WO2005003837A1 - Verfahren und anordnung zur eliminierung von falschlicht - Google Patents

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WO2005003837A1
WO2005003837A1 PCT/EP2004/006868 EP2004006868W WO2005003837A1 WO 2005003837 A1 WO2005003837 A1 WO 2005003837A1 EP 2004006868 W EP2004006868 W EP 2004006868W WO 2005003837 A1 WO2005003837 A1 WO 2005003837A1
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sample
field diaphragm
detector
illumination
arrangement according
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PCT/EP2004/006868
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Inventor
Peter Westphal
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Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Definitions

  • the invention relates to a method and an arrangement for eliminating false light when using wide field optics for imaging heterogeneously illuminating objects on a spatially resolving detector.
  • objects can be, for example, biochips that were produced by photolithography or using a spotter, or material surfaces.
  • Another area of application is quantitative fluorescence microscopy.
  • False light is understood to mean any light that reduces or falsifies the contrast of the detected intensity distribution
  • False light can also come from areas of the object or the sample lying outside the focal plane, for example from the back of a slide, The false light becomes problematic in particular when the brightness distribution of the sample is very heterogeneous is and a high contrast ratio is required for the detection.
  • the bright surface is composed of a large number of similarly fluorescent spheres with a sharply defined diameter.
  • DE 1 99 30 81 6 A1 describes a method and a device for depth selection of microscope images in which a one-dimensional periodic grating, for example a stripe grating, is used for illumination. At least n (n> 2) CCD camera recordings are made, with the structure of the lighting is shifted by 1 / n of the lattice constant. A confocal section of the sample is then calculated from the at least three recordings.
  • a one-dimensional periodic grating for example a stripe grating
  • WO 98/45745 AI (DE 698 02 514 T2) describes an imaging system and method for microscopes in which structured illumination is provided by superimposing two coherent light beams. Like the method described above according to DE 1 99 30 81 6 A1, the method mainly pursues the objective of generating optical sections in different object planes analogously to a laser scanning microscope.
  • the aim of the methods mentioned is to obtain a depth resolution of thick samples.
  • the invention is based on the object of eliminating the influence of any type of false light on measurements and observations in an arrangement with wide-field optics for imaging flat objects and samples in which the information sought lies within the depth of field of the objective used and the intensity To expand the dynamic range of such arrangements.
  • this object is achieved in a method for eliminating false light using the means disclosed in the first claim.
  • Further claims 2 to 6 show details of the method.
  • An arrangement according to the invention achieves the object with the means disclosed in claim 7. Further details of the arrangement are given in the subclaims.
  • the receptacle which contains the false light distribution, can also advantageously be smoothed to reduce the noise. This can be done, for example, by low-pass filtering.
  • an image is composed of the four detector recordings, which corresponds to a picture without structured lighting.
  • the image information sought could be obtained by taking a single picture without structured lighting. To do this, however, the field diaphragm would have to be changed.
  • the spatially resolved false light removal is now intended to subtract ⁇ a ⁇ n, aas tsn ⁇ with ⁇ er false light information from the bright image according to a) or b). For this purpose, all light components that do not originate from the focal plane are removed from the bright image
  • An arrangement for carrying out the method for eliminating false light in the imaging of heterogeneous, luminous (or illuminated) flat objects or samples on spatially resolving detectors comprises a radiation source with downstream radiation optics that homogenize the radiation for homogeneous illumination of a subordinate field diaphragm plane, in which a structured field diaphragm is arranged to produce an illumination structure superimposed on the object or the sample.
  • the field diaphragm is imaged on the sample by first optical means, wherein these first optical means can comprise an illumination tube, optionally a color splitter and an objective.
  • the arrangement also contains second optical means for imaging the sample together with the superimposed illumination structure on a spatially resolving detector, in particular for optical radiation.
  • the arrangement also contains setting means with which the lighting structure can be positioned in the object plane together with the object or the sample in a defined manner.
  • the detector is connected to an evaluation unit for determining and eliminating the false light.
  • the spatially resolving detector is designed as a CCD or CMOS matrix.
  • the structured field diaphragm has a light-dark structure of different geometry.
  • the individual light and dark areas of the field diaphragm have a square shape.
  • a checkerboard-like structure proves to be particularly advantageous since only two recordings are required.
  • the field diaphragm is defined in the two coordinates of the field diaphragm plane and can be reproducibly positioned by displacement.
  • a glass plate behind the field diaphragm can also advantageously be defined and reproducibly tilted about the two coordinates that define the field diaphragm plane
  • piezo actuators, eccentric drives or other suitable drive mechanisms are provided as drive and setting means for positioning and / or tilting the glass plate behind the field diaphragm in the field diaphragm plane or for positioning the lighting structure and the sample. that enable a corresponding precise adjustment and positioning
  • the field diaphragm has periodically alternating light-dark contrasts of suitable geometry and size in two mutually perpendicular directions, whereby the dark contrasts (areas) should not directly adjoin one another in order to avoid areas of the sample in the event of positioning inaccuracies to leave unlit
  • the field diaphragm as a stripe grating with a stripe-shaped structure of alternating light-dark contrasts if the illumination optics have an astigmatism, caused, for example, by filters which are not perpendicular to the optical axis of the beam path
  • the object or the sample can also be defined and reproducibly positioned in the two coordinates of the object plane.
  • Piezo actuators, eccentric drives or other drives suitable for motorized sample tables can also be provided here as drive means
  • this object is further achieved in that the first optical means for imaging the structured field diaphragm on the sample are designed as a unit in the manner of a device for dark field illumination
  • the unit in question is designed as an illumination objective with a small aperture in order to obtain a large depth of field, the optical axis of the illumination objective and the optical axis defined by the second optical means enclosing an angle, whereby this Should be at an angle of> 50 ° in order to minimize the radiation intensity on the underside of transparent samples.
  • the unit is a Scheimpflug optics known per se.
  • a larger numerical aperture can be used for the dark field illumination because the focal plane of the BL LEVEL ⁇ processing can be adapted to the top of the sample.
  • the imaging optics can also be designed as Scheimpflug optics.
  • the optical axis of the illumination lens is perpendicular to the surface of the sample, while the optical axis of the imaging lens is at an angle ⁇ to the optical axis of the illumination lens.
  • FIG. 1 shows an optical structure of an arrangement according to the invention, with which a sharp image of a structured field diaphragm is generated by means of bright field illumination
  • FIG. 5 shows a field diaphragm structured in the form of a strip with associated signal profiles
  • Fig.l shows the overall optical structure of an arrangement in a highly simplified manner, with which a sharp image of a structured field diaphragm can be realized on an object or a sample.
  • the arrangement for carrying out the method for eliminating false light when using wide-field optics for imaging heterogeneous illuminated objects comprises a light or radiation source 1 which, for example, has a filter 2 and a shutter 3 and, under certain circumstances, optical beams which homogenize the beam path Elements 4, such as a light guide rod or an internally mirrored hollow glass rod, and lighting optics 5 and 6 for homogeneous illumination of a structured field diaphragm 8 arranged in the field diaphragm plane 7 in the beam path are arranged downstream.
  • This field diaphragm 8 is arranged in the beam path in the two coordinates of the field diaphragm plane 7 in a defined position. It can therefore be moved in this level 7.
