DE10341662A1 - Herstellungsverfahren für einen Immunoassay, Verfahren zum Nachweis eines Analyten und Immunoassay - Google Patents
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Abstract
Herstellungsverfahren für einen Immunoassay, Nachweisverfahren und Immunoassay zum Nachweis eines in einer Testflüssigkeit enthaltenen Analyten, bei dem auf einem porösen Träger (10) in einer Startzone ein markierter Sondenantikörper (3) und in einer stromabwärts gelegenen Detektionszone (D) ein immobilisierter Detektionsantikörper (6) vorgesehen sind, die beide an ein estes Antigen (1) und ein zweites Antigen (2) binden können. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, in einem späten Herstellungsschritt in der Startzone (S) weiter einen Konkurrenzantikörper (4; 4') vorzusehen, der entweder an das erste Antigen (1) oder an das zweite Antigen (2) binden kann. Durch geeignete Wahl des Konkurrenzantikörpers (3) wird bestimmt, ob der Immunoassay zum Nachweis des ersten Antigens (1) oder des zweiten Antigens (2) als Analyt geeignet ist.
Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren für einen Immunoassay zum Nachweis eines in einer Testflüssigkeit enthaltenen Analyten, umfassend die folgenden Schritte:
- – Bereitstellen eines porösen Trägers,
- – Aufbringen eines mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierten Sondenantikörpers in einer Startzone auf dem porösen Träger, wobei der Sondenantikörper so gewählt ist, dass er an ein in der Testflüssigkeit enthaltenes erstes Antigen sowie an ein ebenfalls in der Testflüssigkeit enthaltenes zweites Antigen binden kann und in der Startzone derart aufgebracht wird, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger bewegen kann,
- – dauerhaftes Immobilisieren eines Detektionsantikörpers in einer Detektionszone auf dem porösen Träger, wobei der Detektionsantikörper so gewählt ist, dass er geeignet ist, mit dem ersten Antigen und dem Sondenantikörper in einer Sandwich-Reaktion zu binden.
- Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zum Nachweis eines zu detektierenden Analyten in einer Testflüssigkeit, wobei ein poröser Träger in einer Applikationszone mit der Testflüssigkeit befeuchtet wird, welche ihn stromab wärts durchläuft und dabei folgende Zonen auf dem porösen Träger passiert:
- – eine Startzone in welcher ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierter und in trockenem Zustand des porösen Trägers fixierter Sondenantikörper vorliegt, der mit dem Analyten bindet, sofern dieser in der Testflüssigkeit vorhanden ist, und der sich mit der Testflüssigkeit weiter stromabwärts bewegt,
- – eine stromabwärts von der Startzone gelegene Detektionszone, in welcher ein Detektionsantikörper dauerhaft immobilisiert ist, der mit dem Analyten und dem Sondenantikörper in einer Sandwich-Reaktion bindet, sofern diese beiden Stoffe nach Passieren der Startzone in der Testflüssigkeit vorhanden sind.
- Die Erfindung bezieht sich schließlich auf einen Immunoassay, umfassend einen porösen Träger, welcher zur Durchführung eines Nachweises eines zu detektierenden Analyten in einer Testflüssigkeit in einer Applikationszone mit der Testflüssigkeit befeuchtbar ist, wobei auf dem porösen Träger
- – in einer Startzone ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierter Sondenantikörper, der an den Analyten sowie an ein ebenfalls in der Testlösung enthaltenes Störantigen binden kann, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger bewegen kann,
- – in einer stromabwärts von der Startzone gelegenen Detektionszone ein Detektionsantikörper, der mit dem Analyten und dem Sondenantikörper in einer Sandwichreaktion binden kann, dauerhaft immobilisiert ist.
-
EP 0291 194 A1 offenbart einen entsprechenden Immunoassay, mit dem das vorgenannte Nachweisverfahren durchführbar ist. Der bekannte Immunoassay wird auf bekannte Weise mittels des oben genannten, gattungsgemäßen Herstellungsverfahrens hergestellt. Derartige Assays werden in der modernen Diagnostik vielfach verwendet, um einen Analyten in einer Testflüssigkeit nachzuweisen. Allgemein findet dabei ein streifenförmiger, poröser Träger Anwendung, der in einer Applikationszone an einem Ende des Teststreifens mit einer Testflüssigkeit befeuchtbar ist, die mutmaßlich den zu detektierenden Analyten enthält. - Aufgrund von Kapillarkräften in dem porösen Träger wird die Testflüssigkeit durch den Teststreifen in ein an dem gegenüberliegenden Streifenende gelegenes Flüssigkeitsreservoir gesaugt. Auf ihrem Weg durch den Teststreifen passiert die Testflüssigkeit verschiedene unterschiedlich präparierte Zonen auf dem porösen Träger. Die Formulierung „auf dem Träger" ist hier weit zu verstehen und umfasst alle Zonenformen, die mit dem Trägermaterial in Flüssigkeit leitender Verbindung stehen. Das sind z.B. Präparationen, die den Teststreifen durchdringen, solche die allein seine Oberfläche betreffen, ebenso wie solche, bei der ein separates, präpariertes Element, wie beispielsweise ein Glasfaserkissen mit darin aufgetrockneten Substanzen, in direktem Kontakt zu dem Teststreifen steht.
