DE112021008078T5

DE112021008078T5 - Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz

Info

Publication number: DE112021008078T5
Application number: DE112021008078.4T
Authority: DE
Inventors: Yuguo Tang; Zhenqiao Zhou; Min Li; Jing LYU; Yan Wang; Qinying LIU; Yueyan Chen; Hongbo Jia
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2024-05-29
Also published as: CN113655026B; CN113655026A; WO2023010718A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart ein ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz, umfassend eine Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe, eine Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe, eine Abtasteinheit-Kopplungsgruppe, ein Bündelungs- und Spleißmodul, ein ellipsoidisches Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld, einen dichroitischen Farbfilm und ein Photomultiplier-Detektionsarray; die vorliegende Erfindung realisiert ein großes Sichtfeld mit elliptisch gekrümmter Oberfläche mittels einem reflektierenden Objektiv, das in der Lage ist, ein planares rechteckiges Laser-Abtastfeld in ein elliptisches halbkugelförmiges Laser-Abtastfeld umzuwandeln; dabei werden paralleles Abtasten mit mehreren Pfaden von Laserlicht und parallele Detektionen von mehreren Fluoreszenzstrahlen verwendet, um Abtasten hohen Durchsatzes zu erzielen; die nicht aneinander angrenzenden Bereiche werden nach dem Prinzip des Vierfarbsystems in eine Gruppe unterteilt, und unter Verwendung der Lücke der Bereiche und der kombinierten Halbwellenplatte wird die Energieeffizienz der mehrfachen Polarisationsbündelung maximiert; darüber hinaus wird die Verzögerung zwischen die verschiedenen Gruppen von Laserlicht eingeführt, und die Quellenbereiche der Fluoreszenzsignale können in Zeit und Raum durch die Lösung, dass die an demselben Zeitpunkt befindlichen Bereiche des Abtastbereichs nicht aneinander angrenzen und die aneinander angrenzenden Bereiche nicht an demselben Zeitpunkt liegen, effektiv unterschieden werden, wodurch das durch die Fluoreszenzstreuung verursachte Signalübersprechen stark vermieden wird.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der mikroskopischen Abbildungsinstrumente, insbesondere ein ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz.
STAND DER TECHNIK
Das Zwei-Photonen-Mikroskop wird aufgrund ihrer großen biologischen Gewebeabbildungstiefe und hohen räumlichen Auflösung derzeit sehr gut für die Abbildung der funktionellen Struktur neuronaler Gewebe in der Großhirnrinde von Tieren verwendet und fördert die Entwicklung der Neurowissenschaften (Gehirnforschung).
Die Wissenschaftler wollen die funktionellen Signale von mehr Neuronen in einem größeren Umfang gleichzeitig beobachten und aufzeichnen, was neue Anforderungen an die Zwei-Photonen-Bildgebungstechnologie stellt. Erstens muss die Auflösung der Neuronen erreicht werden, was eine optische Auflösung von 1-2 µm erfordert, was einer numerischen Apertur von 0,3-0,5 entspricht; Erstens muss die Auflösung der Neuronen erreicht werden, was eine optische Auflösung von 1 bis 2 Mikrometern erfordert, was einer numerischen Apertur von 0,3 bis 0,5 entspricht; zweitens muss die Bildauffrischungsgeschwindigkeit mindestens 5 Bilder pro Sekunde betragen, um die neuronalen Kalzium-Funktionssignale effektiv zu erfassen; unter der Voraussetzung, dass die räumliche und zeitliche Auflösung erfüllt ist, wird ein größeres Sichtfeld des Bildes abgebildet, was dazu führt, dass eine größere Anzahl von Neuronen auf einmal erfasst wird.
Gegenwärtig beträgt der maximale Sichtfelddurchmesser der Zwei-Photonen-Bildgebung etwa 5 mm, aber die Bildgebungsgeschwindigkeit des gesamten Sichtfeldes liegt unter 1 Bild pro Sekunde, was die Anforderungen der funktionellen Signalerkennung nicht erfüllt. Unter den Bedingungen der Echtzeit-Bildgebung und der Einzelzellauflösung beträgt die Fläche des Sichtfeldes der Zwei-Photonen-Bildgebung nur 1mm×1mm, was bei Mäusen nur einen einzigen funktionellen Gehirnbereich abdeckt. Die gesamte Großhirnrinde von Mäusen ist etwa 200 mm2 groß, und die Großhirnoberfläche ist uneben und ähnelt einer ellipsoidischen Halbkugel, was eine große Herausforderung für die optische Mikrobildgebung darstellt.
Bei der dynamischen Bildgebung großen Sichtfeldes mit Einzelneuronen-Auflösung in der tierischen In-vivo-Großhirnrinde müssen zwei Probleme gelöst werden: erstens muss, wenn eine große Bildgebungsfläche erreicht wird, das Sichtfeld gekrümmt sein, um der Krümmung der Großhirnrinde zu entsprechen, was einen großen Unterschied im Konzept des Sichtfeld-Designs zu dem herkömmlichen Flachfeld-Objektiv darstellt; und zweitens erfordert das hochauflösende Bild großen Sichtfeldes eine extrem große Anzahl von Pixeln bei gleichzeitiger Sicherstellung der zeitlichen Auflösung, so dass der erforderliche Bildgebungs-Datendurchsatz enorm ist, aufgrund dessen muss der Durchsatz bei dem Laserscanning und der Fluoreszenzdetektion um eine Größenordnung erhöht werden.
Paralleles Abtasten und Detektieren werden üblicherweise eingesetzt, um den Durchsatz bei dem Laserscanning und der Fluoreszenzdetektion zu erhöhen. Der Bildgebungsdurchsatz kann erheblich erhöht werden, indem das große Sichtfeld in mehrere Regionen unterteilt wird, die unabhängig voneinander mit mehreren Laserfokus gescannt werden, und die Fluoreszenzsignale in jeder Region mit einer Kombination aus Mehrkanaldetektoren oder Oberflächenarraydetektoren detektiert werden. Die derzeitige Lösung des parallelen Abtastens weist jedoch einen großen Verlust an Laserenergie auf, wenn das Sichtfeld mit mehreren Strahlen zusammengefügt wird, und die Laserenergie wird jedes Mal um die Hälfte reduziert, wenn sie das depolarisierende bündelnde Prisma passiert; außerdem gibt es ein Übersprechen der Signale, das durch die Fluoreszenzstreuung bei der parallelen Detektion mit mehreren Kanälen verursacht wird, insbesondere ist die Fluoreszenzstreuungsfläche groß und die Fluoreszenz fällt auf mehrere benachbarte Flächen gleichzeitig, was zu einem Übersprechen der Signale zwischen den Kanälen führt.
Daher besteht ein Bedarf an einer zuverlässigeren Lösung.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Es ist ein zu lösendes technisches Problem der vorliegenden Erfindung, hinsichtlich der Mängel aus dem Stand der Technik ein ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz zur Verfügung zu stellen.