  • first optical means such. B. lighting tube 9, beam splitter 1 0 and lens 1 1, the structured field diaphragm 8 is imaged on the object to be examined or measured or the sample 1 2.
  • second optical means which also include, for example, the objective 1 1, the beam splitter 1 0 and an imaging tube 1 3, the sample 1 2 is imaged in high contrast together with the illumination structure superimposed on it on a spatially resolving detector 1 4 for optical radiation.
  • This detector 1 4 comprises a matrix of CCD or CMOS elements and can be part of a CCD camera.
  • the detector 1 4 is connected to an evaluation unit 1 5, by means of which the measurement results are created and the detection or elimination of the false light takes place when the sample 1 2 is imaged.
  • the beam splitter 1 0 can also be designed as a color splitter and filter 1 6; 1 7 include with which unwanted or disruptive radiation components can be filtered out.
  • the beam splitter 1 0 and the filter 1 6; 1 7 are components of an arrangement for incident light fluorescence, it being advantageous if the filters 1 6 and 1 7 are inclined by a few angular degrees in order to remove disturbing reflections from the beam path.
  • the variant of a structured field diaphragm 8 shown in FIG. 2 comprises a light-dark structure or a structure made of light-dark contrasts, consisting of light areas 1 8 and dark areas 1 9 arranged in a matrix, the dark areas 1 9 being flat overall are smaller than the light areas 1 8, since the webs 20 between the individual areas 1 8; 1 9 are bright.
  • the areas 1 8 and 1 9 have the dimensions b and d in their two orthogonal directions, and the distances between adjacent areas are designated a and c in these directions
  • an illumination structure consisting of light-dark structures is produced on the sample 1 2 by imaging the structured field diaphragm 8.
  • These light-dark structures preferably have one of the geometries specified in connection with the description of FIGS. 2 to 5.
  • the areas shown in black correspond to non-transparent areas, the bright areas to transparent areas of the field diaphragm 8.
  • the sample 1 2 can be shifted when the field diaphragm 8 is fixed.
  • a motorized table not shown, on which the sample 1 2 is arranged can be used.
  • b ⁇ a and d ⁇ c For the dimensions (distances) a; b; c; and d the following boundary conditions apply: b ⁇ a and d ⁇ c.
  • the exact ratios b / a and d / c are set so that they are as close as possible to 1 (one). At the same time, however, it is ensured that each point on the sample 1 2 is bright in at least one lighting position. This depends on the lateral positioning accuracy of the structured illumination on the sample 1 2.
  • the slots a and c are adapted to the sample structure and nature and the desired location resolution for the false light measurement. On the sample side, the distances a and c are in the ⁇ m range.
  • each of the specified Areas 1 8; 1 9 is not illuminated once.
  • the numbers 1 to 4 in the areas exemplify the successive positions of the dark area.
  • the structured illumination extends over the entire image of the sample 1 2 recorded by the detector 1 4.
  • the signal curves 1 to 4 indicated below in FIG. 2 are obtained, which correspond to the four illumination positions of the image of the field diaphragm 8 on the sample 1 2 or on the detector 1 4 correspond. If, for example, a homogeneously reflecting or fluorescent sample 1 2 is present and the brightness values of all four recorded images are added, the bottom signal curve (1 + 2+) results along the dashed line 21 3 + 4). Since the bright areas 1 8 predominate here, the addition of the four images gives a good signal yield in the bright areas 1 8.
  • the four added images, taken on a homogeneously shining standardization sample, can be used for pixel-precise brightness standardization.
  • the normalization can be used if the brightness distribution of a real sample 1 2 with any reflectivity and / or fluorophore distribution by adding the four images taken according to the above. Procedure is determined.
  • the brightness distribution of the real sample 1 2 can also be determined by a single exposure with an unstructured illumination of the sample 1 2, but the field diaphragm 8 must be removed or replaced.
  • a location-resolved elimination of false light in a sample 1 2 that is illuminated as desired is achieved by the following procedure:
  • the dark areas 1 9 of each of the four recordings (images) are combined with pixel accuracy in a new image. Those areas that were not illuminated in none of the images are interpolated.
  • the resulting image with the spatially resolved false light distribution can be smoothed if necessary to reduce the noise in the image. This can be done, for example, by low-pass filtering.
  • a pixel-precise subtraction of the spatially resolved false light distribution from a measured brightness distribution, in which the false light components are still contained, is carried out.
  • the dark areas 19 predominate with more than 50%. If the distribution of lightness along the dashed line 22 in FIG. 3 is considered, the results given below in FIG. 3 are obtained Signal curves 1 to 4, which correspond to the four illumination positions of the image of the field diaphragm 8 on the sample 1 2 or on the detector 1 4. If, for example, there is a homogeneously reflecting or fluorescent sample 1 2 and the brightness values of all four recorded images are added, this results in the lowest signal curve along the dashed line 21 (1 + 2 + 3 + 4). This gives a good signal yield in the dark areas 19, that is to say with regard to the false light
  • FIG. 5 shows a field diaphragm 8 with a strip-shaped, alternating light-dark areas 24 and 25. If the brightness distribution along the dashed line 26 in FIG. 5 is considered, the signal curves 1 and 2 indicated below in FIG. 5 are obtained. which correspond to the two illumination positions of the image of the field diaphragm 8 on the sample 1 2 or on the detector 1 4. If, for example, a homogeneously reflecting or fluorescent sample 1 2 is present and the sanctity values of the two images taken are added, then along the dashed line 26 get the lowest waveform (1 +2)
  • a strip-shaped lighting structure is particularly advantageous when the influence of astigmatic errors in the lighting optics on the measurements or observations is to be minimized bine ⁇ e ⁇ nier ⁇ e, repro ⁇ uzieroare rosmomerung ⁇ es Dn ⁇ es ⁇ er rei ⁇ uie ⁇ ue o ⁇ »v to sample 1 2 can either by a defined displacement or positioning of the field diaphragm 8 in the field diaphragm plane 7 or by a defined displacement or positioning of the sample 1 2 itself in the sample or object level can be achieved, this positioning being realized by a displacement in the corresponding plane or by tilting a glass plate 27 arranged behind the field diaphragm 8, so as to generate at least two reproducible lighting structures through the generated beam offset.
  • FIG. 6 shows in simplified form a device for producing different lighting structures by tilting a plane-parallel glass plate 27 arranged downstream of the structured field diaphragm 8 in the light direction.
  • piezo actuators 28 are advantageously provided, which are appropriately provided by a control unit (not shown) - be controlled.
  • the tilting of the glass plate 27 results in an optical radiation offset of the beam path and thus an offset image of the field diaphragm 8 on the sample 1 2.
  • the arrows shown in FIG. 6 indicate the tilting directions of the glass plate 27.
  • Other suitable ones can also be used to generate the radiation offset Elements are used.
  • Eccentric drives or other suitable drive mechanisms can also be provided as drives for the glass plate 27.
  • This device comprises piezo actuators 29 and 30 which are in operative connection with the field diaphragm 8 and by which the field diaphragm 8 is defined by lateral ones Shift along the coordinates x and y of the field diaphragm plane 7 can be adjusted.
  • piezo actuators 29 and 30 which are in operative connection with the field diaphragm 8 and by which the field diaphragm 8 is defined by lateral ones Shift along the coordinates x and y of the field diaphragm plane 7 can be adjusted.
