DE112007001503T5

DE112007001503T5 - Kügelchen-Immobilisierungsverfahren und dadurch gebildete Kügelchen-Arrays

Info

Publication number: DE112007001503T5
Application number: DE112007001503T
Authority: DE
Inventors: Dan Veniamin Brownlow Hill Nicolau; Luisa Filipponi; Prashant Dnyandeo Melbourne Sawant
Original assignee: Swinburne University of Technology
Current assignee: Swinburne University of Technology
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2027-06-28
Also published as: NZ573915A; DE112007001503B4; US20170232646A1; IL196156A; DE112007001503A5; US10335982B2; AU2007264405B2; US20090270276A1; AU2007264405A1; US9586346B2; WO2008000031A1; IL196156A0

Abstract

Kügelchen-Immobilisierungsverfahren, umfassend das Aufnehmen mindestens eines Kügelchens in mindestens einem Napf einer Gießfläche, und das Gießen eines Gießmaterials auf die Gießfläche zum Bilden eines Negativabgusses, bei dem das mindestens eine Kügelchen an mindestens einen Stift gegossen wird, der von einer Oberfläche des Negativabgusses absteht.

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kügelchen-Immobilisierungsverfahren und dadurch gebildete Kügelchen-Arrays.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nanoarrays und Mikroarrays, die in der biotechnologischen, pharmazeutischen und medizinischen Industrie verwendet werden, werden generell ausgebildet, indem reaktive und als Nachweis verwendbare chemische Einheiten auf Substraten in räumlich adressierbaren Arrays gebildet werden. Die herkömmlichen Immobilisierungstechnologien zum Bilden derartiger Arrays können grob in Photolithographie- und Spotting-Technologien kategorisiert werden.
Bei der Photolithographie-Technologie werden Arrays chemisch modifizierter Sites mittels Photolithographie und kombinatorischer Chemie in situ auf Substrate synthetisiert. Probleme bei dieser Immobilisierungstechnologie sind der Kostenaufwand, die Komplexität und der Zeitaufwand, die mit den mehrfachen Schritten des Bestrahlens, des Maskierens und der chemischen Reaktion einhergehen.
Bei der Spotting-Technologie werden Tröpfchen einer chemischen Reaktions-/Nachweis-Lösung auf der Oberfläche eines Substrats oder in Näpfe, die in dem Substrat ausgebildet sind, auf- bzw. eingebracht. Bei dieser Immobilisierungstechnologie treten Probleme in Form von unzureichender Präzision und Reproduzierbarkeit und eines niedrigen Signal-/Rauschverhältnisses auf. Tropfen auf der Oberfläche des Substrats können mit benachbarten Spotts interferieren, so dass Kontamination verursacht wird. Die Dichte und die Gleichförmigkeit jedes Spotts kann nicht leicht gesteuert werden. Um den Umfang eines Spottbereichs angeordnetes Verfestigungsmittel kann eine nichtspezifische Adsorption von Tröpfchen auf dem Substrat verursachen und das Signal-/Rauschverhältnis verschlechtern. Das Lumineszenz-Signal-/Rauschverhältnis von Oberflächen-Spotts oder Tröpfchen, die in den Näpfen gehalten sind, wird durch das Lumineszenz-Hintergrundrauschen aus dem Substrat selbst reduziert.
Somit besteht Bedarf an einer Immobilisierungstechnologie zum Bilden von Nanoarrays und Mikroarrays, die gattungskonform, einfach und kostengünstig ist und sich dennoch durch verbesserte Präzision, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit auszeichnet.
ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kügelchen-(Bead-)Immobilisierungsverfahren bereitgestellt, bei dem mindestens ein Kügelchen (Bead) in mindestens einem Napf einer Gießfläche aufgenommen wird, und ein Abgussmaterial über die Gießfläche gegossen wird, um einen negativen Abguss zu bilden, bei dem das mindestens eine Kügelchen auf mindestens einen Stift aufgebracht wird, der von einer Oberfläche des negativen Abgusses absteht.
Das mindestens eine Kügelchen kann ausgewählt werden aus einem Mikropartikel, einer Mikrosphäre, einem Nanopartikel, einer Nanosphäre und Kombinationen derselben.
Der mindestens eine Napf kann ein Mikronapf sein, und der mindestens eine Stift kann ein Mikrostift sein.
