DE112009004267B4

DE112009004267B4 - Rekombinantes Antigen für den Nachweis vonToxokarose

Info

Publication number: DE112009004267B4
Application number: DE112009004267T
Authority: DE
Inventors: Suharni Mohamad; Rahmah Binti Noordin
Original assignee: Universiti Sains Malaysia (USM)
Current assignee: Universiti Sains Malaysia My
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2013-06-06
Anticipated expiration: 2029-02-28
Also published as: US8962259B2; MY160430A; WO2010068084A1; GB2479279A; US20120077187A1; GB201108282D0; JP2012511325A; JP5614409B2; GB2479279B; BRPI0922812A2; DE112009004267T5

Abstract

Ein Vektor, umfassend eine Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Antigen zum Nachweis von Toxokarose. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der ein Polynucleotid des TES-Gens aufweist, und das Polypeptid des rekombinanten TES-Antigens, welches von in vitro kultivierten Toxocara-Larven erhalten worden ist. Sie stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis von Toxokarose unter Verwendung des rekombinanten TES-Antigens bereit.
Hintergrund der Erfindung
Toxokarose ist eine Helminthen-Infektion des Menschen, welche von dem Rundwurm Toxocara canis oder Toxocara cati verursacht wird. Diese Infektion tritt auf, wenn embryonierte Eier, die vollständig entwickelte infektiöse Larven der Toxocara spp. enthalten, aufgenommen werden. Die Larven im humanen Darm werden die Darmwand durchdringen und durch die Blutgefäße wandern, um Leber, Muskeln und Lunge zu erreichen, sogar bis zum Auge und Gehirn. Deshalb ist ein Verfahren zur Diagnose und zum Nachweis von Toxokarose für deren Verhütung und Behandlung essenziell.
Es gibt kaum patentierte Technologien bezüglich des Nachweises oder der Diagnose von Toxokarose im Stand der Technik. Die meisten der serologischen und immunologischen Studien von Nematoden-Parasiten, die im Gegenstand der Technik offenbart sind, sind konzipiert für die Diagnose des Herzwurms, wie zum Beispiel Dirofilaria immitis, wie im US-Patent Nr. US 6 103 484 A beschrieben.
Einige patentierte Technologien haben das Ziel, Antikörper gegen verschiedene Spezies von Nematoden-Parasiten, einschließlich der Spezies der Gattungen Trichinella, Osteragia, Dirofilaria, Toxocara und anderer, nachzuweisen und zu induzieren. Im US-Patent Nr. US 5 948 644 A wird ein isoliertes Polynucleotidsegment, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein exkretorisches/sekretorisches Protein mit einem Molekulargewicht von 11 kDa, 17 kDa, 30 kDa, 37 kDa und 81 kDa codiert, offenbart. Abgesehen davon wird auch ein gereinigtes Antigen, erhalten von einer parasitischen Nematodenspezies, mit einem Molekulargewicht von 40 kDa im US-Patent Nr. US 5 871 738 A offenbart. Diese Erfindungen helfen, Antikörper gegen die Antigene und verwandten Moleküle und Antikörperzusammensetzungen, welche die Antikörper umfassen, Vaccine, welche die Antigene umfassen, und andere bereitzustellen. Jedoch sind diese Methoden komplex und die verwendeten Proteine sind nicht spezifisch.
Die meisten der patentierten Technologien verwenden Proteine mit höherem Molekulargewicht zum Nachweis von Nematoden-Parasiten. Darüber hinaus sind die offenbarten Verfahren nicht in der Lage, Toxokarose spezifisch nachzuweisen oder zu diagnostizieren. Obwohl die exkretorischen/sekretorischen Antigene, die von infektiösen Larven der zweiten Stufe (L2) von T. canis, in definiertem Medium in vitro gehalten, erhalten wurden, ausgiebig für die Immundiagnose von humaner Toxokarose verwendet wurden, zeigen Immunoassays unter Verwendung von Serumproben aus Patienten mit Askariose, Filariose und Strongyloidosis jedoch Kreuzreaktivitäten mit dem nativen TES.