  • FIG. 8 A further device is shown in FIG. 8, in which eccentric drives 31 and 32 which are operatively connected to the field diaphragm 8 are provided, with which the field diaphragm 8 can be laterally displaced and in this way can be positioned in the field diaphragm plane 7 in a defined manner.
  • An eccentric drive is provided for each of the two coordinates x and y of the field diaphragm plane 7.
  • At least two different lighting structures can be generated on the surface of the sample 1 8 even with a fixed field diaphragm 8 by a corresponding lateral, defined positioning and adjustment of the sample 1 2 relative to the lighting structure generated by the imaging of the field diaphragm 8 in the sample plane.
  • the above-mentioned piezo actuators, eccentric drives or other suitable adjustment mechanisms are also to be used, but preferably a motorized microscope stage.
  • optical structure is shown in simplified form in FIG. 9, with which a sharp image of a structured field diaphragm is achieved by means of dark field illumination.
  • the features according to claims 2 to 1 5 apply in a figurative sense to the execution of the individual optical elements or assemblies.
  • this arrangement comprises a light or radiation source 33, which has, for example, a shutter 35 and advantageously optical elements 36 that homogenize the beam path, such as, for. B. a light guide rod or an internally mirrored hollow glass rod, and lighting optics 37 and 38 for homogeneous illumination of a field diaphragm 40 arranged in the field diaphragm plane 39 in the beam path are arranged downstream.
  • a light or radiation source 33 which has, for example, a shutter 35 and advantageously optical elements 36 that homogenize the beam path, such as, for. B. a light guide rod or an internally mirrored hollow glass rod, and lighting optics 37 and 38 for homogeneous illumination of a field diaphragm 40 arranged in the field diaphragm plane 39 in the beam path are arranged downstream.
  • the field diaphragm 40 can be positioned in the beam path in a defined manner in the two coordinates of the field diaphragm plane 39. It can therefore be moved in this field diaphragm level 39.
  • the structured field diaphragm 40 is imaged in dark field illumination onto the object to be examined or measured or the sample 44 by means of first optical means arranged downstream of the field diaphragm 40, such as a lighting tube 41, a deflection mirror 42, excitation filter 34 and an objective 49.
  • first optical means form a Scheimpflug optic known per se, the optical axis of which is arranged at an angle .alpha.
  • second optical means which include, for example, an objective 43, an emission filter 48 and an imaging tube 45, the sample 44 together with the lighting structure superimposed on it is imaged in high contrast on a spatially resolving detector 46 for optical radiation.
  • This detector 46 comprises a matrix of CCD or CMOS elements and can be part of a CCD camera.
  • the detector 46 is connected to an evaluation unit 47, by means of which the measurement results are created and the detection or minimization of the false light takes place when the sample 44 is imaged
  • the second optical means forming imaging optics can also be designed as Scheimpflug optics.
  • the optical axis of the first means (imaging objective 49) is perpendicular to the surface of the sample 44.
  • the optical axis then forms the optical axis of the second Mean (lens 43) the angle ⁇

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Proben (12) auf ortsauflösende Detektoren (14) für elektromagnetische Strahlung, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst: Die Probe (12) wird durch eine Beleuchtungseinrichtung derart beleuchtet, dass eine laterale Beleuchtungsstruktur vorhanden ist und mindestens zwei dunkle Bereiche (19; 25) erzeugt werden, die nicht direkt aneinander grenzen. Aufnahmen der beleuchteten Probe (12) werden mit einem ortsauflösenden Detektor (14) hergestellt, wobei für jede Aufnahme die Beleuchtungsstruktur relativ zur Probe (12) verschoben wird. Aus den Intensitätsmessungen in den dunklen Bereichen (19; 25) der Aufnah­men werden ortsaufgelöste Untergrundsignale ermittelt und durch Subtraktion der Falschlichtverteilung von einer vorher gemessenen, das Falschlicht noch enthaltenen Helligkeitsverteilung wird eine von Falschlicht freie Abbildung der Probe (12) erzeugt.

Description

Titel
Verfahren und Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht
Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zum Eliminieren von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Objekten auf einen ortsauflosenden Detektor. Solche Objekte können beispielsweise Biochips sein, welche auf photolithographischem Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden, oder Materialoberflachen. Ein weiteres Anwen- dungsgebiet ist u a die quantitative Fluoreszenzmikroskopie.
Stand der Technik
Bei der Verwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Flachen, bzw. flachenhaften Objekten, auf einen ortsauflosenden Detektor, beispielsweise eine CCD-Kamera, ergibt sich stets das Problem des Vorhandenseins von „Falschlicht", welches die Abbildung des Objektes negativ beeinträchtigt So wird unter Falschlicht hier jegliches Licht verstanden, das den Kontrast der detek- tierten Intensitatsverteilung verringert oder verfälscht. Falschlicht entsteht bei- spielsweise durch Reflexionen und Streulicht an Oberflachen, in Glasern z.B. durch Lufteinschlusse, durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Glaser, an Fassungen oder bei Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin kann Falschlicht auch aus außerhalb der Fokusebene liegenden Bereichen des Objektes oder der Probe kommen, beispielsweise von der Ruckseite eines Objekt- tragers. Problematisch wird das Falschlicht insbesondere dann, wenn die Hellig- keitsverteilung der Probe stark heterogen ist und ein hohes Kontrastverhaltnis bei der Detektion verlangt wird. Bei einem Objekt mit minimalem Kontrast setzt sich beispielsweise die helle Flache aus einer Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kugelchen mit einem scharf definierten Durchmesser zusammen. Somit sollte im Idealfall dort, wo sich die Kugelchen befinden, maximale Helligkeit vorhanden sein. In den übrigen Bereichen sollte eine vollkommene Dunkelheit herrschen. Tatsachlich ist jedoch auch dort, wo es dunkel sein sollte, eine gewisse Resthelligkeit vorhanden, d.h. ein inhomogener Untergrund, dessen Ursache in dem oben genannten Falschlicht liegt. Ware dieser Untergrund homogen über das Bild verteilt, konnte er als „offset" betrachtet werden und in einfacher Weise von allen Pixelwerten des Detektors subtrahiert werden. Ein solcher idealer Fall ist jedoch in der Praxis kaum vorhanden, und demzufolge ist diese Vorgehensweise nicht generell anwendbar.
Bei photometrischen Messungen, speziell bei Biochip-Anwendungen und quantitati- ver Fluoreszenzmikroskopie im Allgemeinen, wird die nutzbare Intensitatsdynamik, welche das Verhältnis von größtem zu kleinstem detektierbaren Intensitatswert beinhaltet, durch den inhomogenen Untergrund stark eingeschränkt, da bei einer unbekannten Fluorophor-Verteilung das Nutzlicht vom Falschlicht nicht unterschieden werden kann. Dieses ist insbesondere dann problematisch, wenn keine oder kaum Referenzflachen zur Verfugung stehen, an denen lokal der Untergrund bestimmt werden kann, also z. B. bei hochdichten Biochips, welche photolithographisch hergestellt wurden
Bei einem konfokalen Laserscanner wird stets nur eine kleine Flache der Probe von wenigen μm2 beleuchtet, und zudem bei der Detektion nur diese kleine Flache betrachtet. Wird dieses mit Hilfe einer gut angepaßten Lochblende konsequent durchgeführt, so wird Falschlicht von vornherein unterdruckt. Laserscanner weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf Es sind dies die Anregungssattigung und das starke Ausbleichen von Fluorophoren auf Grund der hohen Strahlungsintensität im Fokus. Ferner gibt es deutliche Einschränkungen bei der Wahl der Wellenlange. Viele bewegliche Komponenten, ein hoher Justieraufwand sowie eine geringe Quanteneffizienz des Detektors, in der Regel ein Photomultiplier, sind weitere Nachteile.
