DE112009000338T5

DE112009000338T5 - Verbesserte Verfahren für eine Gas- und/oder Dampfphasenanalyse biologischer Assays

Info

Publication number: DE112009000338T5
Application number: DE112009000338T
Authority: DE
Inventors: Andrew David Pris
Original assignee: Morpho Detection LLC
Current assignee: Smiths Detection Inc
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2009-02-11
Publication date: 2011-06-09
Also published as: GB2471210A; CN102066933A; US20090203149A1; GB201012572D0; WO2009137125A2; CA2713735A1; WO2009137125A3

Abstract

Verfahren zum Bestimmen eines Targets in einer Probe, wobei das Verfahren der Reihe nach umfasst:
das Durchführen eines Assays, wobei der Assay ein dispergiertes Trägerteilchen, das an einen ersten Targetbinder mit einer bekannten Targetselektivität gebunden ist, einen zweiten Targetbinder, der an eine Umwandlerkomponente gebunden ist, und eine Testprobe, die ein Target in einer ersten wässrigen Flüssigkeit enthalten kann, aufweist; wobei die Umwandlerkomponente selektiv an das Target bindet, das selektiv an das Trägerteilchen gebunden ist, in einer Menge, die abhängig von einer Konzentration des Targets in der Testprobe ist;
das Konzentrieren und Trennen des Trägerteilchens von der ersten wässrigen Flüssigkeit;
das Ersetzen der ersten wässrigen Flüssigkeit durch eine zweite wässrige Flüssigkeit mit einem Volumenanteil des Volumens der ersten wässrigen Flüssigkeit und Dispergieren des Trägerteilchens darin;
das Zuführen eines Substrates zu dem dispergierten Trägerteilchen in der zweiten wässrigen Flüssigkeit und Umwandeln des Substrates mit der Umwandlerkomponente, um ein...

Description

HINTERGRUND
Die vorliegende Offenbarung betrifft allgemein verbesserte Verfahren um einen biologischen Assay zur Analyse durch Gas- und Dampfphasen-Analyseverfahren auszuführen und insbesondere die Verwendung von Trägerteilchen als einen Träger in einem Assay, um die Gas- und Dampfphasenanalyse zu verbessern.
Gas- und Dampfphasen-Analyseverfahren wie Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) können verwendet werden, um geringe Konzentrationen von Sprengstoffen, Drogen, chemischen Waffen und anderen interessierenden Chemikalien nachzuweisen und zu identifizieren. Dies wird durch das IMS-Verfahren, wie in U.S. Pat. Nr. 3,699,333 , U.S. Pat. Nr. 5,027,643 , U.S. Pat. Nr. 5,491,337 und U.S. Pat. Nr. 6,690,005 beispielhaft gezeigt, erreicht.
In der Vergangenheit wurden Anstrengungen unternommen, um einen biochemischen Test oder Assay so zu konfigurieren, dass ein Gas- oder Dampfphasenanalysegerät den Assay analysieren konnte und fähig war, die Anwesenheit und/oder Konzentration eines bestimmten Targets zu bestimmen. In diesen biologischen Assays mittels standard-kompetitiven oder -nicht-kompetitiven Assayverfahren ist eine markierte, das Target bindende Komponente anwesend, indem die Markierung entweder selbst in die Gasphase überführt werden kann oder verwendet werden kann, um (ein) weitere(s) Molekül(e) in ein Produkt umzuwandeln, das in die Gasphase überführt werden kann, wo es durch das Gasphasen-Analysegerät zur quantitativen oder qualitativen Information über das untersuchte Target analysiert wird. Regina et al. ( WO 88/06732 ) hat das beschriebene Verfahren des direkten Analysierens der Markierung, die in die Gasphase überführt wurde, gezeigt. Das letztere Verfahren, das eine Markierung, die andere Molekül(e) in eine Gasphasenspezies umwandelt, einsetzt, hat einen Vorteil in der Analyse biologischer Spuren, da eine einzige Markierung verwendet wird, um zahlreiche Moleküle in ein Produkt, das leicht in die Gasphase überführt wird, umzuwandeln. Dies amplifiziert wirksam die Anwesenheit des Targets und hilft bei seinem Nachweis. Dieser zweite Ansatz wurde auch in mehreren verschiedenen Ausführungsformen gezeigt, die alle begrenzte Nachweisfähigkeiten aufgrund der eingesetzten Assayverfahren aufweisen.
Eine bestimmte Ausführungsform dieses zweiten Ansatzes ist der nicht-kompetitive enzymgekoppelte Immunabsorptionstest (engt.: enzyme linked immunosorbant assay, ELISA), in dem das Target an einen festen Träger angebracht wird und mit einem biologischen Erkennungsliganden (z. B. Antikörper), der mit einem Enzym modifiziert ist, spezifisch markiert wird. Nach ausreichendem Waschen wird der Träger mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die mehrere Vorläufermoleküle enthält, die das Enzym wiederhohlt in eine Form, die durch Gasphase-Analysegeräte nachweisbar ist, umwandelt. In einem ELISA steht die Menge des nachweisbaren Moleküls, das gebildet wird, in direktem Bezug zu der Konzentration des anwesenden Targets. In einem verwandten ELISA Verfahren, der kompetitiven Ausführung, wird die Enzymmarkierung von dem Träger verdrängt oder muss mit dem Target konkurrieren, um an den Träger zu binden, wobei beide Fälle darin resultieren, dass sowie die Targetkonzentration steigt weniger nachweisbares Molekül gebildet wird. Somit kann der Wert, der durch das Gasphase-Analysegerät bereitgestellt wird, dennoch verwendet werden, um mit der Menge an Target, die in der Probe anwesend ist, in Bezug gesetzt zu werden. Beispielhafte Referenzen, die diese Standardassayausführung und -Terminologie beschreiben, sind in E. P. Diamandis, & T. K. Christopoulos (Immunoassay, Academic Press: 1996); S. S. Deshpande (Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development; Springer: 1996); und J. R. Crowther (The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology); Humana: 1996) enthalten.
Insbesondere, Diamond et al. ( U.S. Pat. 4,629,689 ), Snyder et al. (Journal of Microbiological Methods. 27 (1996) 81–88 & U. S. Statutory Invention Registration H1563, 7/2/1996), und Eiceman (Field Analytical Chemistry and Technology. 1(4):213–226, 1997) zeigen alle einen ELISA, der mit einem Gasphasen-Analysegerät analysiert wird. In jedem dieser beispielhaften Beispiele beschränkt das Verfahren, durch das der ELISA ausgeführt wird, jedoch die Einfachheit, Effizienz und den analytischen Nutzen des gesamten biologischen Nachweisverfahrens.
Diamond et al. versucht dieses Verfahren durch Konzentrieren der Gasphasenspezies nach Verdampfung zu verbessern. Eiceman et al. versucht es nicht durch Analysieren des Gasraums zu verbessern, sondern stattdessen dadurch einen Teil des nicht-konzentrierten Reaktionsvolumens oberhalb eines massiven Trägers zu abzunehmen und ihn von einem Filterpapierstreifen aus zu analysieren. Snyder et al. versucht die bekannte Methodik durch Verringern der enzymatischen Reduktionsvolumina durch unausgereift und ineffiziente Verfahren wie ”Paddles/Tissues” Kombinationen zu verbessern.
In allen Fällen wäre es besonders vorteilhaft einen allgemeineren Ansatz einzusetzen, um den Umwandler (oder das Enzym) vor der Produktion des nachgewiesenen Moleküls zu konzentrieren. Es ist gut bekannt, dass es in den enzymatischen oder anderen katalytischen Umwandlungsreaktionen sehr wünschenswert ist, die Konzentration des Katalysators oder Enzyms in der Reaktionslösung zu steigern. Das steigert nicht nur die Reaktionsgeschwindigkeit für den Umwandlungsprozess, so dass eine größere Veränderung in der Menge nachweisbarer Moleküle in einer bestimmten Zeitspanne ermöglicht wird, sondern erreicht dies auch in einem kleineren Flüssigkeitsvolumen. Nachdem die Menge an Flüssigkeit, die in ein Gasphasen-Analysegerät eingebracht werden kann, beschränkt ist, kann durch Ausführen der Umwandlung in einem geringeren Flüssigkeitsvolumen ein größerer Anteil der Reaktionslösung untersucht werden, so dass dem Analysegerät ein größerer Anteil des nachweisbaren Moleküls zugeführt wird, bei einer gleichzeitig verringerten Menge an Flüssigmatrix, die gewöhnlich die Effizienz der Verdampfung und/oder Analyse kleiner Moleküle behindert oder verringert.
Ein Verfahren um diese Konzentrierung des Umwandlers vor der Produktion des Gasphasenmoleküls zu erreichen kann in einem gesonderten Wissenschaftsbereich gefunden werden, in dem eine Vielzahl von Targetassayuntersuchungen dispergierte Bindeteilchen eingesetzt haben, die Mikrometer- oder Nanometergröße und spezifische Erkennungsfähigkeiten (z. B. modifiziert mit Antikörpermarkierungen) aufweisen. Es wurde gezeigt, dass diese dispergierten Bindeteilchen die Effizienz und Ausführung des biologischen Assays sowohl durch Erhöhen der Oberfläche für den Assay verbessern, als auch dadurch, dass sie eine gesteigerte Targeterkennungskinetik über festen Substraten oder nicht-dispergierten Trägerbeads ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Hinzufügung spezifischer physikalischer und chemischer Eigenschaften (z. B. elektrostatisch, Dichte, magnetisch, Brechungsindex, optisch) zu den Mikrometer oder Nanometer großen dispergierten Bindeteilchen eine effizientere Trennung und, für diese Anwendung wichtiger, eine Konzentration der Targetspezies. Ein beispielhaftes Beispiel dispergierter Bindeteilchen für Assays ist in dem U.S. Pat. 4,628,037 zu finden.