Um die obigen technischen Probleme zu lösen, verwendet die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung: ein ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz, umfassend eine Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe, eine Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe, eine Abtasteinheit-Kopplungsgruppe, ein Bündelungs- und Spleißmodul, ein ellipsoidisches Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld, einen dichroitischen Farbfilm und ein Photomultiplier-Detektionsarray;
wobei das von der Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe emittierte Laserlicht nacheinander die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe, die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe und das Bündelungs- und Spleißmodul passiert und dann durch den dichroitischen Farbfilm hindurchgeht, und wobei das Laserlicht danach durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld auf die Probe gestrahlt wird, und wobei die durch Anregung der Probe erzeugte Fluoreszenz durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld gesammelt und danach durch den dichroitischen Farbfilm an das Photomultiplier-Detektionsarray reflektiert wird;
und wobei das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld einen entlang dem optischen Pfad nacheinander angeordneten Primärspiegel, Sekundärspiegel und Tertiärspiegel umfasst, und wobei die optische Fläche des Primärspiegels eine hyperbolische Fläche, die optische Fläche des Sekundärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche und die optische Fläche des Tertiärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche ist,
und wobei das ins ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld eintretende Laserlicht, nachdem es durch den Primärspiegel, den Sekundärspiegel und den Tertiärspiegel nacheinander reflektiert wurde, auf die Probe gestrahlt wird;
und wobei die Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser umfasst;
und wobei die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe vier Strahlteilung/Verzögerungsmodule umfasst, und wobei ein Strahlteilung/Verzögerungsmodul einen optischen Pfad zur Verzögerung und einen optischen Pfad zur Strahlteilung umfasst;
und wobei die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe vier Abtasteinheiten umfasst, und wobei jede Abtasteinheit vier unabhängige Abtastmodule umfasst, und wobei jedes Abtastmodul unabhängig eine 2D-Abtastung eines rechteckigen Teilabtastbereichs durchführt;
und wobei jeder Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser einem Strahlteilung/Verzögerungsmodul entspricht, und wobei jedes Strahlteilung/Verzögerungsmodul einer Abtasteinheit entspricht;
und wobei das von den vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslasern emittierte Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Verzögerung vier Pfade von verzögertem Laserlicht mit einem Zeitintervall von T/4 bildet, und wobei jeder Pfad von verzögertem Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Strahlteilung gleichmäßig in vier Pfade von Teillaserlicht unterteilt ist, und wobei die von demselben Pfad von verzögertem Laserlicht kommenden vier Pfade von Teillaserlicht in dieselbe Abtasteinheit eintreten, und wobei jeder Pfad von Teillaserlicht einem Abtastmodul entspricht, um die Abtastung von einem Teilabtastbereich zu realisieren, so dass die Abtastung von 16 Teilabtastbereichen realisiert wird, indem 16 Pfade von Teillaserlicht in einer Eins-zu-Eins-Entsprechung mit den 16 Abtastmodulen stehen; und wobei T eine Impulsperiode des von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierten Laserlichts ist, in einem weiter bevorzugten Ausführungsbeispiel ist T = 12,5 ns, dann beträgt die Verzögerung zwischen zwei zeitlich benachbarten Gruppen 3,125 ns; und wobei sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten jedes Abtastmoduls in derselben Abtasteinheit erhalten werden, sich am selben Zeitpunkt befinden, während sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten der Abtastmodule in verschiedenen Abtasteinheiten erhalten werden, an verschiedenen Zeitpunkten befinden;
und wobei das Bündelungs- und Spleißmodul dazu verwendet, Bündeln und Spleißen von den 16 Pfaden von Teillaserlicht, die von 16 Abtastmodulen emittiert werden, zu realisieren, und wobei durch Bündeln und Spleißen von 16 Teilabtastbereichen ein rechteckiges Abtastfeld in einem 4×4-Array gebildet wird, und wobei die Grenzen der 4 Teilabtastbereiche, die sich am selben Zeitpunkt befinden, nicht aneinander angrenzen und alle 4 Bereiche, deren Grenzen aneinander angrenzen, sich an verschiedenen Zeitpunkten befinden.
Bevorzugt ist die optische Fläche des Primärspiegels eine hyperbolische Fläche achter Ordnung, die optische Fläche des Sekundärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche zweiter Ordnung und die optische Fläche des Tertiärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche sechster Ordnung.
Weiter bevorzugt liegt die numerische Apertur des ellipsoidischen Reflexionsobjektivs mit großem Sichtfeld in einem Bereich von 0,3-0,5. Das abbildende Sichtfeld des reflektierenden Objektivs ist ellipsoidisch, wobei der Krümmungsradius der langen Achse 9-12 mm, der Krümmungsradius der kurzen Achse 6-9 mm und die planare Projektionsgröße des Sichtfeldes 6 mm × 6 mm beträgt.
Bevorzugt umfasst der optischen Pfad zur Verzögerung einen ersten Reflektor und einen zweiten Reflektor, wobei das von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierte Laserlicht nacheinander den ersten Reflektor und den zweiten Reflektor passiert, um verzögertes Laserlicht auszugeben, und wobei durch Einstellen des Abstandes zwischen dem ersten Reflektor und dem zweiten Reflektor das ausgegebene verzögerte Laserlicht unterschiedliche Verzögerungsbeträge erzeugt;
und wobei der optische Pfad zur Strahlteilung ein erstes strahlteilendes Element, ein zweites strahlteilendes Element und ein drittes strahlteilendes Element umfasst, und wobei das von dem zweiten Reflektor ausgegebene verzögerte Laserlicht nach Eintreten ins erste strahlteilende Element gleichmäßig in zwei Pfade geteilt wird, und wobei ein Pfad durch das erste strahlteilende Element hindurchgeht, dann das zweite strahlteilende Element erreicht und von dem zweiten strahlteilenden Element in zwei Pfade geteilt wird, während der andere Pfad von dem ersten strahlteilenden Element reflektiert wird, dann das dritte strahlteilende Element erreicht und von dem dritten strahlteilenden Element in zwei Pfade geteilt wird, wodurch das verzögerte Laserlicht gleichmäßig in vier Pfade geteilt wird.
Bevorzugt sind das erste strahlteilende Element, das zweite strahlteilende Element und das dritte strahlteilende Element jeweils ein depolarisierendes strahlteilendes Prisma oder ein 50/50-Strahlenteiler.
Bevorzugt umfasst das Abtastmodul einen resonanten Abtastspiegel mit schneller Achse und einen Galvanometerspiegel mit langsamer Achse.
Bevorzugt umfasst das Bündelungs- und Spleißmodul vier primäre Bündelungs- und Spleißmodule und ein sekundäres Bündelungs- und Spleißmodul, wobei jedes primäre Bündelungs- und Spleißmodul jeweils einer Abtasteinheit entspricht, um die von den vier Abtastmodulen in einer Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht zu bündeln und spleißen;
und wobei das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul dazu verwendet wird, die vier Gruppen von Laserlicht, die von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen emittiert werden, erneut zu bündeln und spleißen und dann in den dichroitischen Farbfilm einzugeben.
Bevorzugt umfasst das primäre Bündelungs- und Spleißmodul zwei primäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen, ein primäres polarisierendes Bündelungsprisma, eine erste primäre Linse, eine primäre kombinierte Halbwellenplatte und eine zweite primäre Linse, wobei das von den beiden primären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen emittierte Laserlicht, nachdem es durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma gebündelt wurde, nacheinander die erste primäre Linse, die primäre kombinierte Halbwellenplatte und die zweite primäre Linse passiert und danach ausgegeben wird, und wobei die primäre kombinierte Halbwellenplatte vier verschiedene Halbwellenplatten umfasst; und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen die gleiche Struktur aufweisen und jeweils eine erste primäre Sub-Halbwellenplatte, eine zweite primäre Sub-Halbwellenplatte, ein primäres subpolarisierendes Bündelungsprisma, eine erste primäre Sublinse, eine primäre subkombinierte Halbwellenplatte und eine zweite primäre Sublinse umfasst, und wobei die primäre subkombinierte Halbwellenplatte zwei verschiedene Halbwellenplatten umfasst, und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen jeweils als ein erster primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen und ein zweiter primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen aufgezeichnet werden; und wobei die von den vier Abtastmodulen in derselben Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils ein erster Pfad von Teillaserlicht, ein zweiter Pfad von Teillaserlicht, ein dritter Pfad von Teillaserlicht und ein vierter Pfad von Teillaserlicht aufgezeichnet werden, und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht durch den ersten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wird und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, was insbesondere wie folgt ist: und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht durch den ersten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wird und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, was insbesondere wie folgt ist: und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht nach Passieren der ersten primären Sub-Halbwellenplatte durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, und wobei der zweite Pfad von Teillaserlicht nach Passieren der zweiten primären Sub-Halbwellenplatte von dem primären subpolarisierenden Bündelungsprisma reflektiert und mit dem ersten Pfad von Teillaserlicht, der durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt wird, und wobei dann der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht gemeinsam die erste primäre Sublinse passieren und auf zwei verschiedenen Halbwellenplatten der primären subkombinierten Halbwellenplatte auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse zwei Teilabtastbereiche bilden, und wobei die beiden Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind; und wobei die gebündelten beiden Pfade von Teillaserlicht wieder die zweite primäre Sublinse passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, und wobei die beiden Pfade von Laserlicht, die die primäre subkombinierte Halbwellenplatte passierten, denselben Polarisationszustand haben;
und wobei der dritte Pfad von Teillaserlicht und der vierte Pfad von Teillaserlicht durch den zweiten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma reflektiert werden, und wobei sie dann mit dem gebündelte Laserlicht, das durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt werden; und wobei sie dann gemeinsam die erste primäre Sublinse passieren und auf vier verschiedenen Halbwellenplatten der primären kombinierten Halbwellenplatte auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse vier Teilabtastbereiche bilden, und wobei die vier Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind, und wobei sie schließlich die zweite primäre Linse passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann an das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul ausgegeben wird, und wobei die vier Pfade von Laserlicht, die die primäre kombinierte Halbwellenplatte passierten, denselben Polarisationszustand haben.
