DE10347389A1

DE10347389A1 - Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht

Info

Publication number: DE10347389A1
Application number: DE2003147389
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2005-05-19
Also published as: WO2005003837A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Proben (12) auf ortsauflösende Detektoren (14) für elektromagnetische Strahlung. Die Anordnung umfaßt eine Strahlungsquelle (1) zur Ausleuchtung einer nachgeordneten strukturierten Feldblende (8) und zur Erzeugung einer in der Objektebene dem Objekt oder der Probe (12) zu überlagernden Beleuchtungsstruktur. Durch optische Mittel werden die Feldblende (8) auf die Probe (12) in Dunkelfeldbeleuchtung und die Probe (12) mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor (14) für optische Strahlung abgebildet. Die Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes erfolgt durch eine mit dem Detektor (14) verbundene Auswerteeinheit.

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen reflektierenden oder lumineszieren- den, insbesondere fluoreszierenden, Objekten auf einen ortsauflösenden Detektor für Strahlung nach der Patentanmeldung P 103 30 716.8 .
Solche Objekte können auch Biochips sein, welche auf photo- lithographischem Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden, oder Materialoberflächen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist u. a. die quantitative Fluoreszenzmikroskopie.
Bei der Verwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Flächen, bzw. flächenhaften Objekten, auf einen ortsauflösenden Detektor, beispielsweise eine CCD-Kamera, ergibt sich stets das Problem des Vorhandenseins von „Falschlicht", welches die Abbildung des Objektes negativ beeinträchtigt. So wird unter Falschlicht hier jegliches Licht verstanden, das den Kontrast der detektierten Intensitätsverteilung verringert oder verfälscht. Falschlicht entsteht beispielsweise durch Reflexionen und Streulicht an Oberflächen, in Gläsern z. B. Lufteinschlüsse, durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, an Fassungen oder bei Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin kann Falschlicht auch aus außerhalb der Fokusebene liegenden Bereichen des Objektes oder der Probe kommen, beispielsweise von der Rückseite eines Objektträgers. Problematisch wird das Falschlicht insbesondere dann, wenn die Helligkeitsverteilung der Probe stark heterogen ist und ein hohes Kontrastverhältnis bei der Detektion verlangt wird.
Bei einem Objekt mit minimalem Kontrast setzt sich beispielsweise die helle Fläche aus einer Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kügelchen mit einem scharf definierten Durchmesser zusammen. Somit sollte im Idealfall dort, wo sich die Kügelchen befinden maximale Helligkeit vorhanden sein. In den übrigen Bereichen sollte eine vollkommene Dunkelheit herrschen. Tatsächlich ist jedoch auch dort, wo es dunkel sein sollte, eine gewisse Resthelligkeit vorhanden, d. h. ein inhomogener Untergrund, dessen Ursache in dem oben genannten Falschlicht liegt. Wäre dieser Untergrund homogen über das Bild verteilt, könnte er als „offset" betrachtet werden und in einfacher Weise von allen Pixelwerten des Detektors subtrahiert werden. Ein solcher idealer Fall ist jedoch in der Praxis kaum vorhanden, und demzufolge ist diese Vorgehensweise generell nicht anwendbar.
Bei photometrischen Messungen, speziell bei Biochip-Anwendungen und quantitativer Fluoreszenzmikroskopie im Allgemeinen, wird die nutzbare Intensitätsdynamik, welche das Verhältnis von größtem zu kleinstem detektierbaren Intensitätswert beinhaltet, durch den inhomogenen Untergrund stark eingeschränkt, da bei einer unbekannten Fluorophor-Verteilung das Nutzlicht vom Falschlicht nicht unterschieden werden kann. Dieses ist insbesondere dann problematisch, wenn keine oder kaum Referenzflächen zur Verfügung stehen, an denen lokal der Untergrund bestimmt werden kann, also z. B. bei hochdichten Biochips, welche photolithographisch hergestellt wurden.
So umfaßt gemäß dem Gegenstand der Patentanmeldung P 103 30 716.8 eine Anordnung zur Durchführung eines Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten, flächenhaften Objekten eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer dem Objekt oder der Probe überlagerten Beleuchtungsstruktur angeordnet ist. Diese Beleuchtungsstruktur wird durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet, wobei diese ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls einen Farbteiler und ein Objektiv umfassen können. Es sind ferner zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflö- senden Detektor, insbesondere für optische Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthält ferner Einstellmittel, mit denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene auf dem Objekt oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinheit zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes verbunden.
Die bei dieser Anordnung vorgesehene strukturierte Hellfeldbeleuchtung, bei welcher die Objektbeleuchtung und die Abbildung des Objektes zusammen mit der aufbelichteten Feldblendenstruktur durch ein einziges Objektiv erfolgen, kann durch das Anregungslicht im Objektiv Falschlicht, insbesondere durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, erzeugt werden. Weiterhin wird die Rückseite, z. B. eines Biochips, nahezu mit der gleichen Anregungsintensität bestrahlt wie die Fokusebene. Daher kann auch die durch die Kontamination der Rückseite bedingte Fluoreszenzintensität entsprechend hoch sein und zu Meßfehlern Anlaß geben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, bei einer Anordnung mit einer Weitfeldoptik zur Abbildung flacher Objekte und Proben, bei denen die gesuchte Information innerhalb der Tiefenschärfe des verwendeten Objektivs liegt, den Einfluß von Falschlicht jeglicher Art auf Messungen und Beobachtungen zu eliminieren und den Intensitäts-Dynamikbereich derartiger Anordnungen zu erweitern.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer gemäß dem Anspruch 7 der Patentanmeldung P 103 30 716.8 ausgebildeten Anordnung dadurch gelöst, daß die ersten optischen Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende auf die Probe als eine Einheit nach Art einer Einrichtung zur Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet sind.
Dabei ist es vorteilhaft, wenn die besagte Einheit als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet ist, um einen großen Tiefenschärfebereich zu erhalten, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die zweiten optischen Mittel definierte optische Achse einen Winkel einschließen, wobei dieser Winkel bei > 50° liegen soll, um die Strahlungsintensität auf der Unterseite von transparenten Proben zu minimieren.
Ferner ergibt sich eine vorteilhafte Anordnung, wenn die Einheit eine an sich bekannte Scheimpflugoptik ist. In diesem Fall kann eine größere numerische Apertur für die Dunkelfeldbeleuchtung verwendet werden, da die Fokusebene der Beleuchtung an die Oberseite der Probe angepaßt werden kann. In analoger Weise kann auch die Abbildungsoptik als Scheimpflugoptik ausgeführt sein. In diesem Fall steht die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs senkrecht zur Oberfläche der Probe, während die optische Achse des Abbildungsobjektivs unter einem Winkel α zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs steht.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung ist vereinfacht der optische Gesamtaufbau der erfindungsgemäßen Anordnung dargestellt.
Die Zeichnung zeigt vereinfacht den optischen Gesamtaufbau der erfindungsgemäßen Anordnung, mit dem eine scharfe Ab- bildung einer strukturierten Feldblende mittels Dunkelfeldbeleuchtung auf ein Objekt oder eine Probe realisiert werden kann.
Die Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung heterogener beleuchteter Objekte nach 1 umfaßt eine Licht- oder Strahlungsquelle 1, der beispielsweise ein Verschluß 3 und vorteilhaft, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 4, wie z. B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 5 und 6 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 7 im Strahlengang angeordneten, strukturierten Feldblende 8 nachgeordnet sind. Diese Feldblende 8 ist im Strahlengang in den beiden Koordinaten der Feldblendenebene 7 definiert positionierbar angeordnet. Sie kann also in dieser Ebene 7 verschoben werden. Durch der Feldblende 8 nachgeordnete, erste optische Mittel, wie z. B. ein Beleuchtungstubus 9, einen Ablenkspiegel 10, Anregungsfilter 2, und ein Objektiv 18, wird die strukturierte Feldblende 8 in Dunkelfeldbeleuchtung auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt oder die Probe 12 abgebildet. Die ersten optischen Mittel bilden insgesamt eine an sich bekannte Scheimpflugoptik, deren optische Achse unter einem Winkel α zur senkrecht zur Oberfläche der Probe 12 verlaufenden optischen Achse zweiter optischer Mittel angeordnet ist. Vorteilhaft ist der Winkel α > 50°. Durch diese zweiten optischen Mittel, die beispielsweise ein Objektiv 11, Emissionsfilter 16 sowie einen Abbildungstubus 13 umfassen, wird die Probe 12 kontrastreich zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor 14 für optische Strahlung abgebildet. Dieser Detektor 14 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und kann Bestandteil einer CCD-Kamera sein. Der Detektor 14 ist mit einer Auswerteeinheit 15 verbunden, durch welche die Meßergebnisse erstellt werden und die Ermittlung bzw. Eliminierung des Falschlichtes bei der Abbildung der Probe 12 erfolgt.
In analoger Weise können jedoch auch die eine Abbildungsoptik bildenden zweiten optischen Mittel als eine Scheimpflugoptik ausgebildet sein. In diesem Fall steht die optische Achse der ersten Mittel (Abbildungsobjektiv 18) senkrecht auf der Oberfläche der Probe 12. Mit dieser optischen Achse bildet dann die optische Achse der zweiten Mittel (Objektiv 11) den Winkel α.