Eine Kombinationen dieser zwei Arbeitsbereiche (d. h. Gasphasenanalyse eines Bioerkennungsschemas und Einsatz von Mikrometer oder Nanometer großen dispergierten Bindeteilchen), um die Bindungskinetik, die Einfachheit einer Trennung und die Konzentration von Markierungen zu steigern, wurde bisher nicht spezifisch gezeigt, beschrieben, oder Bezug darauf genommen.
Dementsprechend existiert ein Bedarf für ein Verfahren, das die Art, wie ein Assay, der durch ein Gas- oder Dampfphasen-Analysegerät analysiert werden soll, ausgeführt wird zu verbessern, um die Effizienz der Bindungserkennung zu steigern, die Effizienz der Assaymarkierungsumwandlungsreaktion zu steigern, den Anteil an Assaykomponenten, die dem Analysegerät zugeführt werden, zu steigern und um das Assayprobevolumen, das dem Analysegerät zugeführt wird zu verringern.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Hier offenbart sind Verfahren zur Gas- und/oder Dampfanalyse biologischer Assays. In einer Ausführungsform, wird ein Verfahren zum Bestimmen eines Targets in einer Probe offenbart, das Verfahren umfasst Durchführen eines Assays, wobei der Assay ein dispergiertes Trägerteilchen, das an einen ersten Targetbinder mit einer bekannten Targetselektivität gebunden ist, einen zweiten Targetbinder, der an eine Umwandlerkomponente gebunden ist, und eine Testprobe, die ein Target in einer ersten wässrigen Flüssigkeit enthalten kann, aufweist; wobei die Umwandlerkomponente selektiv an das Target bindet, das selektiv an das Trägerteilchen gebunden ist, in einer Menge, die abhängig von einer Konzentration des Targets in der Testprobe ist; Konzentrieren und Trennen der Trägerteilchen von der ersten wässrigen Flüssigkeit; Ersetzen der ersten wässrigen Flüssigkeit durch eine zweite wässrige Flüssigkeit mit einem Volumenanteil des Volumens der ersten wässrigen Flüssigkeit und Dispergieren der Trägerteilchen darin; Zuführen eines Substrates zu den dispergierten Trägerteilchen in der zweiten wässrigen Flüssigkeit und Umwandeln des Substrates mit der Umwandlerkomponente, um ein Produkt zu bilden; und Nachweisen der Veränderung in dem Substrat und/oder Produkt mit Dampf- und/oder Gasphasen-Analysenverfahren.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Analyse von nachweisbaren Produkten, die in biologischen Flüssigphasen-Assays mit Dampf- und/oder Gasphasenanalyse erzeugt werden, Dispergieren magnetischer Trägerteilchen, die mit einem ersten selektiven Targetbinder modifiziert sind, und einer Umwandlerkomponente, die mit einem zweiten selektiven Targetbinder modifiziert ist, in einer Assaylösung, wobei die magnetischen Trägerteilchen eine durchschnittliche Teilchengröße von 5 Nanometer bis 100 Mikrometer aufweisen, wobei die Umwandlerkomponente ein Enzym ist, und wobei die Assaylösung eine Probe aufweist, die auf ein Target untersucht wird; Bilden eines Komplexes, der aus mindestens einem magnetischen Trägerteilchen, mindestens einem der Targets, und mindestens einem Enzym besteht, verbunden durch den zweiten selektiven Targetbinder, wenn das Target anwesend ist; Anlegen eines magnetischen Feldes und Konzentrieren der komplexierten und nicht-komplexierten magnetischen Trägerteilchen aus den nicht-komplexierten Enzymen und der Assaylösung; Erneutes Dispergieren der konzentrierten magnetischen Trägerteilchen in einer zweiten Lösung, wobei die zweite Lösung, bei einem Volumenanteil des ersten wässrigen Volumenanteils, ein Substrat zur Reaktion mit dem komplexierten Enzym enthält, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen; Nachweisen des nachweisbaren Produktes durch Einbringen eines Aliquots der Reaktionslösung in ein Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät, wobei die Reaktionslösung das nachweisbare Produkt, nicht-reagiertes Substrat, komplexierte magnetische Trägerteilchen und nicht-komplexierte magnetische Trägerteilchen enthält, und wobei das Substrat selbst nicht durch das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät nachweisbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Analyse von nachweisbaren Produkten, die in biologischen Flüssigphasen-Assays mit einer Dampf- und Gasphasenanalyse erzeugt werden, Dispergieren magnetischer Trägerteilchen, die mit einem ersten selektiven Targetbinder modifiziert sind, und einer Umwandlerkomponente, die mit einem zweiten selektiven Targetbinder modifiziert ist, in einer Assaylösung, wobei die magnetischen Trägerteilchen eine durchschnittliche Teilchengröße von 5 Nanometer bis 100 Mikrometer aufweisen, und die Umwandlerkomponente ein Enzym ist, wobei die Assaylösung eine Probe, die auf das Target untersucht wird, umfasst; Bilden eines Komplexes, der aus mindestens einem magnetischen Teilchen, mindestens einem Target, und mindestens einem Enzym, verbunden durch die entsprechenden Targetbinder besteht, wenn das Target anwesend ist; Anlegen eines magnetischen Feldes und Konzentrieren der komplexierten und nicht-komplexierten magnetischen Trägerteilchen aus den nicht-komplexierten Enzymen und der Assaylösung; Erneutes Dispergieren der konzentrierten magnetischen Trägerteilchen in eine Reaktionslösung, wobei die Lösung ein nachweisbares Substrat zur Reaktion mit dem komplexierten Enzym enthält, um ein nicht-nachweisbares Produkt zu erzeugen; und Nachweisen des nachweisbaren Substrates durch Einbringen eines Aliquots der Reaktionslösung in ein Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät, wobei die Reaktionslösung Produkt, nicht-reagiertes Substrat, komplexierte magnetische Trägerteilchen und nicht-komplexierte magnetische Trägerteilchen enthält, wobei das Produkt selbst nicht durch das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät nachweisbar ist.
Diese und andere Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen vollständiger verstanden werden. Es wird angemerkt, dass der Schutzumfang der Ansprüche durch deren Wiedergabe hier und nicht durch die spezifische Erörterung der Merkmale und Vorteile, die in der vorliegenden Beschreibung dargelegt sind, bestimmt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt schematisch eine Ausführungsform dar, in der ein, mit einem selektiven Targetbinder (z. B. Antikörper) modifiziertes, dispergiertes Trägerteilchen, ein Enzym, das an einen Targetbinder (z. B. Antikörper) angelagert ist, und eine Probe, die ein Target enthält, nach einer Wechselwirkung ein komplexiertes Trägerteilchen bilden, das nach Konzentration und Waschen ein nachweisbares Produkt aus einem nicht nachweisbaren Substrat bildet.
2 stellt schematisch eine Ausführungsform dar, in der ein, mit einem selektiven Targetbinder (z. B. Antikörper) modifiziertes, dispergiertes Trägerteilchen, ein Enzym, das an einen Targetbinder (z. B. Antikörper) angelagert ist, und eine Probe, die kein Target enthält, nach einer Wechselwirkung kein komplexiertes Trägerteilchen bilden, das nach Konzentration und Waschen kein nachweisbares Produkt aus einem nicht nachweisbaren Substrat bildet.
3 stellt schematisch eine IMS Antwort für eine Probe dar, die sowohl o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG) als auch verschiedene Negativ- und Positivkontrollen enthält.
4 stellt schematisch eine IMS Antwort für eine Probe dar, die sowohl p-Nitrophenylphosphat (PPNP) als auch verschiedene Negativ- und Positivkontrollen enthält.
Der Fachmann wird erkennen, dass Elemente in den Figuren zur Einfachheit und Klarheit dargestellt sind und nicht notwendigerweise maßstabsgerechnet gezeichnet sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGSGEMÄßEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Hier wird ein Verfahren für verbesserte Effizienzen offenbart soweit es die Analyse kleiner Moleküle, die in Flüssigphasen-biologischen Assays mit Dampf- und/oder Gasphasenanalyse erzeugt werden, betrifft. Beispielhaft wird auf kleine Moleküle Bezug genommen, die durch einen nicht-kompetitiven ELISA erzeugt werden und unter Verwendung eines Ionenmobilitätsspektrometers (IMS), hier auch als Ionenfallenmobilitätsspektrometer (ITMS) bezeichnet, analysiert werden. Es sollte jedoch vom Fachmann erkannt werden, dass das Verfahren auf jeden Flüssigphasenassay angewendet werden kann, der eine Erkennungskomponente mit einer bekannten Targetselektivität einsetzt und der in einer kompetitiven oder nicht-kompetitiven Weise betrieben wird, wobei das Assayergebnis entweder durch Erzeugung oder Verbrauch des nachweisbaren Moleküls, der abhängig ist von der Anwesenheit oder Konzentration des Targets, in einer Veränderung der Menge der nachweisbaren Moleküle, die anwesend sind, resultiert. Ebenso können die kleinen Moleküle, die durch den Flüssigphasenassay angepasst sind, unter Verwendung anderer Arten von Dampf- oder Gasphasenanalysen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Spektroskopie, Massenspektrometrie, differentielle Mobilitätsspektrometrie, Gaschromatographie und andere analytische Verfahren, die selektive Analysekomponenten und Masse, elektronische, optische und/oder thermische Transduktion und dergleichen kombinieren, analysiert werden.
