Die
Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen
zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Beschreibung
des Erfindung
Gegenstand
der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man
- a) ein L-Lysin produzierendes
coryneformes Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium
inokuliert und kultiviert,
- b) einen Teil der Fermentationsbrühe abtrennt, wobei mehr als
60 Vol.-%, mehr als 70 Vol.-%, mehr als 80 Vol.-%, bevorzugt mehr
als 85 Vol.-%, bevorzugt mehr als 90 Vol.-% und besonders bevorzugt
mehr als 95 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe im Fermenter
verbleiben, anschließend
- c) die verbleibende Fermentationsbrühe mit einem oder mehreren
weiteren Nährmedien
auffüllt,
wobei das weitere Nährmedium
oder die weiteren Nährmedien
mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle
und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, und die Kultivierung
unter Bedingungen die die Bildung von L-Lysin erlauben, fortsetzt,
- d) die Schritte b) und c) gegebenenfalls mehrfach durchführt,
- e) über
den gesamten Zeitraum des Schrittes (b), eine Konzentration der
Kohlenstoffquelle(n) von maximal 10 g/l eingestellt wird, und
- f) über
den gesamten Zeitraum des Schrittes (b), die Bildung des L-Lysin,
bezogen auf Lysin-HCl, mit einem Leistungs-Index (LI) = Raum-Zeit-Ausbeute
[g/(l*h)] × Ausbeute
[w/w] × Konzentration
Lysin-HCl [g/l])
von wenigstens 130 g2/(l2*h)
erfolgt.
Erfindungsgemäß kann die
Anlagenleistung einer L-Lysin produzierenden Fermentationseinheit
dadurch gesteigert werden, dass man in dem oben beschriebenen ersten
Kultivierungsschritt (a) nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren
(fed batch) kultiviert, wobei bei Verwendung des Zulaufverfahrens
mindestens ein Zusatz-Nährmedium
eingesetzt wird. In dem beschriebenen Kultivierungsschritt (b) wird
der Kultur Fermentationsbrühe
entzogen, wobei weniger als 40 Vol.-%, insbesondere weniger als
30 Vol.-%, weniger als 20 Vol.-%, bevorzugt weniger als 15 Vol.-%,
bevorzugt weniger als 10 Vol.-% und besonders bevorzugt weniger
als 5 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe abgetrennt
werden.
Anschließend, im
Schritt (c) wird die verbleibende Fermentationsbrühe mit einem
oder mehreren weiteren Nährmedien
aufgefüllt,
wobei das weitere Nährmedium
oder die weiteren Nährmedien
mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle
und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, und die Kultivierung
unter Bedingungen die die Bildung von L-Lysin erlauben, fortgesetzt
wird.
Während des
Kultivierungsschrittes (a) wird das Bakterium in mindestens einem
ersten Nährmedium inokuliert
und nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch)
kultiviert. Bei Verwendung des Zulaufverfahrens wird nach mehr als
0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis 10 Stunden, bevorzugt
nach 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt nach 3 bis 7 Stunden
ein Zusatz-Nährmedium
zugeführt.
Das
erste Nährmedium
enthält
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose,
Galaktose, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in
den Konzentrationen von 1 bis 50 g/kg, bevorzugt von 5 bis 40 g/kg,
besonders bevorzugt von 10 bis 30 g/kg. Unter Stärkehydrolysat versteht man
erfindungsgemäß das Hydrolysat
von Stärke
aus Mais, Getreide, Kartoffeln oder Tapioka.
Als
Stickstoffquelle im ersten Nährmedium
können
organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und
Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat
Kaliumnitrat, Kaliumnatriumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln
oder als Mischung in den Konzentrationen von 1 bis 50 g/kg, bevorzugt
von 3 bis 40 g/kg, besonders bevorzugt von 5 bis 30 g/kg verwendet
werden.
Als
Phosphorquelle im ersten Nährmedium
können
Phosphorsäure,
Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze, Polymere
der Phosphorsäure
oder das Hexaphosphorsäureester
des Inosits auch Phytinsäure
genannt in den Konzentrationen von 0,1 bis 5 g/kg, bevorzugt von
0,3 bis 3 g/kg, besonders bevorzugt von 0,5 bis 2,0 g/kg verwendet
werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Diese Substanzen liegen in den Konzentrationen von 0,0003 bis 15
g/kg vor. Schließlich
können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine
(z.B. Thiamin) zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können
Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Das
Zusatz-Nährmedium,
welches in einem Zulaufverfahren (fed batch) angewandt wird, enthält im allgemeinen
lediglich als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen
ausgewählt
aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Essigsäure, Ethanol und Methanol in
den Konzentrationen von 300 bis 700 g/kg, bevorzugt von 400 bis
650 g/kg, und gegebenenfalls eine anorganische Stickstoffquelle
wie z.B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat.