- Von der Applikationszone durchläuft die Testflüssigkeit stromabwärts zunächst einer Startzone, in welcher partikelmarkierte Sondenantikörper vorliegen. Diese sind in der Startzone derart fixiert, dass sie im trockenen Zustand des porösen Trägers nicht beweglich sind, im feuchten Zustand des porösen Trägers jedoch von der Testflüssigkeit erfasst werden und sich mit dieser stromabwärts bewegen können. Die Sonden antikörper sind derart gewählt, dass sie an den Analyten binden können. Enthält die Testflüssigkeit den Analyten, kommt es daher in der Startzone zu einer ersten Immunreaktion zwischen dem Analyten und dem Sondenantikörper.
- Weiter stromabwärts läuft die Detektionsflüssigkeit zusammen mit dem gelösten Sondenantikörper eine Detektionszone, in welcher ein Detektionsantikörper dauerhaft immobilisiert ist. Das bedeutet, dass der Detektionsantikörper weder im trockenen noch im feuchten Zustand des porösen Trägers beweglich ist. Der Detektionsantikörper ist so gewählt, dass er ebenfalls an den Analyten binden kann. Enthält die Testflüssigkeit den Analyten, kommt es daher in der Detektionszone zu einer sogenannten Sandwich-Reaktion, bei welcher der Analyt zusammen mit dem an den ihn gebundenen Sondenantikörper an den Detektionsantikörper bindet und so in der Detektionszone immobilisiert wird. In der Folge kommt es zu einer Anfärbung der Detektionszone, die optisch nachgewiesen werden kann.
- Die für die Herstellung eines derartigen Immunoassays erforderlichen Schritte des Aufbringens von Reaktanden, insbesondere von Antikörpern in bestimmten Zonen des porösen Trägers sind dem Fachmann allgemein bekannt. Auch die unterschiedliche Aufbringung, d.h. dauerhafte Immobilisierung oder lediglich Fixierung, so dass die im trockenen Zustand fixierten Antikörper sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts bewegen können, sind hinlänglich bekannt. Auf die Details derartiger Schritte soll daher im Rahmen dieser Beschreibung nicht im Einzelnen eingegangen werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Begriff „Aufbringen eines Antikörpers" sowohl das Aufbringen des Antikörpers selbst auf dem Träger als auch das Aufbringen eines mit dem Antikörper versehenen Elementes, wie etwa eines Glasfaserkissens, auf dem Träger umfasst.
- Ein Anwendungsbeispiel für derart hergestellte Immunoassays und mit diesen durchgeführte Nachweisverfahren ist ein Schwangerschaftstest, bei dem die Testflüssigkeit, beispielsweise weiblicher Urin und der Analyt hCG ist.
- Nachteilig bei den bekannten Herstellungsverfahren ist es, dass das Verfahren von Anfang an auf die Herstellung eines für einen bestimmten Analyten (oder eine Gruppe simultan detektierbarer Analyten) optimierten Assays ausgerichtet ist. So wird insbesondere großer Aufwand getrieben, möglichst hochselektive oder spezifische Antikörper herzustellen, die eine möglichst kleine Gruppe von Antigenen oder günstigstenfalls nur genau ein Antigen binden. Im Rahmen dieser Beschreibung wird der Begriff „selektiv" für Antikörper verwendet, welche an eine kleine Gruppe biochemisch ähnlicher Antigene binden können. Als „spezifisch" werden hier Antikörper bezeichnet, die jeweils genau an ein Antigen binden können. Der Begriff „Selektivität" umfasst daher in seiner extremen Ausprägung auch die „Spezifität". Die Entwicklung hoch selektiver oder spezifischer Antikörper ist mit großem Zeitaufwand und entsprechenden Kosten verbunden. Sollen, wie beispielsweise im Fall der Sandwich-Reaktion mehrer Antikörper an ein Antigen binden, ist eine zweifach spezifische Bindung, etwa aus Gründen der sterischen Inhibition, häufig nicht möglich oder nur mit extremem Entwicklungsaufwand realisierbar.
- Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungsgemäßes Herstellungsverfahren für einen Immunoassay derart weiterzubilden, dass möglichst viele Vorstufen von Immunoassays zum Nachweis verschiedener Analyte gleichartig, vorzugsweise in identischen Verfahrensschritten, hergestellt werden können und ihre Optimierung für einen bestimmten Analyten in einem möglichst späten Schritt des Herstellungsverfahrens erfolgt.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten zur Verfügung zu stellen, welches mittels eines Immunoassays durchgeführt werden kann, der mittels des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens herstellbar ist.