Das Verfahren schließt allgemein das Binden einer Targetsubstanz an beide, sowohl die mit einem Targetbinder modifizierte Umwandlerkomponente als auch die mit einem Targetbinder modifizierten Trägerteilchen ein, wobei die Trägerteilchen Mikrometer oder Nanometer große Teilchen sind, die in dem biologischen Assay als eine Einfangphase fungieren. Die Trägerteilchen sind so konfiguriert, dass sie physikalische und/oder chemische Eigenschaften aufweisen, die eine Konzentration der markierenden Umwandlerspezies ermöglichen. Dies bildet den Trägerteilchenkomplex wie in einer besonderen Ausführungsform in 1 dargestellt. Es ist wichtig, dass der Trägerteilchenkomplex nicht gebildet wird, wenn das Target nicht anwesend ist, und es keine Veränderung in der Menge der nachweisbaren Verbindung gibt, wie in einer besonderen Ausführungsform in 2 dargestellt. Nicht-spezifische Bindungsstellen können zuerst mit einem geeigneten Blockierungsagens, z. B. Casein, geblockt werden. In der nicht-kompetitiven Assayform markiert der Assay das an dem Trägerteilchen angebrachte Target mit einer Umwandlerspezies, die ein Molekül in eine Form, die durch eine Gashasenanalyse entweder nachweisbar oder nicht nachweisbar ist, umwandelt. In der kompetitiven Assayform verdrängt der Assay Umwandlerspeziesmarkierungen von dem Träger, oder die Umwandlerspezies muss mit dem Target konkurrieren, um an den Träger zu binden, wobei die gebundene Umwandlerspezies ein Molekül in eine Form, die durch eine Gasphasenanalyse entweder nachweisbar oder nicht nachweisbar ist, umwandelt. Außerdem stellt das Einsetzen der Trägerteilchen als Substrate eine vergrößerte Oberfläche, auf der die Reaktion erfolgen kann, bereit; steigert die Targetbindungskinetiken; steigert die Einfachheit der Waschschritte; ermöglicht die Konzentration der vergrößerten Oberfläche in ein kleineres Reaktionsvolumen zur Umwandlung des nicht nachweisbaren oder nachweisbaren Moleküls; und ermöglicht es, ein gesteigertes Verhältnis von Assaykomponenten zu Umwandlungspuffermatrix in das Gasphasenanalysegerät einzuführen. Wegen des kleineren Reaktionsvolumens wird die Umwandlung des kleinen Molekülvorläufers in das kleine Molekülprodukt schneller erfolgen, nachdem in der Literatur gezeigt wurde, dass eine Enzymkatalyse auf Teilchen schneller ist als auf festen Substraten. Außerdem wird das kleine Molekül nicht nur schneller gebildet, sondern die Konzentration wird schneller aufgebaut, auch weil die Reaktion in einem kleineren Volumen erfolgt, was dazu führt, dass die kleinen Moleküle eine kritische Konzentration, bei der das kleine Molekül beginnen kann, einen Partialdruck über der Lösung zu bilden, schneller erreichen. Das verringerte Reaktionsvolumen ermöglicht auch eine schnellere Verdampfung der gesamten Lösung und ermöglicht eine schnellere Freisetzung der nachweisbaren kleinen Moleküle aus der Flüssigphase in die Dampfphase. Zusätzlich steigert das verringerte Reaktionsvolumen das Verhältnis zwischen Assaykomponenten und Trägerpuffer, was weniger Reaktionsvolumenkomponenten in der Dampfphase entspricht, und somit das Hintergrundsignal/Rauschen verringert.
Eine Verwendung der dispergierten Trägerteilchen im Flüssigphasen-Assayverfahren wird den Endverbraucher durch ein Verbessern der Nachweisgrenze und Sensitivität (um, wie oben erörtert, durch die vergrößerte Oberfläche und besseres Freisetzen des Produkts in die Dampf- und/oder Gasphase nachgewiesen zu werden) betreffen, wird sowohl die Anzahl an Waschschritten verringern als auch die gesamte Anzahl an Assayschritten verringern; und es wird den Zeitaufwand, um den Assay auszuführen, verringern. Die Assaybioerkennungskinetiken sind auf den dispergierten Trägerteilchen im Gegensatz zu Trägern des Standes der Technik schneller, die Unwandlungskinetiken kleiner Moleküle sind schneller, und das nachweisbare kleine Molekül wird schneller in größeren Mengen in die Dampf- und/oder Gasphase abgegeben.
Die Trägerteilchen sind in der Assaylösung während des Assays dispergiert. Die Trägerteilchen sind so ausgewählt, dass die Teilchen mittels optischer, elektrischer, magnetischer, Gravitations- oder Druckkräften von der Assaylösung schnell getrennt werden können. In einer Ausführungsform sind die Trägerteilchen magnetisch, die leicht, durch die Anlage eines magnetischen Feldes von der Assaylösung getrennt und/oder konzentriert werden können.
In der nicht-kompetitiven Assayausführung schließt die Zubereitung von Assayproben allgemein Mischen eines interessierenden Targets, z. B. eines Antigens, mit den, mit einem Targetbinder modifizierten, dispergierten Trägerteilchen und mit einem Targetbinder mit einer kovalent gebundenen Umwandlerkomponente in einer geeigneten, typischerweise wasserbasiert, Flüssigkeit ein, um ein komplexiertes Trägerteilchen, wie in einer Ausführungsform in 1 gezeigt, zu bilden. Alternativ dazu ist die Vorbereitung von Assayproben in der kompetitiven Assayausführungsform ähnlich dem nicht-kompetitiven Assay, außer dass die, mit einem Targetbinder modifizierte, Umwandlerkomponente entweder durch das Target von dem Komplex verdrängt wird oder mit dem Target konkurriert, um an das Trägerteilchen zu binden. Somit ist die Menge an Umwandlerkomponente, die an dem Trägerteilchen anwesend ist, negativ korreliert mit der Menge an anwesendem Target. In beiden Assayausführungsformen werden die komplexierten und nicht-komplexierten Trägerteilchen dann von dem Überstand getrennt. Zum Beispiel werden die Teilchen, wie in 1 für magnetische Teilchen gezeigt, in ein Konzentrationsgerät für magnetische Teilchen platziert, für einen Zeitraum, der ausreicht damit sich die magnetischen Teilchen entlang der Seitenwände sammeln, was üblicherweise im Bereich von einigen Minuten bis etwa 30 Minuten liegt, und das magnetische Feld in dem Konzentrationsgerät wird anschließend unterbrochen und der Überstand entfernt. Auf diese Weise werden Trennungszeiten im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik wesentlich verringert. Einmal getrennt, werden die Trägerteilchen dann in einem geeigneten wässrigen Puffer einmal oder mehrmals gewaschen. Die konzentrierten Teilchen werden dann mit einem enzymatischen Substrat dispergiert, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen, falls ein Target anwesend ist, wodurch die Bildung eines komplexierten Trägerteilchens ermöglicht wird. Falls das Target nicht anwesend ist, wird das komplexierte Trägerteilchen nicht gebildet, und es ist kein Enzym in der zweiten Lösung anwesend, so dass, wie in 2 gezeigt, kein nachweisbares Produkt gebildet wird. In allen Fällen wird dann ein Aliquot der Probe einschließlich der komplexierten Teilchen, nicht-komplexierter Teilchen, nicht-reagierten Substrats und dem nachweisbaren Produkt in das Dampfphasenspektrometer, z. B. IMS, eingeführt. Im Fall eines IMS werden zuerst Driftzeiten für das entsprechende nachweisbare Produkt gesammelt. Die Probe wird erhitzt und das nachweisbare Produkt quantifiziert. Es sollte beachtet werden, dass in den oben genannten Beispielen ein sekundärer Antikörper nicht benötigt wird, falls der Fangantikörper, der auf den Trägerteilchen inkubiert wird, an ein Enzym konjugiert ist. Dennoch verhindert die Verwendung eines sekundären Antikörperkonjugats den Aufwand, enzymgekoppelte Antikörper für jedes Antigen, das möglicherweise nachgewiesen wird, herzustellen.
Die Trägerteilchen sollen nicht auf irgendeine besondere Art beschränkt werden, auch wenn verschiedene Arten verschiedene Vorzüge bereitstellen können. Die Trägerteilchen können magnetisch sein und während des Verarbeitens mittels eines angelegten magnetischen Feldes von dem Assay getrennt werden; elektrisch geladen sein und durch Anlegen eines elektrischen Feldes von dem Assay getrennt werden; einen bestimmten Brechungsindex im Verhältnis zu der Assaylösung aufweisen, so dass Photonen verwendet werden können, um eine optische Kraft zur Trennung, z. B. optische Fallen, optische Pinzetten und dergleichen bereitzustellen oder können eine verhältnismäßig hohe Dichte aufweisen, so dass Gravitations- oder Zentrifugalkräfte verwendet werden können, um die Teilchen zu konzentrieren. Das Trennungsverfahren wird die Konzentration der Assayumwandlerkomponente ermöglichen und die Aspekte des Umwandlungsverfahrens und der Schnittstelle zu dem Gasphasen-Analysegerät verbessern. Bei Anwendungen, bei denen die Dichte der Trägerteilchen verwendet wird, liegt die Dichte in einem Bereich von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 1 mg/ml.
Die Trägerteilchen können in jeder geeigneten Form vorliegen, ohne Beschränkung hinsichtlich der Größe und/oder Gestalt der Teilchen. In einer Ausführungsform sind die Teilchen im Wesentlichen sphärisch. Zum Beispiel können sphärische Teilchen mit einem Durchmesser zwischen etwa 5 Nanometer und 100 Mikrometer verwendet werden. In anderen Ausführungsformen können sphärische Teilchen mit einem Durchschnittsdurchmesser zwischen etwa 50 Nanometer und 5 Mikrometer verwendet werden. Die Modalität der Verteilung der Teilchengröße kann unimodal, bimodal oder multimodal sein. Die Größe der Teilchen kann eine Anzahl von Parametern beeinflussen. Wenn zum Beispiel kleinere Teilchen verwendet werden, ist die maximal erreichbare Arraydichte entsprechend größer. Die größere Oberfläche eines Teilchens mit einem größeren Durchmesser ermöglicht jedoch die Anlagerung von mehr Targets pro Teilchen, was in einer geringeren Nachweisgrenze und einer größeren analytischen Sensitivität und in einer möglicherweise größeren Signalintensität für jedes Teilchen resultiert.