Alternativ können
diese und andere Komponenten auch separat zugefüttert werden.
Es
wurde gefunden, dass die Bestandteile des weiteren Nährmediums
in Form eines einzigen weiteren Nährmediums sowie in einer Vielzahl
von weiteren Nährmedien
der Kultur zugeführt
werden können.
Erfindungsgemäß wird das
weitere Nährmedium
beziehungsweise werden die weiteren Nährmedien in mindestens einem
(1) Zufütterungsstrom
oder in einer Vielzahl an Zufütterungsströmen mindestens
2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 7 oder 2 bis 5 Zufütterungsströmen der Kultur zugeführt.
Das
weitere Nährmedium
bzw. die weiteren Nährmedien
enthält/enthalten
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Maltose, Xylose, Essigsäure,
Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 20 bis 700 g/kg,
bevorzugt von 50 bis 650 g/kg.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Stickstoffquelle bestehend aus organischen, Stickstoff-haltigen
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische
Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat und/oder Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat.
Die Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 5 bis 500 g/kg,
bevorzugt von 25 bis 400 g/kg, verwendet werden.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Phosphorquelle, bestehend aus Phosphorsäure, Alkali- oder Erdalkalisalze
der Phosphorsäure,
insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat
oder die entsprechenden Natrium-haltigen
Salze, Polymere der Phosphorsäure
oder das Hexaphosphorsäureester
des Inosits auch Phytinsäure
genannt. Die Phosphorquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 0,3 bis 3 g/kg,
bevorzugt von 0,5 bis 2 g/kg verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind, in den Konzentrationen von 0,0003 bis 15
g/kg, bevorzugt in den Konzentrationen von 0,008 bis 2 g/kg. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren
(z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten
Stoffen eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel
wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Bei
Verwendung eines einzigen weiteren Nährmediums wird dieses typischerweise
in einem Zufütterungsstrom
der Kultur zugeführt.
Bei Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien werden diese in einer entsprechenden
Vielzahl an Zufütterungsströmen zugeführt. Bei
der Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien ist zu beachten, dass
diese jeweils nur eine der beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen enthalten können,
aber auch eine Mischung von den beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen.
Das
in Schritt (b) beschriebene Abtrennen der Fermentationsbrühe geschieht
in weniger als 180 Minuten, vorzugsweise in weniger als 120 Minuten,
bevorzugt in weniger als 60 Minuten, 30 Minuten, besonders bevorzugt
15 Minuten.
Wird
ein weiteres oder mehrere weitere Nährmedien wie unter Schritt
(c) beschrieben zum Auffüllen genutzt
kann dieses Auffüllen
schnellstmöglich
oder kontinuierlich erfolgen. Erfolgt das Auffüllen schnellstmöglich, geschieht
dies erfindungsgemäß in weniger
als 180 Minuten, vorzugsweise in weniger als 120 Minuten, besonders
bevorzugt in weniger als 60 Minuten, besonders bevorzugt in weniger
als 30 Minuten besonders bevorzugt 15 min. Anschließend erfolgt
die Kultivierung bis zum Verbrauch der Kohlenstoffquelle oder bis
zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt kurz vor dem vollständigen Verbrauchen
der Kohlenstoffquelle, bevor wiederum Fermentationsbrühe gemäß Schritt
(b) abgelassen wird. Erfolgt das Auffüllen kontinuierlich, so setzt man
das Auffüllen
mit einem oder mehreren weiteren Nährmedien fort, bis der Füllstand
von annähernd
100% wieder erreicht ist. Anschließend kultiviert man so lange
weiter, bis die Kohlenstoffquelle verbraucht ist.
Werden
wie unter Schritt (c) beschrieben mehrere weitere Nährmedien
zum Auffüllen
genutzt, so können
sofort alle weiteren Nährmedien
in den Fermenter gegeben werden (schnellstmögliches Auffüllen) oder ein
oder mehrere weitere Nährmedien
schnellstmöglich
zugegeben werden und anschließend
ein oder mehrere weitere Nährmedien kontinuierlich
zugeführt
werden. Erfolgt das Auffüllen
kontinuierlich, so setzt man das Auffüllen mit einem oder mehreren
weiteren Nährmedien
fort, bis der Füllstand
von annähernd
100% wieder erreicht ist. Anschließend kultiviert man so lange
weiter, bis die Kohlenstoffquelle verbraucht ist.
Die
Kultivierung in den Schritten (a) und (c) erfolgt unter Bedingungen
die die Bildung von L-Lysin erlauben. Während der Kultivierung wird
die Temperatur in einem Bereich von 28°C bis 40°C, vorzugsweise von 30°C bis 35°C, eingestellt.