Bevorzugt umfasst das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul zwei sekundäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen, ein sekundäres polarisierendes Bündelungsprisma und eine sekundäre Linse, wobei das von den beiden sekundären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen emittierte Laserlicht, nachdem es durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma gebündelt wurde, die sekundäre Linse passiert und dann auf den dichroitischen Farbfilm eingestrahlt wird;
und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen die gleiche Struktur aufweisen und jeweils ein sekundäres subpolarisierendes Bündelungsprisma, eine erste sekundäre Sublinse und eine zweite sekundäre Sublinse umfasst, und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen jeweils als ein erster sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen und ein zweiter sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen aufgezeichnet werden;
und wobei das gebündelte Laserlicht der von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils als ein erster Pfad von subgebündeltem Laserlicht, ein zweiter Pfad von subgebündeltem Laserlicht, ein dritter Pfad von subgebündeltem Laserlicht und ein vierter Pfad von subgebündeltem Laserlicht aufgezeichnet wird;
und wobei der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht, nachdem sie durch dem ersten sekundären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wurden, durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgehen, was insbesondere wie folgt ist:

dass der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht, nachdem er durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchging, und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht, der durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma reflektiert wurde, miteinander gebündelt werden, wobei sie gemeinsam die erste sekundäre Sublinse passieren und auf der hinteren Fokusebene der ersten sekundären Sublinse acht Teilabtastbereiche bilden, und wobei es sich bei den acht Teilabtastbereichen um gleichmäßig geteilte zwei Reihen von Abtastbereichen handelt, die durch Spleißen von jeweiligen vier Teilabtastbereichen des ersten Pfades von subgebündeltem Laserlicht und des zweiten Pfades von subgebündeltem Laserlicht gebildet sind, und wobei die beiden Reihen von Abtastbereichen durch einen Abstand von einem Abtastbereich voneinander beabstandet sind;
und wobei der dritte Pfad von subgebündeltem Laserlicht und der vierte Pfad von subgebündeltem Laserlicht durch den zweiten sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen gebündelt und dann durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma reflektiert werden, und wobei sie dann mit dem gebündelte Laserlicht, das durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt werden, und wobei sie schließlich gemeinsam die sekundäre Linse passieren und auf der hinteren Fokusebene der sekundären Linse ein vollständiges rechteckiges Abtastfeld in einem 4 × 4-Array bilden, das durch 16 Teilabtastbereiche gebildet ist.

Bevorzugt ist das Photomultiplier-Detektionsarray ein Array von 4 × 4 Photomultipliern, wobei jedes Photomultiplier der Fluoreszenzdetektion im bildgebenden Sichtfeld eines Abtastmoduls entspricht.
Die vorliegende Erfindung realisiert ein großes Sichtfeld mit elliptisch gekrümmter Oberfläche mittels einem reflektierenden Objektiv, das in der Lage ist, ein planares rechteckiges Laser-Abtastfeld in ein elliptisches halbkugelförmiges Laser-Abtastfeld umzuwandeln, um sich an die gekrümmte Form der Großhirnrinde eines Tieres anzupassen.
Bei der vorliegenden Erfindung werden paralleles Abtasten mit mehreren Pfaden von Laserlicht und parallele Detektionen von mehreren Fluoreszenzkanälen verwendet, um Abtasten hohen Durchsatzes zu erzielen. Beim Spleißen und Bündeln mehrerer Teilsichtfeldbereiche werden die Teilsichtfeldbereiche des 16-Pfad-4X4-Arrays nach dem Prinzip des Vierfarbsystems in vier Gruppen unterteilt, wobei die Grenzen der vier Teilbereiche in derselben Gruppe nicht aneinander angrenzen. An den vier Teilbereichen derselben Gruppe werden zuerst Bündeln und Spleißen durchgeführt, da ihre Grenzen nicht aneinander angrenzen, kann das Abtastsichtfeld auf die Halbwellenplatte mit unterschiedlichen Kristallorientierungen fallen, so dass der Polarisationszustand nach der Polarisationsbündelung auf denselben eingestellt werden kann, was die optimale Polarisationsrichtung für die nächste Polarisationsbündelung darstellt. Dieses Verfahren maximiert die Energiedurchlässigkeit von mehreren Polarisationsbündelungen, und die Effizienz jeder Bündelung ist besser als 90 %, während im herkömmlichen Verfahren die Laserenergie bei jedem Durchgang durch das depolarisierende bündelnde Prisma um die Hälfte reduziert wird. Das Bündeln und Spleißen zwischen verschiedenen Gruppen erfolgt nach dem herkömmlichen Verfahren.
Die relativen Positionen zwischen den abtastenden Teilsichtfeldern werden durch die Einstellung des Einfallswinkels auf das polarisierende strahlteilende Prisma oder das depolarisierende strahlteilende Prisma während jedes Bündelungsprozesses gesteuert, um den geplanten Positionsverteilungseffekt nach dem Spleißen zu erreichen.
Durch das Verzögerungsmodul befinden sich die Laserstrahlen, die den vier Teilbereichen derselben Gruppe entsprechen, am gleichen Zeitpunkt, und die Laserstrahlen verschiedener Gruppen unterscheiden sich zeitlich, und die Verzögerung zwischen zwei zeitlich benachbarten Gruppen beträgt 3,125 ns, was einer Aufteilung der Impulsdauer von 12,5 ns in vier gleiche Teile entspricht, wobei jede Lasergruppe an einem der Zeitpunkte liegt.
Das Photomultiplier-Detektionsarray ist ein Array von 4 × 4 Photomultipliern, wobei jedes Array-Element Photomultiplier der Fluoreszenzdetektion im bildgebenden Sichtfeld einer Abtasteinheit entspricht. Aufgrund der Fluoreszenzstreuung wird die resultierende Fluoreszenz nicht nur in dieses Detektions-Array-Element eindringen, sondern mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch in das benachbarte Detektions-Array-Element fallen, wenn das Laserlicht die Kreuzung des Sichtfelds abtastet. Da zwischen den abtastenden Laserlichtern in den benachbarten Bereichen eine Verzögerungsdifferenz besteht, die zu der gleichen Zeitdifferenz in der erzeugten Fluoreszenz führt, ist es möglich, den Quellbereich der Fluoreszenz zeitlich zu differenzieren und so das durch die Fluoreszenzstreuung verursachte Signalübersprechen zu verringern.
Zusammenfassend gesagt, kann die vorliegende Erfindung die Quellenbereiche der Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum durch die Idee, dass die an demselben Zeitpunkt befindlichen Bereiche des Abtastbereichs nicht aneinander angrenzen und die aneinander angrenzenden Bereiche nicht an demselben Zeitpunkt liegen, effektiv unterscheiden, wodurch das Signalübersprechen zwischen den Bereichen stark vermieden wird.
Die vorliegende Erfindung hat die folgenden Vorteile:
bei dem ellipsoidischen halbkugelförmigen Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein großes Sichtfeld mit elliptisch gekrümmter Oberfläche mittels einem reflektierenden Objektiv realisiert, das in der Lage ist, ein planares rechteckiges Laser-Abtastfeld in ein elliptisches halbkugelförmiges Laser-Abtastfeld umzuwandeln, um sich an die gekrümmte Form der Großhirnrinde eines Tieres anzupassen;
Bei der vorliegenden Erfindung werden paralleles Abtasten mit mehreren Pfaden von Laserlicht und parallele Detektionen von mehreren Fluoreszenzstrahlen verwendet, um Abtasten hohen Durchsatzes zu erzielen. Beim Spleißen und Bündeln mehrerer Teilsichtfeldbereiche werden die nicht aneinander angrenzenden Bereiche nach dem Prinzip des Vierfarbsystems in eine Gruppe unterteilt, und unter Verwendung der Lücke der Bereiche und der kombinierten Halbwellenplatte wird die Energieeffizienz der mehrfachen Polarisationsbündelung maximiert; darüber hinaus wird die Verzögerung zwischen die verschiedenen Gruppen von Laserlicht eingeführt, und die Quellenbereiche der Fluoreszenzsignale können in Zeit und Raum durch die Lösung, dass die an demselben Zeitpunkt befindlichen Bereiche des Abtastbereichs nicht aneinander angrenzen und die aneinander angrenzenden Bereiche nicht an demselben Zeitpunkt liegen, effektiv unterschieden werden, wodurch das durch die Fluoreszenzstreuung verursachte Signalübersprechen zwischen den Bereichen stark vermieden werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt ein schematische Strukturansicht eines allgemeinen Prinzips eines ellipsoidischen halbkugelförmigen Zwei-Photonen-Mikroskops mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz in einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt ein Diagramm des optischen Pfades eines Strahlteilung/Verzögerungsmoduls.
3 zeigt ein schematisches Diagramm der zeitlichen Verteilung jedes Pfades von Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Verzögerung auf der Zeitachse.
4 zeigt ein schematisches Diagramm der Verteilung des abtastenden Sichtfeldbereichs jedes Pfades von Laserlicht nach dem Abtasten sowie Bündeln und Spleißen.
5 zeigt ein Diagramm des optischen Pfades eines primären Bündelungs- und Spleißmoduls.
6 zeigt ein Diagramm des optischen Pfades eines sekundären Bündelungs- und Spleißmoduls.
7 zeigt ein schematisches Diagramm des Prinzips eines ellipsoidischen Reflexionsobjektivs mit großem Sichtfeld.