Das mindestens eine Kügelchen, der mindestens eine Napf und/oder der mindestens eine Stift können funktionalisiert werden mit Funktionen, die ausgewählt sind aus dem Interagieren, Reagieren, Binden, Nachweisen, Detektieren, Identifizieren, Markieren und Kombinationen derselben. Das mindestens eine Kügelchen und/oder der mindestens eine Napf können vor und/oder während des Gieß-Schritts funktionalisiert werden, und das mindestens eine Kügelchen und/oder der mindestens eine Stift können während und/oder nach dem Gieß-Schritt funktionalisiert werden.
Der mindestens eine Napf kann eine Vertikalquerschnittsform haben, die gewählt ist unter einer V-Form, einer U-Form und einer rechteckigen U-Form. Der mindestens eine Stift kann eine Vertikalquerschnittsform haben, bei der es sich um die umgekehrte Form des Vertikalquerschnitts des mindestens einen Napfes handelt.
Der Aufnahme-Schritt kann das Aufnehmen mehrerer Kügelchen in mehreren Näpfen der Gießfläche umfassen, derart, dass in dem Gieß-Schritt ein negativer Abguss mit mehreren Kügelchen gebildet wird, die auf mehrere Stifte verteilt sind. Die mehreren Kügelchen können in gleicher, größerer oder kleinerer Anzahl als die mehreren Näpfe vorhanden sein, und somit können die mehreren Kügelchen in gleicher, größerer oder kleinerer Anzahl- als die mehreren Stifte vorhanden sein.
Die mehreren Kügelchen, die auf die mehreren Stifte verteilt sind, können ein Array von Kügelchen auf Stiften oder ein Kügelchen-auf-Stift-Array bilden.
Der Aufnahme-Schritt kann durchgeführt werden durch zufallsbedingtes oder gelenktes Einbringen der mehreren Kügelchen in die mehreren Näpfe.
Bei der räumlichen Verteilung der jeweiligen funktionalisierten oder nicht-funktionalisierten Kügelchen in dem Array kann es sich um einen räumlichen Code zum Identifizieren und/oder Lesen des Arrays handeln.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner ein Kügelchen-auf-Stift-Array, das durch das oben beschriebene Negativabgussverfahren gebildet ist.
Die Höhe der auf den Stiften angeordneten Kügelchen über der Oberfläche des Arrays kann das Detektions-Signal-/Rausch-Verhältnis des Arrays oder seiner Kügelchen verbessern.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird nun, jedoch nur als Beispiel, im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen Folgendes gezeigt ist:
1a, 1b und 1c zeigen schematische Darstellungen eines Kügelchen-Immobilisierungsverfahrens durch Negativabguss von Kügelchen auf Stifte;
2a und 2b zeigen mikroskopische Bilder eines Kügelchens in einem Napf, und eines Negativabgießens eines Kügelchens auf einem Stift;
3a und 3b zeigen mikroskopische Bilder von Kügelchen in einem Array von Näpfen, und eines Negativabgießens eines Kügelchen-auf-Stift-Arrays;
4a, 4b und 4c zeigen mikroskopische Nahaufnahmen eines Kügelchen-auf-Stift-Arrays;
5a, 5b und 5c zeigen mikroskopische Bilder verschiedener räumlicher Codes funktionalisierter Kügelchen in Kügelchen-auf-Stift-Arrays;
6a zeigt eine schematische Darstellung eines Arrays von Clustern funktionalisierter Kügelchen auf Stiften, und 6b zeigt mikroskopische Nahaufnahmen von Clustern funktionalisierter Kügelchen auf Stiften;
7 zeigt ein mikroskopisches Bild von Kügelchen vor dem Negativabgießen;
8a und 8b zeigen Fluoreszenzbilder eines Kügelchen-auf-Stift-Arrays vor und nach dem Zusammenwirken funktionaler Kügelchen in dem Array;
9a, 9b und 9c zeigen mikroskopische Bilder von Kügelchen-auf-Stift-Arrays mit nichtfunktionalisierten Kügelchen und Kügelchen, die funktionalisiert sind zum selektiven Binden von Streptavidin (9c) und nicht Anti-Maus-IgG (9b); und
10a, 10b und 10c zeigen mikroskopische Bilder von Kügelchen-auf-Stift-Arrays mit nichtfunktionalisierten Kügelchen und Kügelchen, die funktionalisiert sind zum selektiven Binden von Anti-Kaninchen-IgG (10c) und nicht Anti-Maus-IgG (10b).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1a, 1b und 1c zeigen vereinfachte Beispiele eines Kügelchen-Immobilisierungsverfahrens 100 mittels Negativabgießens auf einer Gießfläche 110 mit Mikronäpfen 120. Mikrokügelchen 130 werden erst in den Näpfen 120 aufgenommen, und dann wird ein Abgussmaterial 140 über die Gießfläche 110 gegossen, um einen Negativabguss 150 zu bilden, bei dem die Kügelchen 130 auf Mikrostifte 160 gegossen sind, die von einer Oberfläche des Negativabgusses 150 abstehen. 1c zeigt, dass ein Variieren der Größe der Kügelchen 130 relativ zu der Tiefe der Näpfe 120 die Höhe der Stifte 160 und somit die Höhe der Kügelchen über der Oberfläche des Negativabgusses 150 beeinflusst.