In einer Ausführungsform können die Teilchen irgendein geeignetes magnetische Material, z. B. Eisen (Fe), Kobalt (Co) oder Nickel-Eisenlegierungen umfassen. Der Begriff magnetisches Material, wie hier verwendet, schließt paramagnetische Materialien ein. Die Teilchen können nicht-magnetische Materialien wie Polysterol, in denen magnetische Subteilchen (z. B. Fe₃O₄ Teilchen) eingebettet sind, umfassen. Solche Teilchen können zum Beispiel durch das ganze nicht-magnetische Material dispergiert sein oder können einen Kern oder eine Schale unter der Oberfläche des nicht-magnetischen Materials bilden. Für biologische Anwendungen ist vorzugsweise zumindest die Oberfläche des Teilchens aus einem biokompatiblen Material ausgebildet. Nicht-magnetische biokompatible Materialien, die verwendet werden können, um die Oberfläche eines nicht biokompatiblem Materials wie Eisen zu überziehen, schließen polymerische Materialien wie Polysterol, Latex und zahlreiche andere Materialien, die im Stand der Technik gut bekannt sind, ein.
In bestimmten Ausführungsformen werden paramagnetische Teilchen verwendet. Paramagnetische Materialien magnetisieren nur wenn ein äußeres magnetisches Feld anwesend ist, und somit zeigen paramagnetische Teilchen minimales Verklumpen. Biokompatible paramagnetische Teilchen sind von mehreren Herstellern (z. B. Dynal, Bangs Labs, Spherotech) erhältlich. Solche Teilchen werden für eine Vielzahl biologischer Anwendungen verwendet und Protokolle zum Koppeln biologischer Moleküle wie Nukleinsäuren und Proteine sind gut etabliert. Zusätzlich sind paramagnetische Teilchen, die mit verschiedenen Bindungsliganden vorkonjugiert sind, erhältlich.
Superparamagnetische Teilchen weisen seit mehr als 15 Jahren eine nachweisbare kommerzielle Verwendung auf. Solche Teilchen werden durch Dispergieren von Eisenkristallen innerhalb eines Polysterolteilchens während dessen Polymerisation hergestellt. Die Kristalle sind ferromagnetisch, verhalten sich aber aufgrund ihrer Größe im Nanobereich nicht ferromagnetisch, sondern paramagnetisch (das Phänomen wurde als Superparamagnetismus bezeichnet). Es wird angenommen, dass die Orientierungskristalle so klein sind, dass sie durch thermische Effekte bei Raumtemperatur zufällig verteilt werden. Ein Array solcher Teilchen hat im Wesentlichen keine Remanenz; er magnetisiert in einem angelegten magnetischen Feld im Wesentlichen linear, und verliert im Wesentlichen jeden Magnetismus, wenn das äußerliche Feld entfernt wird. Dieses Merkmal resultiert in minimalem Verklumpen. Die Teilchen können aus Gründen der Effizienz verkapselt sein, wenn sie mit Enzymen (z. B. um einen Kontakt mit eisenhaltigen Molekülen zu verhindern) verwendet werden und die Oberfläche ist leicht zu modifizieren, um Biomoleküle wie Nukleinsäuren oder Proteine oder kleine organische Moleküle kovalent anzulagern.
Ein Teilchen kann ein nachweisbares Material wie eine Farbe, einen Farbstoff, ein Hybridisierungsstag einschließen oder einen spezifischen Brechungsindex aufweisen, so dass das Teilchen auf dem Array nachgewiesen und unter anderen Teilchen sowie der Assaylösung identifiziert werden kann. Das nachweisbare Material kann in das Teilchen eingebunden sein, kann an der Oberfläche anwesend sein, und/oder kann an das Teilchen gekoppelt sein. Ein besonderes nachweisbares Material oder Kombinationen davon können mit einer besonderen Probe, die an das Teilchen angelagert ist, korrespondieren, so dass der Nachweis des nachweisbaren Materials auch die Probe identifiziert. In bestimmten Ausführungsformen kann ein besonderes nachweisbares Material mit einem besonderen Target korrespondieren, so dass der Nachweis des nachweisbaren Materials auch ein Target, das mit der Probe wechselwirkt, identifiziert.
Das Angebot kommerziell erhältlicher Teilchen (sowohl magnetischer als auch nicht-magnetischer) ist enorm. Teilchen, die in vielen verschiedenen Materialien und Größen ausgebildet sind, sind erhältlich. Teilchen, die verschiedene Moleküle wie fluoreszierende Farben einbinden, Teilchen die mit verschiedenen Komponenten konjugiert sind oder die Oberflächen aufweisen, die modifiziert sind, um solche Konjugationen zu ermöglichen, sind erhältlich.
Geeignete Targets zur Verwendung in dem Flüssigphasenassay schließen lebende Targets und nicht-lebende Targets ein. Beispiele von Targets schließen prokaryotische Zellen, eukaryotische Zellen, Bakterien, Viren, Proteine, Polypeptide, Toxine, Liposome, Teilchen, Liganden, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Pharmazeutika, toxische industrielle Chemikalien, toxische industrielle Materialien und andere kleine Moleküle entweder einzeln oder in Kombinationen davon ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Das Target schließt Extrakte der oben genannten lebenden und nicht-lebenden Targets ein.
Beispiele prokaryotischer Zellen schließen Bakterien ein, sind aber nicht darauf beschränkt und schließen Extrakte davon ein. Beispiele eukaryotischer Zellen schließen Hefezellen, Tierzellen und Gewebe ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele von Toxinen schließen Anthrax ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele von Teilchen schließen Latex, Polysterol, Silikate und Plastik ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff ”Peptid” betrifft Oligomere oder Polymere irgendeiner Länge, wobei die einzelnen Monomere Alpha-Aminosäuren sind, die durch Amidbindungen verbunden sind und Aminosäuredimere sowie Polypeptide, Peptidfragmente, Peptidanaloga, natürlicherweise vorkommende Proteine, mutierte, abweichende oder chemisch modifizierte Proteine, Fusionsproteine und dergleichen umfassen. Die Aminosäuren der Peptidmoleküle können irgendeine der zwanzig üblichen Aminosäuren, Stereoisomere (z. B. D-Aminosäuren) der üblichen Aminosäuren, strukturelle Varianten der üblichen Aminosäuren, z. B. Isovalin, oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren wie α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, β-Alanin, Naphthylalanin, 3-Pyridylalanin, 4-Hydroxyprolin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin und nor-Leucine aufweisen. Zusätzlich umfasst der Begriff ”Peptid” Peptide mit posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen.
Der Begriff ”Oligonukleotid” wird hierverwendet, um eine polymere Form von Nukleotiden irgendeiner Länge, entweder Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden, einzuschließen. Dieser Begriff betrifft nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt der Begriff trippel-, doppel- und einfach-strängige DNA sowie trippel-, doppel- und einfachsträngige RNA ein. Der Begriff schließt auch Modifikationen wie solche durch Methylierung und/oder durch Capping und nicht-modifizierte Formen von Oligonukleotiden ein. Insbesondere schließt der Begriff Polydesoxiribonukleotide (die 2-Desoxy-D-ribose enthalten), Polyribonukleotide (die D-Ribose enthalten), irgendeine andere Art von Polynukleotid, das ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase aufweist und andere Polymere, die nicht-nukleotidische Rückgrate, zum Beispiel Polyamide (z. B. peptidische Nukleinsäuren (PNAs)) und polymorpholine (kommerziell erhältlich von Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, sowie Neugene) Polymere enthalten und andere synthetische sequenzspezifische Nukleinsäurepolymere ein, sofern die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, die Basenpaarung und Basenstapelung, wie sie in DNA und RNA gefunden wird, ermöglicht. Es besteht keine beabsichtigte Unterscheidung bezüglich der Länge zwischen den Begriffen ”Polynukleotid”, ”Oligonukleotid”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül”, und diese Begriffe betreffen nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließen diese Begriffe zum Beispiel 3'-Desoxy-2',5'-DNA, Oligodesoxyribonukleotide, N3'P5' Phosphoramidate, 2'-O-Alkyl-substituierte RNA, doppel- und einfach-strängige DNA, sowie doppel- und einfach-strängige RNA, DNA:RNA Hybride, und Hybride zwischen PNAs und DNA oder RNA ein und schließen auch bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel im Stand der Technik bekannte Markierungen, Methylierung, ”Caps”, Substitution einer oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, zwischennukleotidische Modifikationen wie zum Beispiel solche mit nicht geladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.), mit negativ geladenen Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.) und mit positiv geladenen Bindungen (z. B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphophotriester), solche die anhängende Komponenten wie zum Beispiel Proteine (einschließlich Nukleasen, Toxinen, Antikörpern, Signalpeptiden, Poly-L-Lysin etc.) enthalten, solche mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, etc.), solche die Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.) enthalten, solche die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Bindungen (z. B. alpha-anomere Nukleinsäuren, etc.), sowie nicht-modifizierte Formen des Polynukleotids oder Oligonukleotids ein. Der Begriff schließt auch andere Arten von Nukleinsäuren wie verbrückte Nukleinsäuren (engl.: locked nucleic acids, (LNAs)) ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die Begriffe ”Nukleosid” und ”Nukleotid” schließen auch solche Komponenten ein, die nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidinbasen sondern auch andere heterozyklische Basen, die modifiziert wurden, enthalten. Solche Modifikationen schließen methylierte Purine oder Pyrimidine, acetylierte Purine oder Pyrimidine oder andere Heterozyklen ein. Modifizierte Nukleoside oder Nukleotide können auch Modifikationen an der Zuckerkomponente einschließen, z. B. wobei eine oder mehrere der Hydroxylgruppen mit halogenen, aliphatischen Gruppen ersetzt wurden oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind. Der Begriff ”nukleotidische Einheit” soll, Nukleoside und Nukleotide umfassen.