Die Fermentation kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls bei Überdruck,
vorzugsweise bei 0 bis 2,5 bar Überdruck,
besonders bevorzugt bei 0 bis 1,5 bar durchgeführt werden. Der Sauerstoffpartialdruck
wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca. 20%, Luftsättigung geregelt. Die Regelung
des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 kann
mit Ammoniakgas oder 25%igem Ammoniakwasser erfolgen. Die Bedingungen
der Kultivierung können
während
der Kultivierung konstant bleiben oder verändert werden. Ebenso können die
Kultivierungsbedingungen in Schritt (a) und (c) identisch sein oder
sich unterscheiden.
Die
Wiederholung der Schritte (b) und (c) gemäß (d) erfolgt 1 bis 1000 mal,
bevorzugt 2 bis 500 mal, bevorzugt 4 bis 100 mal und besonders bevorzugt
5 bis 50 mal.
Die
Zeit zwischen Abtrennen der Fermentationsbrühe auf mehr als 60 Vol.-%,
insbesondere mehr als 70 Vol.-%, bevorzugt mehr als 80 Vol.-%, mehr
als 85 Vol.-%, bevorzugt mehr als 90 Vol.-% und besonders bevorzugt
mehr als 95 Vol.-% des Gesamtvolumens und dem vollständigen Auffüllen auf
ca. 100% beträgt
maximal 25 Stunden, bevorzugt maximal 15 Stunden, bevorzugt maximal
10 Stunden, besonders bevorzugt maximal 5 Stunden.
Starkes
Wachstum zu Beginn der Kultivierung ist normalerweise eine logarithmische
Wachstumsphase. Der logarithmischen Wachstumsphase folgt im Allgemeinen
eine Phase von geringerem Zellwachstum als in der logarithmischen
Phase.
Das
Ablassen von Fermentationsbrühe
und Auffüllen
mit Nährmedien
erfolgt mit einer Geschwindigkeit die einer mittleren Verweilzeit
von kleiner als 60 Stunden, kleiner als 55 Stunden, kleiner als
50 Stunden, kleiner 45 als Stunden, kleiner als 40 Stunden, bevorzugt
kleiner als 35 Stunden, ganz besonders bevorzugt kleiner als 30
Stunden ohne Berücksichtigung
der Ablasszeiten entspricht. Dabei ist die mittlere Verweilzeit
(residence time) die theoretische Zeit, die Teilchen in einer kontinuierlich
betriebenen Kultur verbleiben. Die mittlere Verweilzeit wird beschrieben
durch das Verhältnis
des Flüssigkeitsvolumens
des Reaktors und der Durchflussmenge (Biotechnologie; H. Weide,
J. Páca
und W. A. Knorre; Gustav Fischer Verlag Jena; 1991).
Erfindungsgemäß wird die
Konzentration der Kohlenstoffquelle über den gesamten Zeitraum des Schrittes
(b) und/oder im Fall einer vorherigen Kultivierung im Zulaufverfahren
(fed batch), auch während
der Zufuhr des Zusatz-Nährmediums,
bei maximal 10 g/l, maximal 5 g/l, bevorzugt bei maximal 3 g/l,
besonders bevorzugt maximal 1 g/l eingestellt. Dabei wird die Konzentration
der Kohlenstoffquelle anhand von Methoden bestimmt, die Stand der
Technik sind. β-D-Glukose
wird z.B. in einem Glukoseanalysator YSI 02700 Select der Firma
Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt.
Gegebenenfalls
kann die entnommene Kulturbrühe
mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas versehen werden
bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter 2 g/l; unter 1
g/l; oder unter 0,5 g/l sinkt.
Erfindungsgemäß beträgt die Ausbeute
(YP/S) mindestens 43 Gew.-%; mindestens
45 Gew.-%; mindestens 48 Gew.-%; mindestens 50 Gew.-%; mindestens
52 Gew.-% betragen. Dabei ist die Ausbeute YP/S definiert
als das Verhältnis
von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Menge an L-Lysin
zu der Gesamtmenge der eingesetzten oder verbrauchten Kohlenstoffquelle.
Erfindungsgemäß wird L-Lysin
mit einer Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) von mindestens 2,5 g/l, bevorzugt mindestens
3,5 g/l, insbesondere von mindestens 2,5 bis 3,0 g/l pro Std., von
mindestens 3,0 bis mehr als 4,0 g/l pro Std., von mindestens 4,0
bis 5,0 g/l pro Std., oder von mindestens 5,0 bis 8,0, g/l oder
mehr pro Std. gebildet. Dabei ist die Raum-Zeit-Ausbeute definiert
als das Verhältnis
von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten L-Lysinmenge zu
dem aktiv produzierenden Volumen der Kultur über den gesamten Zeitraum der
Kultivierung gesehen. Die Raum–Zeit-Ausbeute
wird auch volumetrische Produktivität genannt.