2a zeigt eine mikroskopische Nahaufnahme eines Mikrokügelchens in einem Mikronapf vor dem Negativgießen, und 2b zeigt eine mikroskopische Nahaufnahme eines Mikrokügelchens an einem Mikrostift nach dem Negativgießen. 3a zeigt mehrere Kügelchen, die zufallsbedingt in einen Gitter-Array von Näpfen einer Gießfläche aufgenommen sind, und 3b zeigt den resultierenden Negativabguss mit einem Gitter-Array von Kügelchen auf Stiften (oder einem Kügelchen-auf-Stift-Array). 4a, 4b und 4c zeigen mikroskopische Nahaufnahmen eines Kügelchen-auf-Stift-Mikroarrays.
Bei den gezeigten Ausführungsformen sind die Näpfe und somit die Stifte teilweise mit Kügelchen belegt. Die Kügelchen können die Näpfe und somit die Stifte in geordneten oder beliebigen Mustern belegen. Es wird ersichtlich sein, dass die Kügelchen-Napf-Belegung durch Variieren der relativen Formen und Größen der Kügelchen und Näpfe und durch die Art, in der die Kügelchen in den Näpfen aufgenommen werden, gesteuert werden kann. Bei den gezeigten Ausführungsformen sind einzelne Näpfe/Kügelchen durch keines oder einzelne Kügelchen belegt. Ferner wird ersichtlich sein, dass einzelne Näpfe/Stifte von keinem, einem einzigen oder mehreren Kügelchen belegt sein können, und dass die Kügelchen-/Napf-/Stift-Packdichte durch Variieren der Form und Größe der Kügelchen und Näpfe und die Art, in der die Kügelchen in den Näpfen aufgenommen werden, gesteuert werden kann. Als Beispiel wird nachstehend das Negativabgießen von Clustern von Kügelchen auf einzelne Stifte erläutert.
Die Aufnahme von Kügelchen in den Näpfen kann zufallsbedingt oder durch gelenktes Einbringen der Kügelchen in die Näpfe erfolgen. Beispielsweise können die Kügelchen zufallsbedingt in die Näpfe eingebracht werden, indem eine kolloidale Kügelchen-Lösung durch Spin-Coating auf die Gießfläche aufgetragen wird. Die räumliche Verteilung der von den Näpfen aufgenommenen Kügelchen kann durch selektives Variieren von Parametern beeinflusst werden, die gewählt sind unter der Geschwindigkeit des winkligen Spin-Coatings, der Häufigkeit und Dauer des Spin-Coating, der Konzentration der kolloidalen Lösung, der Form und Größe der Kügelchen, und der Form, Breite, Tiefe und des gegenseitigen Abstands der Näpfe, etc. Alternativ können die Kügelchen unter Verwendung von Nadeln, mikrofluidischer Strukturen, Masken, Schablonen, aufgebrachter elektrischer Kräfte, elektrostatischer Selbstanordnung, magnetischer Kräfte, Laser-Tweezer etc. in die Näpfe gelenkt werden. Bei der räumlichen Verteilung der Kügelchen in den Näpfen und somit an den Stiften kann es sich um ein zufälliges oder geordnetes Muster handeln, je nachdem, ob die Kügelchen durch zufallsbedingtes oder gelenktes Einbringen von den Näpfen aufgenommen werden.