Außerdem schließen Modifikationen von nukleotidischen Einheiten Umordnen, Anhängen, Substituieren oder anderweitiges Verändern funktionaler Gruppen an der Purin- oder Pyrimidinbase, die Wasserstoffbrücken zu einem entsprechend komplementären Pyrimidin oder Purin bildet, ein. Die resultierende modifizierte nukleotidische Einheit kann gegebenenfalls ein Basenpaar mit anderen so modifizierten nukleotidischen Einheiten, aber nicht mit A, T, C, G oder U, bilden. Basische Seiten, die die Funktion des Polynukleotids nicht verhindern, können eingebunden werden. Einige oder alle Reste in dem Polynukleotid können gegebenenfalls auf eine oder mehrere Weisen modifiziert sein.
Der Begriff ”Antikörper” wie hier verwendet schließt Antikörper, die von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Zubereitungen erhalten werden, sowie hybride (chimäre) Antikörpermoleküle; F(ab')2 und F(ab) Fragmente; Fv Moleküle (nicht-kovalente Heterodimere); Einzelketten-Fv-Moleküle (sFv); dimerische und trimerische Antikörperfragmentkonstrukte; humanisierte Antikörpermoleküle; und irgendwelche funktionalen Fragmente, die von solchen Molekülen erhalten werden ein, wobei solche Fragmente spezifische Bindungseigenschaften des Stammantikörpermoleküls beibehalten.
Binden der Targets an die Teilchen wird über die Oberflächenchemie der Teilchen gesteuert. Die Oberflächenchemie der Teilchen kann dazu verwendet werden, Targetsubstanzen über nicht-spezifische Wechselwirkungen wie zum Beispiel elektrostatische Wechselwirkungen, van der Waals Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrückenwechselwirkungen zu binden. Alternativ können die Trägerteilchen chemisch modifiziert sein, um spezifische Bindungssubstanzen, die selektiv mit den Targetsubstanzen Wechselwirken, einzuschließen. Repräsentative Beispiele von Bindungssubstanzen, die verwendet werden können, schließen ohne Beschränkung, Antigene, Antikörper, Aptamere, Polypeptide, Peptide, Nukleinsäuren, Proteinrezeptoren, Liganden, Oligonukleotide, Streptavidin, Avidin, Biotin, Lektin und dergleichen ein.
Target-bindende Komponenten können sich direkt oder indirekt an das Target anlagern. Beispiele von Anlagern schließen elektrostatisches, chemisches und physikalisches Anlagern ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele Target-bindender Komponenten schließen Antikörper, Aptamere, Polypeptide, Peptide, Nukleinsäuren, Avidin, Streptavidin und Derivate von Avidin und Streptavidin entweder einzeln oder in irgendeiner Kombination davon ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Andere nicht beschränkende Beispiele von Target-bindenden Komponenten schließen Proteine, Peptide, Polypeptide, Glykoproteine, ausgewählte Liganden, Lipoproteine, Phospholipide, Oligonukleotide, und dergleichen ein z. B. Enzyme, Immunmodulatoren, Rezeptorproteine, Antikörper und Antikörperfragmente, die vorzugsweise Markersubstanzen binden, die erzeugt werden durch oder assoziiert mit der Targetstelle, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es sind Proteine bekannt, die vorzugsweise Markersubstanzen binden, die durch Läsionen erzeugt werden oder mit Läsionen assoziiert sind. Zum Beispiel können Antikörper sowohl gegen krebsassoziierte Substanzen als auch gegen irgendeine pathologische Läsion verwendet werden, die einen gesteigerten oder einzigartigen antigenen Marker zeigt, wie gegen Substanzen, die mit kardiovaskulären Läsionen, zum Beispiel vaskulären Gerinnseln einschließlich Thrombi und Emboli, myokardischen Infarkten und anderen Organinfarkten und arteriosklerotischen Plaques; entzündlichen Läsionen; und infektiösen und parasitären Mitteln assoziiert sind.
Krebszustände schließen Karzinome, Melanome, Sarkome, Neuroblastome, Leukämien, Lymphome, Gliome, Myelome und neurale Tumore ein. Infektiöse Erkrankungen schließen solche ein, die durch in den Körper eindringende Mikroben oder Parasiten verursacht werden.
Die Proteinsubstanzen, die als Target-bindende Komponenten nützlich sind, schließen Protein, Peptide, Polypeptide, Glykoprotein, Lipoprotein, und dergleichen, z. B. Hormone, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Albumin, Zytokine, Enzyme, Immunmodulatoren, Rezeptorproteine, Antikörper und Antikörperfragmente ein. Die besonders interessanten Proteinsubstanzen sind Antikörper und Antikörperfragmente. Die Begriffe ”Antikörper” und ”Antikörperfragmente” bedeuten allgemein Immunglobuline oder Fragmente davon, die spezifisch an Antigene binden, um Immunkomplexe zu bilden.
Der Antikörper kann ein ganzes Immunglobulin irgendeiner Klasse sein; z. B. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, chimärische oder hybride Antikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitopspezifitäten. Es kann ein polyklonaler Antikörper, insbesondere ein humanisierter oder ein affinitätsaufgereinigter Antikörper eines Menschen sein. Es kann ein Antikörper von einem geeigneten Tier, z. B. einem Primaten, einer Ziege, einem Kaninchen, einer Maus oder dergleichen sein. Wenn eine Paratopregion von einer nicht-humanen Spezies erhalten wird, kann das Target humanisiert werden um, zur Verwendung in Humandiagnostik oder therapeutischen Anwendungen, eine Immunogenität der nicht-humanen Antikörper zu verringern. Ein solcher humanisierter Antikörper oder ein Fragment davon wird als ”chimär” bezeichnet. Zum Beispiel umfasst ein chimärer Antikörper nicht-humane (wie mausartige) variable Regionen und humane konstante Regionen. Ein chimäres Antikörperfragment kann eine variable Bindungssequenz oder komplementbestimmende Regionen (engl.: complementary-determining regions, CDR), die von einem nicht-humanen Antikörper abstammen, in einer Rahmendomäne einer humanen variablen Region umfassen. Monoklonale Antikörper sind wegen ihrer hohen Spezifität auch geeignet. Antikörperfragmente, die verwendet werden können, schließen F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv und dergleichen, einschließlich Hybrid-Fragmente, ein. Besondere Fragmente sind Fab', F(ab')₂, Fab und F(ab)₂. Auch verwendet werden können sind irgendwelche Subfragmente, welche die hypervariable, Antigen-bindende Region eines Immunglobulins beibehalten und eine Größe gleich oder kleiner eines Fab' Fragments aufweisen. Ein Antikörperfragment kann genetisch veränderte und/oder rekombinante Proteine, sowohl einzelkettig oder mehrkettig, einschließen, die eine Antigenbindungsstelle einbinden und andererseits in vivo als immobilisierte Target-bindende Komponenten, im Wesentlichen genauso wie natürliche Immunglobulinfragmente, funktionieren. Die Fragmente können auch durch genetisches engeneering erzeugt werden.
Beispiele selektiver Liganden schließen Porphyrine, Ethylendiamintetraessigsäure (engl.: ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) und Zinkfinger ein. Selektiver Ligand bedeutet ein Ligand, der für ein bestimmtes Target oder Targets selektiv ist.
Mischungen von Antikörpern und Immunglobulinklassen können verwendet werden, wie Hybridantikörper verwendet werden können. Multispezifische, einschließlich bispezifischer und Hybrid-, Antikörper und Antikörperfragmente sind manchmal zum Nachweisen und Behandeln von Läsionen wünschenswert und schließen mindestens zwei verschiedene, im Wesentlichen monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente ein, wobei mindestens zwei der Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch an mindestens zwei verschiedene Antigene, die erzeugt werden durch oder assoziiert sind mit der Targetläsion oder an mindestens zwei unterschiedliche Epitope oder Moleküle einer Markersubstanz, die erzeugt wird durch oder assoziiert ist mit der Targetläsion binden. Multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente mit dualen Spezifitäten können analog zu Antitumormarkerhybriden hergestellt werden.
Geeignete MAbs gegen Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Protozoen oder Parasiten), die für den Großteil von Infektionen des Menschen verantwortlich sind, können für in vitro Diagnosezwecke verwendet werden. Diese Antikörper und neuere MAbs sind auch zur Verwendung geeignet.
Proteine, die zum Nachweisen und/oder Behandeln kardiovaskulärer Läsionen nützlich sind, schließen Fibrin-spezifische Proteine, zum Beispiel Fibrinogen, lösliches Fibrin, Antifibrinantikörper und Fragmente, Fragment E₁ (ein 60 kDa Fragment von humanem Fibrin, das durch kontrollierte Plasminspaltung quervernetzten Fibrins hergestellt wird), Plasmin (ein Enzym im Blut, das für die Auflösung frischer Thrombi verantwortlich ist), Plasminogenaktivatoren (z. B. Urokinase, Streptokinase und Gewebeplasminogenaktivator), Heparin, und Fibronektin (ein adhäsives Plasmaglykoprotein von 450 kDa) und auf Blutplättchen gerichtete Proteine zum Beispiel Blutplättchen, Anti-Blutplättchen-Antikörper und -Antikörperfragmente, anti-aktivierte-Blutplättchen-Antikörper und anti-aktivierte-Blutplättchen-Faktoren, ein.