Erfindungsgemäß beträgt die L-Lysin
Konzentration (c), bezogen auf Lysin-HCL, in der abgeführten Fermentationsbrühe mindestens
100 g/l, mindestens 110 g/l, mindestens 120 g/l, bevorzugt mehr
als 130 g/l, besonders bevorzugt mehr als 140 g/l.
Bei
der fermentativen Herstellung von L-Lysin wird versucht, ein Optimum
in Abhängigkeit
von den drei Leistungsmerkmalen Ausbeute, Produktivität und Produktkonzentration
zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Ein solches Optimum kann durch
einen Leistungs-Index (LI), der sich aus dem Produkt von Raum-Zeit-Ausbeute
(RZA), Ausbeute (YP/S) und L-Lysin Konzentration
(c), bezogen auf Lysin-HCl, zusammensetzt (LI [g2/(l2*h)] = RZA [g/l*h] YP/S [w/w]*c
[g/l]) beschrieben werden. Es sollte beachtet werden, das der erfindungsgemäße Leistungs-Index
sich auf den gesamten Zeitraum des Schrittes (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
bezieht. Erfindungsgemäß erreicht
der Leistungs-Index, bezogen auf das erfindungsgemäße Verfahren, wenigstens
130 g2/(l2*h), wenigstens
140 g2/(l2*h), wenigstens
150 g2/(l2*h), wenigstens
160 g2/(l2*h), wenigstens
170 g2/(l2*h), wenigstens
190 g2/(l2*h), wenigstens
210 g2/(l2*h), wenigstens
230 g2/(l2*h), wenigstens
250 g2/(l2*h).
Um
dem Anspruch des Leistungs-Index gerecht zu werden, ist während der
Fermentation nicht nur ein ausreichender Sauerstoffpartialdruck
zu gewährleisten,
sondern zudem eine ausreichende biologische Aktivität der Zellen.
Zur Gewährleistung
der biologischen Aktivität,
ist das Verfahren gemäß Anspruch
1 dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt b) eingestellte Sauerstoff-Aufnahme-Rate
(Oxygen Uptake Rate, OUR) maximal 350 mmol/(l*h), maximal 325 mmol/(l*h),
maximal 300 mmol/(l*h), maximal 275 mmol/(l*h), maximal 250 mmol/(l*h),
maximal 225 mmol/(l*h), maximal 200 mmol/(l*h), maximal 175 mmol/(l*h),
maximal 150 mmol/(l*h) beträgt.
Die Sauerstoff-Aufnahme-Rate OUR bezeichnet dabei die spezifische
Sauerstoffabsorptionsgeschwindigkeit durch die Mikroorganismen in
mmol O2 je Liter Fermentationsbrühe und Stunde
(Biotechnologie; D. Schlee und H.-P. Kleber, Gustav Fischer Verlag
Jena; 1991).
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird abzüglich
der Ablasszeiten, in wenigstens 100 Stunden vorzugsweise mehr als
150 Stunden, insbesondere mehr als 200 Stunden, bevorzugt mehr als
250 Stunden, besonders bevorzugt mehr als 300 Stunden betrieben.
Dabei wird das Volumen der Kultur mindestens 0,5 Mal, mindestens
1 Mal, mindestens 2 Mal, mindestens 4 Mal, mindestens 6 Mal, mindestens
8 Mal, mindestens 10 Mal, mindestens 12 Mal, mindestens 20 Mal ausgetauscht.
Die
beschriebenen Ströme
an ersten Nährmedien
und weiteren Nährmedien
oder die Summe der Ströme
an ersten Nährmedien
und weiteren Nährmedien
enthalten komplexe Bestandteile. Als komplexe Bestandteile werden
Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bezeichnet, die in der eingesetzten
Form eine Reinheit von weniger als 95% aufweisen. Bei einem solchen
komplexen Bestandteil handelt es sich um eine oder mehrere Verbindungen
aus der Gruppe Peptone, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte,
Maisquellwasser und Sojabohnenmehl. Erfindungsgemäß beträgt der Anteil
an komplexen Bestandteilen in den eingesetzten Nährmedien weniger als 10 Gew.-%,
weniger als 5 Gew.-%, weniger als 2,5 Gew.-%, weniger als 1,0 Gew.-%, weniger
als 0,5 Gew.-%.
Erfindungsgemäß beträgt die Osmolarität der abgeführten L-Lysin haltigen Fermentationsbrühe weniger
als 2100 mosm/l, besser weniger 1800 mosm/l, insbesondere weniger
1500 mosm/l, bevorzugt weniger 1200 mosm/l. Als Osmolarität wird die
Konzentration osmotisch wirksamer Teilchen in 1 Liter Flüssigvolumen bezeichnet.