- Es ist schließlich eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Immunoassay zur Verfügung zu stellen, der im Vergleich zu bekannten Immunoassay zum Nachweis derselben Analyten besonders kostengünstig ist.
- Die erstgenannte Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass der Detektionsantikörper weiter so gewählt ist, dass er geeignet ist mit dem zweiten Antigen und dem Sondenantikörper in einer Sandwich-Reaktion zu binden, und dass weiter der folgende Schritt umfasst ist: Aufbringen wenigstens eines Konkurrenzantikörpers in der Startzone derart, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger bewegen kann, wobei durch Auswahl des Konkurrenzantikörpers danach, ob er mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper oder dem Detektionsantikörper an das erste Antigen oder an das zweite Antigen binden kann, bestimmt wird, ob der Immunoassay zum Nachweis des zweiten Antigens als Analyt oder des ersten Antigens als Analyt einsetzbar ist.
- Die zweitgenannte Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch dadurch gelöst, dass wenigstens ein im trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixierter und im feuchten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts beweglicher Konkurrenzantikörper mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper oder dem Detektionsantikörper mit einem in der Testlösung enthaltenen Störantigen, an welches zu binden sowohl der Sondenantikörper als auch der Detektionsantikörper geeignet ist, bindet.
- Die letztgenannte Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 3 dadurch gelöst, dass der Detektionsantikörper geeignet ist an das Störantigen zu binden und dass in der Startzone zusätzlich wenigstens ein Konkurrenzantikörper, der mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper oder dem Detektionsantikörper an das Störantigen binden kann, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger bewegen kann.
- Da Immunoassay, Herstellungsverfahren und Nachweisverfahren in enger Verbindung zueinander stehen, sollen die Wirkungen und Vorteile der unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung gemeinsam diskutiert werden.
- Im Gegensatz zu dem üblichen Ansatz, den Detektionsantikörper möglichst selektiv, insbesondere spezifisch für den zu detektierenden Analyten zu wählen wird hier die Wahl eines Detektionsantikörpers vorgeschlagen, der grundsätzlich sowohl mit dem ersten als auch mit einem zweiten Antigen binden kann, welches bei herkömmlichen Tests die Eindeutigkeit des Tests durch Kreuzreaktion mit den verwendeten Antikörpern verringert und daher allgemein als Störantigen bezeichnet wird. Dieser Ansatz erscheint zunächst paradox, da bei einem derartigen Test weder in der Startzone, wo der markierte Sondenantikörper geeignet ist, mit dem ersten sowie dem zweiten Antigen zu binden, noch in der Detektionszone, wo der Detektion santikörper geeignet ist, mit dem ersten sowie dem zweiten Antigen zu binden, eine effektive Unterscheidung zwischen erstem und zweitem Antigen gegeben zu sein scheint.
- Erfindungsgemäß ist jedoch weiter vorgesehen, dass in der Startzone zusätzlich ein hochselektiver Konkurrenzantikörper vorgesehen ist, welcher lediglich zur Bindung mit einem der beiden Antigene in der Lage ist. Dies bedeutet, dass für eines der beiden Antigene in der Startzone eine sehr viel größere Zahl von Bindungsstellen (nämlich die des Sondenantikörpers sowie des Konkurrenzantikörpers) zur Verfügung stehen als für das andere der beiden Antigene (nur die Bindungsstellen des Sondenantikörpers). Bei geeigneter Wahl der in der Startzone aufgebrachten Menge von Sondenantikörper und Konkurrenzantikörper kann erreicht werden, dass eines der beiden Antigene im wesentlichen an den markierten Sondenantikörper bindet, während das andere Antigen im Wesentlichen an den unmarkierten Konkurrenzantikörper bindet. Es handelt sich bei diesem Prinzip um eine besonders vorteilhafte Anwendung des immunologischen Analogons zum Massenwirkungsgesetz. Man beachte, dass der Konkurrenzantikörper dabei tatsächlich konkurrierend binden muss, d.h. eine gleichzeitige Bindung von Konkurrenzantikörper und Sondenantikörper oder – bei einer anderen Ausführungsform – von Konkurrenzantikörper und Detektionsantikörper an einem einzelnen Antigen muss im Wesentlichen unterdrückt sein. Die Bindung des Konkurrenzantikörpers an eines der Antigene muss daher nicht nur mit hoher Selektivität sondern auch alternativ zu dem Sondenantikörper (bei einer ersten Ausführungsform) oder alternativ zu dem Detektionsantikörper (bei einer zweiten Ausführungsform) erfolgen. Der Begriff der „gleichzeitigen Bindung" bezieht sich dabei nicht nur auf ein simultanes Bindeereignis sondern auch auf einen Zustand, in dem zu einer Zeit ein Konkurrenzantikörper und ein Sondenantikörper bzw. ein Konkurrenzantikörper und ein Detektionsantikörper an einem einzelnen Antigen gebunden sind.
