodecyl sulfate, used in a concentration of 0.5 to 20 ° and the said bactericidal Wetting agents in the manufacture of the concentrate vaccine using the usual inactivation processes, z. B. Treatment with concentrated aqueous formaldehyde solution with heating, in the virus suspension leaves.

Es wurde nämlich weiter gefunden, daß die so erhaltene Konzentratvaccine gegenüber einer Infektion mit MKS-Virus für Rinder und auch in signifikanter Weise für Meerschweinchen bei gleichem Antigengehalt einen überraschend hohen Immunisierungseffekt im Vergleich zu einer entsprechend aufgebauten und gleichartig hergestellten Konzentratvaccine, in der zwecks Sterilisierung an Stelle eines Fettalkoholsulfats 1 0/o Chloroform zugesetzt wurde, aufweist und im behandelten Tier keinerlei Zellschädigung am Impfort oder an anderen Stellen verursacht, wie aus histologischen Untersuchungen erhellt. Namely, it was further found that the concentrate vaccine thus obtained to cattle FMD virus infection and also significantly a surprisingly high immunization effect for guinea pigs with the same antigen content in comparison to a correspondingly structured and similarly manufactured concentrate vaccine, in the for the purpose of sterilization 1 0 / o chloroform instead of a fatty alcohol sulfate was added, and in the treated animal no cell damage at the vaccination site or caused elsewhere, as shown by histological examinations.

Man verfährt dabei zweckmäßig in der Weise, daß man das virushaltige Gewebe, z. B. Zungenaphthendecken, in einer Apparatur weitestgehend zerkleinert und mit etwa der 4- bis Sfachen Menge einer gepufferten Lösung, die 0,5 bis 2,0°/o eines Fettalkoholsulfats enthält, extrahiert. Der Extrakt wird durch Zentrifugieren vom Rückstand getrennt. Er ist leicht trübe und wird nochmals mit einer geringen Menge Fettalkoholsulfat versetzt. Hierbei genügt im allgemeinen 0,25 bis 1,00/,. Die Zugabe der erforderlichen Menge Fettalkoholsulfat kann auch auf einmal erfolgen. Nach einer Einwirkungszeit von 24 bis 48 Stunden wird nochmals zentrifugiert, wobei nur noch ein geringer Bodensatz entsteht. Den nunmehr erhaltenen netzmittel- und virushaltigen Überstand adsorbiert man bei p-Werten zwischen 7,5 und 8,5 an etwa die gleiche Menge einer sterilisierten Aluminiumhydroxydsuspension. Nach Inaktivierung dieses Gemisches durch Einwirkung von konzentrierter wäßriger Formaldehydlösung unter Erwärmung erhält man einen Impfstoff, der in Dosen von 5 ml pro Rind wirksam ist. It is expedient to proceed in such a way that the virus-containing Tissue, e.g. B. tongue naphtha blankets, largely crushed in an apparatus and with about 4 to 5 times the amount of a buffered solution, the 0.5 to 2.0% of a Contains fatty alcohol sulfate, extracted. The extract is extracted by centrifugation Residue separated. It is slightly cloudy and becomes again with a small amount Fatty alcohol sulfate added. In general, 0.25 to 1.00 /, is sufficient. The addition the required amount of fatty alcohol sulfate can also be done all at once. After a Exposure time of 24 to 48 hours is centrifuged again, with only a small sediment arises. The wetting agent and virus containing At p-values between 7.5 and 8.5, the supernatant is adsorbed on approximately the same amount a sterilized aluminum hydroxide suspension. After inactivation of this mixture obtained by the action of concentrated aqueous formaldehyde solution with heating a vaccine that is effective in doses of 5 ml per beef.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Fettalkoholsulfate in fester Form zuzugeben, so daß keine Verdünnung der Virussuspension eintritt. Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Fettalkoholsulfate liegen darin, daß sie keine Änderung des pH-Wertes der Suspension bewirken, und daß man an keinen bestimmten pR-Wert gebunden ist. Sie sind leicht löslich und genau dosierbar. It has proven to be useful to solidify the fatty alcohol sulfates Add form so that there is no dilution of the virus suspension. Other advantages of the fatty alcohol sulfates according to the invention are that they do not change the Cause pH value of the suspension, and that you are not bound to a specific pR value is. They are easily soluble and can be precisely dosed.