In der DE 1 99 30 81 6 AI sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Tiefenselekti- on von Mikroskopbildern beschrieben, bei denen ein eindimensional periodisches Gitter, z.B. ein Streifengitter, zur Beleuchtung verwendet wird. Dabei werden mindestens n (n > 2) CCD-Kameraaufnahmen gemacht, wobei die Struktur der Beleuchtung um jeweils 1 /n der Gitterkonstanten verschoben wird. Aus den mindestens drei Aufnahmen wird anschließend ein konfokaler Schnitt der Probe berechnet.
Die WO 98/45745 AI (DE 698 02 514 T2) beschreibt ein Abbildungssystem und - verfahren für Mikroskope, bei denen eine strukturierte Beleuchtung mittels Überlagerung zweier kohärenter Lichtstrahlen vorgesehen ist. Das Verfahren verfolgt ebenso wie das oben beschriebene Verfahren gemäß der DE 1 99 30 81 6 AI hauptsachlich das Ziel, optische Schnitte in verschiedenen Objektebenen analog einem Laser-Scanning-Mikroskop zu generieren.
Beide Verfahren dienen dazu, mit einer Weitfeldoptik konfokale Schnitte einer im Vergleich zur Tiefenschärfe dicken Probe oder eines Objektes zu erhalten. In beiden Fallen ist der Rechenaufwand relativ groß, weil trigonometrische Gleichungen gelost werden müssen. Keines der genannten Verfahren kommt mit weniger als drei Auf- nahmen aus.
Die genannten Verfahren verfolgen das Ziel, eine Tiefenauflosung von dicken Proben zu erhalten.
Beschreibung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, bei einer Anordnung mit einer Weitfeldoptik zur Abbildung flacher Objekte und Proben, bei denen die gesuchte Information innerhalb der Tiefenschärfe des verwendeten Objektivs liegt, den Einfluß von Falschlicht jeglicher Art auf Messungen und Beobachtungen zu eliminieren und den Intensitats-Dynamikbereich derartiger Anordnungen zu erweitern.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Verfahren zur Eliminierung von Falschlicht mit den im ersten Patentanspruch offenbarten Mitteln gelöst. In den wei- teren Ansprüchen 2 bis 6 sind Einzelheiten des Verfahrens dargestellt. Eine erfindungsgemäße Anordnung löst die Aufgabe mit den im Anspruch 7 offenbarten Mitteln. Nähere Einzelheiten der Anordnung sind in den Unteransprüchen angegeben.
So ist es beispielsweise vorteilhaft, wenn vier Detektoraufnahmen des beleuchteten Objektes oder der Probe mit einem ortsauflösenden Detektor hergestellt werden, wobei für jede dieser Aufnahmen die Beleuchtungsstruktur lateral verschoben wird und sich diese periodisch über die gesamte, vom Detektor aufgenommene Probe erstreckt.
Vorteilhaft ist es ferner, daß die jeweils unbeleuchteten Bereiche jeder der vier De- tektoraufnahmen zu einem Bild pixelgenau zusammengefaßt werden und daß Bereiche, die bei keiner der vier Detektoraufnahmen unbeleuchtet waren, interpoliert werden.
Vorteilhaft kann auch die Aufnahme, die die Falschlichtverteilung beinhaltet, zur Verminderung des Rauschens geglättet werden. Dieses kann beispielsweise durch eine Tiefpaßfilterung erfolgen.
Erfindungsgemaß wird aus den vier Detektoraufnahmen ein Bild zusammengesetzt, welches einer Aufnahme ohne strukturierte Beleuchtung entspricht. Hierzu gibt es zwei Varianten:
a) Aus jeder Einzelaufnahme werden nur die beleuchteten Bereiche verwendet und zu einem Bild zusammengesetzt. Da die hellen Bereiche größer sind als die dunklen Bereiche, werden die mehrfach beleuchteten Pixel des Detektors von nur einer Aufnahme verwendet, so daß redundante Bildinformationen verworfen werden. Aufgrund von Beugung können die hellen Bereiche einen Intensitatsabfall zum Rand aufweisen, dem mit einer Referenzierung anhand einer lateral homogen fluoreszierenden Probe begegnet werden kann.
b) Alle Einzelaufnahmen werden pixelgenau aufaddiert. Die mehrfach beleuchteten Bereiche weisen dann zu hohe Intensitatswerte auf, daher wird eine pixelgenaue Normierung des aufaddierten Bildes durchgeführt. Zu diesem Zweck wird die strukturierte Beleuchtung an einem dünnen, fluoreszierenden oder leuchtenden Referenzobjekt vorgenommen. Das aufaddierte Bild des Refe- renzobjektes beinhaltet die Normierungsfunktion. Zur Normierung wird das aufaddierte Bild der Probe durch das aufaddierte Bild des homogenen Referenzobjektes dividiert.
Alternativ zu a) und b) könnte die gesuchte Bildinformation mittels einer Einzelauf- nähme ohne strukturierte Beleuchtung gewonnen werden. Hierzu müßte allerdings die Feldblende gewechselt werden. Die ortsaufgeloste Falschlichtelimimerung Destent nun αaπn, aas tsnα mit αer Falschlichtinformation von dem Hellbild gemäß a) bzw. b) zu subtrahieren. Hierzu werden alle Lichtanteile, die nicht aus der Fokusebene stammen, aus dem Hellbild entfernt
Eine Anordnung zur Durchfuhrung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen, leuchtenden (oder beleuchteten) flachenhaften Objekten oder Proben auf ortsauflosenden Detektoren umfaßt eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur ho- mogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer dem Objekt oder der Probe überlagerten Beleuchtungsstruktur angeordnet ist.
Die Feldblende wird durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet, wobei die- se ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls einen Farbteiler und ein Objektiv umfassen können.
Es sind ferner zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflosenden Detektor, insbesonde- re für optische Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthalt weiterhin Einstellmittel, mit denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene zusammen mit dem Objekt oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinheit zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes verbunden.
Dabei ist es vorteilhaft, wenn der ortsauflosende Detektor als CCD- oder CMOS- Matrix ausgebildet ist.
Um eine entsprechende Beleuchtungsstruktur zu erzeugen, besitzt die strukturierte Feldblende eine Hell-Dunkel-Struktur von unterschiedlicher Geometrie. Hier hat sich als gunstig herausgestellt, wenn die einzelnen hellen und dunklen Bereiche der Feldblende eine quadratische Form besitzen. Hinsichtlich der Gesamtmeßdauer erweist sich eine schachbrettartige Struktur als besonders vorteilhaft, da nur zwei Aufnahmen erforderlich sind.