Zum Beispiel entspricht eine 1 molare Glucoselösung 1000 mosm/l (Biotechnologie;
H. Weide, J. Páca
und W. A. Knorre; Gustav Fischer Verlag Jena; 1991).
Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium
geeignet. Bei den coryneformen Bakterien handelt es sich insbesondere
um die Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung Corynebacterium
sind insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum und weiterhin
die Arten Brevibacterium flavum und Corynebacterium thermoaminogenes
zu nennen. Diese sind in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Lysin zu
produzieren. Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser
Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und Kroppenstedt
(Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)) und in der
US-A-5,250,434 .
Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium efficiens DSM44547
Corynebacterium
efficiens DSM44548
Corynebacterium efficiens DSM44549
Brevibacterium
flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und
Brevibacterium
divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, L-Lysin produzierende
Stämme.
Die
coryneformen Bakterien enthalten mindestens eine Kopie eines lysC-Gens
oder Allels, das für eine
Aspartatkinase kodiert, die gegenüber der Hemmung von Lysin oder
Mischungen von Lysin und Threonin insensitiv sind (lysCfbr).
Derartige Bakterien sind typischerweise resistent gegen das Lysinanalogon
S-(2-Aminoethyl)-Cystein (AEC).
Des
weiteren sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet,
die ein oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe lysC-Allel
(lysC
fbr), hom-Allel (hom
leaky),
zwf-Allel, kodierend für
eine NADPH-insensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, und das
für die
Pyruvat-Carboxylase
kodierende pyc-Allel. Das pyc Allel ist in
EP 1 108 790 beschrieben.
Ebenfalls
sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die eine
oder mehrere Resistenzen ausgewählt
aus der Gruppe Azauracilr (Azar),
Rifamycinr (Rifr),
Streptomycinr (Strepr),
besitzen.
Weiterhin
sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die mindestens
folgende Eigenschaften umfassen: zwei (2) Kopien eines LysC-Allels,
das für
eine Lysin resistente Aspartatkinase kodiert (lysCfbr),
ein hom-Allel, das für
eine abgeschwächte
Homoserin-Dehydrogenase kodiert (homleaky)
und zwei (2) Kopien eines zwf-Allels, das für eine NADPH-insensitive Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
kodiert.
Des
weiteren sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet,
die eine oder mehrere der Eigenschaften ausgewählt aus der Gruppe drei (3),
vier (4), oder fünf
(5) Kopien eines lysC-Allels (lysCfbr),
zwei (2) Kopien eines lysE-Gens, zwei (2) Kopien eines zwa1-Gens,
enthalten.
Darüber hinaus
sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die sensitiv
gegenüber Diaminopimelinsäure-Analoga
sind. Unter dem Begriff Diaminopimelinsäure-Analoga werden nach der
vorliegenden Erfindung Verbindungen wie 4-Fluoro-Diaminopimelinsäure, 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, 4-Oxo-Diaminopimelinsäure oder
2,4,6-Triaminopimelinsäure
zusammengefasst.
Zur
Erzeugung der erfindungsgemäßen gegen
4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitiven
coryneformen Bakterien, werden Mutagenesemethoden verwendet. Für die Mutagenese
können
klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener
Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin
oder ultraviolettes Licht (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial
Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli
and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, 1992) verwendet werden.
Die
coryneformen Bakterien, die sensitiv gegenüber 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sind,
können durch
Ausplattieren auf 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure haltigen Nährmediumsplatten
identifiziert werden. Hierzu eignen sich in besonderem Maße Endkonzentrationen
von ca. 5 bis 15 g/l. beispielsweise ca. 10 g/l 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure im Nährmedium.
Bei dieser Konzentration können
4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive
Mutanten von den unveränderten
Elternstämmen
durch ein verlangsamtes Wachstum unterschieden werden. Nach erfolgter
Selektion zeigen die 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive Mutanten eine verbesserte
L-Lysinproduktion.
Für das beschriebene
Verfahren sind entsprechend stabile Stämme, die ihre Produktionseigenschaften
im Laufe des Verfahrens nicht verlieren, besonders geeignet.
Die
gezielte Veränderung
von Stammeigenschaften coryneformer Bakterien, der Zusammensetzung der
Nährmedien
und die Art der Prozessführung
haben alle zum Ziel, die eingesetzte Kohlenstoffquelle möglichst
effektiv in L-Lysin umzuwandeln. Dafür ist es notwendig, dass der
Kohlenstoff möglichst
ohne verbrauchende Nebenreaktionen und weitestgehend ungehindert
durch den Zellstoffwechsel in Richtung L-Lysin Synthese fließt.