- Dieser Grundgedanke kann in zwei Hauptvarianten der Erfindung verkörpert sein. Bei einer ersten Variante inhibiert die Bindung eines Konkurrenzantikörpers an einem einzelnen Antigen die zusätzliche Bindung eines Sondenantikörpers an demselben Antigen. Da sowohl Sondenantikörper wie auch Konkurrenzantikörper mit der Testflüssigkeit stromabwärts bewegbar sind, kommt es in der Detektionszone zu einer kompetitiven Bindungsreaktion mit dem dort immobilisierten Detektionsantikörper. Allerdings führt eine Sandwichreaktion, an welcher der unmarkierte Konkurrenzantikörper beteiligt ist, nicht zu einer Anfärbung der Detektionszone. Diese Reaktion bleibt daher für den Benutzer unsichtbar. Die Sandwichreaktion, an welcher der markierte Sondenantikörper beteiligt ist, führt hingegen in gewohnter Weise zu eine Anfärbung der Detektionszone.
- Im Vergleich zu den bekannten Verfahren wird sich jedoch ein gewisser Fehler dadurch einstellen, dass nicht nur eines der beiden Antigene an der Sondenantikörper gebunden ist. Wie zuvor erläutert, ist jedoch die Menge des anderen Antigens, welches ebenfalls an den Sondenantikörper gebunden ist, gering und kann durch geeignete Wahl der Aufbringungsmenge des Konkurrenzantikörpers in der Startzone auf nahezu jedes gewünschte Maß reduziert werden. Der unvermeidliche Fehler kann somit bedarfsgerecht für den jeweiligen Test eingestellt werden.
- Bei einer zweiten Variante inhibiert die Bindung eines Konkurrenzantikörpers an einem einzelnen Antigen die zusätzliche Bindung eines Detektionsantikörpers in der Detektionszone an demselben Antigen. Eine gleichzeitige Bindung eines Sondenantikörpers und eines Konkurrenzantikörpers an demselben ein zelnen Antigen in der Startzone ist bei dieser Variante hingegen nicht notwendig ausgeschlossen. In der Detektionszone hingegen ist nur eine Sandwich-Reaktion zwischen Detektionsantikörper und Antigenen-Sondenantikörper-Komplexen, nicht aber zwischen Detektionsantikörper und Antigenen-Konkurrenzantikörper-Komplexen möglich.
- Bei der Wahl der Aufbringungsmenge des Konkurrenzantikörpers sind unter anderem die Selektivitätsgrade der verwendeten Antikörper, die in der Testflüssigkeit erwarteten, typischen Konzentrationen der Antigene sowie deren Aktivität hinsichtlich der Bindungsreaktion mit den verwendeten Antikörpern zu berücksichtigen.
- Die erläuterte Grundidee der Erfindung schlägt sich in besonders vorteilhafter Weise in dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für einen Immunoassay nieder, da für verschiedene Immunoassays zum Nachweis verschiedener Antigene, die bei herkömmlichen Tests ein Analyt-Störantigen-Paar darstellen, ein bis auf den Schritt der Aufbringung des Konkurrenzantikörpers in der Startzone identisches Herstellungsverfahren angewendet werden kann. Insbesondere können „Rohlinge" in großer Zahl auf Halde produziert werden, auf denen in einem sehr späten Arbeitsschritt in der Startzone ein bestimmter Konkurrenzantikörper aufgebracht, z.B. aufgetrocknet, wird. Erst durch Auswahl des Konkurrenzantikörpers dem späten Herstellungsschritt wird somit entschieden, zum Nachweis welchen Analyten sich der so hergestellte Immunoassay eignet, d.h. als, welches Antigen als Analyt und welches als Störantigen betrachtet wird. Die Vorteile, die sich aus der so gewonnen Produktionsflexibilität ergeben, liegen auf der Hand und betreffen sowohl die Kosten wie die Lieferflexibilität.
- Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind Sondenantikörper, Detektionsantikörper und Konkurrenzantikörper so gewählt, dass das erste Antigen und das zweite Antigen jeweils ein Hormon aus der Gruppe hCG, LH, FSH, TSH und untereinander unterschiedlich sind. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass Sondenantikörper und Detektionsantikörper jeweils eine Selektivität für die α-Kette der genannten Hormone haben, welche bei allen Hormonen dieser Gruppe im Wesentlichen identisch ist. Der Konkurrenzantikörper muss dann so gewählt sein, dass wenigstens eines der genannten Hormone an ihn nicht bindet, etwa weil er eine Selektivität für ein Epitop auf der β-Kette aufweist, in welcher sich die genannten Hormone voneinander unterscheiden. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass Sondenantikörper und Detektionsantikörper beide an Epitope auf der β-Kette binden, wobei dann jedoch Epitope zu wählen sind, die bei mindestens zwei der genannten Hormone identisch sind.