8 zeigt ein schematisches Diagramm der Verteilung der von jedem Pfad von Laserlicht angeregten Fluoreszenz auf dem Photomultiplier-Detektionsarray.

Bezugszeichenliste

1: Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe
1.1-1.4: Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser
2: Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe
2.1-2.4: Strahlteilung/Verzögerungsmodul
2.11: Erster Reflektor
2.12: Zweiter Reflektor
2.13: Erstes strahlteilendes Element
2.14: Zweites strahlteilendes Element
2.15: Drittes strahlteilendes Element
3: Abtasteinheit-Kopplungsgruppe
3.11-3.14: Abtastmodul
4: Bündelungs- und Spleißmodul
4.1-4.4: Primäres Bündelungs- und Spleißmodul
4.5: Sekundäres Bündelungs- und Spleißmodul
4.1.01: Erster primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen
4.1.02: Zweiter primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen
4.1.1, 4.1.7: Erste primäre Sub-Halbwellenplatte
4.1.2, 4.1.8: Zweite primäre Sub-Halbwellenplatte
4.1.3, 4.1.9: Primäres subpolarisierendes Bündelungsprisma
4.1.4, 4.1.10: Erste primäre Sublinse
4.1.5, 4.1.11: Primäre subkombinierte Halbwellenplatte
4.1.6, 4.1.12: Zweite primäre Sublinse
4.1.13: Primäres polarisierendes Bündelungsprisma
4.1.14: Erste primäre Linse
4.1.15: Primäre kombinierte Halbwellenplatte
4.1.16: Zweite primäre Linse
4.5.01: Erster sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen
4.5.02: Zweiter sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen
4.5.1, 4.5.4: Sekundäres subpolarisierendes Bündelungsprisma
4.5.2, 4.5.5: Erste sekundäre Sublinse
4.5.3, 4.5.6: Zweite sekundäre Sublinse
4.5.7: Sekundäres polarisierendes Bündelungsprisma
4.5.8: Blende
4.5.9: Sekundäre Linse
5: Ellipsoidisches Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld
5.1: Primärspiegel
5.2: Sekundärspiegel
5.3: Tertiärspiegel
6: Dichroitischer Farbfilm
7: Photomultiplier-Detektionsarray
A, B, C, D: Laserlicht
A1: Erster Pfad von Teillaserlicht
A2: Zweiter Pfad von Teillaserlicht
A3: Dritter Pfad von Teillaserlicht
A4: Vierter Pfad von Teillaserlicht

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden im Zusammenhang mit Ausführungsbeispielen näher beschrieben, damit der Fachmann sie unter Bezugnahme auf den Text der Beschreibung entsprechend Implementierung kann.
Es versteht sich, dass Begriffe wie „aufweisend“, „umfassend“ und „einschließlich“, wie sie hier verwendet werden, das Vorhandensein oder die Hinzufügung von einem oder mehreren anderen Elementen oder Kombinationen davon nicht ausschließen.
Ausführungsbeispiel 1
Bezugnehmend auf 1, ein ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz, umfassend eine Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe 1, eine Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe 2, eine Abtasteinheit-Kopplungsgruppe 3, ein Bündelungs- und Spleißmodul 4, ein ellipsoidisches Reflexionsobjektiv 5 mit großem Sichtfeld, einen dichroitischen Farbfilm 6 und ein Photomultiplier-Detektionsarray 7;
wobei das von der Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe 1 emittierte Laserlicht nacheinander die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe 2, die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe 3 und das Bündelungs- und Spleißmodul 4 passiert und
dann durch den dichroitischen Farbfilm 6 hindurchgeht, und wobei das Laserlicht danach durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv 5 mit großem Sichtfeld auf die Probe gestrahlt wird, und wobei die durch Anregung der Probe erzeugte Fluoreszenz durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv 5 mit großem Sichtfeld gesammelt und danach durch den dichroitischen Farbfilm 6 an das Photomultiplier-Detektionsarray 7 reflektiert wird.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel umfasst die Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe 1 vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser;
und wobei die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe 2 vier Strahlteilung/Verzögerungsmodule umfasst, und wobei ein Strahlteilung/Verzögerungsmodul einen optischen Pfad zur Verzögerung und einen optischen Pfad zur Strahlteilung umfasst;
und wobei die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe 3 vier Abtasteinheiten umfasst, und wobei jede Abtasteinheit vier unabhängige Abtastmodule umfasst, und wobei jedes Abtastmodul unabhängig eine 2D-Abtastung eines rechteckigen Teilabtastbereichs durchführt;
und wobei jeder Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser einem Strahlteilung/Verzögerungsmodul entspricht, und wobei jedes Strahlteilung/Verzögerungsmodul einer Abtasteinheit entspricht;
und wobei das von den vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslasern emittierte Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Verzögerung vier Pfade von verzögertem Laserlicht mit einem Zeitintervall von T/4 bildet, und wobei jeder Pfad von verzögertem Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Strahlteilung gleichmäßig in vier Pfade von Teillaserlicht unterteilt ist, und wobei die von demselben Pfad von verzögertem Laserlicht kommenden vier Pfaden von Teillaserlicht in dieselbe Abtasteinheit eintreten, und wobei jeder Pfad von Teillaserlicht einem Abtastmodul entspricht, um die Abtastung von einem Teilabtastbereich zu realisieren, so dass die Abtastung von 16 Teilabtastbereichen realisiert wird, indem 16 Pfade von Teillaserlicht in einer Eins-zu-Eins-Entsprechung mit den 16 Abtastmodulen stehen; und wobei T eine Impulsperiode des von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierten Laserlichts ist, und wobei sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten jedes Abtastmoduls in derselben Abtasteinheit erhalten werden, sich am selben Zeitpunkt befinden, während sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten der Abtastmodule in verschiedenen Abtasteinheiten erhalten werden, an verschiedenen Zeitpunkten befinden;
und wobei das Bündelungs- und Spleißmodul 4 dazu verwendet, Bündeln und Spleißen von den 16 Pfaden von Teillaserlicht, die von 16 Abtastmodulen emittiert werden, zu realisieren, und wobei durch Bündeln und Spleißen von 16 Teilabtastbereichen ein rechteckiges Abtastfeld in einem 4×4-Array gebildet wird, und wobei die Grenzen der 4 Teilabtastbereiche, die sich am selben Zeitpunkt befinden, nicht aneinander angrenzen und alle 4 Bereiche, deren Grenzen aneinander angrenzen, sich an verschiedenen Zeitpunkten befinden.
Oben ist die allgemeine Idee der vorliegenden Erfindung, auf dieser Grundlage wird die vorliegende Erfindung weiter unten in Verbindung mit spezifischeren Ausführungsbeispielen und den beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Bezugnehmend auf 2 bis 8, umfasst die Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe 11 in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser 1.1, 1.2, 1.3 und 1.4, die vom gleichen Modell sind und jeweils das Femtosekundenlaserlicht A, B, C, D in ihre jeweiligen Strahlteilung/Verzögerungsmodule 2.1-2.4 emittieren.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel umfasst die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe 2 vier Strahlteilung/Verzögerungsmodule 2.1-2.4, wobei ein Strahlteilung/Verzögerungsmodul einen optischen Pfad zur Verzögerung und einen optischen Pfad zur Strahlteilung umfasst, wie in 2 dargestellt (nur 2.1 wird dargestellt, 2.2-2.4 sind gleich); der optischen Pfad zur Verzögerung umfasst einen ersten Reflektor 2.11 und einen zweiten Reflektor 2.12, wobei das von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierte Laserlicht A nacheinander den ersten Reflektor 2.11 und den zweiten Reflektor 2.12 passiert, um verzögertes Laserlicht auszugeben, und wobei durch Einstellen des Abstandes L zwischen dem ersten Reflektor 2.11 und dem zweiten Reflektor 2.12 das ausgegebene verzögerte Laserlicht unterschiedliche Verzögerungsbeträge Uc erzeugt, wobei c die Lichtgeschwindigkeit ist;
und wobei der optische Pfad zur Strahlteilung ein erstes strahlteilendes Element 2.13, ein zweites strahlteilendes Element 2.14 und ein drittes strahlteilendes Element 2.15 umfasst, und wobei das von dem zweiten Reflektor 2.12 ausgegebene verzögerte Laserlicht nach Eintreten ins erste strahlteilende Element 2.13 gleichmäßig in zwei Pfade geteilt wird, und wobei ein Pfad durch das erste strahlteilende Element 2.13 hindurchgeht, dann das zweite strahlteilende Element 2.14 erreicht und von dem zweiten strahlteilenden Element 2.14 in zwei Pfade geteilt wird, während der andere Pfad von dem ersten strahlteilenden Element 2.13 reflektiert wird, dann das dritte strahlteilende Element 2.15 erreicht und von dem dritten strahlteilenden Element 2.15 in zwei Pfade geteilt wird, wodurch das verzögerte Laserlicht gleichmäßig in vier Pfade geteilt wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind das erste strahlteilende Element 2.13, das zweite strahlteilende Element 2.14 und das dritte strahlteilende Element 2.15 jeweils ein depolarisierendes strahlteilendes Prisma oder ein 50/50-Strahlenteiler.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beträgt die Wiederholfrequenz der Femtosekunden-Laserpulse im Allgemeinen 80 MHz, d.h. die Periode beträgt 12,5 ns. Durch Einstellen der jeweiligen Verzögerungsbeträge der Strahlteilung/Verzögerungsmodule 2.1-2.4 werden die vier Gruppen von Laserpulsen von A bis D zeitlich getrennt, und die Verzögerung zwischen zwei zeitlich benachbarten Pfaden beträgt 3,125 ns, wie in 3 dargestellt, was einer Aufteilung der Impulsdauer von 12,5 ns in vier gleiche Teile entspricht, wobei jede Lasergruppe an einem der Zeitpunkte liegt.