Deshalb ist es wünschenswert für die vorliegende Erfindung, ein neues Antigen bereitzustellen, welches in der Lage ist, spezifisch Toxokarose nachzuweisen, um die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. Nachdem gezeigt wird, dass für den Nachweis von Toxokarose Antigene mit niedrigem Molekulargewicht spezifischer als hochmolekulare Proteine sind, kann ein geeignetes Protein, das von Toxocara-Larven erhalten worden ist, zur Entwicklung eines nützlicheren und effektiveren serodiagnostischen Markers für diese Krankheit eingesetzt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines rekombinanten Proteins oder Antigens, welches in der Lage ist, Toxokarose spezifisch und effektiv nachzuweisen oder zu diagnostizieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Antigens mit einem niedrigeren Molekulargewicht, welches sensitiver und spezifischer für den Nachweis von Toxokarose ist.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektors, der ein TES-Polypeptid exprimiert, welches als rekombinantes Antigen zum Nachweis von Toxokarose in einer biologischen Probe eingesetzt werden kann.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines spezifischen, sensitiven und verlässlichen Verfahrens zum Nachweis und zur Diagnose der Anwesenheit eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Mindestens eine der vorstehenden Aufgaben wird ganz oder teilweise durch die vorliegende Erfindung erfüllt, worin eine der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einen Vektor, der eine Polynucleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2, umfasst, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe beschreibt. Vorzugsweise ist der Vektor ein Gluthathion-S-Transferase(GST)-markierter Vektor.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine bakterielle Zelle, umfassend einen Vektor, welcher ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 exprimiert, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid ein rekombinantes Protein oder Antigen.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 1, codiert von einem Gluthathion-S-Transferasemarkierten Vektor und einem TES-26-Gen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe, umfassend: a) Klonieren einer Polynucleotidsequenz oder komplementären Sequenz davon, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 codiert: 2; b) Exprimieren des Klons in einem Expressionsvektor, um das Polypeptid zu erhalten; und c) Entwickeln eines Immunoassays unter Verwendung des Polypeptids, um einen Antikörper gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe nachzuweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Polynucleotidsequenz abgeleitet von einem offenen Leserahmen (ORF) oder vollständigen codierenden Sequenzen (cds) des TES-26-Gens. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor ein GST-markierter Vektor.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird unschwer erkennen, dass die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, um die genannten Aufgaben zu erfüllen und die genannten Vorteile und Ziele sowie die damit inhärent verbundenen zu erreichen. Die hier beschriebenen Ausführungsformen sollen keine Beschränkungen des Umfangs der Erfindung darstellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung sind in den Begleitzeichnungen die bevorzugten Ausführungsformen illustriert, anhand derer in Verbindung mit der folgenden Beschreibung die Erfindung, deren Aufbau und Funktionsweise und viele ihrer Vorteile unschwer verstanden und gewürdigt werden können.
1 ist die Aminosäuresequenz des Vektors, in den das Polypeptid zum den Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe inseriert ist.
2 ist das Polypeptid, welches die von dem ORF oder vollständigen codierenden Sequenzen (cds) des TES-26 codierte Aminosäuresequenz umfasst.
3 stellt die Nucleotidsequenzen der Oligonucleotide dar, welche bei der reversen Transcriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis und zur Identifizierung des TS-26-Gens und des Klonierungsvektors verwendet wurden, wie durch eine der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
4 ist die Darstellung eines elektrophoresierten Gels der amplifizierten RT-PCR-Produkte des TES-26-Gens wie durch eine der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, welche eine Bandengröße von 793 bp in Spur 2 zeigt. Spur 1 ist ein 100 bp-DNA-Größenmarker, während Spur 4 und Spur 5 die positive beziehungsweise negative Kontrolle für die RT-PCR-Reaktion sind.