Bei Betrieb ermöglicht die Höhe der Kügelchen über der ebenen Fläche des Arrays vorteilhafterweise eine verbesserte Detektion oder Diskriminierung der Kügelchen. Wenn beispielsweise ein Konfokal-Mikroskop verwendet wird, um das Kügelchen-auf-Stift-Array auf Fluoreszenz-Basis zu lesen, wird die Fluoreszenz der Kügelchen auf der Höhe des Stifts gelesen, wodurch die Restfluoreszenz von der Oberfläche des Arrays unterdrückt wird. Die Kügelchen-auf-Stift-Arrays weisen somit verbesserte Detektions-Signal-/Rausch-Verhältnisse auf, z. B. verbesserte optische Detektions-Signal-/Rausch-Verhältnisse.
Die Mikronäpfe bei den gezeigten Ausführungsformen sind im Vertikalquerschnitt im Wesentlichen V-förmig, und die invertiert geformten Mikrostifte haben einen im Wesentlichen invertierten V-förmigen Vertikalquerschnitt. Es wird ersichtlich sein, dass die Erfindung auch mit Näpfen, die andere vertikale Querschnitte haben, z. B. U-Formen, rechteckige U-Formen etc., und mit Stiften implementiert werden kann, die invertiert geformte vertikale Querschnitte haben, z. B. invertierte U-Formen, invertierte rechteckige U-Formen etc. Ferner kann der horizontale Querschnitt der Näpfe und somit der Stifte jede zweidimensionale Form haben, die ausreicht, um Kügelchen aufzunehmen bzw. zu halten. Ferner wird ersichtlich sein, dass die Erfindung nicht auf diese Formen beschränkt ist und dass das Negativ-Abgießen mit Näpfen und umgekehrt geformten Stiften implementiert werden kann, die beliebige komplementäre dreidimensionale Geometrien aufweisen, welche zum Aufnehmen bzw. Halten von Kügelchen geeignet sind. Beispielsweise können die umgekehrt gegossenen Mikrostifte im Wesentlichen konisch, pyramidenförmig, zylindrisch, rechteckig etc. sein.
Die Kügelchen können Mikropartikel, Mikrosphären, Nanopartikel, Nanosphären und Kombinationen derselben sein, die aus Glas, Kunststoff, Keramik, magnetischem Material und Kombinationen derselben hergestellt sind. Die Kügelchen, Näpfe und/oder Stifte können funktionalisiert sein mit Funktionen, die gewählt sind unter dem Interagieren, Reagieren, Binden, Nachweisen, Detektieren, Identifizieren, Bezeichnen und Kombinationen derselben. Die Kügelchen und/oder Näpfe können vor dem Negativ-Abgießen funktionalisiert werden, während die Kügelchen und/oder Stifte während und/oder nach dem Gieß-Schritt funktionalisiert werden.
Je nach der gewünschten Funktionalität des Kügelchen-auf-Stift-Arrays können die Kügelchen eine chemische Modifikation aufweisen, die gewählt ist aus einem Rezeptor, einem Kohlehydrat, einem Dendrimer, einer chemischen funktionalen Gruppe, einem chemischen Molekül, einer Detektionsmarkierung, einem Lumineszenz-Tag, einem Farb-Tag, Quantum-Dots, einem Metall-Nanopartikel, einer Phosphormarkierung, einer redox-aktiven Sonde, einem biologischen Molekül, Nukleinsäure, DNA, einem Enzym, einem Protein, einem Antikörper, einem Mikroorganismus, RNA, Oligonukleotiden, und Fragmenten oder Kombinationen derselben. In Abhängigkeit von der gewählten Funktionalität können die Kügelchen selektiv chemisch modifiziert werden, bevor sie in den Näpfen, an den Stiften, oder in bzw. an Kombinationen derselben aufgenommen werden. Je nachdem, welche funktionalen Kügelchen gewählt sind, kann die Funktionalität des Kügelchen-auf-Stift-Arrays ausgewählt werden aus einem Biochip, einem Oligonukleotid-Array, einem Nukleinsäure-Array, einem DNA-Array, einem RNA-Array, einem Peptid-Array, einem Kohlehydrat-Array, einem Dendrimer-Array, einem Protein-Array, einem Zell-Array, und Kombinationen derselben.