Das Laserlicht jedes Lasers werden gleichmäßig auf 4 Pfade aufgeteilt, so dass insgesamt 16 Pfade aufgeteilt werden. Die jeweiligen Pfade von Laserlicht treten weiter in die Parallel-Abtasteinheit-Kopplungsgruppe ein und fallen in die entsprechende Abtasteinheit ein. Die Laserlichter A1 bis A4 entsprechen den Abtasteinheiten 3.11 bis 3.14, die Laserlichter B1 bis B4 entsprechen den Abtasteinheiten 3.21 bis 3.24, die Laserlichter C1 bis C4 entsprechen den Abtasteinheiten 3.31 bis 3.34 und die Laserlichter D1 bis D4 entsprechen den Abtasteinheiten 3.41 bis 3.44.
Jedes Abtastmodul 3.11 bis 3.14 umfasst einen 8-kHz-Resonanzabtastspiegel mit schneller Achse und einen Galvanometerspiegel mit langsamer Achse, m eine schnelle 2D-Abtastung jedes einzelnen Teilbereichs zu erreichen, und das abtastende Sichtfeld jedes Teilbereichs ist rechteckig.
Für die abtastenden Sichtfelder von 16 Teilbereichen müssen ein Bündeln und Spleißen durch das Bündelungs- und Spleißmodul 4 durchgeführt werden, um ein vollständiges Abtastfeld zu bilden, bevor sie in das Objektiv 5 eintreten, und das Abtastfeld ist ein 4 × 4-Abtastsichtfeld-Array, wie in 4 dargestellt. Die Anordnung der Teilbereiche, die durch das Abtasten jedes Pfades von Laserlicht gebildet werden, ist wie folgt gekennzeichnet: die Grenzen der Teilbereiche derselben Lasergruppe sind nicht benachbart, z.B. A1 bis A4 sind nicht benachbart; die Teilbereiche mit benachbarten Grenzen stammen von verschiedenen Lasergruppen, z.B. A1, B1, C1 und D1 sind benachbart und stammen von vier Lasergruppen; eine detaillierte Beschreibung wird unten gegeben.
Das Bündelungs- und Spleißmodul 4 umfasst vier primäre Bündelungs- und Spleißmodule 4.1-4.4 und ein sekundäres Bündelungs- und Spleißmodul 4.5, wobei jedes primäre Bündelungs- und Spleißmodul jeweils einer Abtasteinheit entspricht, um die von den vier Abtastmodulen in einer Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht zu bündeln und spleißen;
und wobei das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul 4.5 dazu verwendet wird, die vier Gruppen von Laserlicht, die von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen emittiert werden, erneut zu bündeln und spleißen und dann in den dichroitischen Farbfilm 6 einzugeben.
Die 16 Abtastzweige führen durch das Bündelungs- und Spleißmodul 44 ein Bündeln und ein Spleißen von Sichtfeldern durch, um schließlich das Abtastfeld gemäß 4 zu bilden. Die vier Abtastzweige derselben Lasergruppe führen zuerst durch das primäre Bündelungs- und Spleißmodul ein Bündeln und Spleißen durch, z.B. führen A1-A4 durch das primäre Bündelungs- und Spleißmodul 4.1 ein Bündeln und Spleißen durch, während die Gruppen B, C, D führen jeweils durch 4.2, 4.3, 4.4 ein Bündeln und Spleißen durchführen.
Im Folgenden wird es am Beispiel des primären Bündelungs- und Spleißmoduls 4.1 erläutert, wie das Bündeln und Spleißen durchzuführen, und 4.2 bis 4.4 sind gleich.
Bezugnehmend auf 5, umfasst das primäre Bündelungs- und Spleißmodul zwei primäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen 4.1.01, 4.1.02, ein primäres polarisierendes Bündelungsprisma 4.1.13, eine erste primäre Linse 4.1.14, eine primäre kombinierte Halbwellenplatte 4.1.15 und eine zweite primäre Linse 4.1.16, wobei das von den beiden primären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen 4.10 emittierte Laserlicht, nachdem es durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma 4.1.13 gebündelt wurde, nacheinander die erste primäre Linse 4.1.14, die primäre kombinierte Halbwellenplatte 4.1.15 und die zweite primäre Linse 4.1.16 passiert und danach ausgegeben wird, und wobei die primäre kombinierte Halbwellenplatte 4.1.15 vier verschiedene Halbwellenplatten umfasst;
und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen 4.1.01, 4.1.02 die gleiche Struktur aufweisen und jeweils eine erste primäre Sub-Halbwellenplatte 4.1.1, eine zweite primäre Sub-Halbwellenplatte 4.1.2, ein primäres subpolarisierendes
Bündelungsprisma 4.1.3, eine erste primäre Sublinse 4.1.4, eine primäre subkombinierte Halbwellenplatte 4.1.5 und eine zweite primäre Sublinse 4.1.6 umfasst, und wobei die primäre subkombinierte Halbwellenplatte 4.1.5 zwei verschiedene Halbwellenplatten umfasst, und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen jeweils als ein erster primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.1.01 und ein zweiter primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.1.02 aufgezeichnet werden;
und wobei die von den vier Abtastmodulen 3.11-3.14 in derselben Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils ein erster Pfad von Teillaserlicht A1, ein zweiter Pfad von Teillaserlicht A2, ein dritter Pfad von Teillaserlicht A3 und ein vierter Pfad von Teillaserlicht A4 aufgezeichnet werden,
und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht A1 und der zweite Pfad von Teillaserlicht A2 durch den ersten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.1.01 gebündelt wird und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma 4.1.13 hindurchgeht, was insbesondere wie folgt ist:

dass der erste Pfad von Teillaserlicht A1 nach Passieren der ersten primären Sub-Halbwellenplatte 4.1.1 durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma 4.1.3 hindurchgeht, und wobei der zweite Pfad von Teillaserlicht A2 nach Passieren der zweiten primären Sub-Halbwellenplatte 4.1.2 von dem primären subpolarisierenden Bündelungsprisma 4.1.3 reflektiert und mit dem ersten Pfad von Teillaserlicht A1, der durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma 4.1.3 hindurchgeht, gebündelt wird, und wobei dann der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht gemeinsam die erste primäre Sublinse 4.1.4 passieren und auf zwei verschiedenen Halbwellenplatten der primären subkombinierten Halbwellenplatte 4.1.5 auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse 4.1.4 zwei Teilabtastbereiche bilden, und wobei die beiden Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind; durch Einstellen der ersten primären Sub-Halbwellenplatte 4.1.1 und der zweiten primären Sub-Halbwellenplatte 4.1.2 wird die Bündelungsleistung des Laserlichts maximiert, und durch Einstellen des auf das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma 4.1.5 einfallenden Winkels werden die beiden Teilabtastbereiche in eine geeignete Position gebracht, d.h. die beiden Teilabtastbereiche sind durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet; da die von A1 und A2 gebildeten Abtastfelder nicht aneinander angrenzen und eine Lücke zueinander haben, können sie weiter vollständig auf zwei verschiedene Halbwellenplatten fallen, und die beiden Halbwellenplatten werden mit einem Klebeverfahren zu einer primären subkombinierten Halbwellenplatte 4.1.5 gebildet;
und wobei die gebündelten beiden Pfade von Teillaserlicht wieder die zweite primäre Sublinse 4.1.6 passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma 4.1.13 hindurchgeht, und wobei die beiden Pfade von Laserlicht, die die primäre subkombinierte Halbwellenplatte 4.1.5 passierten, denselben Polarisationszustand haben;

Die Polarisationszustände von A1 und A2 nach der Polarisationsbündelung sind unterschiedlich und stehen genau senkrecht zueinander, so dass sie durch die anschließende Polarisationsbündelung wieder getrennt werden und der Bündelungseffekt verloren geht. Durch die Auswahl geeigneter unterschiedlicher Richtungen für die Kristallorientierungen der beiden Halbwellenplatten, die in der primären subkombinierten Halbwellenplatte 4.1.5 zusammengeklebt sind, werden die Laserpolarisationszustände der Bereiche A1 und A2 nach dem Passieren von 4.1.5 gleich und genau auf den optimalen Polarisationszustand eingestellt, der für die nächste Polarisationsbündelung erforderlich ist.