5 ist das Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE)-Profil des gereinigten TES-26-GST-Fusionsproteins mit 69 kDa Molekulargewicht (Spur 3). Spur 1 ist der Proteingrößenmarker.
6 ist die Westernblot-Analyse eines rekombinanten TES-26-Antigens, sondiert mit verschiedenen Kategorien von Serum. Spur 1 ist der Proteingrößenmarker; Spuren 2–4 betreffen drei verschiedene Toxokarose-Patienten, Spur 5 betrifft einen Trichuriose-Patienten, Spur 6 betrifft einen Toxoplasmose-Patienten und Spuren 7 und 8 betreffen gesunde normale Individuen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Antigen für den Nachweis von Toxokarose. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein Polynucleotid des TES-Gens aufweist, und das Polypeptid des rekombinanten TES-Gens, welches von in vitro kultivierten Toxocara-Larven erhalten worden ist, bereit. Sie stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von Toxokarose unter Verwendung des rekombinanten TES-Antigens bereit.
Im Folgenden soll hier die Erfindung anhand der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und durch den Verweis auf die begleitende(n) Beschreibung und Zeichnungen beschrieben werden. Es versteht sich jedoch, dass die Beschränkung der Beschreibung auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die Zeichnungen lediglich zur Erleichterung der Erörterung der vorliegenden Erfindung dient und es wird in Betracht gezogen, dass Fachleute verschiedene Modifikationen vornehmen können, ohne über den Umfang der beigefügten Ansprüche hinauszugehen.
Die vorliegende Erfindung offenbart einen Vektor, der eine Polynucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 codiert, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Eine der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 1, codiert von einem Gluthathione-S-Transferase-markierten Vektor und einem TES-26-Gen. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des exprimierten Vektors mit dem TES-26-Protein, welche als SEQ-ID-NR. 1 angegeben ist. Die Aminosäuresequenz des TES-Polypeptids ist in 2 illustriert. Der bevorzugte Vektor, der zur Expression dieses Polypeptides verwendet wird, ist ein GST-markierter Vektor, welcher vorzugsweise die im Handel erhältliche pET42-Version „b” ist.
Vorzugsweise kann die Polynucleotidsequenz von einem ORF oder vollständigen cds eines TES-Gens, welches vorzugsweise ein TES-26-Gen ist, das für ein 26 kD-Protein codiert, erhalten werden. Die biologische Probe, welche zum Nachweis verwendet werden kann, umfasst humanes Serum, Plasma oder Gesamtblut (mit oder ohne Anti-Koagulans).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegende Erfindung ist eine bakterielle Zelle, die einen Vektor, welcher ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 exprimiert, beherbergt, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe. Die bakterielle Zelle ist ein Expressionswirt, welcher in vitro kultiviert werden kann. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der bakterielle Wirt BL21(DE3), XL1-Blue, DH5α, TOP10 oder NovaBlue, welche im Handel erhältlich sind, sein. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird BL21(DE3) als bakterieller Wirt verwendet. Jedoch soll die vorliegende Erfindung nicht die Verwendung geeigneter Wirte, die für die Expression des Polypeptids erhältlich sind, beschränken.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2 zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe. Dieses Polypeptid ist unglycosyliert. Die Glycosylierung des Polypeptids kann zu einer Erhöhung von Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen andere Organismen, welche die Zuckergruppierungen erkennen, führen. Deshalb wird das unglycosylierte Polypeptid der Erfindung von solchen Kreuzreaktionen nicht beeinflusst werden. Es hat auch ein niedriges Molekulargewicht und ist geeignet zum Nachweis und zur Identifizierung der Anwesenheit von Antikörpern gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe auf sensitive, spezifische und verlässliche Weise.