- Das erfindungsgemäße Prinzip ist auch bei Verwendung mehrerer Sondenantikörper, Detektionsantikörper und/oder Konkurrenzantikörper anwendbar. Grundsätzlich kann das Reaktionsschema beliebig komplex aufgebaut werden.
- Bei einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung, ist auf dem porösen Träger stromabwärts der Detektionszone eine Kontrollzone vorgesehen, in der ein Kontroll-Detektionsagens dauerhaft mobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit dem Sondenantikörper zu binden. Wird im Rahmen des Herstellungsverfahrens nämlich eine solche Kontrollzone eingerichtet, färbt sich diese Kontrollzone aufgrund derjenigen markierten Sondenantikörper, welche die Detektionszone passieren ohne eine Bindung einzugehen, an, unabhängig davon, ob sie zuvor mit einem Antigen reagiert haben oder nicht. Die Kontrollzone kann somit zur Feststellung der Beendigung des Nachweisverfahrens verwendet werden.
- Bei einer alternativen Ausführungsform ist das in der Kontrollzone immobilisierte Kontroll-Detektionsagens so gewählt, dass es nicht mit dem Sondenantikörper bindet, sondern vielmehr mit einem von dem Sondenantikörper verschiedenen Kontrollantikörper, welcher mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markiert ist und der in einer stromaufwärts der Kontrollzone gelegenen Kontroll-Startzone, die vorzugsweise der Startzone entspricht, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Kontroll-Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers mit der Testflüssigkeit stromabwärts in den porösen Träger bewegen kann. Dies hat zur Folge, dass die Kontrollreaktion vollkommen unabhängig von der Detektionsreaktion stattfindet, so dass es hier zu keiner den Test eventuell verfälschenden Wechselwirkung kommen kann.
- Als optisch detektierbarer Farbstoff, der sowohl zur Markierung des Sondenantikörpers als auch ggf. zur Markierung des Kontrollantikörpers verwendet werden kann, eignet sich in besonderer Weise ein partikelförmiger Direktfarbstoff, der vorzugsweise Gold und/oder Latexpartikel enthält. Andere Färbemethoden sind jedoch grundsätzlich auch anwendbar.
- Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden speziellen Beschreibung sowie den Zeichnung, in denen
-
1 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens unter Verwendung einer Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Immunoassays zeigt und -
2 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens unter Verwendung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Immunoassays zeigt. -
1 zeigt in schematischer Darstellung einen erfindungsgemäßen Immunoassay10 , der im Wesentlichen als ein poröser Träger dargestellt ist, der in verschiedene Zonen eingeteilt ist. Die Teilfiguren I und II beziehen sich auf zwei Immunoassays, die sich allein in der Wahl des Konkurrenzantikörpers unterscheiden. - Zunächst soll das Schema
2 erläutert werden. Mit A ist eine Applikationszone bezeichnet, die beispielsweise als schwammartiger Fortsatz in Flüssigkeit leitender Verbindung mit dem porösen Träger ausgeführt sein kann. Die Applikationszone wird bei Anwendung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens mit einer Testflüssigkeit benetzt, die (mutmaßlich) mindestens zwei Antigene1 und2 enthält. - Aufgrund von Kapillarkräften strömt die Testflüssigkeit mit den Antigenen
1 ,2 stromabwärts entlang des porösen Trägers. Sie passiert dabei die Startzone S. In der Startzone S sind ein Sondenantikörper3 und ein Konkurrenzantikörper4 beispielsweise durch Auftrocknen fixiert. Sondenantikörper3 und Konkurrenzantikörper4 unterscheiden sich in wenigstens zwei Kriterien. Sondenantikörper3 ist zum einen mittels eines vorzugsweise partikelförmigen Direktfarbstoffs, der als Gold- oder Latexpartikel5 ausgeführt sein kann, markiert, während Konkurrenzantikörper4 keine oder eine von der Markierung des Sondenantikörpers3 unterscheidbare Markierung aufweist. Bei der gezeigten Ausführungsform ist der Konkurrenzantikörper4 nicht markiert. - Zweitens unterscheiden sich die beiden Antikörpern in ihren Bindungseigenschaften. Während der Sondenantikörper
3 sowohl mit dem ersten Antigen1 als auch mit dem zweiten Antigen2 eine Bindung eingehen kann, kann der Konkurrenzantikörper4 lediglich mit dem zweiten Antigen2 in nicht vernachlässigbarem Ausmaß reagieren. - Aus der schematischen Darstellung von
1 wird deutlich, dass bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel für das zweite Antigen2 in der Startzone S wesentlich mehr Bindungsstellen zur Verfügung stehen, als für das erste Antigen1 . Da auf diese Weise ein großer Teil des zweiten Antigens2 von dem Konkurrenzantikörper4 gebunden wird, ist die Wahrscheinlichkeit einer Bindung mit dem Sondenantikörper3 für das erste Antigen1 im Vergleich zum Antigen2 deutlich erhöht. Entsprechend bindet im Wesentlichen nur das erste Antigen1 an den partikelmarkierten Sondenantikörper3 . - Da der Sondenantikörper