Analog dazu werden der dritte Pfad von Teillaserlicht A3 und der vierte Pfad von Teillaserlicht A4 durch den zweiten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.1.02 gebündelt und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma 4.1.13 reflektiert, so dass A3, A4 dann mit den gebündelten Laserlichter A1, A2, die durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma 4.1.13 hindurchgehen, gebündelt werden, und wobei sie dann gemeinsam die erste primäre Sublinse 4.1.14 passieren und auf vier verschiedenen Halbwellenplatten der primären kombinierten Halbwellenplatte 4.1.15 auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse 4.1.14 vier Teilabtastbereiche bilden, und wobei die vier Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind, und wobei sie schließlich die zweite primäre Linse 4.1.16 passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann an das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul 4.5 ausgegeben wird, und wobei die vier Pfade von Laserlicht, die die primäre kombinierte Halbwellenplatte 4.1.15 passierten, denselben Polarisationszustand haben.
Die Bündelungseffizienz wird durch die primären subkombinierten Halbwellenplatten 4.1.5, 4.1.11 maximiert, und durch Einstellen des auf 4.1.13 einfallenden Winkels werden die relativen Position der Abtastfelder der vier abtastenden Teilbereiche auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Linse 4.1.14 in die vorgesehenen geeigneten Positionen gebracht. Die Grenzen von den vier Teilsichtfeldbereichen grenzen immer noch nicht aneinander an, deshalb können sie vollständig in vier verschiedene Halbwellenplatten fallen. Die vier Halbwellenplatten bilden mit einem Klebeverfahren eine primäre zusammenführende Halbwellenplatte 4.1.15. Durch kontrollierte Auswahl der Kristallorientierung jeder Halbwellenplatte haben die vier Teilfelder nach Passieren von 4.1.15 einen gleichen Polarisationszustand, was einen optimalen Polarisationszustand darstellt, der für die nächste Polarisationsbündelung erforderlich ist. Danach wird das Laserlicht nach Passieren der zweiten primären Linse 4.1.16 in ein kollimiertes Laserlicht umgewandelt.
Bis jetzt haben A1 bis A4 durch das primäre Bündelungs- und Spleißmodul die Bündelung und das Spleißen der Sichtfelder vervollständigt, und die Gruppen B, C, D haben ein gleiches Bündelungsverfahren, was hier nicht näher erläutert wird.
Bezugnehmend auf 6 werden ein Bündeln und Spleißen für die vier Lasergruppen A, B, C, D durch das sekundäres Bündelungs- und Spleißmodul 4.5 durchgeführt.
Das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul 4.5 umfasst zwei sekundäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen 4.5.01, 4.5.02, ein sekundäres polarisierendes Bündelungsprisma 4.5.7 und eine sekundäre Linse 4.5.9, wobei das von den beiden sekundären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen 4.5.0 emittierte Laserlicht, nachdem es durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 gebündelt wurde, die sekundäre Linse 4.5.9 passiert und dann auf den dichroitischen Farbfilm 6 eingestrahlt wird;
und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen 4.5.01, 4.5.02 die gleiche Struktur aufweisen und jeweils ein sekundäres subpolarisierendes Bündelungsprisma 4.5.1, eine erste sekundäre Sublinse 4.5.2 und eine zweite sekundäre Sublinse 4.5.3 umfasst, und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen 4.5.0 jeweils als ein erster sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.5.01 und ein zweiter sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.5.02 aufgezeichnet werden;
und wobei das gebündelte Laserlicht der von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen 4.1-4.4 emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils als ein erster Pfad von subgebündeltem Laserlicht A, ein zweiter Pfad von subgebündeltem Laserlicht B, ein dritter Pfad von subgebündeltem Laserlicht C und ein vierter Pfad von subgebündeltem Laserlicht D aufgezeichnet wird;
und wobei der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht A und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht B, nachdem sie durch dem ersten sekundären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen 4.5.01 gebündelt wurden, durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 hindurchgehen, was insbesondere wie folgt ist:

dass der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht A, nachdem er durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma 4.5.1 hindurchging, und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht B, der durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma 4.5.1 reflektiert wurde, miteinander gebündelt werden, wobei sie gemeinsam die erste sekundäre Sublinse 4.5.2 passieren und auf der hinteren Fokusebene der ersten sekundären Sublinse 4.5.2 acht Teilabtastbereiche bilden, und wobei es sich bei den acht Teilabtastbereichen um gleichmäßig geteilte zwei Reihen von Abtastbereichen handelt, die durch Spleißen von jeweiligen vier Teilabtastbereichen des ersten Pfades von subgebündeltem Laserlicht A und des zweiten Pfades von subgebündeltem Laserlicht B gebildet sind, und wobei die beiden Reihen von Abtastbereichen durch einen Abstand von einem Abtastbereich voneinander beabstandet sind;
und wobei der dritte Pfad von subgebündeltem Laserlicht C und der vierte Pfad von subgebündeltem Laserlicht D durch den zweiten sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen gebündelt und dann durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 reflektiert werden, und wobei sie dann mit dem gebündelte Laserlicht C, das durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 hindurchgeht, gebündelt werden, und wobei sie schließlich gemeinsam die sekundäre Linse 4.5.9 passieren und auf der hinteren Fokusebene der sekundären Linse 4.5.9 ein vollständiges rechteckiges Abtastfeld in einem 4 × 4-Array bilden, das durch 16 Teilabtastbereiche gebildet ist, wie in 4 dargestellt.

Die Lasergruppen A und B werden durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 gebündelt, da in dem jeweiligen primären Bündelungs- und Spleißmodul der jeweilige Polarisationszustand schon durch die kombinierte Halbwellenplatte auf einen optimalen Zustand eingestellt wird, wird die Bündelungseffizienz hier sichergestellt. Durch Einstellen des auf das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 einfallenden Winkels werden die jeweiligen Abtastfelder der auf der hinteren Fokusebene der ersten sekundären Sublinse 4.5.2 gebildeten zwei Gruppen von 8 Teilbereichen auf die vorgesehenen geeigneten Positionen gebracht. Das Bündeln und Spleißen der Lasergruppen C und D sind gleich.
Unter weiterer Bezugnahme auf 6 umfasst das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul 4.5 in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weiterhin eine Blende 4.5.8, um die durch die depolarisierende Bündelung verlorene Hälfte von Laserlicht abzublocken. In einem weiter bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die Blende 4.5.8 auch durch eine Kamera ersetzt werden, die dazu dient, die aktuelle Spleißsituation jedes Sichtfeldes in Echtzeit zu überwachen, so dass das Wartungspersonal rechtzeitig feststellen kann, wenn sich die Position des Sichtfeldes eines bestimmten Teilbereichs verschiebt, und Anpassungen vornehmen kann.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma 4.5.7 auch durch einen flachen 50/50-Strahlenteiler ersetzt werden.
Der dichroitische Farbfilm6 überträgt das Laserwellenband mit hoher Effizienz, während das sichtbare Fluoreszenzwellenband mit hohem Reflexionsvermögen reflektiert wird. Das Laserlicht passiert nach dem Bündeln der Abtastfelder den dichroitischen Farbfilm 6 und erreicht dann das reflektierende Objektiv, wodurch ein Anregungsabtastfeld in der Probe gebildet wird, und die angeregte Fluoreszenz in der Probe passiert das reflektierende Objektiv, erreicht den dichroitischen Farbfilm 6 und wird zur photoelektrischen Signalumwandlung an das Photomultiplier-Detektionsarray reflektiert.
Bezugnehmend auf 7, wird ein ebenes Abtastfeld (4) nach dem Spleißen der mehreren abtastenden Teilbereiche in ein gekrümmtes abtastende Sichtfeld einer ellipsoidischen halbkugelförmigen Oberfläche mittels des ellipsoidischen Reflexionsobjektivs mit großem Sichtfeld 55 umgewandelt.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel umfasst das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld 5 einen entlang dem optischen Pfad nacheinander angeordneten Primärspiegel 5.1, Sekundärspiegel 5.2 und Tertiärspiegel 5.3 umfasst, und wobei die optische Fläche des Primärspiegels eine hyperbolische Fläche achter Ordnung, die optische Fläche des Sekundärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche zweiter Ordnung und die optische Fläche des Tertiärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche sechster Ordnung ist, und wobei das ins ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld 5 eintretende Laserlicht, nachdem es durch den Primärspiegel 5.1, den Sekundärspiegel 5.2 und den Tertiärspiegel 5.3 nacheinander reflektiert wurde, auf die Probe gestrahlt wird. Die numerische Apertur des ellipsoidischen Reflexionsobjektivs mit großem Sichtfeld 5 liegt in einem Bereich von 0,3-0,5. Das abbildende Sichtfeld des reflektierenden Objektivs ist ellipsoidisch, wobei der Krümmungsradius der langen Achse 9-12 mm, der Krümmungsradius der kurzen Achse 6-9 mm und die planare Projektionsgröße des Sichtfeldes 6 mm × 6 mm beträgt.