Das rekombinante Protein, auch als rTES-26 bekannt, kann als einziges Antigen oder in Kombination mit anderen rekombinanten Antigenen wie zum Beispiel rTES-30 und/oder rTes-120 zum Nachweis von humaner Toxokarose verwendet werden. Daneben kann dieses rTES-26 in Immunoassays wie Mikroplatten-ELISA-, Dot-blot-, Westernblot- und Agglutinierungs-Assays eingesetzt werden. Es kann auch zur Entwicklung von Schnelltests wie Durchstromtests und Immunchromatographie-Tests (Querstrom-Test) eingesetzt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe, umfassend: a) Klonieren einer Polynucleotidsequenz oder einer komplementären Sequenz davon, codierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2; b) Exprimieren des Klons in einem Expressionsvektor, um das Polypeptid zu erhalten; und c) Entwickeln eines Immunoassays unter Verwendung des Polypeptids, um einen Antikörper gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe nachzuweisen.
Wie in der vorstehenden Beschreibung angegeben, ist die verwendete Polynucleotidsequenz von einem ORF oder vollständigen codierenden Sequenzen eines TES-Gens, welches vorzugsweise das TES-26 ist, abgeleitet. In 2 ist das in dem vorliegenden Verfahren verwendete Polynucleotid dargestellt. Dieses Polypeptid wird von dem TES-26-Gen codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 umfasst.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung offenbart einen Satz von Primern, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ-ID-NR. 3 und SEQ-ID-NR. 4, die zum Nachweis und zur Identifizierung des TES-26-Gens in einer biologischen Probe, die Toxocara spp. enthält, konzipiert wurden. Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer von SEQ-ID-NR. 3 und SEQ-ID-NR. 4, wie in 3 gezeigt, sind unter Heranziehung des ORF oder der vollständigen codierenden Sequenzen des TES-26-Gens, erhalten von GenBank, konzipiert. Eine RT-PCR wird vorzugsweise unter Verwendung von RNA aus der biologischen Probe durchgeführt, um das Nucleotidfragment des TES-26-Gens zu erhalten.
Anschließend wird das für TES-26 codierende Gen, welches ein frisch gereinigtes RT-PCT-Produkt mit einem A-Ende ist, vorzugsweise in einen Klonierungsvektor kloniert, der vorzugsweise ein TOPO-Vektor ist. Jedoch soll die vorliegende Erfindung nicht die Verwendung irgendwelcher anderer kommerziell erhältlichen PCR-Klonierungsvektoren, wie zum Beispiel pJET1.2, pT7Blue T, pCRTM II, pGEM[R]-T oder der pLUG^®-Multi-TA-Klonierungsvektor, beschränken. Ein geeigneter TOPO-Vektor, der im Handel erhältlich ist, ist der TOPO-TA-Klonierungsvektor. Das klonierte Plasmid wird dann in eine kompetente Bakterienzelle transformiert, welche vorzugsweise ein im Handel erhaltener Escherichia coli-Wirt ist. Die Orientierung des rekombinanten Plasmids kann durch PCR-Screening unter Verwendung von sowohl TES-Gen-spezifischen Primern (SEQ-ID-NR. 3 und SEQ-ID-NR. 4) und Vektor-spezifischem M13R-Primer (SEQ-ID-NR. 5) mit TES-Gen-spezifischem reversen Primer (SEQ-ID-NR. 4) bestätigt werden. Die Primersequenzen sind in 3 gezeigt. Die Anwesenheit des gentechnisch hergestellten Gens wird vorzugsweise durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Während des Klonierungsprozesses können Basenmutationen auftreten. Deshalb kann eine PCR-basierte, stellenspezifische Mutagenese in vitro durchgeführt werden, um die in dem rekombinanten TES-26-TOPO-Vektor-Plasmid aufgetretenen Basenfehler vor der Transformation in den Expressionswirt zu korrigieren. Ein im Handel erhältlicher Basenmutations-Reparaturkit kann verwendet werden. Wie im Elektrophoresegel in 4 gezeigt, zeigen die amplifizierten RT-PCR Produkte des ORF des für TES-26 codierenden Gens (Spur 2) eine Bandengröße von etwa 793 pp.