Die Gießfläche kann eine Form oder eine Schablone sein, die aus einem starren Substratmaterial gebildet ist, das ausgewählt ist aus einem Polymermaterial, einem anorganischen Material, einem Siliciummaterial, einem Quarzmaterial, einem Glasmaterial, oder Kombinationen derselben. Beispielsweise kann die Form ein Siliciumsubstrat-Master sein. Die Mikronäpfe können durch herkömmliche Techniken in der Form ausgebildet werden, z. B. Lithographie oder Ätzen. Die Form kann wiederverwendet werden, um eine Reproduktion oder Replikation des Kügelchen-auf-Stift-Arrays mit verschiedenen räumlichen Verteilungen oder nichtfunktionalisierten oder funktionalisierten Kügelchen und/oder verschiedenen räumlichen Verteilungen verschieden funktionalisierter Kügelchen zu ermöglichen.
Das Gießmaterial kann ausgewählt sein aus einem Polymermaterial, einem Polymerisationsinitiator, einem Polymerisationskatalysator, einem anorganischen Vorläufer, einem Metall-Vorläufer oder Kombinationen derselben. Beispielsweise kann das Gießmaterial Polydimethylsiloxan (PDMS) sein.
Die räumlichen Verteilungen oder Positionen verschiedener funktionalisierter und/oder nichtfunktionalisierter Kügelchen kann räumliche Adressen in dem Kügelchen-auf-Stift-Array repräsentieren. Die räumlichen Adressen können einen räumlichen Code zum Selbstidentifizieren oder Lesen des Arrays repräsentieren. 5a, 5b und 5c zeigen mikroskopische Bilder verschiedener räumlicher Codes bei verschiedenen Kügelchen-auf-Stift-Arrays.
Räumliche Kügelchen-auf-Stift-Arrays können a priori durch gelenkten Auftrag oder a posteriori durch zufallsbedingten Auftrag zugewiesen werden. Wenn die Kügelchen in durch gelenkten Auftrag in den Näpfen aufgenommen werden, kann der räumliche Code des Kügelchen-auf-Stift-Arrays mindestens teilweise vorbestimmt werden, bevor das Negativabgießen vorgenommen wird. Alternativ können, wenn die Kügelchen durch zufallsbedingten Auftrag in den Näpfen aufgenommen werden, die räumlichen Adressen des räumlichen Codes nach dem Negativabgießen mittels markierungs-basierter Detektionsverfahren oder markierungsfreier Detektion einzelner immobilisierter Kügelchen bestimmt werden. Bei der markierungs-basierten Detektion kann jede beliebige herkömmliche Technologie zum Detektieren von Markierungen oder anderer Funktionen, die einzelnen immobilisierten Kügelchen zugeordnet sind, verwendet werden, z. B. Fluoreszenz, gesteigerte Fluoreszenz unter Verwendung von Dendrimer- und/oder Quantum-Dot-Technologie, Phosphoreszenz, elektrochemische Detektion, metall-nanopartikel-basierte Detektion, z. B. mittels silber-aktivierter Abbildung, Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Abbildung, Lichtstreuung, oberflächenaktivierte Raman-Spektroskopie, photothermische Abbildung, elektrochemische Detektion, abtastende elektrochemische Mikroskopie, kalorimetrische Veränderung, etc. Bei der markierungsfreien Detektion können beliebige herkömmliche Technologien zum Detektieren intrinsischer Eigenschaften einzelner immobilisierter Kügelchen verwendet werden, z. B. Bild-Nullellipsometrie, Bildoberflächen-Plasmon-Resonanz, Massenspektroskopie, Flugzeit-Sekundärmassenspektroskopie und intrinsische UV-Fluoreszenz, etc.
Cluster funktionalisierter Mikrokügelchen können auf einzelne Stifte gegossen werden, wobei die Funktionalität des Kügelchen-auf-Stift-Arrays einzelne funktionalisierte Bereiche erfordert, die im Durchmesser größer als ungefähr 0.5 mm sind. 6a zeigt ein Kügelchen-auf-Stift-Array, das gebildet ist durch Negativgießen von Clustern von Kügelchen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 mm auf Stifte in einem Gitter-Muster von 5 × 5 mm². 6b zeigt mikroskopische Nahaufnahmen von Clustern immobilisierter Kügelchen vor und nach der Ultraschallbehandlung. Einzelne Mikrokügelchen in dem Kügelchen-Cluster haben einen Durchmesser von ungefähr 2 μm.