1: Strahlungsquelle
2: Anregungsfilter
3: Verschluß
4: homogenisierendes optisches Element
5, 6: Beleuchtungsoptik
7: Feldblendenebene
8: Feldblende
9: Beleuchtungstubus
10: Ablenkspiegel
11: Abbildungobjektiv
12: Probe
13: Abbildungstubus
14: Detektor
15: Auswerteeinheit
16: Emissionsfilter
18: Abbildungsobjektiv

Claims

Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen leuchtenden (oder beleuchteten) flächenhaften Objekten oder Proben auf ortsauflösenden Detektoren, umfassend – eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, – eine in der Feldblendenebene angeordnete, strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer in der Objektebene dem Objekt oder der Probe zu überlagernden Beleuchtungsstruktur, – erste optische Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende auf die Probe, – zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor für optische Strahlung, – Einstellmittel zur definierten Positionierung der Beleuchtungsstruktur in der Objektebene in unterschiedlichen Positionen relativ zur Probe – und eine mit dem Detektor verbundene Auswerteeinheit zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes nach Patentanmeldung P 103 30 716.8 , dadurch gekennzeichnet, – daß die ersten optischen Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende (8) auf die Probe (12) als eine Beleuchtungseinheit nach Art einer Dunkelfeldbeleuchtungseinrichtung ausgebildet sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Beleuchtungseinheit als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet ist, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die zweiten optischen Mittel definierte optische Achse einen Winkel α einschließen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinheit eine an sich bekannte Scheimpflugoptik ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten optischen Mittel zur Abbildung der Probe (12) auf den Detektor (14) eine an sich bekannte Scheimpflugoptik ist.