Wie in einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, können das rekombinante Plasmid und der Expressionsvektor vor der Subklonierung in einen GST-markierten Vektor, beispielsweise den Vektor pET42-Version „b”, mit einem Restriktionsenzym verdaut werden. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht die Verwendung anderer geeigneter Expressionsvektoren, welche zur Produktion des Ziel-Polypeptids zur Verfügung stehen, beschränken. Nach der Verifizierung durch DNA-Sequenzierung wird das konstruierte Plasmid einem Transformationsprozess unterworfen, in dem eine bakterielle Zelle oder ein Wirt eingesetzt werden. Wie in der vorhergehenden Beschreibung angegeben, ist die bakterielle Zelle vorzugsweise BL21(DE3). Jedoch können andere geeignete Wirte, die zur Verfügung stehen, ebenfalls zur Expression dieses Polypeptids eingesetzt werden.
Die rekombinanten Bakterien können bis zur Mitte der logarithmischen Phase kultiviert werden und die Expression wird dann mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Kultur kann nach 3 Stunden geerntet und unter nativen Bedingungen gereinigt werden, wenn das rekombinante Protein in ausreichenden Mengen in aktiver oder löslicher Form vorliegt. Es kann ein Affinitätsreinigungsverfahren eingesetzt werden, wobei die rekombinanten bakteriellen Zellen in Lysisbuffer lysiert und unter Verwendung von GST-Harz gereinigt werden. Diese GST-Markierung wird dann durch stellenspezifische Proteasen, wie zum Beispiel Faktor Xa-Enzym, von Restriktionsgrad abgespalten oder entfernt.
Nach der Abspaltung des Zielproteins wird Faktor Xa durch Affinitätschromatografie entfernt. Die Spaltung oder Entfernung kann durch Elektrophorese bestätigt werden. Eines der am meisten bevorzugten Verfahren, welche eingesetzt werden können, um die Größen von Protein und Polypeptid zu bestimmen, ist SDS-PAGE. Jedoch soll die Erfindung nicht die Verwendung anderer geeigneter Methoden beschränken. Wie in 5 gezeigt, beträgt die exprimierte Zielproteingröße, bestimmt mittels SDS-PAGE-Analyse, etwa 69 kDa. Nachdem die GST-Markierung ein großes Molekül von etwa 26 kDa ist, welches die Immunogenizität des Proteins beeinflussen kann, war es somit erforderlich, die GST-Markierung vor der Entwicklung eines Immunoassays zu entfernen. Nach Abspaltung oder Entfernung der GST-Markierung zeigt das Molekulargewicht des rekombinanten TES-26-Proteins etwa 30 bis 34 kDa.
Optional kann eine Analyse der Immunreaktivität des rekombinanten Proteins vorgenommen werden. Die bevorzugte eingesetzte Methode ist ein Westernblot. 6 zeigt die Westernblot-Analyse des rekombinanten TES-26-Antigens, sondiert mit verschiedenen Kategorien von Serum, einschließlich Serum vom Patienten, die unter Toxokarose, Trichuriose, Toxoplasmose leiden, und Serum von gesunden normalen Individuen. Wie in 6 dargestellt, ist die Antigenizität des abgespaltenen rekombinanten TES-26-Proteins nur eine Reaktivität in Serumproben aus Toxokarose-Patienten. Keines der Seren aus gesunden Individuen und anderen Helminthen-Infektionen zeigt irgendeine Reaktivität.
Wie in der vorstehenden Beschreibung angegeben, wird das gereinigte rekombinante TES-26-Protein dann zur Entwicklung eines ELISA-Tests verwendet, welches vorzugsweise ein IgG4-ELISA-Test für den Nachweis spezifischer Antikörper in Seren aus Patienten ist, die mit T. canis infiziert sind. Das bevorzugte Verfahren wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben. Anschließend werden die Sensitivität und die Spezifität dieser Assays hinsichtlich ihrer Eignung für den Nachweis von Toxokarose unter Verwendung eines Spektrums von Toxokarose-Seren, gesunden normalen Individuen und anderen Helminthen-bezogenen Infektionen untersucht. Das IgG4-ELISA-rTES-26-Antigen der Erfindung ist in der Lage, ein Sensitivitätsniveau von 78% bis 85% und ein Spezifitätsniveau von 95% bis 99% zu erreichen.