Neben
der genauen Kenntnis des zellulären
Stoffwechsels ist für
eine modellbasierte Verbesserung des Stammes und des Produktionsprozesses
eine Stoffflussanalyse notwendig, bei der durch Einsatz von zum Beispiel 13C markiertem Substrat der Kohlenstofffluss
durch den Stoffwechsel nachvollzogen werden kann und die Flussverhältnisse
an Verzweigungen in Form von relativen Flüssen bestimmt werden können (Bioreaktionstechnik:
Bioprozesse mit Mikroorganismen und Zellen: Prozessüberwachung;
K. Schügerl;
Birkhäuser
Verlag Basel – Bosten – Berlin;
1997). Der Kohlenstofffluss ist definiert als das Verhältnis der
auf Kohlenstoff bezogenen molaren Raten einer im Stoffwechsel stattfindenden
Einzelreaktion oder Reaktionsfolge zu der Kohlenstoffaufnahme. Wird
für die
Markierung eine 13C-Verbindung verwendet, ist die Bestimmung
der Verteilung der markierten Atome in den verschiedenen Metaboliten
beispielsweise mittels Kern-Resonanz-Spektroskopie (NMR) möglich.
Erfindungsgemäß besitzen
die L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien die Fähigkeit,
den Kohlenstofffluss durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg mit
einem prozentualen Anteil von mehr als 75%, mehr als 85%, mehr als
95%, mehr als 105%, mehr als 115%, mehr als 125%, mehr als 135%,
mehr als 145%, zu lenken.
Weiterhin
besitzen die L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien die Fähigkeit
besitzen, den Kohlenstofffluss durch den Tricarbonsäurezyklus,
bezogen auf die Acetyl-Reste,
die von Acetyl-CoA auf Oxalacetat durch die Citratsynthase Reaktion übertragen
werden, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 1% höchstens
jedoch 20%, mindestens 2% höchstens
jedoch 18%, mindestens 3% höchstens
jedoch 16% zu lenken.
Der
Tricarbonsäurezyklus
dient neben der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten auch zur Synthese
von Verbindungen, die wesentliche Vorstufen der Aminosäuresynthesewege
sind. Oxalacetat dient beispielsweise als eine Vorstufe der Lysinsynthese.
Die Entnahme dieser Vorstufen aus dem Tricarbonsäurezyklus wird durch Auffüllreaktionen,
so genannte anaplerotische Reaktionen kompensiert. Je nach Art der
Kohlenstoffquelle, Wachstumsrate und Produktbildung der coryneformen
Bakterien können
diese Reaktionen vorwärts
oder rückwärts ablaufen.
Vorwärts
bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Kohlenstofffluss von der
Glykolyse in Richtung Tricarbonsäurezyklus
erfolgt (z.B. vom Pyruvat zum Oxalacetat und/oder vom Phosphoenolpyruvat
zum Oxalacetat). Rückwärts bedeutet
in diesem Zusammenhang, dass der Kohlenstofffluss vom Tricarbonsäurezyklus
in Richtung Glykolyse verläuft
(z.B. vom Oxalacetat zum Pyruvat). Die Flüsse können dabei gleichzeitig in
beide Richtungen verlaufen. Die Summe aller vorwärts und rückwärts gerichteten Flüsse bezeichnet
man als Nettofluss. Ist der Nettofluss vorwärts gerichtet (also von der
Glykolyse zum Tricarbonsäurezyklus),
erhält
er ein positives Vorzeichen, ist er rückwärts gerichtet, erhält er ein
negatives Vorzeichen. Lysin produzierende coryneforme Bakterien
besitzen im Allgemeinen die Fähigkeit,
den Kohlenstoff durch die anaplerotischen Reaktionen von der Glykolyse
in Richtung Tricarbonsäurezyklus
zu lenken.
Besonders
geeignet sind erfindungsgemäß L-Lysin
produzierende coryneforme Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, den Kohlenstofffluss
durch die anaplerotischen Reaktionen, bezogen auf die Summe an Pyruvat
und Phosphoenolpyruvat (PEP), die durch die PEP- bzw. Pyruvatcarboxylase,
kodiert durch ppc bzw. pyc, in Oxalacetat umgewandelt werden, mit
einem prozentualen Anteil von mehr als 19%, mehr als 23%, mehr als
26%, mehr als 28%, mehr als 30%, mehr als 33%, mehr als 35%, mehr
als 37% zu lenken. Dies entspricht definitionsgemäß einem
Nettofluss durch die anaplerotischen Reaktionen von mehr als 19%,
mehr als 23%, mehr als 26%, mehr als 28%, mehr als 30%, mehr als
33%, mehr als 35%, mehr als 37%.
Erfindungsgemäß besonders
geeignet sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien, die die
Fähigkeit
besitzen, den Kohlenstofffluss durch die Aspartatkinase, kodiert
durch lysC, mit einem prozentualen Anteil von mindestens 28% höchstens
jedoch 60%, mindestens 30% höchstens
jedoch 57%, mindestens 32% höchstens
jedoch 53%, mindestens 33% höchstens
jedoch 50% zu lenken.