In einer Ausführungsform schließt die Target-bindende Komponente einen MAb oder ein Fragment davon ein, das ein Heptapeptid des Aminoterminus der β-Kette eines Fibrinmonomers erkennt und bindet. Fibrinmonomere werden erzeugt, wenn Thrombin zwei Paare kleiner Peptide von Fibrinogen spaltet. Fibrinmonomere aggregieren spontan zu einem unlöslichen Gel, welches weiter stabilisiert wird, um Blutgerinnsel zu erzeugen.
Die Offenbarung verschiedener Antigene oder Biomarker, die verwendet werden können, um spezifische Antikörper gegen sie zu schaffen (und von dem Antikörperfragmente angefertigt werden können), dient nur als ein Beispiel und soll nicht in irgendeiner Weise als eine Beschränkung der Erfindung ausgelegt werden.
Der Assay kann mit den beschriebenen dispergierten Trägerteilchen auf eine kompetitive oder eine nicht-kompetitive Weise ausgeführt werden. Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass ein nicht-kompetitiver Assay dazu führt, dass mehr der Umwandlerkomponente in der Umwandlungsreaktion anwesend ist, wohingegen ein kompetitiver Assay dazu führt, dass weniger der Umwandlerkomponente in der Umwandlungsreaktion anwesend ist. Als ein Resultat dessen, dass der Assay kompetitiv oder nicht-kompetitiv ist, wird die Veränderung in der Menge an nachweisbarem Molekül für irgendeine vorgegebene Umwandlerkomponente, aufgrund von Steigerungen in der Konzentration der Targetspezies entgegengesetzt sein und entsprechend überwacht werden.
Die Umwandlerkomponente ist direkt durch elektrostatische, chemische und/oder physikalische Mittel, aber nicht darauf beschränkt, an eine Targetbindende Komponente angelagert. Die Umwandlerkomponente ist dafür verantwortlich das nachweisbare Molekül für die Gasphasenanalyse entweder zu bilden oder zu unterdrücken. Nicht einschränkende Beispiele dieser schließen anorganische, organische oder biologische Katalysatoren ein, die eine Redox-, elektronische oder enzymatische Unwandlung ermöglichen.
Die Umwandlerkomponente fungiert als ein Verstärker; selbst wenn nur wenige Umwandlerkomponenten, die an bindende Komponenten gekoppelt sind, gebunden bleiben, wird die Umwandlerkomponente viele Signalmoleküle umwandeln. Die vorliegende Offenbarung ist nicht dazu bestimmt auf irgendeine besondere Umwandlerkomponente beschränkt zu werden und wird allgemein von dem nachweisbaren/nicht-nachweisbaren Molekül abhängen; dessen Auswahl liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns.
Die Umwandlerkomponente kann funktionieren, um entweder die nachweisbare Spezies aus einer nachweisbaren Spezies, aus einer nicht-nachweisbaren Form zu bilden (z. B. Hydrolyse einer Zuckergruppe aus der nachweisbaren Spezies wie mit einer Galactosidase) oder alternativ, um eine nicht-nachweisbare Form aus einer nachweisbaren Form (z. B. Bildung einer radikalen Gruppe, die polymerisiert oder zwei Moleküle der nachweisbaren Form kombiniert, wie mit einer Peroxidase) zu bilden. In jedem der Fälle wird das Gasphasenanalysegerät die Bildung oder Verringerung der nachweisbaren Spezies überwachen und diese mit entweder der Anwesenheit (qualitativ) oder Menge (quantitativ) der anwesenden Umwandlerkomponente in Beziehung setzen. Es wir auch verstanden, dass auch ein Reaktionsschema, das durch die Wirkung der Umwandlerkomponente ausgelöst wird, die eventuell die Form der nachweisbaren Spezies beeinflusst, eingeschlossen ist.
”Substrate” betreffen die Ausgangsform des Moleküls, das die Umwandlerkomponente in das ”Produkt” verändert oder die Endform des Moleküls nach einer Aktion der Umwandlerkomponente. Das Substrat und das Produkt müssen durch das Gasphasenanalysegerät unterschieden werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder das Substrat oder das Produkt nicht durch das Gasphasenanalysegerät nachgewiesen werden, während ihr anderes Gegenstück nachweisbar ist.
Das Gasphasenionenspektrometer betrifft irgendeine Vorrichtung, die Gasphasenionen nachweist. Gasphasenionenspektrometer schließen eine Ionenquelle ein, die Gasphasenionen bereitstellen. Gasphasenionenspektrometer schließen, zum Beispiel, Massenspektrometer, Ionenmobilitätsspektrometer und Gesamtionenladungsmessgeräte ein. In einer Ausführungsform wird ein IMS verwendet, um das nachweisbare Produkt des Assays nachzuweisen und dann zu charakterisieren. Die Trägerteilchen und das Substrat in der Flüssigphase werden in das IMS platziert und auf eine Temperatur von etwa 25°C bis etwa 600°C erhitzt, abhängig von dem nachweisbaren Molekül, z. B. wird das Produkt durch die Enzymsubstratreaktion erzeugt, wobei das Substrat selbst nicht nachweisbar ist.
Das folgende Beispiel stellt die Merkmale der Offenbarung dar und ist nicht dazu bestimmt, die Offenbarung darauf zu beschränken. In den Beispielen war ein Itemiser^3® ITMS Instrument, das Software der Version 8.12 (GE Security, Bradenton, FL) ausführt, oder ein VaporTracer^2® ITMS Instrument, das Software der Version 3.19 (GE Security, Bradenton, FL) ausführt, auf Sprengstoffmodus, mit einer Standardprobennahmedauer von 7 Sekunden, einer Desorbertemperatur von 220°C und einer Detektortemperatur von 205°C eingestellt. Vor allen experimentellen Durchläufen wurde die Einheit entsprechend den Herstellerangaben im Dualmodus unter Verwendung von Kalibrationsfallen (Part #M0001319) kalibriert. Die Systeme wurden mit der eingesetzten semipermeablen Membran (Part #PA005007) und mit dem explosiven Dotierstoff (Methylenchlorid, Part #MP005810), der im System anwesend war, durchgeführt.
BEISPIEL
In den Beispielen wurden die folgenden Chemikalien und Reagenzien verwendet. Zweibasisches Natriumphosphat, 2-(N-Morpholino)enthansulfonsäure (MES), Glycin, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris), Tween-20, Rinderserumalbumin (engl.: bovine serum albumin, BSA), Triton-X-100, Orthonitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG), Paranitrophenylphosphat (PNPP), Orthonitrophenyl (ONP), Paranitrophenyl (PNP) wurden bezogen und verwendet wie von Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) erhalten. Natriumchlorid, Natriumhydroxid und Salzsäure (konzentriert) wurden verwendet, wie von Fisher Scientific Inc. (Pittsburgh, PA) erhalten. Die folgenden Puffer wurden mit 18 MΩ Milli-Q Wasser (Millipore, Billerica, MA) hergestellt und mit Natriumhydroxid oder Salzsäure auf den korrekten pH-Wert gebracht; 10 mM Phosphat, 137 mM NaCl, 0,1% (w/w) Triton-X-100, 0,1% (w/w) Natriumazid (pH 7,4); 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 1% BSA, 0,1% Tween-20 (pH 7,6); 100 mM Glycin, 125 mM NaCl, 1 mM MgCl, 1 mM ZnCl₂ (pH 10,0); 25 mM MES (pH 6,0). Dynabeads anti-E. coli O157 wurden bezogen und in den Phosphatpuffer für den ONPG Assay oder in den Tris Puffer für den PNPP Assay entsprechend des Herstellerprotokolls gewaschen und auf ~1 × 10⁸ Teilchen/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA) verdünnt. Affinitätsgereinigter Ziege-anti-E. coli O157:H7, Phosphatase-markierter affinitätsgereinigter Ziege-anti-E. coli O157:H7 (0,1 mg/ml) und E. coli O157:H7 Positivkontrolle wurden von KPL (Gaithersbug, MD) beschafft und in 50% Wasser:50% Glycerol rehydriert und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Beta-Galactose konjugiertes Streptavidin wurde käuflich erworben und verwendet wie erhalten (Rockland, Gilbertsville, PA). EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo-Pierce, Rockford, IL) wurde, entsprechend den Herstellerprotokollen, in 25 mM MES verwendet um den Ziege-anti-E. coli Antikörper zu biotinylieren. Aufreinigungsschritte wurden mit Microcon YM-50 Spinfiltern (Millipore) mit dem Phosphatpuffer ausgeführt. Ein 4:1 molares Verhältnis von biotinyliertem Antikörper zu Streptavidin modifiziertem Enzym wurde vereinigt und 4 Stunden bei 4°C reagieren gelassen, um eine endgültige Antikörperkonzentration von ~0,1 mg/ml in dem Phosphatpuffer bereitzustellen.
Die folgenden Substrate und Produktlösungen wurden mit einer Konzentration von 1 mg/ml gebildet: ONPG in Phosphatpuffer; ONP in Phosphatpuffer; PNPP in Glycinpuffer; PNP in Glycinpuffer.