Die vorliegende Offenbarung umfasst den Inhalt der beigefügten Ansprüche sowie den der vorstehenden Beschreibung. Obwohl diese Erfindung in ihrer bevorzugten Form mit einem gewissen Grad an Spezifität beschrieben wurde, versteht es sich, dass die vorliegende Offenbarung der bevorzugten Ausführungsformen nur als Beispiel erfolgt ist und dass zahlreiche Änderungen in Details der Gestaltung und der Kombination und Anordnung von Teilen vorgenommen werden können ohne über den Umfang der Erfindung hinauszugehen.
BEISPIEL
Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben werden. Diese Beispiele werden bereitgestellt, um verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu erläutern, und sollen in keiner Weise die offenbarte Erfindung beschränken, welche nur durch die Ansprüche beschränkt wird.
Beispiel 1: PCR-Amplifizierung der codierenden Sequenz des TES-26-Gens
Die Sequenzen (offener Leserahmen oder vollständige cds) des TES-26-Gens wurde von Genbank (Hinterlegungsnummer: U29761) erhalten. Primer wurden konstruiert und analysiert mit dem Vektor NTi Version 6.0 (Informac Ing., Invitrogen, USA). Die Sequenzen der verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer sind in SEQ-ID-NR. 3 beziehungsweise SEQ-ID-NR. 4 gezeigt. RT-PCR wurde unter Verwendung des kommerziellen StrataScript^TM One-Tube RT-PCR-Systems mit dem Easy-A^TM Hight-Fidelity PCR Cloning Enzyme Kit (Stratagene, USA) durchgeführt. Die experimentelle Reaktion umfasste 39,5 μl RNase-freies Wasser, 5 μl 10 × RT-PCR-Puffer, 1 μl Vorwärts- und Rückwärts-Primer (jeweils 20 pmol/μl) 1 μl 40 mM dNTP-Mix, 1 μl mRNA-Probe, 1 μl von verdünntem StrataScript RT (2,5 U/μl) 0,5 μl Easy-A HiFi PCR-Klonierungsenzym. Alle Komponenten wurden nacheinander in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen zugegeben, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl zu ergeben. Der Amplizierungsprozess wurde wie folgt durchgeführt: Synthese des ersten Stranges bei 42°C für 15 Minuten; StrataScript RT-Inaktivierung bei 95°C für 1 Minute; Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden; Matrize-Primer-Verschmelzung bei 60°C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 68°C für 2 Minuten (40 Zyklen) und endgültige Verlängerung bei 68°C für 5 Minuten.
Beispiel 2: Klonierung von Genen, die für TES-26 codieren
Das frisch gereinigte RT-PCT-Produkt, das mit einem A-Ende versehen war, wurde in den TOPO TA-Klonierungsvektor (PCR2.1 TOPO TA – Invitrogen, USA) kloniert, gefolgt von Transformation in den TOP10-E. coli-Wirt (Invitrogen, USA). Die Orientierung des rekombinanten Plasmids wurde dann durch PCR-Screening unter Verwendung von sowohl genspezifischen Primern (TES26F und TES26R) und vektorspezifischem Primer (M13R) und genspezifischem Primer (TES26R) bestätigt. Dem folgte eine DNA-Sequenzierung und die Sequenz des gentechnisch hergestellten Gens wurde dann mit den veröffentlichten Sequenzen unter Verwendung von Vektor NTi-Software Version 6.0 (Informac Inc., Invitrogen, USA) verglichen.