Weiterhin
sind erfindungsgemäß L-Lysin
produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die die Fähigkeit
besitzen den Kohlenstofffluss durch die Diaminopimelatdehydrogenase,
kodiert durch ddh, mit einem prozentualen Anteil von mindestens
49% höchstens
jedoch 98%, mindestens 53% höchstens
jedoch 95%, mindestens 56% höchstens
jedoch 91%, mindestens 58% höchstens
jedoch 87% zu lenken.
Erfindungsgemäß besitzen
die L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien die Fähigkeit,
ein Verhältnis
des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphat-Weg zu dem Kohlenstofffluss
durch die anaplerotischen Reaktionen (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg
[%]/anaplerotische Reaktionen [%] = PPP/Ana [-]) von mindestens
3,4 höchstens
jedoch 4,6, mindestens 3,5 höchstens
jedoch 4,5, mindestens 3,6 höchstens
jedoch 4,4, mindestens 3,7 höchstens
jedoch 4,3 einzustellen.
Weiterhin
sind L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien geeignet, die die
Fähigkeit
besitzen, ein Verhältnis
des Kohlenstoffflusses durch den oxidativen Pentose-Phosphatweg
zu dem Kohlenstofffluss in den Tricarbonsäurezyklus (oxidativer Pentose-Phosphat-Weg
[%]/Tricarbonsäurezyklus
[%] = PPP/TCA [-]) von mindestens 7 höchstens jedoch 150, mindestens
10 höchstens
jedoch 125, mindestens 13 höchstens
jedoch 100, oder mindestens 16 höchstens
jedoch 75 einzustellen.
Die
abgeführte,
L-Lysin haltige Fermentationsbrühe
aus dem erfindungsgemäßen Verfahren
besitzt einen Feststoffgehalt von mindestens 10 Gew.-%, mindestens
12,5 Gew.-%, mindestens 15 Gew.-%, mindestens 17,5 Gew.-%.
Das
produzierte L-Lysin kann anschließend aus der Fermentationsbrühe gereinigt
werden. Zur Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden
wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung
oder eine Kombination hieraus eingesetzt. Die L-Lysin haltige Brühe wird anschließend mit
bekannten Methoden wie beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie,
Ionenausschlusschromatographie, Extraktion, Kristallisation, Fällung oder
einer Kombination hieraus aufgereinigt.
Alternativ
hierzu kann die abgeführte
L-Lysin haltige Fermentationsbrühe
auch entwässert
werden. Hierzu wird Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden wie beispielsweise
mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers,
durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder einer Kombination
hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert. Das Wasser wird
hierbei zu 10% bis 90% entfernt.
Zur
verbesserten Konservierung des L-Lysin haltigen Flüssigprodukts
kann durch Zugabe von Säure oder
Lauge der pH-Wert in den sauren (pH 2 bis 5) oder alkalischen (pH
9 bis 12) Bereich verändert
werden.
Es
ist ebenfalls möglich,
aus der entnommenen Fermentationsbrühe ein Produkt herzustellen,
indem man die in der Kulturbrühe
enthaltene Biomasse des Bakteriums vollständig (100%) oder nahezu vollständig d.h.
mehr als oder größer als
(>) 90%, > 95%, > 97%, > 99% entfernt und die übrigen Bestandteile
der Fermentationsbrühe
weitgehend d.h. zu 30%–100%,
40%–100%,
50%–100%,
60%–100%,
70%–100%, 80%–100%, oder
90%–100%,
bevorzugt größer gleich
(≥)50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% oder ≥ 95% oder auch
vollständig
(100%) im Produkt belässt.
Zur
Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden
wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung
oder eine Kombination hieraus eingesetzt.
Die
erhaltene Brühe
wird anschließend
mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,
Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder
einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert.
Das Wasser wird hierbei zu 10% bis 90% entfernt.
Weiterhin
kann aufkonzentrierte Brühe
anschließend
durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen
Pulver aufgearbeitet werden. Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann
dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren
in ein grobkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Das Wasser wird
hierbei dann zu insgesamt mehr als 90% entfernt, sodass der Wassergehalt
im Produkt kleiner als 10%, kleiner als 5% beträgt.
Die
angegebenen Verfahrensschritte müssen
nicht notwendigerweise in der hier aufgeführten Reihenfolge durchgeführt sondern
können
gegebenenfalls in technisch sinnvoller Weise kombiniert werden.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zeichnet sich gegenüber
dem üblichen
fed batch-Verfahren, vor allem durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute aus.