Die 16 Pfade von abtastenden Laserstrahlen werden die Probe anregen, um die entsprechende Fluoreszenz zu erzeugen. AA1-AA4 stellen jeweils die von Laserlicht A1-A4 angeregte Fluoreszenz dar, BB1-BB4 stellen jeweils die von Laserlicht B1-B4 angeregte Fluoreszenz dar, CC1-CC4 stellen jeweils die von Laserlicht C1-C4 angeregte Fluoreszenz dar und DD1-DD4 stellen jeweils die von Laserlicht D1-D4 angeregte Fluoreszenz dar.
Das Photomultiplier-Detektionsarray 7 ist ein Array von 4 × 4 Photomultipliern, wobei jedes Array-Element Photomultiplier der Fluoreszenzdetektion im bildgebenden Sichtfeld einer Abtasteinheit entspricht, wie in 8 dargestellt. Die Fluoreszenz aus dem gekrümmten Sichtfeld wird durch das Abtastfeld des reflektierenden Objektivs 5 transformiert und dann am Detektionsarray 7 in die Verteilung der planaren Matrix zurückverwandelt.
Aufgrund der Fluoreszenzstreuung wird die resultierende Fluoreszenz nicht nur in dieses Detektions-Array-Element eindringen, sondern mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch in das benachbarte Detektions-Array-Element fallen, wenn das Laserlicht die Kreuzung des Sichtfelds abtastet. Da zwischen den abtastenden Laserlichtern in den benachbarten Bereichen eine Verzögerungsdifferenz besteht, die zu der gleichen Zeitdifferenz in der erzeugten Fluoreszenz führt, ist es möglich, den Quellbereich der Fluoreszenz zeitlich zu differenzieren und so das durch die Fluoreszenzstreuung verursachte Signalübersprechen zu verringern.
Zusammenfassend gesagt, kann die vorliegende Erfindung die Quellenbereiche der Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum durch die Idee, dass die an demselben Zeitpunkt befindlichen Bereiche nicht aneinander angrenzen und die aneinander angrenzenden Bereiche nicht an demselben Zeitpunkt liegen, effektiv unterscheiden, wodurch das Signalübersprechen zwischen den Bereichen stark vermieden wird.
Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschreibt ein Abtast- und Detektionsverfahren eines 16-Pfad-4×4-Arrays, und nach dem Prinzip des Vierfarbsystems ist es für Bereiche in einer beliebige Anzahl, die in einer Ebene verteilt sind, möglich, diese Bereich in vier Kategorien zu unterteilen, wobei die Bereiche derselben Kategorie nicht aneinander angrenzen, was wiederum die Energietransmissionsrate der Bündelung durch das einzigartige Verfahren zum Bündeln und Spleißen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, verbessert und das Übersprechen von Fluoreszenzsignalen durch die räumliche und zeitliche Differenzierung, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, reduziert, und daher kann die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf eine beliebige Anzahl von parallelen Abtasten und Detektieren erweitert werden.
Obwohl die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wie oben offenbart werden, sind sie nicht auf die Anwendungen in der Spezifikation und die Ausführungsformen beschränkt, und sie sind voll auf verschiedenen Gebieten, die geeignet für die vorliegende Erfindung sind, anwendbar, und zusätzliche Modifikationen können leicht von Personen, die mit dem Gebiet vertraut sind, erreicht werden, und daher ist die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Details beschränkt, ohne von den allgemeinen Konzepten, die in den Ansprüchen und dem Umfang der Äquivalente definiert werden, abzuweichen.

Claims

Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe, eine Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe, eine Abtasteinheit-Kopplungsgruppe, ein Bündelungs- und Spleißmodul, ein ellipsoidisches Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld, einen dichroitischen Farbfilm und ein Photomultiplier-Detektionsarray umfasst; wobei das von der Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe emittierte Laserlicht nacheinander die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe, die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe und das Bündelungs- und Spleißmodul passiert und dann durch den dichroitischen Farbfilm hindurchgeht, und wobei das Laserlicht danach durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld auf die Probe gestrahlt wird, und wobei die durch Anregung der Probe erzeugte Fluoreszenz durch das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld gesammelt und danach durch den dichroitischen Farbfilm an das Photomultiplier-Detektionsarray reflektiert wird; und wobei das ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld einen entlang dem optischen Pfad nacheinander angeordneten Primärspiegel, Sekundärspiegel und Tertiärspiegel umfasst, und wobei die optische Fläche des Primärspiegels eine hyperbolische Fläche, die optische Fläche des Sekundärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche und die optische Fläche des Tertiärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche ist, und wobei das ins ellipsoidische Reflexionsobjektiv mit großem Sichtfeld eintretende Laserlicht, nachdem es durch den Primärspiegel, den Sekundärspiegel und den Tertiärspiegel nacheinander reflektiert wurde, auf die Probe gestrahlt wird; und wobei die Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser-Kopplungsgruppe vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser umfasst; und wobei die Strahlteilung/Verzögerungsmodul-Kopplungsgruppe vier Strahlteilung/Verzögerungsmodule umfasst, und wobei ein Strahlteilung/Verzögerungsmodul einen optischen Pfad zur Verzögerung und einen optischen Pfad zur Strahlteilung umfasst; und wobei die Abtasteinheit-Kopplungsgruppe vier Abtasteinheiten umfasst, und wobei jede Abtasteinheit vier unabhängige Abtastmodule umfasst, und wobei jedes Abtastmodul unabhängig eine 2D-Abtastung eines rechteckigen Teilabtastbereichs durchführt; und wobei jeder Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser einem Strahlteilung/Verzögerungsmodul entspricht, und wobei jedes Strahlteilung/Verzögerungsmodul einer Abtasteinheit entspricht; und wobei das von den vier Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslasern emittierte Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Verzögerung vier Pfade von verzögertem Laserlicht mit einem Zeitintervall von T/4 bildet, und wobei jeder Pfad von verzögertem Laserlicht nach Passieren des optischen Pfades zur Strahlteilung gleichmäßig in vier Pfade von Teillaserlicht unterteilt ist, und wobei die von demselben Pfad von verzögertem Laserlicht kommenden vier Pfade von Teillaserlicht in dieselbe Abtasteinheit eintreten, und wobei jeder Pfad von Teillaserlicht einem Abtastmodul entspricht, um die Abtastung von einem Teilabtastbereich zu realisieren, so dass die Abtastung von 16 Teilabtastbereichen realisiert wird, indem 16 Pfade von Teillaserlicht in einer Eins-zu-Eins-Entsprechung mit den 16 Abtastmodulen stehen; und wobei T eine Impulsperiode des von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierten Laserlichts ist, und wobei sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten jedes Abtastmoduls in derselben Abtasteinheit erhalten werden, sich am selben Zeitpunkt befinden, während sich die Teilabtastbereiche, die durch Abtasten der Abtastmodule in verschiedenen Abtasteinheiten erhalten werden, an verschiedenen Zeitpunkten befinden; und wobei das Bündelungs- und Spleißmodul dazu verwendet, Bündeln und Spleißen von den 16 Pfaden von Teillaserlicht, die von 16 Abtastmodulen emittiert werden, zu realisieren, und wobei durch Bündeln und Spleißen von 16 Teilabtastbereichen ein rechteckiges Abtastfeld in einem 4×4-Array gebildet wird, und wobei die Grenzen der 4 Teilabtastbereiche, die sich am selben Zeitpunkt befinden, nicht aneinander angrenzen und alle 4 Bereiche, deren Grenzen aneinander angrenzen, sich an verschiedenen Zeitpunkten befinden.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Fläche des Primärspiegels eine hyperbolische Fläche achter Ordnung, die optische Fläche des Sekundärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche zweiter Ordnung und die optische Fläche des Tertiärspiegels eine flache ellipsoidische Fläche sechster Ordnung ist.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der optischen Pfad zur Verzögerung einen ersten Reflektor und einen zweiten Reflektor umfasst, wobei das von dem Nahinfrarot-Femtosekundenimpulslaser emittierte Laserlicht nacheinander den ersten Reflektor und den zweiten Reflektor passiert, um verzögertes Laserlicht auszugeben, und wobei durch Einstellen des Abstandes zwischen dem ersten Reflektor und dem zweiten Reflektor das ausgegebene verzögerte Laserlicht unterschiedliche Verzögerungsbeträge erzeugt; und wobei der optische Pfad zur Strahlteilung ein erstes strahlteilendes Element, ein zweites strahlteilendes Element und ein drittes strahlteilendes Element umfasst, und wobei das von dem zweiten Reflektor ausgegebene verzögerte Laserlicht nach Eintreten ins erste strahlteilende Element gleichmäßig in zwei Pfade geteilt wird, und wobei ein Pfad durch das erste strahlteilende Element hindurchgeht, dann das zweite strahlteilende Element erreicht und von dem zweiten strahlteilenden Element in zwei Pfade geteilt wird, während der andere Pfad von dem ersten strahlteilenden Element reflektiert wird, dann das dritte strahlteilende Element erreicht und von dem dritten strahlteilenden Element in zwei Pfade geteilt wird, wodurch das verzögerte Laserlicht gleichmäßig in vier Pfade geteilt wird.