Vorteilhaft ist es auch, wenn zur Erzielung mindestens zweier unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen die Feldblende in den zwei Koordinaten der Feldblendenebene definiert und reproduzierbar durch Verschieben positionierbar ist. Zur Erzielung dieser mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen kann eine Glasplatte hinter der Feldblende auch vorteilhaft um die zwei Koordinaten, die die Feldblendenebene definieren, definiert und reproduzierbar gekippt werden
Es ist ferner vorteilhaft, daß zur Positionierung und/oder Verkippung der Glasplatte hinter der Feldblende in der Feldblendenebene oder zur Positionierung der Beleuchtungsstruktur und der Probe in der Objektebene als Antriebs- und Einstellmittel Pie- zoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vor- gesehen sind, die eine entsprechende präzise Verstellung und Positionierung ermöglichen
Von Vorteil ist es auch, wenn die Feldblende in zwei senkrecht zueinander verlaufenden Richtungen periodisch abwechselnde Hell-Dunkel-Kontraste geeigneter Geometrie und Große aufweist, wobei die dunklen Kontraste (Bereiche) nicht direkt aneinander grenzen sollen, um im Falle von Positionierungsungenauigkeiten keine Bereiche der Probe unbeleuchtet zu lassen
Vorteilhaft ist ferner, die Feldblende als Streifengitter mit einer streifenformigen Struktur aus einander abwechselnden Hell-Dunkel-Kontrasten auszubilden, wenn die Beleuchtungsoptik einen Astigmatismus besitzt, hervorgerufen beispielsweise durch Filter, die nicht senkrecht zur optischen Achse des Strahlenganges stehen
Zur Erzeugung von mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen kann auch, wenn es sich als vorteilhaft erweist, das Objekt oder die Probe in den zwei Koordinaten der Objektebene definiert und reproduzierbar positioniert werden Als Antriebsmittel können auch hier Piezoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere für motorisierte Probentische geeignete Antriebe vorgesehen sein
Erfmdungsgemaß wird diese Aufgabe weiterhin dadurch gelost, daß die ersten optischen Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende auf die Probe als eine Einheit nach Art einer Einrichtung zur Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet sind
Dabei ist es vorteilhaft, wenn die besagte Einheit als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet ist, um einen großen Tiefenscharfebereich zu erhalten, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die zweiten optischen Mittel definierte optische Achse einen Winkel einschließen, wobei dieser Winkel bei >50° hegen soll, um die Strahlungsintensität auf der Unterseite von transparenten Proben zu minimieren.
Ferner ergibt sich eine vorteilhafte Anordnung, wenn die Einheit eine an sich be- kannte Scheimpflugoptik ist. In diesem Fall kann eine größere numerische Apertur für die Dunkelfeldbeleuchtung verwendet werden, da die Fokusebene der Beleuch¬ tung an die Oberseite der Probe angepaßt werden kann. In analoger Weise kann auch die Abbildungsoptik als Scheimpflugoptik ausgeführt sein. In diesem Fall steht die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs senkrecht zur Oberflache der Probe, wahrend die optische Achse des Abbildungsobjektivs unter einem Winkel α zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs steht.
Sowohl das Verfahren als auch die Anordnung, mit der dieses Verfahren durchgeführt wird, können vorteilhaft zum Auslesen von Biochips, in der Fluoreszenzmikro- skopie und bei photometrischen Messungen angewendet werden
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausfuhrungsbeispiel naher erläutert wer- den. In der zugehörigen Zeichnung zeigen
Fig.1 einen optischen Aufbau einer erfindungsgemaßen Anordnung, mit dem eine scharfe Abbildung einer strukturierten Feldblende mittels Hellfeldbeleuchtung erzeugt wird,
Fig.2 eine Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverlaufe,
Fig.3 eine weitere Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverlaufe,
Fιg.4 eine weitere Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverlaufe,
Fig.5 eine streifenformig strukturierte Feldblende mit zugehörigen Signalverlaufen,
Fιg.6 Verstellmittel zur Kippung einer hinter der strukturierten Feldblende angeordneten Glasplatte,
Fig.7 Verstellmittel zur lateralen Verstellung der Feldblende und
Fιg.8 eine Feldblende mit Exzenterverstellung, 1-ιg.y einen opuscnen AUTDau αer erπnαungsgemaisen Anordnung, mit αem eine scharfe Abbildung einer strukturierten Feldblende mittels Dunkelfeldbeleuchtung realisiert wird.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
Fig.l zeigt stark vereinfacht den optischen Gesamtaufbau einer Anordnung, mit dem eine scharfe Abbildung einer strukturierten Feldblende auf ein Objekt oder eine Probe realisiert werden kann.
Die Anordnung zur Durchfuhrung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung heterogener beleuchteter Objekte nach Fig. l umfaßt eine Licht- oder Strahlungsquelle 1 , der beispielsweise ein Filter 2 und ein Verschluß 3 und unter Umständen den Strahlengang homogeni- sierende optische Elemente 4, wie z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 5 und 6 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 7 im Strahlengang angeordneten, strukturierten Feldblende 8 nachgeordnet sind. Diese Feldblende 8 ist im Strahlengang in den beiden Koordinaten der Feldblendenebene 7 definiert positionierbar angeordnet. Sie kann also in dieser Ebene 7 verschoben werden. Durch der Feldblende 8 nachgeordnete, erste optische Mittel, wie z. B. Beleuchtungstubus 9, Strahlenteiler 1 0 und Objektiv 1 1 , wird die strukturierte Feldblende 8 auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt oder die Probe 1 2 abgebildet. Durch zweite optische Mittel, die beispielsweise auch das Objektiv 1 1 , den Strahlenteiler 1 0 sowie einen Abbildungstubus 1 3 um- fassen, wird die Probe 1 2 kontrastreich zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflosenden Detektor 1 4 für optische Strahlung abgebildet. Dieser Detektor 1 4 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und kann Bestandteil einer CCD-Kamera sein. Der Detektor 1 4 ist mit einer Auswerteeinheit 1 5 verbunden, durch welche die Meßergebnisse erstellt werden und die Ermitt- lung bzw. Eliminierung des Falschlichtes bei der Abbildung der Probe 1 2 erfolgt.
Der Strahlenteiler 1 0 kann auch als Farbteiler ausgebildet sein und Filter 1 6; 1 7 umfassen, mit denen unerwünschte oder störende Strahlungsanteile ausgefiltert werden können. Der Strahlenteiler 1 0 und die Filter 1 6; 1 7 sind Bestandteile einer An- Ordnung für Auflichtfluoreszenz, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Filter 1 6 und 1 7 um einige Winkelgrade schräg gestellt sind, um so störende Reflexe aus dem Strahlengang zu entfernen. Die in Fig.2 dargestellte Variante einer strukturierten Feldblende 8 umfaßt eine Hell- Dunkel-Struktur oder eine Struktur aus Hell-Dunkel-Kontrasten, bestehend aus matrixartig angeordneten hellen Bereichen 1 8 und dunklen Bereichen 1 9, wobei die dunklen Bereiche 1 9 insgesamt flachenmaßig kleiner sind als die hellen Bereiche 1 8, da die Stege 20 zwischen den einzelnen Bereichen 1 8; 1 9 hell sind. Die Bereiche 1 8 und 1 9 haben in ihren zwei orthogonalen Richtungen die Abmessungen b und d und die Abstände einander benachbarter Bereiche werden in diesen Richtungen mit a und c bezeichnet
Nach dem Verfahren werden auf der Probe 1 2 durch die Abbildung der strukturierten Feldblende 8 eine aus Hell-Dunkel-Strukturen bestehende Beleuchtungsstruktur erzeugt. Diese Hell-Dunkel-Strukturen weisen bevorzugt eine der im Zusammenhang mit der Beschreibung der Fig.2 bis Fig.5 angegebenen Geometrien auf. Die schwarz dargestellten Flachen entsprechen nichttransparenten, die hellen Flachen transparenten Bereichen der Feldblende 8. Durch Verschiebung der Feldblende 8 in der Feldblendenebene 7 wird die abgebildete Hell-Dunkel-Struktur in der Objektebene relativ zur Probe 1 2 so verschoben, daß mindestens zwei unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen reproduzierbar eingestellt werden können. Mögliche Verstellme- chanismen für die Feldblende 8 werden im Zusammenhang mit der Beschreibung der Fig.6 bis Fig.8 weiter unten erläutert. Alternativ kann bei feststehender Feldblende 8 die Probe 1 2 verschoben werden. Hierzu kann ein nicht dargestellter, motorisierter Tisch verwendet werden, auf welchem die Probe 1 2 angeordnet ist.