Vorzugsweise
wird aus der Fermentationsbrühe
durch Entfernen von Wasser ein L-Lysin enthaltenes Produkt folgender
Zusammensetzung gewonnen:
Lysin | 35–80 Gew.-% |
Protein | max.
7 Gew.-% |
Karbonsäuren | max.
7 Gew.-% |
Gesamtzucker | max.
9 Gew.-% |
Fette
und Öle | max.
5 Gew.-% |
Mineralstoffe | 3–30 Gew.-% |
Erfindungsgemäß hat dieses
L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung einen Wassergehalt von
mindestens 0,5 Gew.-%, jedoch höchstens
5,0 Gew.-%.
Weiterhin
sollte zur Herstellung des Lysin enthaltenden Produkts die abgeführte Fermentationsbrühe folgende
Nebenproduktkonzentrationen einhalten. Eine Trehalose Konzentration
von kleiner gleich (≤)
10 g/l, ≤ 5,0
g/l, ≤ 2,0
g/l, ≤ 0,5
g/l. Eine L-Alanin Konzentration von ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,5 g/l, ≤ 1,0 g/l, ≤ 0,25 g/l. Eine L-Valin Konzentration
von ≤ 5,0
g/l, ≤ 2,5
g/l, ≤ 1,0
g/l, ≤ 0,25
g/l. Eine L-Glutamat Konzentration von ≤ 7,5 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Ethanol Konzentration
von ≤ 8,0
g/l, ≤ 4,0
g/l, ≤ 2,0
g/l, ≤ 0,5
g/l. Eine Laktat Konzentration von ≤ 8,0 g/l, ≤ 4,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Ketoglutarat Konzentration
von ≤ 10
g/l, ≤ 5,0
g/l, ≤ 2,0
g/l, ≤ 0,5
g/l. Eine Succinat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l. Eine Malat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l,≤ 0,5 g/l.
Eine Oxalacetat Konzentration von ≤10
g/l, ≤ 5,0
g/l, ≤ 2,0
g/l, ≤ 0,5 g/l.
Eine Acetat Konzentration von ≤ 10
g/l, ≤ 5,0
g/l, ≤ 2,0
g/l, ≤ 0,5
g/l. Eine Pyruvat Konzentration von ≤ 10 g/l, ≤ 5,0 g/l, ≤ 2,0 g/l, ≤ 0,5 g/l.
Erfindungsgemäß wird für die Herstellung
eines L-Lysin enthaltenden Produkts bevorzugt, dass die L-Lysin
haltige Fermentationsbrühe
eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von maximal 5,0%, bevorzugt maximal
4,0%, 3,0%, 2,5%, 2,0%, besonders bevorzugt maximal 1,5%, 1,0% oder
0,5% besitzt. Es ist besonders wünschenswert,
dass die L-Lysin haltige Fermentationsbrühe eine Gesamt-Nebenproduktkonzentration von
kleiner als 0,5% besitzt.
Erfindungsgemäß besitzt
das L-Lysin enthaltende Produkt nach der Entwässerung und anschließender Granulation
eine mittlere Partikelgröße von > 0,1 bis 1,0 mm, bevorzugt
in einer Menge von mehr als 97%, insbesondere mehr als 98%.
Weiterhin
besitzt das L-Lysin enthaltende Produkt nach Entwässerung
und Granulation eine Schüttgutdichte
von mindestens 600 kg/m3, bevorzugt 650
kg/m3, insbesondere 700 kg/m3,
bevorzugt jedoch größer als
750 kg/m3.
Wie
in US Patent Application Serial No. 10/319,843 beschrieben, kann
das L-Lysin enthaltenden Produkt nach Entwässerung und Granulation ein
Additiv zugesetzt werden, um die Eigenschaften des Produktes zu
verbessern. Der Anteil an zugesetztem Additiv, insbesondere Öl, sollte
dabei 0,02–2,0
Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des L-Lysin enthaltenen Produktes, an der
Oberfläche
betragen.
Erfindungsgemäß enthält das L-Lysin
enthaltende Produkt als Additiv eines oder mehrere der Öle, ausgewählt aus
der Gruppe Mineralöl,
pflanzliche Öle,
Sojaöl,
Olivenöl,
Soja/Lecithin-Gemische, Speiseöle, Mischungen
pflanzlicher Öle
an der Oberfläche.
Empfehlenswert
ist in jedem Fall, dass das L-Lysin enthaltende Produkt nach der
Entwässerung
und Granulation einen Laktatanteil von ≤ 3 Gew.-%, ≤ 2 Gew.-%, ≤ 1 Gew.-%, ≤ 0,5 Gew.-%, ≤ 0,1 Gew.-% besitzt.
Die
Analyse von L-Lysin und anderen Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit
anschliefßender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical
Chemistry 30: 1190–1206
(1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen,
so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979))
beschrieben.