Die Ausführungsformen sind nur als Beispiele beschrieben worden, und innerhalb des Umfangs der offenbarten Erfindung sind Modifikationen möglich.
Die folgenden Beispiele sind nur zur Veranschaulichung vorgesehen. Somit sind sie nicht dahingehend zu interpretieren, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
BEISPIEL 1
Ein Kügelchen-Mikroarray wurde zur Protein-Immobilisierung durch kovalente Bindung mittels amino-endiger Mikrokügelchen hergestellt. Die verwendeten Kügelchen waren amino-endige Melamin-Mikrokügelchen (NH₂-Mikrosphären), gekennzeichnet durch eine hohe und gleichförmige Ligandendichte (12,6 × 10⁶ Aminogruppen pro Mikrosphäre). Die Kügelchen waren sphärisch, gleichförmig in ihrer Bemessung (2 μm) und wiesen eine beschränkte Tendenz zum Aggregieren auf, wie anhand des SEM-Bildes von 7 ersichtlich ist. Die Verwendung einer verdünnten Kügelchen-Lösung (0,04% Gew/vol) und einer leichten Wirbelungsbehandlung vor ihrer Verwendung führte zu einer Beschränkung der Bildung von Aggregaten.
Ein NH₂-Kügelchen-Mikroarray wurde mittels des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens hergestellt. Insbesondere wurde eine Wasserlösung der NH₂-Kügelchen durch Spin-Coating auf eine Silicium-Master-Form aufgetragen, die eine Gruppe von 25 V-förmigen Mikronäpfen unter Anordnung in einem 5 × 5-Gitter-Muster aufwies. Während des Spin-Coating wurden die NH₂-Kügelchen zufällig in den Näpfen des Masters verteilt. Das Spin-Coating wurde dreimal wiederholt, um eine gute Abdeckung zu gewährleisten, und der Silicium-Master wurde zwischen sämtlichen Beschichtungsschritten zu einem flachen PDMS-Stück gepresst, um Kügelchen zu entfernen, die auf den flachen Flächen des Masters zwischen den Mikrokügelchen angeordnet waren. Dann wurde PDMS-Präpolymer über den Silicium-Master gegossen, in einem Ofen gehärtet, in dem es sich verfestigte, und von dem Master abgeschält, der zur Wiederverwendung beibehalten wurde. Die Relativbemessungen der Näpfe und der Mikrokügelchen beeinflussen die Anzahl der Kügelchen, die in dem Array platziert werden. In diesem Beispiel ent hielt der Silicium-Master 25 Näpfe mit einer Breite von 4 μm und einer Tiefe von 3 μm (gemessen in der Mitte der invertierten Pyramide). Bei diesem Typ von Array wurden im Mittel 13 ± 3 Mikrokügelchen zufällig in die 25 Näpfe eingebracht und zwischen diesen verteilt.
Ein Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray, das 12 eingeschlossene Kügelchen enthielt, wurde auf seine Stabilität getestet. Insbesondere wurde das NH₂-Kügelchen-Mikroarray einer extensiven Ultraschallbehandlung unterzogen, um die mechanische Stabilität der eingeschlossenen Kügelchen zu beurteilen. Es wurden verschiedene Medien verwendet, und die Ultraschallbehandlung wurde 5, 10 und 20 Minuten lang vorgenommen. Bei den gewählten Medien handelte es sich um diejenigen, die üblicherweise beim Durchführen einer Protein-Immobilisierung (wässrige Puffer) und beim Reinigen des Substrats (Ethanol) verwendet werden, einschließlich eines (mit geringer Wahrscheinlichkeit verwendeten) organischen Lösungsmittels (Aceton). Von den 12 Kügelchen, die das Array bildeten, löste sich kein Kügelchen von der PDMS-Form, noch nicht einmal nach einer 20minütigen Ultraschallbehandlung.
Die Reaktivität der Amino-Mikrokügelchen nach der Array-Herstellung wurde mittels eines amino-reaktiven Fluorospheres getestet; ein Array von Glaskügelchen wurde zur Kontrolle verwendet. 8a und 8b zeige Epifluoreszenz-Mikroskopiebilder nach der Reaktion des NH₂-Kügelchen-Mikroarrays und des Kontroll-Glaskügelchen-Mikroarrays. 8b zeigt, dass fluoreszierende Kügelchen ausschließlich an dem amino-funktionalisierten Array (nicht in der Kontrollanordnung) detektiert wurden, was auf ihre beibehaltene Aktivität hindeutet.