Für die Abmessungen (Strecken) a; b; c; und d gelten folgende Randbedingungen: b < a und d < c. Die genauen Verhaltnisse b/a und d/c werden so eingestellt, daß sie möglichst nahe bei 1 (eins) liegen. Es wird aber gleichzeitig sichergestellt ist, daß jeder Punkt auf der Probe 1 2 bei mindestens einer Beleuchtungsposition hell ist. Abhangig ist dieses von der lateralen Positioniergenauigkeit der strukturierten Beleuchtung auf der Probe 1 2. Die Stecken a und c werden der Probenstruktur und -beschaffenheit und der gewünschten Ortsauflosung für die Falschlichtmessung angepaßt. Probenseitig liegen die Strecken a und c im μm-Bereich.
So werden mit der Variante nach Fig.2, bei welcher die hellen Bereiche 1 8 mehr als 50 % betragen, vier Beleuchtungsstrukturen auf der Probe 1 2 eingestellt, wobei die dargestellte Beleuchtungsstruktur entweder horizontal um a oder vertikal um c oder um beide Strecken relativ zur Probe verschoben wird, wobei jeder der angegebenen Bereiche 1 8; 1 9 einmal unbeleuchtet ist. Die Ziffern 1 bis 4 in den Bereichen geben exemplarisch die sukzessiven Positionen des dunklen Bereiches an. Die strukturierte Beleuchtung erstreckt sich über das gesamte von dem Detektor 1 4 aufgenommene Bild der Probe 1 2.
Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 21 in Fig.2 betrachtet, so erhalt man bei einer homogen leuchtenden Probe 1 2 die in dieser Fig.2 unten angegeben Signalverlaufe 1 bis 4, welche zu den vier Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 1 2 bzw. auf dem Detektor 1 4 korrespondie- ren. Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 1 2 vor und werden die Helligkeitswerte aller vier aufgenommenen Bilder addiert, so ergibt sich entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1 +2+3+4). Da die hellen Bereiche 1 8 hier überwiegen, erhalt man durch die Addition der vier Aufnahmen eine gute Signalausbeute in den hellen Bereichen 1 8.
Die vier addierten Bilder, aufgenommen an einer homogen leuchtenden Normierungsprobe, können zur pixelgenauen Helligkeitsnormierung verwendet werden. Die Normierung kann dann zur Anwendung kommen, wenn die Helligkeitsverteilung einer realen Probe 1 2 mit einer beliebigen Reflektivitat und/oder Fluorophorvertei- lung durch Addition der vier aufgenommenen Bilder nach dem o.g. Verfahren ermittelt wird. Alternativ kann die Helligkeitsverteilung der realen Probe 1 2 auch durch eine einzige Aufnahme mit einer unstrukturierten Beleuchtung der Probe 1 2 ermittelt werden, wobei jedoch die Feldblende 8 entfernt oder ausgetauscht werden muß.
Eine ortsaufgeloste Eliminierung von Falschlicht bei einer beliebig leuchtenden Probe 1 2 wird durch die folgende Verfahrensweise erreicht: Die jeweils dunklen Bereiche 1 9 jeder der vier Aufnahmen (Bilder) werden in einem neuen Bild pixelgenau zusammengefaßt. Diejenigen Bereiche, die bei keiner der Aufnahmen unbeleuchtet waren, werden interpoliert. - Das entstandene Bild mit der ortsaufgelosten Falschlichtverteilung kann bei Bedarf geglättet werden, um das Rauschen im Bild zu vermindern. Dieses kann beispielsweise durch eine Tiefpaßfilterung vorgenommen werden. Es wird eine pixelgenaue Subtraktion der ortsaufgelosten Falschlichtverteilung von einer gemessenen Helligkeitsverteilung, in welcher die Falschlichtanteile noch enthalten sind, vorgenommen. Bei der in Fig 3 dargestellten weiteren Variante einer strukturierten Feldblende 8 und des zugehörigen Signalverlaufes überwiegen die dunklen Bereiche 1 9 mit mehr als 50% Wird die Helhgkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 22 in Fig 3 betrachtet, so erhalt man die in dieser Fig 3 unten angegebenen Signalverlaufe 1 bis 4, welche zu den vier Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 1 2 bzw auf dem Detektor 1 4 korrespondieren Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 1 2 vor und werden die Hellig- keitswerte aller vier aufgenommenen Bilder addiert, so ergibt sich entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1 +2+3+4) So wird erhalt man eine gute Signalausbeute in den dunklen Bereichen 1 9, also bezüglich des Falschlichtes
Bei der in Fig 4 dargestellten Variante einer Feldblende 8, bei welcher bei jeder Aufnahme die unbeleuchtete Flache nahezu 50% einnimmt, werden nur zwei Aufnahmen mit lateral in Bezug auf die Probe verschobener Beleuchtungsstruktur benotigt Wird die Helhgkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 23 in Fig 4 betrachtet, so werden die in dieser Fig 4 unten angegeben Signalverlaufe 1 und 2 erhalten, welche zu den zwei Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 1 2 bzw auf dem Detektor 1 4 korrespondieren Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 1 2 vor und werden die Helligkeitswerte der beiden aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1 +2) erhalten
In Fig 5 ist eine Feldblende 8 mit einer streifenformigen, einander abwechselnden Hell-Dunkel-Bereichen 24 und 25 dargestellt Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 26 in Fig 5 betrachtet, so werden die in dieser Fig 5 unten angegeben Signalverlaufe 1 und 2 erhalten, welche zu den zwei Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 1 2 bzw auf dem Detektor 1 4 korrespondieren Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 1 2 vor und werden die Heiligkeitswerte der beiden aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 26 der unterste Signalverlauf (1 +2) erhalten
Je nach Applikation kann eine der Varianten der Feldblende 8 besonders vorteilhaft eingesetzt werden So ist eine streifenformige Beleuchtungsstruktur besonders dann von Vorteil, wenn der Einfluß astigmatischer Fehler der Beleuchtungsoptik auf die Messungen oder Beobachtungen zu minimieren ist bine αeπnierτe, reproαuzieroare rosmomerung αes Dnαes αer reiαuieπue o ικκ» v zur Probe 1 2 kann entweder durch eine definierte Verschiebung bzw. Positionierung der Feldblende 8 in der Feldblendenebene 7 oder durch eine definierte Verschiebung bzw. Positionierung der Probe 1 2 selbst in der Proben- oder Objektebene er- zielt werden, wobei diese Positionierung durch eine Verschiebung in der entsprechenden Ebene oder durch Kippung einer hinter der Feldblende 8 angeordneten Glasplatte 27 realisiert wird, um so durch den erzeugten Strahlenversatz mindestens zwei reproduzierbare Beleuchtungsstrukturen zu erzeugen.