3 sowie der Konkurrenzantikörper4 in der Startzone nicht dauerhaft fixiert sind, strömen sie mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger. Sie passieren im Folgenden die Detektionszone D, in der ein Detektionsantikörper6 dauerhaft immobilisiert ist. Der Detektionsantikörper6 ist so gewählt, dass er sowohl mit dem ersten Antigen1 , als auch mit dem zweiten Antigen2 binden kann. Aufgrund der oben erläuterten Vorselektion durch Verschiebung der Bindungswahrscheinlichkeiten in der Startzone S kommt es in der Detektionszone D im Wesentlichen nur durch die an den Sondenantikörper3 gebundenen ersten Antigene1 zu einer die Detektionszone anfärbenden Sandwichreaktion. Die Sandwichreaktion, an welcher das zweite Antigen2 beteiligt ist, erfolgt im Wesentlichen nur unter Beteiligung des unmarkierten Konkurrenzantikörpers4 , so dass diese Reaktion für den Benutzer unsichtbar bleibt. - In einer sich stromabwärts anschließenden Kontrollzone C ist bei der gezeigten, vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ein Kontroll-Detektionsantikörper dauerhaft immobilisiert, welcher an ein markiertes Kontrollagens bindet, das bei einer Ausführungsform der Sondenantikörper
3 sein kann, bei einer alternativen Ausführungsform aber auch ein hiervon unabhängiger Kontrollantikörper. - Um den Flüssigkeitsstrom durch den porösen Träger möglichst lange aufrechtzuerhalten, ist im Anschluss vorzugsweise ein Flüssigkeitsreservoir R vorgesehen, welches schwämmchenartig ausgebildet sein kann.
- In dem mit II gekennzeichneten Teil von
1 ist im Wesentlichen dasselbe Schema wie unter2 dargestellt, wobei sich lediglich der Konkurrenzantikörper4' von dem unter I gezeigten Konkurrenzantikörper4 unterscheidet. Dieser weist nämlich eine hohe Selektivität für das erste Antigen1 anstelle des zweiten Antigens2 , wie zuvor erläutert, auf. - Das Ergebnis dieser Modifikation ist, dass an den Sondenantikörper
3 nun im Wesentlichen das zweite Antigen2 bindet. Der gesamte Test kann somit zum Nachweis des zweiten Antigens2 als Analyt verwendet werden (das erste Antigen1 wirkt hierbei als Störantigen), während die weiter oben unter I beschriebene Variante dem Nachweis des ersten Antigens1 als Analyt diente (das zweite Antigen2 wirkt hierbei als Störantigen). - Durch die erfinderische Grundidee kann daher das Herstellungsverfahren eines Immunoassays soweit vereinfacht werden, dass erst in einem sehr späten Herstellungsschritt durch Wahl des Konkurrenzantikörpers
4 oder4' ausgewählt und entschie den wird, ob der gesamte Test zum Nachweis eines ersten Antigens1 oder eines zweiten Antigens2 eingesetzt werden kann. -
2 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens unter Verwendung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Immunoassays. Zur Vereinfachung soll bei der Beschreibung von2 nur auf deren Unterschiede zu1 eingegangen werden. - Bei der Ausführungsform gemäß Spalte I in
2 treffen in der Startzone erstes und zweites Antigen1 und2 auf dort im trockenen Zustand fixierte und markierte Sondenantikörper3 sowie auf unmarkierte Konkurrenzantikörper9 . Diese sind so gewählt, dass sie mit hoher Selektivität an Antigen2 binden können (Bildung eines Immunkomplexes11 ), welches hierdurch als Störantigen identifiziert wird, während Antigen1 hierdurch als Analyt identifiziert wird. Der Konkurrenzantikörper9 ist weiter so gewählt, dass er zwar die gleichzeitige Bindung des Sondenantikörpers3 zur Bildung eines mobilen Sandwich-Immunkomplexes12 ermöglicht. Eine Bindung des in der Detektionszone D immobilisierten Detektionsantikörpers6 wird jedoch inhibiert, sodass dort weder der Immunkomplex11 noch der Sandwich-Immunkomplex12 gebunden werden kann. Die Anfärbung der Detektionszone wird also klar von dem an Sondenantikörper3 gebundenen Antigen1 dominiert. - Die Ausführungsform gemäß Spalte II von
2 unterscheidet sich allein durch den Austausch des Konkurrenzantikörpers9 durch den Konkurrenzantikörper9' , der mit hoher Selektivität an das Antigen1 bindet, ansonsten aber im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie der Konkurrenzantikörper9 hat, von der oben erläuterten Ausführungsform gemäß Spalte I. In der Startzone S kommt es daher zu der Bildung des Immunkomplexes11' und ggf. des Sandwich-Immunkomplexes12' , die bei de das Antigen1 enthalten, welches hierdurch als Störantigen identifiziert wird, während Antigen2 in diesem Fall den Analyten darstellt. Die Anfärbung der Detektionszone D wird klar von dem an Sondenantikörper3 gebundenen Antigen2 dominiert - Natürlich stellen die in der Beschreibung erläuterten Ausführungsbeispiele lediglich vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Prinzips dar. Modifikationen sind in weitem Umfang innerhalb des Erfindungsbereiches möglich. Insbesondere liegt die spezielle Wahl der verwendeten Antikörper, ihre Selektivitäten oder Spezifitäten, ihre Mengen sowie Belegungsdichten auf dem porösen Träger im Ermessen des Fachmanns, welcher seine Wahl in Abstimmung mit den ihn speziell interessierenden Antigenen, deren biochemischen Besonderheiten und typischerweise in der Testflüssigkeit vorliegenden Mengen oder Konzentrationen zu treffen hat.