Beispiel 1 30 g in bekannter Weise gewonnene Zungenaphthendecken vom Typ 0 werden im Mörser feinst zerkleinert, in 470 ml gepufferter physiologischer Kochsalzlösung vom p-Wert 7,6 aufgenommen und 30 Minuten geschüttelt. Ncah lOminutigem Zentrifugieren des Gemisches bei 2000 g versetzt man den erhaltenen Überstand mit 2,5 g Natriumdodecylsulfat. Anschließend wird die Suspension wiederum 1 Stunde geschüttelt und danach etwa zwölf Stunden bei +4 bis +7°C gehalten. Nach nochmaligem Zentrifugieren mischt man den erhaltenen Überstand in einer Menge von 480 ml mit 500 ml einer 2 obigen Aluminiumhydroxydsuspension, der zuvor 10 ml Glykokollpuffer von einem p:E-Wert von 9,0 zugegeben wurde. Zur Inaktivierung des MKS-Virus verbleibt das Gemisch nach Zugabe von 10 mol wäßriger Formaldehydlösung, die 6°/o der käuflichen 37 0/0eigen wäßrigen Formaldehydlösung, also 2,2 °/0 Formaldehyd enthält, über 30 Stunden bei 25OC. Example 1 30 g of tongue naphtha ceilings obtained in a known manner Type 0 are finely ground in a mortar, in 470 ml buffered physiological Saline solution with a p-value of 7.6 was taken up and shaken for 30 minutes. After ten minutes Centrifugation of the mixture at 2000 g, the supernatant obtained is mixed with it 2.5 g sodium dodecyl sulfate. The suspension is then shaken again for 1 hour and then held for about twelve hours at +4 to + 7 ° C. After another centrifugation the supernatant obtained is mixed in an amount of 480 ml with 500 ml of a 2nd above aluminum hydroxide suspension, previously 10 ml of glycocolla buffer of a p: E value of 9.0 was added. The mixture remains to inactivate the FMD virus Addition of 10 mol of aqueous formaldehyde solution, 6% of the commercially available 37% aqueous formaldehyde solution, i.e. 2.2% formaldehyde, over 30 hours 25OC.

Die so erhaltene Konzentratvaccine schützt Rinder in einer Dosis von 5 ml vom 17. Tag nach der Impfung an gegen eine künstlich gesetzte Infektion mit dem Typ 0 des MKS-Virus. The concentrate vaccine thus obtained protects cattle in one dose of 5 ml from the 17th day after vaccination against an artificially created infection with type 0 of the FMD virus.

Beispiel 2 Je 30 g Zungenaphthendecken der Typen O, A und C werden zusammen in einem Mörser angerieben und nach Aufnahme in 940 ml gepufferter physiologischer Kochsalzlösung vom pn-Wert 7,6 30 Minuten geschüttelt. Example 2 30 g each of tongue naphtha blankets of types O, A and C are used rubbed together in a mortar and after absorption in 940 ml of buffered physiological Saline solution with a pn value of 7.6 shaken for 30 minutes.

Nach lOminutigem Zentrifugieren bei 2000 g wird die eine Hälfte des Überstandes, nämlich 480 ml, mit 2,5 g Natriumdodecylsulfat versetzt, 1 Stunde geschüttelt und danach etwa 12 Stunden bei +4 bis +7 ~ C aufbewahrt. Nachdem der Überstand wiederum zentrifugiert worden ist, mischt man den Abguß mit 500 ml einer 2 0/0eigen Aluminiumhydroxydsuspension, der zuvor 10 ml Glykokollpuffer von einem pH-Wert von 9,0 zugegeben worden ist. Das Gemisch verbleibt nach Zusatz von 10 mol wäßriger Formaldehydlösung, die 601o einer 37 0/0eigen wäßrigen Formaldehydlösung enthält, über 30 Stunden bei 25"C. After centrifuging at 2000 g for 10 minutes, one half of the Supernatant, namely 480 ml, mixed with 2.5 g of sodium dodecyl sulfate, shaken for 1 hour and then stored at +4 to +7 ~ C for about 12 hours. After the supernatant turn has been centrifuged, the cast is mixed with 500 ml of a 2 0/0 strength aluminum hydroxide suspension, which has previously been added to 10 ml glycocolla buffer at pH 9.0. The mixture remains after the addition of 10 mol of aqueous formaldehyde solution, the 601o a 37% strength aqueous formaldehyde solution for 30 hours at 25 ° C.

Die so erhaltene Konzentratvaccine schützt Rinder in einer Dosis von 5 ml vom 17. Tag nach der Impfung an gegenüber der künstlich gesetzten Infektion nach der Wollappeninethode (O. Waldmann, G. Pyl, K. O. Hobohm und H. Möhlmann, Z. Bakt., 148, S. 1, 1941) mit dem Typ 0, während ein aus der anderen Hälfte des oben beschriebenen, nach dem Zentrifugieren der Zellsuspension erhaltenen Überstandes mit Chloroform, aber sonst nach derselben Methode hergestellter und geprüfter Impfstoff alle Rinder unter Generalisationserscheinungen an MKS erkranken läßt. The concentrate vaccine thus obtained protects cattle in one dose of 5 ml from the 17th day after vaccination against the artificially placed infection according to the Wollappenin method (O. Waldmann, G. Pyl, K. O. Hobohm and H. Möhlmann, Z. Bakt., 148, p. 1, 1941) with type 0, while one from the other half of the above described supernatant obtained after centrifuging the cell suspension with chloroform, but otherwise manufactured and tested using the same method causes all cattle to develop FMD with symptoms of generalization.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the production of foot and mouth disease concentrate vaccines, marked by the fact that when working up the foot and mouth disease virus containing material, e.g. B. during its extraction. Filtration, elution, ultracentrifugation and / or for its bactericidal treatment, in a manner known per se Fatty alcohol sulfate, preferably sodium dodecyl sulfate, is also used and that the Fatty alcohol sulfate in the manufacture of the concentrate vaccine using the usual inactivation process, z. B. by treatment with concentrated aqueous formaldehyde solution with heating, left in the virus suspension.