Fig.6 zeigt vereinfacht eine Vorrichtung zur Erzeugung unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen durch Kippung einer der strukturierten Feldblende 8 in Lichtrichtung nachgeordneten, planparallelen Glasplatte 27. Zur gesteuerten, definierten Kippung dieser Glasplatte 27 sind in vorteilhafter Weise Piezoaktuatoren 28 vorgesehen, welche durch eine nicht dargestellte Ansteuereinheit entsprechend ange- steuert werden. Durch die Kippung der Glasplatte 27 erfolgt bekanntermaßen ein optischer Strahlenversatz des Strahlenganges und damit eine versetzte Abbildung der Feldblende 8 auf der Probe 1 2. Die in der Fig.6 eingezeichneten Pfeile kennzeichnen die Kipprichtungen der Glasplatte 27. Zur Erzeugung des Strahlenversatzes können auch andere geeignete Elemente eingesetzt werden. Als Antriebe für die Glasplatte 27 können auch Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen werden.
Fig.7 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Erzeugung und definierten Positionierung einer Beleuchtungsstruktur in der Probenebene relativ zur Probe 1 2. Diese Vorrich- tung umfaßt Piezoaktuatoren 29 und 30, welche mit der Feldblende 8 in Wirkverbindung stehen und durch welche die Feldblende 8 definiert durch laterale Verschiebung längs der Koordinaten x und y der Feldblendenebene 7 verstellt werden kann. Durch die Abbildung der in unterschiedlichen Positionen eingestellten Feldblende 8 auf die Probe 1 2 werden unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen in den Probenebene erzeugt, welche dann zusammen mit der Probe 1 2 auf den Detektor 1 4 abgebildet werden.
In Fig.8 ist eine weitere Vorrichtung dargestellt, bei welcher mit der Feldblende 8 in Wirkverbindung stehende Exzenterantriebe 31 und 32 vorgesehen sind, mit denen die Feldblende 8 lateral verschoben und auf diese Weise definiert in der Feldblendenebene 7 positioniert werden kann. Es ist für jede der beiden Koordinaten x und y der Feldblendenebene 7 ein Exzenterantrieb vorgesehen. Die Erzeugung mindestens zweier unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen auf der Oberflache der Probe 1 8 kann auch bei feststehender Feldblende 8 durch eine entsprechende laterale, definierte Positionierung und Einstellung der Probe 1 2 relativ zur der durch die Abbildung der Feldblende 8 in der Probenebene erzeugten Beleuchtungsstruktur erfolgen. Zur Positionierung der Probe 1 2 in der Probenebene sind ebenfalls die oben genannten Piezoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Verstellmechanismen einzusetzen, vorzugsweise aber ein motorisierter Mikroskoptisch.
Die Ausgestaltung der Erfindung nach Anspruch 1 6, die sich auf eine Ausgestaltung der erfindungsgemaßen Anordnung mit einer Dunkelfeldbeleuchtung bezieht, soll nachstehend an einem Ausfuhrungsbeispiel naher erläutert werden.
Dazu ist in Fig.9 vereinfacht der optische Aufbau dargestellt, mit dem eine scharfe Abbildung einer strukturierten Feldblende mittels Dunkelfeldbeleuchtung erzielt wird. Für die Ausfuhrung der einzelnen optischen Elemente bzw. Baugruppen gelten im übertragenen Sinn die Merkmale nach den Ansprüchen 2 bis 1 5.
Nach Fig.9 umfaßt diese Anordnung eine Licht- oder Strahlungsquelle 33, der beispielsweise ein Verschluß 35 und vorteilhaft den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 36, wie z. B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 37 und 38 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 39 im Strahlengang angeordneten strukturierten Feldblen- de 40 nachgeordnet sind.
Die Feldblende 40 ist im Strahlengang in den beiden Koordinaten der Feldblendenebene 39 definiert positionierbar. Sie kann also in dieser Feldblendenebene 39 verschoben werden.
Durch der Feldblende 40 nachgeordnete erste optische Mittel, wie z.B. ein Beleuch- tungstubus 41 , ein Ablenkspiegel 42, Anregungsfilter 34 und ein Objektiv 49, wird die strukturierte Feldblende 40 in Dunkelfeldbeleuchtung auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt bzw. die Probe 44 abgebildet. Die ersten optischen Mittel bilden insgesamt eine an sich bekannte Scheimpflugoptik, deren optische Achse unter einem Winkel α zur senkrecht zur Oberflache der Probe 44 verlaufenden opti- sehen Achse zweiter optischer Mittel angeordnet ist. Vorteilhaft gilt für den Winkel α > 50" Durch diese zweiten optischen Mittel, die beispielsweise ein Objektiv 43, ein Emissionsfilter 48 sowie einen Abbildungstubus 45 umfassen, wird die Probe 44 zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur kontrastreich auf einen ortsauflosenden Detektor 46 für optische Strahlung abgebildet Dieser Detektor 46 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und kann Bestandteil einer CCD-Kamera sein Der Detektor 46 ist mit einer Auswerteeinheit 47 verbunden, durch welche die Meßergebnisse erstellt werden und die Ermittlung bzw Ehminie- rung des Falschlichtes bei der Abbildung der Probe 44 erfolgt
In analoger Weise können jedoch auch die eine Abbildungsoptik bildenden zweiten optischen Mittel als eine Scheimpflugoptik ausgebildet sein In diesem Fall steht die optische Achse der ersten Mittel (Abbildungsobjektiv 49) senkrecht auf der Oberflache der Probe 44 Mit dieser optischen Achse bildet dann die optische Achse der zweiten Mittel (Objektiv 43) den Winkel α

Claims

Patentansprüche
1 Verfahren zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen leuchtenden oder beleuchteten flachenhaften Objekten oder Proben auf ortsauflosende Detektoren für elektromagnetische Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (1 2) durch eine Beleuchtungseinrichtung strukturiert derart be- leuchtet wird, daß die laterale Beleuchtungsstruktur in einer Richtung oder in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch abwechselnde Hell- Dunkel-Bereiche (Kontraste) auf der Probe (1 2) aufweist und mindestens zwei dunkle Bereiche (1 9; 25) erzeugt werden, die nicht direkt aneinander grenzen, daß mindestens zwei Aufnahmen des beleuchteten Objektes oder der Probe (1 2) mit einem ortsauflosenden Detektor (1 4) hergestellt werden, wobei für jede dieser Aufnahmen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene lateral relativ zur Probe (1 2) verschoben wird, daß aus den Intensitatsmessungen in den dunklen Bereichen (1 9; 25) einer jeden Aufnahme jeweils ein ortsaufgelostes Untergrundsignal ermittelt wird - und daß durch Subtraktion der ermittelten ortsaufgelosten Falschlichtverteilung von einer vorher gemessenen, das Falschlicht noch enthaltenen Helligkeitsverteilung eine von Falschlicht freie Abbildung der Probe (1 2) realisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zwei, vier, neun oder sechzehn Detektoraufnahmen des beleuchteten Objektes oder der Probe (1 2) mit einem ortsauflosenden Detektor (1 4) hergestellt werden, wobei für jede dieser Aufnahmen die Beleuchtungsstruktur lateral verschoben wird und sich diese periodisch über die gesamte, von der CCD- Kamera aufgenommene Probe erstreckt.