Claims (18)
- Herstellungsverfahren für einen Immunoassay zum Nachweis eines in einer Testflüssigkeit enthaltenen Analyten (
1 ;2 ), umfassend die folgenden Schritte: – Bereitstellen eines porösen Trägers (10 ), – Aufbringen eines mit einem optisch detektierbaren Farbstoff (5 ) markierten Sondenantikörpers (3 ) in einer Startzone (S) des porösen Trägers (10 ), wobei der Sondenantikörper (3 ) so gewählt ist, dass er an ein in der Testflüssigkeit enthaltenes erstes Antigen (1 ) sowie an ein ebenfalls in der Testflüssigkeit enthaltenes zweites Antigen (2 ) binden kann und in der Startzone (S) derart aufgebracht wird, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann, – dauerhaftes Immobilisieren eines Detektionsantikörpers (6 ) in einer Detektionszone (D) auf dem porösen Träger (10 ), wobei der Detektionsantikörper (6 ) so gewählt ist, dass er geeignet ist, mit dem ersten Antigen (1 ) und dem Sondenantikörper (3 ) in einer Sandwich-Reaktion zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsantikörper (6 ) weiter so gewählt ist, dass er geeignet ist, mit dem zweiten Antigen (2 ) und dem Sondenantikörper (3 ) in einer Sandwich-Reaktion zu binden, und dass weiter der folgende Schritt umfasst ist: Aufbringen wenigstens eines Konkurrenzantikörpers (4 ;4' ;9 ;9' ) in der Startzone (S) derart, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann, wobei durch Auswahl des Konkurrenzantikörpers (4 ;4' ;9 ;9' ) danach, ob er mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper (3 ) oder dem Detektionsantikörper (6 ) an das erste Antigen (1 ) oder an das zweite Antigen (2 ) binden kann, bestimmt wird, ob der Immunoassay zum Nachweis des zweiten Antigens (2 ) als Analyt oder des ersten Antigens (1 ) als Analyt einsetzbar ist. - Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Sondenantikörper (
3 ), Detektionsantikörper (6 ) und Konkurrenzantikörper (4 ,4' ;9 ;9' ) so gewählt sind, dass das erste Antigen (1 ) und das zweite Antigen (2 ) jeweils ein Hormon aus der Gruppe hCG, LH, FSH, TSH und untereinander unterschiedlich sind. - Herstellungsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger stromabwärts der Detektionszone eine Kontrollzone vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens dauerhaft immobilisiert wird, welches in der Lage ist, mit dem Detektionsantikörper zu binden.
- Herstellungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger (
10 ) stromabwärts der Detektionszone (D) eine Kontrollzone (C) vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens (7 ) dauerhaft immobilisiert wird, welches in der Lage ist, mit einem von dem Sondenantikörper verschiedenen Kontrollantikörper (8 ) zu binden, der mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markiert ist und der in einer stromaufwärts der Kontrollzone (C) gelegenen Kontroll-Startzone (S) derart aufgebracht wird, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Kontroll-Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann. - Herstellungsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optisch detektierbare Farbstoff (
5 ) ein partikelförmiger Direktfarbstoff ist. - Herstellungsverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der partikelförmige Direktfarbstoff Gold- und/oder Latexpartikel (
5 ) enthält. - Verfahren zum Nachweis eines zu detektierenden Analyten (
1 ;2 ) in einer Testflüssigkeit, wobei ein poröser Träger (10 ) in einer Applikationszone (A) mit der Testflüssigkeit befeuchtet wird, welche ihn stromabwärts durchläuft und dabei folgende Zonen auf dem porösen Träger (10 ) passiert: – eine Startzone (S) in welcher ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff (5 ) markierter und in trockenem Zustand des porösen Trägers (10 ) fixierter Sondenantikörper (3 ) vorliegt, der mit dem Analyten bindet, sofern dieser in der Testflüssigkeit vorhanden ist, und der sich mit der Testflüssigkeit weiter stromabwärts bewegt, – eine stromabwärts von der Startzone (S) gelegene Detektionszone (D), in welcher ein Detektionsantikörper (6 ) dauerhaft immobilisiert ist, der mit dem Analyten und dem Sondenantikörper (3 ) in einer Sandwich-Reaktion bindet, sofern diese beiden Stoffe nach Passieren der Startzone (S) in der Testflüssigkeit vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein im trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Startzone (S) fixierter und im feuchten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts beweglicher Konkurrenzantikörper (4 ;4' ;9 ;9' ) mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper (3 ) oder dem Detektionsantikörper (6 ) mit einem in der Testlösung enthaltenen Störantigen (2 ;1 ), an welches zu binden sowohl der Sondenantikörper (3 ) als auch der Detektionsantikörper (6 ) geeignet ist, bindet. - Nachweisverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Sondenantikörper (
3 ), Detektionsantikörper (6 ) und Konkurrenzantikörper (4 ,4' ;9 ;9' ) so gewählt sind, dass das erste Antigen (1 ) und das zweite Antigen (2 ) jeweils ein Hormon aus der Gruppe hCG, LH, FSH, TSH und untereinander unterschiedlich sind. - Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger stromabwärts der Detektionszone eine Kontrollzone vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens dauerhaft immobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit dem Detektionsantikörper zu binden.
- Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger (
10 ) stromabwärts der Detektionszone (D) eine Kontrollzone (C) vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens (7 ) dauerhaft immobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit einem von dem Sondenantikörper (3 ) verschiedenen Kontrollantikörper (8 ) zu binden, der mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markiert ist und der in einer stromaufwärts der Kontrollzone (C) gelegenen Kontroll-Startzone (S) derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Kontroll-Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann. - Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der optisch detektierbare Farbstoff (
5 ) ein partikelförmiger Direktfarbstoff ist. - Nachweisverfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der partikelförmige Direktfarbstoff Gold- und/oder Latexpartikel (
5 ) enthält. - Immunoassay, umfassend einen porösen Träger (
10 ), welcher zur Durchführung eines Nachweises eines zu detektierenden Analyten (1 ;2 ) in einer Testflüssigkeit in einer Applikationszone (A) mit der Testflüssigkeit befeuchtbar ist, wobei auf dem porösen Träger (10 ) – in einer Startzone (S) ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff (5 ) markierter Sondenantikörper (3 ), der an den Analyten (1 ;2 ) sowie an ein ebenfalls in der Testlösung enthaltenes Störantigen (2 ;1 ) binden kann, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Startzone (10 ) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann, – in einer stromabwärts von der Startzone (S) gelegenen Detektionszone (D) ein Detektionsantikörper (6 ), der mit dem Analyten (1 ;2 ) und dem Sondenantikörper (3 ) in einer Sandwichreaktion binden kann, dauerhaft immobilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsantikörper (6 ) geeignet ist, an das Störantigen (2 ;1 ) zu binden und dass in der Startzone (S) zusätzlich wenigstens ein Konkurrenzantikörper (4 ;4' ), der mit hoher Selektivität und alternativ zu dem Sondenantikörper (3 ) oder dem Detektionsantikörper (6 ) an das Störantigen (2 ;1 ) binden kann, derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers (10 ) in der Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann. - Immunoassay nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Sondenantikörper (
3 ), Detektionsantikörper (6 ) und Konkurrenzantikörper (4 ;4' ) so gewählt sind, dass das erste Antigen (1 ) und das zweite Antigen (2 ) jeweils ein Hormon aus der Gruppe hCG, LH, FSH, TSH und untereinander unterschiedlich sind. - Immunoassay nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger stromabwärts der Detektionszone eine Kontrollzone vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens dauerhaft immobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit dem Detektionsantikörper zu binden.
- Immunoassay nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem porösen Träger (
10 ) stromabwärts der Detektionszone (D) eine Kontrollzone (C) vorgesehen ist, in der ein Kontroll-Detektionsagens (7 ) dauerhaft immobilisiert ist, welches in der Lage ist, mit einem von dem Sondenantikörper (3 ) verschiedenen Kontrollantikörper (8 ) zu binden, der mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markiert ist und der in einer stromaufwärts der Kontrollzone (C) gelegenen Kontroll-Startzone (S) derart aufgebracht ist, dass er in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in der Kontroll-Startzone (S) fixiert ist und sich im befeuchteten Zu stand des porösen Trägers (10 ) mit der Testflüssigkeit stromabwärts in dem porösen Träger (10 ) bewegen kann. - Immunoassay nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der optisch detektierbare Farbstoff (
5 ) ein partikelförmiger Direktfarbstoff ist. - Immunoassay nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der partikelförmige Direktfarbstoff Gold- und/oder Latexpartikel (
5 ) enthält.
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