ONPG Assay: Die Folgenden wurden in einem 600 Mikroliter Polypropylenmikrozentrifugentgefäß (Fisher Scientific) vereinigt: 150 Mikroliter Phosphatpuffer, 10 Mikroliter Ziege-anti-E. coli magnetische Teilchen in Phosphatpuffer, 10 Mikroliter 1 × 10⁹ Zellen/ml E. coli Positivkontrolle, 10 Mikroliter der 0,1 mg/ml Ziege-anti-E. coli-Biotin-Streptavidin-Galactosidase in Phosphatpuffer. Diese wurden kurz gevortext und auf einer rotierenden Platte für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Mikrozentrifugengefäß für 1 Minute in ein Konzentratorrack (Dynal) für magnetische Teilchen gestellt, um den magnetischen Teilchen zu ermöglichen, sich entlang der Seitenwand zu sammeln. Der Überstand wurde entfernt und durch 300 Mikroliter des Phosphatpuffers, in den die Teilchen mittels leichtem Vortexen wieder suspendiert wurden, ersetzt. Dies wurde zwei weitere Male wiederholt, und schließlich wurden die Teilchen in 100 Mikroliter des 1 mg/ml ONPG Substrats in dem Phosphatpuffer dispergiert und für 30 min bei 37°C erhitzt.
PNPP Assay: Die Folgenden wurden in einem 600 Mikroliter Polypropylenmikrozentrifugentube (Fisher Scientific) vereinigt: 150 Mikroliter Tris Puffer, 10 Mikroliter Ziege-anti-E. coli magnetische Teilchen in Tris Puffer, 10 Mikroliter 1 × 10⁹ Zellen/ml E. coli Positivkontrolle, 10 Mikroliter der 0,1 mg/ml Ziege-anti-E. coli-Phosphatase in Tris Puffer. Diese wurden kurz gevortext und auf einer rotierenden Matte für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Mikrozentrifugengefäß für 1 Minute in ein Konzentratorrack für Teilchen gestellt, um all den magnetischen Teilchen zu ermöglichen, sich entlang der Seitenwand zu sammeln. Der Überstand wurde entfernt und durch 300 Mikroliter des Tris Puffer, in den die Teilchen durch leichtes Vortexen wieder suspendiert wurden, ersetzt. Dies wurde zwei weitere Male wiederholt, und schließlich wurden die Teilchen in 100 Mikroliter der 1 mg/ml PNPP Substrat in dem Glycinpuffer dispergiert und für 30 min bei 37°C erhitzt.
Insbesondere wurden 10 Mikroliter einer Probenlösung auf eine gewebte ”Gold” Probenfalle (Part #M0001249, GE Security, Bradenton, FL) pipettiert und sofort in den ”partikulären” Probeneingang des Instruments eingeführt. Das System wurde dann ausgelöst, um die Probe zu erlangen. Nach Aufforderung durch das Instrument wurde die Probenfalle entfernt und verworfen. Der gesammelte Datensatz bestand aus 70 Spektren, oder Plasmagrammen, die durch 100 ms Intervalle getrennt waren, diese wurden alle gespeichert und auf einem anderen Computer analysiert.
Vor dem Untersuchen der Galactosidase oder Phosphatase Assayproben wurden die 1 mg/ml ONP in Phosphatpuffer und 1 mg/ml PNP in Glycinpuffer untersucht, auf eine ähnliche Weise wie die Assayproben untersucht wurden, um die entsprechenden Driftzeiten der Produktmoleküle zu bestimmen. Zusätzlich wurde der 1 mg/ml ONPG in Phosphatpuffer und der 1 mg/ml PNPP in Glycinpuffer als Probe verwendet, um sicherzustellen, dass diese Substratmoleküle nicht durch die IMS Einheit nachgewiesen werden können.
Nach der Analyse der Assaylösungen durch die IMS Einheit wurden die gesammelten Daten untersucht und die Peakhöhen des Spektrums, das mit dem Produktmolekül assoziiert war, gesammelt. Die Peakhöhe, die mit der Driftzeit verschiedener Proben, die mit dem Assay assoziiert waren, assoziiert war, ist in den 3 und 4 dargestellt, um die Fähigkeit, die magnetischen Teilchen in einem Assay mit IMS Analyse zu verwenden, zu zeigen. Die 3 und 4 zeigen auch verschiedene Negativ- und Positivekontrollen.
Vorteilhafterweise ermöglicht es die Verwendung von dispergierten Trägerteilchen, wie hier beschrieben, dass ein vergrößerter Umfang an Oberfläche anwesend ist, um das Produkt zu bilden; es ermöglicht eine Konzentration der Oberfläche in ein kleineres Reaktionsvolumen, welches ermöglicht, dass das kleine Moleküle leichter in die Dampf- und/oder Gasphase, durch normale Entwicklung von Partialdruck oder durch gesteigerte Leichtigkeit von Verdampfung, abgegeben wird. Außerdem reduziert es auch die Anzahl der gesamten Schritte in dem Assayverfahren.
Es wird verstanden werden, dass, wenn ein Element als ”auf” einem anderen Element zu sein bezeichnet wird, es direkt auf dem anderen Element sein kann oder es können Zwischenelemente dazwischen anwesend sein. Im Gegensatz dazu, wenn ein Element als ”angelegt an” oder ”gebildet an” ein anderes Element bezeichnet wird, wird verstanden, dass die Elemente zumindest in teilweisem Kontakt miteinander stehen, außer es ist etwas anderes beschrieben.
Die Terminologie wie hier verwendet dient dem Zweck nur besondere Ausführungsformen zu beschreiben und ist nicht dazu bestimmt, die Erfindung zu beschränken. Die Einzahlformen ”ein”, ”eine” und ”der, die, das”, wie hier verwendet, sollen auch die Mehrzahlformen einschließen, außer der Zusammenhang gibt etwas anderes deutlich zu verstehen. Die Verwendung der Begriffe ”erste/erster”, ”zweite/zweiter” und dergleichen implizieren nicht eine besondere Reihenfolge, sondern sind eingefügt, um individuelle Elmente zu bezeichnen. Es wird weiter verstanden, dass die Begriffe ”umfassen” oder ”einschließen”, wenn in dieser Beschreibung verwendet, die Anwesenheit von angegebenen Merkmalen, Regionen, Zahlen, Schritten, Vorgängen, Elementen und/oder Komponenten, bezeichnen, aber nicht die Anwesenheit oder Zugabe von einem oder mehrerer anderen Merkmalen, Regionen, Zahlen, Schritten, Abläufen, Elementen, Komponenten und/oder Gruppen davon ausschließen.
Außer anderweitig definiert weisen alle Begriffe (einschließlich technischer und wissenschaftlicher Begriffe), die hier verwendet werden, die selbe Bedeutung auf, wie allgemein vom Fachmann an den sich die Ausführungsform der Erfindung richtet, verstanden. Es wird weiter verstanden, dass Begriffe wie solche, die in allgemein verwendeten Wörterbüchern definiert sind, so interpretiert werden sollen, als hätten sie eine Bedeutung, die mit ihrer Bedeutung im Zusammenhang des relevanten Standes der Technik und der vorliegenden Offenbarung übereinstimmt, und sie werden nicht in einem idealisierten oder übermäßig formalem Sinne interpretiert, außer sie sind hier ausdrücklich so definiert.
Während Ausführungsformen der Erfindung mit Bezug zu beispielhaften Ausführungsformen beschrieben wurden, wird vom Fachmann verstanden werden, dass verschiedene Veränderungen ausgeführt werden können und Äquivalente für Elemente daraus substituiert werden können, ohne den Umfang der Ausführungsformen der Erfindung zu verlassen. Zusätzlich können viele Modifikationen ausgeführt werden, um eine besondere Situation oder Material an die Lehre der erfindungsgemäßen Ausführungsformen anzupassen, ohne den wesentlichen Umfang zu verlassen. Daher ist es bestimmt, dass die erfindungsgemäßen Ausführungsformen nicht auf die besondere offenbarte Ausführungsform, die als beste Art und Weise betrachtet wird um diese Erfindung auszuführen, beschränkt werden, sondern dass die erfindungsgemäßen Ausführungsformen alle Ausführungsformen, die in den Umfang der angefügten Ansprüche fallen, eingeschlossen werden.