3 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweils unbeleuchteten Bereiche jeder der mindestens zwei Detektoraufnahmen zu einem Bild pixelgenau zusammengefaßt werden - und daß Bereiche, die bei keiner dieser Detektoraufnahmen unbeleuchtet waren, interpoliert werden.
4. Verfahren nach 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von vollständigen Bildinformationen (mit Untergrund) die Detektoraufnahmen hinsichtlich der gemessenen Intensitäten addiert und ortsaufgelost normiert oder die hellen Bereiche der Einzelbilder zusammenge- faßt werden und daß die ortsaufgelosten Untergrundsignale von den addierten Detektoraufnahmen oder von einer Aufnahme ohne strukturierte Beleuchtung subtrahiert werden
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bild mit der Falschlichtverteilung zur Verminderung des Rauschens geglättet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Glattung durch eine Tiefpaßfilterung erfolgt
7 Anordnung zur Durchfuhrung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen leuchtenden oder beleuchteten flachenhaften Objekten oder Proben (1 2;44) auf ortsauflosenden Detektoren (1 4;46), umfassend - eine Strahlungsquelle (1 ;33) mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik (5;6;37;38) zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene (7;39), eine in der Feldblendenebene (7;39) angeordnete strukturierte Feldblende (8;40) zur Erzeugung einer in der Objektebene dem Objekt oder der Probe (1 2;44) zu überlagernden Beleuchtungsstruktur, erste optische Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende (8;40) auf die Probe (1 2;44), zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe (1 2;44) mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflosenden Detektor (1 4,46) für optische Strahlung, Einstellmittel zur definierten Positionierung der Beleuchtungsstruktur in der Objektebene in unterschiedlichen Positionen relativ zur Probe (1 2;44) und eine mit dem Detektor (1 4,46) verbundene Auswerteeinheit zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes.
Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der ortsauflosen- de Detektor (1 4) eine CCD- oder CMOS-Matrix ist.
9. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die strukturierte Feldblende (8) eine Hell-Dunkel-Struktur von unterschiedlicher Geometrie besitzt.
1 0. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung mindestens zweier Beleuchtungsstrukturen die Feldblende (8) in den zwei Koordinaten (x; y) der Feldblendenebene (7) definiert und reproduzierbar positionierbar ist.
1 1 . Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung mindestens zweier Beleuchtungsstrukturen eine Glasplatte (27) hinter der Feldblende (8) um zwei orthogonale Koordinaten (x; y) definiert und reproduzierbar kippbar ist.
1 2. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Feldblende (8) in zwei senkrecht zueinander verlaufenden Richtungen periodisch abwechselnde helle und dunkle Bereiche (1 8; 1 9) aufweist, wobei die dunklen Bereiche (1 9) nicht direkt aneinander grenzen.
1 3. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Feldblende (8) eine streifenformige Struktur aus einander abwechselnden hellen und dunklen Bereichen (24; 25) aufweist.
14. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung mindestens zweier Beleuchtungsstrukturen das Objekt oder die Probe (1 2) in den zwei Koordinaten der Objektebene definiert und reproduzierbar positionierbar ist.
1 5. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Positionierung und/oder Verkippung der hinter der Feldblende (8) angeordneten Glasplatte (27) Piezoaktuatoren (28), Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebe vorgesehen sind.
1 6. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten optischen Mittel zur Abbildung der strukturierten Feldblende (40) auf die Probe (44) als eine Beleuchtungsemheit nach Art einer Dunkelfeldbeleuchtungsein- πchtung ausgebildet sind
Anordnung nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Be- leuchtungsemheit als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet ist, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die zweiten optischen Mittel definierte optische Achse einen Winkel α einschließen
Anordnung nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsemheit eine an sich bekannte Scheimpflugoptik ist
Anordnung nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten optischen Mittel zur Abbildung der Probe (44) auf den Detektor (46) eine an sich bekannte Scheimpflugoptik ist
Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 6 und der Anordnung nach den Ansprüchen 7 bis 1 9 zum Auslesen von Biochips, in der Fluoreszenzmikroskopie und zu photometrischen Messungen
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DE10330716.8 2003-07-03
DE10347389.0 2003-10-08
DE2003147389 DE10347389A1 (de) 2003-07-03 2003-10-08 Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht

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DE (1) DE10347389A1 (de)
WO (1) WO2005003837A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1688734A1 (de) * 2005-02-03 2006-08-09 Samsung Electronics Co.,Ltd. Optisches Mehrkanal-Fluoreszenzmesssystem und Mehrkanal-Fluoreszenzprobenanalysator
CN113008377A (zh) * 2021-02-22 2021-06-22 中国电子科技集团公司第十一研究所 红外光学系统杂散辐射的分析方法和抑制方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011053775A1 (de) 2011-09-20 2013-03-21 Carl Zeiss Ag Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Tau-Proteinablagerungen im Auge

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998045745A1 (en) * 1997-04-04 1998-10-15 Isis Innovation Limited Microscopy imaging apparatus and method
US5867604A (en) * 1995-08-03 1999-02-02 Ben-Levy; Meir Imaging measurement system
DE19930816A1 (de) * 1999-07-01 2001-01-04 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern
WO2002012945A2 (de) * 2000-08-08 2002-02-14 Carl Zeiss Jena Gmbh Anordnung zur erhöhung der tiefendiskriminierung optisch abbildender system

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5867604A (en) * 1995-08-03 1999-02-02 Ben-Levy; Meir Imaging measurement system
WO1998045745A1 (en) * 1997-04-04 1998-10-15 Isis Innovation Limited Microscopy imaging apparatus and method
DE19930816A1 (de) * 1999-07-01 2001-01-04 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern
WO2002012945A2 (de) * 2000-08-08 2002-02-14 Carl Zeiss Jena Gmbh Anordnung zur erhöhung der tiefendiskriminierung optisch abbildender system

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1688734A1 (de) * 2005-02-03 2006-08-09 Samsung Electronics Co.,Ltd. Optisches Mehrkanal-Fluoreszenzmesssystem und Mehrkanal-Fluoreszenzprobenanalysator
EP1830174A2 (de) * 2005-02-03 2007-09-05 Samsung Electronics Co., Ltd Optisches Mehrkanal-Fluoreszenzmesssystem und Mehrkanal-Fluoreszenzprobenanalysator
EP1830174A3 (de) * 2005-02-03 2007-09-12 Samsung Electronics Co., Ltd Optisches Mehrkanal-Fluoreszenzmesssystem und Mehrkanal-Fluoreszenzprobenanalysator
US7928408B2 (en) 2005-02-03 2011-04-19 Samsung Electronics Co., Ltd. Multi-channel fluorescence measuring optical system and multi-channel fluorescence sample analyzer
CN113008377A (zh) * 2021-02-22 2021-06-22 中国电子科技集团公司第十一研究所 红外光学系统杂散辐射的分析方法和抑制方法

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