Beispiel 3: Reparatur von Basenmutationen
Eine PCR-basierte, stellenspezifische Mutagenese wurde in vitro durchgeführt, um vier Basenfehler (124, 502, 613 und 768 bp) im rekombinanten TES-26-Plasmid (TES26/TOPO) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (QuickChange XL, Stratagene, USA) zu korrigieren. Die amplifizierten RT-PCR-Produkte des ORF des für TES-26 codierenden Gens werden mittels Gelelektrophorese gezeigt.
Beispiel 4: Subklonierung in bakterielle Expressionsvektoren
Rekombinantes Plasmid und Expressionsvektor wurden mit EcoR1-Enzym (Fermentas, USA) verdaut. Nach der Verdauung wurde das rekombinante TES-26-Plasmid in pET42-Version „b” (Novagen, Deutschland) unter Verwendung des T4 Rapid-DNA-Ligation-Kits (Roche Diagnostics, Deutschland) subkloniert. Nach Verifizierung des Konstrukts durch DNA-Sequenzierung wurde das rekombinante Plasmid in einen Expressionswirt, BL21 (DE3) (Novagen, Deutschland), transformiert.
Beispiel 5: Expression und Reinigung von TES-26
Die rekombinanten Bakterien wurden in TB (”Terrific broth”), enthaltend 30 μg/ml Kanamycin, kultiviert und bei 37°C inkubiert bis die OD₆₀₀ die mittlere logarithmische Phase erreichte (OD₆₀₀ = 0,5). Die Expression wurde dann mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM bei 30°C in einem Inkubationsschüttler induziert. Die Kultur wurde dann nach 3 Stunden geerntet. Anschließend wurden die rekombinanten Bakterienzellen in Lysispuffer, enthaltend NaH₂PO₄, KH₂PO₄, NaCl und KCl, mittels einer French-Presse lysiert und unter Verwendung von GST-Harz (Novagen, Deutschland) gereinigt. Eine stellenspezifische Protease von Restriktionsgrad, Faktor Xa-Enzym, wurde zur spezifischen Spaltung/Entfernung der GST-Markierung unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Faktor Xa Cleavage-Capture-Kit, Novagen, Deutschland) verwendet. Nach Abspaltung des Zielproteins wurde Faktor Xa durch Affinitätschromatografie unter Verwendung von Xarrest^TM-Agarose (Novagen, Deutschland) entfernt. Die exprimierten Zielproteingrößen wurden mittels SDS-PAGE-Analyse bestimmt.
Beispiel 6: Westernblot
Die Immunreaktivität des rekombinanten Proteins wurde mittels einer Westernblot-Technik, basierend auf dem Nachweis von IgG4-Antikörper in Serumproben, analysiert. rTES-26 (20 μg/ml) wurde einer SDS-PAGE-Elektrophorese (10%) unterworfen und auf eine Nitrocellulose-Membran (Osmonic, USA) unter Verwendung eines halbtrockenen Transblots (BioRad, USA) überführt. Die Membran wurde in Streifen geschnitten, mit 1%-iger Casein-Blockierungslösung (Roche Diagnostic, Deutschland) für eine Stunde blockiert. Anschließend wurden die Streifen mit Serumproben inkubiert (1:100 verdünnt in 0,5%-iger Blockierungslösung) bei 4°C über Nacht; gefolgt von einem monoklonalen Antihuman-IgG4-HRP (Zymed, USA) mit 1:2000 (in 0,5%iger Blockierungslösung) für 30 Minuten. BM Chemilumineszenz-Blotting-Reagenz (Roche Diagnostic, Deutschland) und Röntgenfilme (Kodak, USA) wurden zur Entwicklung der Blots verwendet.