Zusammenfassung
Offenbart werden Verfahren für eine verbesserte Effektivität in Bezug auf die Analyse kleiner Moleküle, deren Konzentration in der Analysenlösung von der Konzentration eines Targets abhängt, welche durch einen biologischen Assay in flüssiger Phase mit Dampf- und/oder Gasphasenanalyse bestimmt wird. Das Verfahren schließt im Allgemeinen die kompetitive oder nicht-kompetitive Bindung von Zielsubstanzen an Trägerteilchen ein, welche in dem biologischen Assay als Substrate fungieren. Der Einsatz von Trägerteilchen als Substrate stellt eine vergrößerte Oberfläche für das Ablaufen der Reaktion und ein leichteres Durchführen der Waschschritte bereit, und ermöglicht die Konzentration der vergrößerten Oberfläche in ein kleineres Reaktionsvolumen vor dem Einbringen in das Dampf- und/oder Gasphasenspektrometer, wie z. B. ein Ionenmobilitätsspektrometer.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 3699333 [0002]
US 5027643 [0002]
US 5491337 [0002]
US 6690005 [0002]
WO 88/06732 [0003]
US 4629689 [0005]
US 4628037 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

E. P. Diamandis, & T. K. Christopoulos (Immunoassay, Academic Press: 1996) [0004]
S. S. Deshpande (Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development; Springer: 1996) [0004]
J. R. Crowther (The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology); Humana: 1996 [0004]
Snyder et al. (Journal of Microbiological Methods. 27 (1996) 81–88 & U. S. Statutory Invention Registration H1563, 7/2/1996) [0005]
Eiceman (Field Analytical Chemistry and Technology. 1(4):213–226, 1997) [0005]
Eiceman et al. [0006]
Snyder et al. [0006]

Claims

Verfahren zum Bestimmen eines Targets in einer Probe, wobei das Verfahren der Reihe nach umfasst: das Durchführen eines Assays, wobei der Assay ein dispergiertes Trägerteilchen, das an einen ersten Targetbinder mit einer bekannten Targetselektivität gebunden ist, einen zweiten Targetbinder, der an eine Umwandlerkomponente gebunden ist, und eine Testprobe, die ein Target in einer ersten wässrigen Flüssigkeit enthalten kann, aufweist; wobei die Umwandlerkomponente selektiv an das Target bindet, das selektiv an das Trägerteilchen gebunden ist, in einer Menge, die abhängig von einer Konzentration des Targets in der Testprobe ist; das Konzentrieren und Trennen des Trägerteilchens von der ersten wässrigen Flüssigkeit; das Ersetzen der ersten wässrigen Flüssigkeit durch eine zweite wässrige Flüssigkeit mit einem Volumenanteil des Volumens der ersten wässrigen Flüssigkeit und Dispergieren des Trägerteilchens darin; das Zuführen eines Substrates zu dem dispergierten Trägerteilchen in der zweiten wässrigen Flüssigkeit und Umwandeln des Substrates mit der Umwandlerkomponente, um ein Produkt zu bilden; und das Nachweisen der Veränderung in dem Substrat und/oder Produkt mit Dampf- und/oder Gasphasen-Analysenverfahren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Target eine Assoziation der Umwandlerkomponente mit dem Trägerteilchen erhöht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Target eine Assoziation der Umwandlerkomponente mit dem Trägerteilchen herabsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trägerteilchen magnetische Teilchen sind und das Trennen der Trägerteilchen von der ersten Flüssigkeit Anlegen eines magnetischen Feldes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trägerteilchen elektrisch geladene Teilchen sind und das Trennen der Trägerteilchen von der ersten Flüssigkeit Anlegen eines elektrischen Feldes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trägerteilchen, in Bezug auf die erste wässrige Flüssigkeit einen Brechungsindex aufweisen, der optischen Kräften ermöglicht, die Trägerteilchen zu konzentrieren und von der ersten Flüssigkeit zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trägerteilchen eine durchschnittliche Teilchengröße von etwa 5 Nanometer bis etwa 100 Mikrometer aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Trennen der Trägerteilchen von der ersten wässrigen Flüssigkeit während eines Zeitraums von weniger als 30 Minuten stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Produkt, das durch Umwandlung des Substrates durch die Umwandlerkomponente erzeugt wird, ein nachweisbares Produkt ist und das Substrat nicht nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Nachweisen der Veränderung in dem Substrat und/oder Produkt mit Dampf- und/oder Gasphasen-Analysenverfahren, Einbringen eines Aliquots der zweiten wässrigen Flüssigkeit mit den Trägerteilchen und dem nachweisbaren Produkt in ein Ionenmobilitätsspektrometer, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Produkt, das durch Umwandlung des Substrates durch die Umwandlerkomponente erzeugt wird, ein nicht nachweisbares Produkt ist und das Substrat nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Nachweisen der Veränderung in dem Substrat und/oder Produkt mit Dampf- und/oder Gasphasen-Analysenverfahren, Einbringen eines Aliquots der zweiten wässrigen Flüssigkeit mit den Trägerteilchen und dem nachweisbaren Substrat in ein Ionenmobilitätsspektrometer, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Dampf- und/oder Gasphasen-Analysenverfahren ein Ergebnis zum quantitativen oder qualitativen Bestimmen einer Anwesenheit oder einer Menge des ausgewählten Targets in der Probe erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Target einen Antikörper oder ein Antigen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste und zweite Targetbinder mindestens eine chemische Komponente aufweisen, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Aptameren, Polypeptiden, Peptiden, Nukleinsäuren, Proteinrezeptoren, Liganden, Oligonukleotiden, Streptavidin, Avidin, Biotin, Lektin, und dergleichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Targetbinder gleich sind.
Verfahren zur Analyse von nachweisbaren Produkten, die in biologischen Flüssigphasen-Assays mit Dampf- und/oder Gasphasenanalyse erzeugt werden, wobei das Verfahren umfasst: das Dispergieren magnetischer Trägerteilchen, die mit einem ersten selektiven Targetbinder modifiziert sind, und einer Umwandlerkomponente, die mit einem zweiten selektiven Targetbinder modifiziert ist, in einer Assaylösung, wobei die magnetischen Trägerteilchen eine durchschnittliche Teilchengröße von 5 Nanometer bis 100 Mikrometer aufweisen, wobei die Umwandlerkomponente ein Enzym ist, und wobei die Assaylösung eine Probe aufweist, die auf ein Target untersucht wird; das Bilden eines Komplexes, der aus mindestens einem magnetischen Trägerteilchen, mindestens einem Target, und mindestens einem Enzym besteht, verbunden durch den zweiten selektiven Targetbinder, wenn das Target anwesend ist; das Anlegen eines magnetischen Feldes und Konzentrieren der komplexierten und nicht-komplexierten magnetischen Trägerteilchen aus den nicht-komplexierten Enzymen und der Assaylösung; das erneute Dispergieren der konzentrierten magnetischen Trägerteilchen in einer zweiten Lösung, wobei die zweite Lösung ein Substrat zur Reaktion mit dem komplexierten Enzym enthält, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen; und das Nachweisen des nachweisbaren Produktes durch Einbringen eines Aliquots der Reaktionslösung in ein Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät, wobei die Reaktionslösung das nachweisbare Produkt, nicht-reagiertes Substrat, komplexierte magnetische Trägerteilchen und nicht-komplexierte magnetische Trägerteilchen enthält, und wobei das Substrat selbst nicht durch das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 17, das Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen vor dem Mischen mit der Probe, die auf das Target untersucht wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Bilden eines Komplexes kompetitiv ist, so dass eine Menge des anwesenden Komplexes negativ mit einer Menge des in der Probe anwesenden Targets korreliert.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Bilden eines Komplexes nicht-kompetitiv ist, so dass eine Menge des anwesenden Komplexes positiv mit einer Menge des in der Probe anwesenden Targets korreliert.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ionenmobilitätsspektrometer ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ionenfallenmobilitätsspektrometer ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ergebnis zum qualitativen oder quantitativen Bestimmen einer Anwesenheit oder einer Menge des ausgewählten Targets in der Probe bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Target einen Antikörper oder ein Antigen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei Trennen der Trägerteilchen von der ersten wässrigen Flüssigkeit während eines Zeitraums von weniger als 30 Minuten stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die selektiven Targetbinder mindestens eine chemische Komponente aufweisen, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Aptameren, Polypeptiden, Peptiden, Nukleinsäuren, Proteinrezeptoren, Liganden, Oligonukleotiden, Streptavidin, Avidin, Biotin, Lektin, und dergleichen.
Verfahren zur Analyse von nachweisbaren Produkten, die in biologischen Flüssigphasen-Assays mit einer Dampf- und Gasphasenanalyse erzeugt werden, wobei das Verfahren umfasst: das Dispergieren magnetischer Trägerteilchen, die mit einem ersten selektiven Targetbinder modifiziert sind, und einer Umwandlerkomponente, die mit einem zweiten selektiven Targetbinder modifiziert ist, in einer Assaylösung, wobei die magnetischen Trägerteilchen eine durchschnittliche Teilchengröße von 5 Nanometer bis 100 Mikrometer aufweisen, und die Umwandlerkomponente ein Enzym ist, wobei die Assaylösung eine Probe, die auf das Target untersucht wird, umfasst; das Bilden eines Komplexes, der aus mindestens einem magnetischen Teilchen, mindestens einem Target, und mindestens einem Enzym besteht, verbunden durch die entsprechenden Targetbinder, wenn das Target anwesend ist; das Anlegen eines magnetischen Feldes und Konzentrieren der komplexierten und nicht-komplexierten magnetischen Trägerteilchen aus den nicht-komplexierten Enzymen und der Assaylösung; das erneute Dispergieren der konzentrierten magnetischen Trägerteilchen in eine Reaktionslösung, wobei die Lösung ein nachweisbares Substrat zur Reaktion mit dem komplexierten Enzym enthält, um ein nicht-nachweisbares Produkt zu erzeugen; und das Nachweisen des nachweisbaren Substrates durch Einbringen eines Aliquots der Reaktionslösung in ein Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät, wobei die Reaktionslösung Produkt, nicht-reagiertes Substrat, komplexierte magnetische Trägerteilchen und nicht-komplexierte magnetische Trägerteilchen enthält, wobei das Produkt selbst nicht durch das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 27, das Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen vor dem Mischen mit der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Anlegen eines magnetischen Feldes die magnetischen Trägerteilchen von der Assaylösung trennt und Unterbrechen des magnetischen Feldes die magnetischen Teilchen in die Reaktionslösung erneut dispergiert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Bilden eines Komplexes kompetitiv ist, so dass eine Menge des anwesenden Komplexes negativ mit einer Menge des anwesenden Targets in der Probe korreliert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Bilden eines Komplexes nicht-kompetitiv ist, so dass eine Menge des anwesenden Komplexes positiv mit einer Menge des in der Probe anwesenden Targets korreliert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ionenmobilitätsspektrometer ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ionenfallenmobilitätsspektrometer ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Gas- und/oder Dampfphasenanalysegerät ein Ergebnis zum qualitativen oder quantitativen Bestimmen einer Anwesenheit oder einer Menge des ausgewählten Targets in der Probe bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Target einen Antikörper oder ein Antigen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Anlegen eines magnetischen Feldes und das erneute Dispergieren der Trägerteilchen aus der Assaylösung während einer Zeit von weniger als 30 Minuten stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Targetbinder mindestens eine chemische Komponente aufweisen, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Aptameren, Polypeptiden, Peptiden, Nukleinsäuren, Proteinrezeptoren, Liganden, Oligonukleotiden, Streptavidin, Avidin, Biotin, Lektin, und Kombinationen davon.