Proteine wurden mittels eines Bioerkennungs-Liganden-Systems, insbesondere Biotin-Streptavidin, selektiv immobilisiert. Diese Liganden sind äußerst spezifisch und bewirken gleichzeitig eine Immobilisierung, die ihrer Stärke der kovalenten Bindung gleicht. Biotin-Mikrosphären wurden durch Anheften eines handelsüblichen Biotin-Liganden an die amino-endigen Melamin- Mikrokügelchen synthetisiert. Ein Biotin-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray wurde dann entsprechend dem oben beschriebenen Vorgang hergestellt. Um ein nichtspezifisches Anhaften auf der PDMS-Hintergrundfläche zu verhindern, wurde das Biotin-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray mittels einer proteinresistenten Beschichtung, nämlich bovine Serumalbuminlösung (BSA), blockiert. Das Biotin-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray wurde auf zwei Proteine getestet, nämlich Streptavidin (das "Target-Protein") und Anti-Maus-IgG (ein "Kontroll-Protein"), die nicht mit der Kügelchen-auf-Stift-Mikrorray-Plattform reagieren sollten. Die Target- und Kontroll-Proteine wurden jeweils mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert, und zwar grün fluoreszierend im Fall von Streptavidin (FITC), und rot im Fall von Anti-Maus-IgG (Alexa Fluor^® 546). Das Biotin-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray wurde ferner zur Kontrolle abgebildet. 9a, 9b und 9c zeigen, dass eine Erkennung nur bei dem gewünschten Target-Protein erfolgte, d. h. dem FITC-markierten Streptavidin (9c).
BEISPIEL 2
Ferner wurden Proteine mittels eines immuno-basierten Erkennungssystems immobilisiert. Antikörper (Kaninchen-IgG) wurden an Kügelchen durch kovalente Bindung mittels eines handelsüblichen heterobifunktionalen Vernetzungsmittels (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidamethyl)cyclohexan-1-carboxylat) immobilisiert. IgG könnte auch durch physische Adsorption immobilisiert werden. Dann wurde ein Antikörper-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray entsprechend dem oben beschriebenen Vorgang hergestellt. Das Antikörper-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray wurde mittels BSA blockiert, um eine nichtspezifische Adsorption von Proteinen an der PDMS-Oberfläche zu verhindern, wie oben im Zusammenhang mit den Biotin-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray beschrieben. Das Antikörper-Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray wurde auf Anti-Kaninchen-IgG (das "Target-Protein") und auf Anti-Maus-IgG ("Kontroll-Protein") getestet, das nicht mit dem Kaninchen-IgG reagieren sollte. Die Target- und Kontroll-Proteine wurden jeweils mit einem grü nen fluoreszierenden Farbstoff (FITC) und einem roten fluoreszierenden Farbstoff (Alexa Fluor^® 546) markiert. Ferner wurde ein Kügelchen-auf-Stift-Mikroarray, bei dem keine Antikörper an den Kügelchen anhafteten, als zweite Kontrollinstanz abgebildet. 10a, 10b und 10c zeigen, dass eine immuno-basierte Erkennung nur bei dem gewünschten Target-Protein auftrat, d. h. dem FITC-markierten Anti-Kaninchen-IgG (10c).
Aus den Ergebnissen der oben aufgeführten beiden Beispiele ist Folgendes ersichtlich.

– Die biomolekulare Funktionalität der Mikrosphären wird während des Herstellungsvorgangs beibehalten. Dies zeigt sich an der beibehaltenen Fähigkeit mit Biotin und Kaninchen-IgG konjugierter Kügelchen, selektiv Streptavidin bzw. Anti-Kaninchen-IgG zu binden und keine anderen Proteine (Anti-Maus-IgG) zu binden; ein Blockieren mit BSA vor dem Inkubieren der Kügelchen-auf-Stift-Mikrorray-Platformen mit Target-Proteinen (Streptavidin oder Anti-Kaninchen-IgG) schließt aus, dass Target-Proteine aufgrund von nichtspezifischer Adsorption über die Mikrosphären immobilisiert werden.