Beispiel 7: Enzymgekoppelter Immunosorbens-Assay (ELISA)

Ein ELISA auf Basis des rTES-26-Antigens wurde entwickelt und Laborüberprüfungen wurden unter Verwendung eines Spektrums von Seren, umfassend Toxocara-Infektionen, andere Helminthenbezogene Infektionen und gesunde Individuen, durchgeführt, um die Sensitivität und Spezifität des Assays zu bestätigen. Jede Mulde einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte mit flachem Boden (NUNC IMMUNO^TM Maxisorp, Dänemark) wurde mit 100 μl des rTES-26 bei einer optimalen Konzentration von 10 μg/ml in 0,02 M Hydrogencarbonatpuffer (pH 9,6) beschichtet. Die Platte wurde dann bedeckt und in einer Feuchtigkeitskammer bei 4°C über Nacht und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Platte wurde in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 0,05 (v/v) Tween-20 (PBS-T) pH 7,2, gewaschen, um etwaiges nicht adsorbiertes Antigen zu entfernen. Nach einem Waschschritt von 5 × 5 Minuten wurde jede Mulde mit 1,0%-igem Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics, Deutschland) für 1 Stunde bei 37°C blockiert. Die Platte wurde erneut wie zuvor beschrieben gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Duplikaten für jede Serumverdünnung (100 μl Humanserum, verdünnt 1:50 in PBS) zu jeder Mulde und bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Nach Abwaschen des überschüssigen Serums wurde monoklonaler Antihuman-IgG4-HRP der Maus (Zymed, USA) in einer optimalen Verdünnung von 1:1000 (in PBS) zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt wurde das Substrat 2',2-Azino-bis[3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure-Diammoniumsalz] (ABTS) (Roche Diagnostics, Deutschland) zugegeben und die optischen Dichten (O. D) wurden nach 30 Minuten bei einer Extinktion von 405 nm (Referenz 490 nm) unter Verwendung eines ELISA-Spektralphotometers (Tecan, Schweden) gemessen. Eine O. D-Ablesung von 0,200 wurde als Ausschlusswert (COV) für die Bestimmung eines positiven Werts oder zur Unterscheidung zwischen positiv und negativ verwendet. Dieser COV basierte auf der mittleren O. D-Ablesung plus 3 Standardabweichungen (SD) von 30 Serumproben von gesunden Individuen. Die O. D-Ablesungen wurden mit PBS (als Blindprobe) verglichen und O. D-Ablesungen gleich und/oder größer als 0,200 wurden als positive Fälle interpretiert. Die Ergebnisse von Sensitivitäts- und Spezifitätsbeurteilungen der IgG4-ELISA sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Sensitivitätsbeurteilung:

IgG4-ELISA	Gesamt	Positiv	Negativ	Sensitivität (%)
rTES-26	30	24	6	80,0

Spezifitätsbeurteilung:

Typen von Infektionsseren	Negativ bei rTES-26-ELISA
A. lumbricoides, T. trichiura, Hakenwurm	27/28 (1)
Strongyloides stercoralis	4/5 (1)
Gnathostoma spinigerum	1/1 (0)
Entamoeba histolytica	28/30 (2)
Brugia malayi (mikrofilarämisch)	26/28 (2)
Toxoplasma condii	18/20 (2)
Gesunde Individuen	100/100 (0)
Gesamt	204/212 (8)
	Spezifität (96,2%)

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Vektor, umfassend eine Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 codiert, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Vektor nach Anspruch 1, der ein Glutathion-S-Transferase-markierter Vektor ist.
Bakterielle Zelle, umfassend einen Vektor, der ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 exprimiert, zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2 zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, das ein rekombinantes Protein ist.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 1, codiert von einem Glutathion-S-Transferase-markierten Vektor und einem TES-26-Gen.
Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe, umfassend: a) Klonieren einer Polynucleotidsequenz oder einer komplementären Sequenz davon, codierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 2; b) Exprimieren des Klons in einem Expressionsvektor, um das Polypeptid zu erhalten; und c) Entwickeln eines Immunoassays unter Verwendung des Polypeptids zum Nachweis eines Antikörpers gegen Toxocara spp. in einer biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Polynucleotidsequenz von einem offenen Leserahmen oder vollständigen codierenden Sequenzen des TES-26-Gens abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Expressionsvektor ein Glutathion-S-Transferase-markierter Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Protein ist.