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erste strahlteilende Element, das zweite strahlteilende Element und das dritte strahlteilende Element jeweils ein depolarisierendes strahlteilendes Prisma oder ein 50/50-Strahlenteiler sind.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtastmodul einen resonanten Abtastspiegel mit schneller Achse und einen Galvanometerspiegel mit langsamer Achse umfasst.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Bündelungs- und Spleißmodul vier primäre Bündelungs- und Spleißmodule und ein sekundäres Bündelungs- und Spleißmodul umfasst, wobei jedes primäre Bündelungs- und Spleißmodul jeweils einer Abtasteinheit entspricht, um die von den vier Abtastmodulen in einer Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht zu bündeln und spleißen; und wobei das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul dazu verwendet wird, die vier Gruppen von Laserlicht, die von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen emittiert werden, erneut zu bündeln und spleißen und dann in den dichroitischen Farbfilm einzugeben.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Bündelungs- und Spleißmodul zwei primäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen, ein primäres polarisierendes Bündelungsprisma, eine erste primäre Linse, eine primäre kombinierte Halbwellenplatte und eine zweite primäre Linse umfasst, wobei das von den beiden primären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen emittierte Laserlicht, nachdem es durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma gebündelt wurde, nacheinander die erste primäre Linse, die primäre kombinierte Halbwellenplatte und die zweite primäre Linse passiert und danach ausgegeben wird, und wobei die primäre kombinierte Halbwellenplatte vier verschiedene Halbwellenplatten umfasst; und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen die gleiche Struktur aufweisen und jeweils eine erste primäre Sub-Halbwellenplatte, eine zweite primäre Sub-Halbwellenplatte, ein primäres subpolarisierendes Bündelungsprisma, eine erste primäre Sublinse, eine primäre subkombinierte Halbwellenplatte und eine zweite primäre Sublinse umfasst, und wobei die primäre subkombinierte Halbwellenplatte zwei verschiedene Halbwellenplatten umfasst, und wobei die beiden primären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen jeweils als ein erster primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen und ein zweiter primärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen aufgezeichnet werden; und wobei die von den vier Abtastmodulen in derselben Abtasteinheit emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils ein erster Pfad von Teillaserlicht, ein zweiter Pfad von Teillaserlicht, ein dritter Pfad von Teillaserlicht und ein vierter Pfad von Teillaserlicht aufgezeichnet werden, und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht durch den ersten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wird und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, was insbesondere wie folgt ist: und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht durch den ersten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wird und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, was insbesondere wie folgt ist: und wobei der erste Pfad von Teillaserlicht nach Passieren der ersten primären Sub-Halbwellenplatte durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, und wobei der zweite Pfad von Teillaserlicht nach Passieren der zweiten primären Sub-Halbwellenplatte von dem primären subpolarisierenden Bündelungsprisma reflektiert und mit dem ersten Pfad von Teillaserlicht, der durch das primäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt wird, und wobei dann der erste Pfad von Teillaserlicht und der zweite Pfad von Teillaserlicht gemeinsam die erste primäre Sublinse passieren und auf zwei verschiedenen Halbwellenplatten der primären subkombinierten Halbwellenplatte auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse zwei Teilabtastbereiche bilden, und wobei die beiden Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind; und wobei die gebündelten beiden Pfade von Teillaserlicht wieder die zweite primäre Sublinse passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, und wobei die beiden Pfade von Laserlicht, die die primäre subkombinierte Halbwellenplatte passierten, denselben Polarisationszustand haben; und wobei der dritte Pfad von Teillaserlicht und der vierte Pfad von Teillaserlicht durch den zweiten primären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt und dann durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma reflektiert werden, und wobei sie dann mit dem gebündelte Laserlicht, das durch das primäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt werden; und wobei sie dann gemeinsam die erste primäre Sublinse passieren und auf vier verschiedenen Halbwellenplatten der primären kombinierten Halbwellenplatte auf der hinteren Fokusebene der ersten primären Sublinse vier Teilabtastbereiche bilden, und wobei die vier Teilabtastbereiche durch einen Abstand von einem Teilabtastbereich beabstandet sind, und wobei sie schließlich die zweite primäre Linse passieren und dann in kollimiertes Laserlicht umgewandelt werden, das dann an das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul ausgegeben wird, und wobei die vier Pfade von Laserlicht, die die primäre kombinierte Halbwellenplatte passierten, denselben Polarisationszustand haben.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das sekundäre Bündelungs- und Spleißmodul zwei sekundäre optische Teilpfade zum Bündeln und Spleißen, ein sekundäres polarisierendes Bündelungsprisma und eine sekundäre Linse umfasst, wobei das von den beiden sekundären optischen Teilpfaden zum Bündeln und Spleißen emittierte Laserlicht, nachdem es durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma gebündelt wurde, die sekundäre Linse passiert und dann auf den dichroitischen Farbfilm eingestrahlt wird; und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen die gleiche Struktur aufweisen und jeweils ein sekundäres subpolarisierendes Bündelungsprisma, eine erste sekundäre Sublinse und eine zweite sekundäre Sublinse umfasst, und wobei die beiden sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen jeweils als ein erster sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen und ein zweiter sekundärer optischer Teilpfad zum Bündeln und Spleißen aufgezeichnet werden; und wobei das gebündelte Laserlicht der von den vier primären Bündelungs- und Spleißmodulen emittierten vier Pfade von Teillaserlicht jeweils als ein erster Pfad von subgebündeltem Laserlicht, ein zweiter Pfad von subgebündeltem Laserlicht, ein dritter Pfad von subgebündeltem Laserlicht und ein vierter Pfad von subgebündeltem Laserlicht aufgezeichnet wird; und wobei der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht, nachdem sie durch dem ersten sekundären optischen Teilpfad zum Bündeln und Spleißen gebündelt wurden, durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgehen, was insbesondere wie folgt ist: dass der erste Pfad von subgebündeltem Laserlicht, nachdem er durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma hindurchging, und der zweite Pfad von subgebündeltem Laserlicht, der durch das sekundäre subpolarisierende Bündelungsprisma reflektiert wurde, miteinander gebündelt werden, wobei sie gemeinsam die erste sekundäre Sublinse passieren und auf der hinteren Fokusebene der ersten sekundären Sublinse acht Teilabtastbereiche bilden, und wobei es sich bei den acht Teilabtastbereichen um gleichmäßig geteilte zwei Reihen von Abtastbereichen handelt, die durch Spleißen von jeweiligen vier Teilabtastbereichen des ersten Pfades von subgebündeltem Laserlicht und des zweiten Pfades von subgebündeltem Laserlicht gebildet sind, und wobei die beiden Reihen von Abtastbereichen durch einen Abstand von einem Abtastbereich voneinander beabstandet sind; und wobei der dritte Pfad von subgebündeltem Laserlicht und der vierte Pfad von subgebündeltem Laserlicht durch den zweiten sekundären optischen Teilpfade zum Bündeln und Spleißen gebündelt und dann durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma reflektiert werden, und wobei sie dann mit dem gebündelte Laserlicht, das durch das sekundäre polarisierende Bündelungsprisma hindurchgeht, gebündelt werden, und wobei sie schließlich gemeinsam die sekundäre Linse passieren und auf der hinteren Fokusebene der sekundären Linse ein vollständiges rechteckiges Abtastfeld in einem 4 × 4-Array bilden, das durch 16 Teilabtastbereiche gebildet ist.
Ellipsoidisches halbkugelförmiges Zwei-Photonen-Mikroskop mit großem Sichtfeld und hohem Durchsatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Photomultiplier-Detektionsarray ein Array von 4 × 4 Photomultipliern ist, wobei jedes Photomultiplier der Fluoreszenzdetektion im bildgebenden Sichtfeld eines Abtastmoduls entspricht.