– Die fluoreszierenden Arrays weisen ausgezeichnete Signal-/Rausch-Verhältnisse bei der optischen Detektion auf (mittlere Spott-Intensitäts-/Hintergrund-Standardabweichung = 80 bis 100).
– Die Geometrie oder die räumlichen Codes sind in 9c und 10c deutlich sichtbar, wodurch die Kodierfähigkeit der Kügelchen-Mikroarray-Plattform demonstriert wird.

Das Kügelchen-Immobilisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung und der durch dieses gebildeten Kügelchen-auf-Stift-Arrays sind nicht auf die oben angeführten Beispiele beschränkt. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen ein einfaches, gattungskonformes, empfindliches, präzises und reproduzierbares Verfahren zum Bilden von Kügelchen-auf-Stift- Nanoarrays oder Mikroarrays mit herkömmlichen Funktionalitäten bereit, die aus dem Interagieren, Reagieren, Binden, Nachweisen, Detektieren, Identifizieren, Markieren und Kombinationen derselben ausgewählt sind.
ZUSAMMENFASSUNG
Kügelchen-Immobilisierungsverfahren, umfassend das Aufnehmen mindestens eines Kügelchens in mindestens einem Napf einer Gießfläche, und das Gießen eines Gießmaterials auf die Gießfläche zum Bilden eines Negativabgusses, bei dem das mindestens eine Kügelchen an mindestens einen Stift gegossen wird, der von einer Oberfläche des Negativabgusses absteht.

Claims

Kügelchen-Immobilisierungsverfahren, umfassend das Aufnehmen mindestens eines Kügelchens in mindestens einem Napf einer Gießfläche, und das Gießen eines Gießmaterials auf die Gießfläche zum Bilden eines Negativabgusses, bei dem das mindestens eine Kügelchen an mindestens einen Stift gegossen wird, der von einer Oberfläche des Negativabgusses absteht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das mindestens eine Kügelchen ausgewählt ist aus einem Mikropartikel, einer Mikrosphäre, einem Nanopartikel, einer Nanosphäre und Kombinationen derselben.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der mindestens eine Napf ein Mikronapf ist, und der mindestens eine Stift ein Mikrostift ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das mindestens eine Kügelchen, der mindestens eine Napf und/oder der mindestens eine Stift funktionalisiert werden mit Funktionen, die ausgewählt sind aus dem Interagieren, Reagieren, Binden, Nachweisen, Detektieren, Identifizieren, Markieren und Kombinationen derselben.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das mindestens eine Kügelchen und/oder der mindestens eine Napf vor und/oder während des Gieß-Schritts funktionalisiert werden, und das mindestens eine Kügelchen und/oder der mindestens eine Stift während und/oder nach dem Gieß-Schritt funktionalisiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der mindestens eine Napf eine Vertikalquerschnittsform hat, die gewählt ist unter einer V-Form, einer U-Form und einer rechteckigen U-Form.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der mindestens eine Stift eine Vertikalquerschnittsform hat, welche die umgekehrte Form des Vertikalquerschnitts des mindestens einen Napfes ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Aufnahme-Schritt das Aufnehmen mehrerer Kügelchen in mehreren Näpfen der Gießfläche derart umfasst, dass in dem Gieß-Schritt ein negativer Abguss mit mehreren Kügelchen gebildet wird, die auf mehrere Stifte verteilt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die mehreren Kügelchen in gleicher, größerer oder kleinerer Anzahl als die mehreren Näpfe vorhanden sind, und somit die mehreren Kügelchen in gleicher, größerer oder kleinerer Anzahl als die mehreren Stifte vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die mehreren Kügelchen, die auf die mehreren Stifte verteilt sind, ein Array von Kügelchen auf Stiften oder ein Kügelchen-auf-Stift-Array bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem der Aufnahme-Schritt durchgeführt wird durch zufallsbedingtes oder gelenktes Einbringen der mehreren Kügelchen in die mehreren Näpfe.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die räumliche Verteilung funktionalisierter oder nichtfunktionalisierter Kügelchen auf Stifte in dem Array ein räumlicher Code zum Identifizieren und/oder Lesen des Arrays ist.
Kügelchen-auf-Stift-Array, gebildet durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Array nach Anspruch 13, bei dem die Höhe der auf Stiften angeordneten Kügelchen über der Oberfläche des Arrays das Detektions-Signal-/Rausch-Verhältnis des Arrays oder seiner Kügelchen verbessert.