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Die
Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einem Detektor zur Non-Descan-Detektion
des von einer Probe ausgehenden Detektionslichtes und mit einem
Lichtleiter, der das Detektionslicht dem Detektor zuführt.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions-
oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles
wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel
in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird
beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt.
Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in
Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein
konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese
Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so daß man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahles
zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales
Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt. Kommerzielle Scanmikroskope
bestehen meist aus einem Scanmodul, dass an das Stativ eines klassischen
Lichtmikroskops angeflanscht wird, wobei das Scanmodul alle genannten zur
Abrasterung einer Probe zusätzlich
nötigen
Elemente beinhaltet.
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In
der konfokalen Scanmikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung
(oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden,
da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte
und damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die
naturgemäß im Fokus
viel höher
ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht
stammt daher mit großer
Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil
aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen
aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen
mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.
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Insbesondere
vor dem Hintergrund einer ohnehin geringen Ausbeute an Fluoreszenzphotonen bei
Zweiphotonenanregung ist eine Non-Descan-Anordnung, bei der das Detektionslicht
nicht über
die Strahlablenkeinrichtung (Descan-Anordnung) und den Strahlteiler
zur Beleuchtungslichteinkopplung zum Detektor gelangt, sondern direkt
nach dem Objektiv mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers ausgelenkt
und detektiert wird, interessant; denn im Allgemeinen geht auf diesem
Detektionslichtweg weniger Licht verloren. Außerdem tragen bei der Zweiphotonenanregung
mit Descan-Detektion gestreute Anteile des Detektionslichtes Wesentlich
zum Signal bei, was bei Non-Descan-Detektion nur in wesentlich verringertem
Maße eine
Rolle spielt. Anordnungen dieser Art sind beispielsweise aus der
Veröffentlichung
von David. W. Piston et al. „Two-photon-excitation
fluorecence imaging of three dimensional calcium-ion activity", Applied Optics,
Vol. 33, No. 4, Feb 1996, und aus Piston et al: „Time-Resolved Fluorecence
Imaging and Background Rejection by Two-Photon Excitation in Laser
Scanning Microscopy",
SPIE Vol. 1640 bekannt.
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Aus
der U.S.-Patentschrift
US
6,169,289 B1 ist ein Mikroskop mit Mehrphotonenanregung
bekannt, bei dem das von der Probe ausgehende Detektionslicht kondensorseitig
detektiert wird.
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Aus
der Offenlegungsschrift
DE
100 04 233 A1 ist ein Mikroskopaufbau bekannt, bei dem
das Licht der Descan-Detektion und der Non-Descan-Detektion optisch überlagerbar
ist. Das Non-Descan-Detektionslicht wird hierbei von einem Kondensor
gesammelt und nach Durchlaufen eines verwinkelten Strahlenganges
mit einer Einkoppeloptik in eine Lichtleitfaser eingekoppelt, die
das Non-Descan-Detektionslicht einem Detektor zuführt.
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Ein
Problem der bekannten Anordnungen zur Non-Descan-Detektion besteht
darin, dass die Sammeloptik – insbesondere
der Kondensor und nachführende
Strahlführungsoptik – viel Bauraum beansprucht,
so dass dieser oft nicht in gängigen
Mikroskopstativen – besonders
nachteilig: nicht im Fußteil
der Mikroskopstative – untergebracht
werden kann. Oft sind massive bauliche Veränderungen des Scanmikroskops
und insbesondere des Mikroskopstativs erforderlich, um eine Non-Descan-Detektion zu
realisieren, wobei oft aus Gründen
des beschränkten
Bauraumes auf eine Detektionsanordnung mit einer Vielzahl von Detektionskanälen verzichtet
werden muss.
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Aus
dem Gebrauchsmuster
DE 202 06
153 .1 ist ein Scanmikroskop mit einem Mikroskopstativ bekannt,
das anstelle eines Strahlteilers zur Auskopplung des Non-Descan-Detektionslichts
aus dem Strahlengang des Mikroskops ein Bauernfeindprisma verwendet.
Hierdurch ist der Platzbedarf für
das Auskoppelelement etwas reduziert. Das Platzproblem insgesamt
wird mit dieser Anordnung jedoch nur ansatzweise beseitigt, insbesondere
da allein der Kondensor nach wie vor einen enormen Bauraum beansprucht.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Rastermikroskop
anzugeben, das das Non-Descan-Detektionslicht bei geringer Bauraumbeanspruchung
dem Detektor zuführt.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass das Einkoppelende des Lichtleiters weitgehend unmittelbar
im Bereich der Probe angeordnet ist.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass das Non-Descan-Detektionslicht mit
dem Lichtleiter weitgehend direkt aus der Nähe des Präparats weggeleitet und dem
Non-Descan-Detektor zugeführt
werden kann. Hierbei kommen die Vorteile des flexiblen biegsamen
und beliebig lang ausführbaren
Lichtleiters voll zum tragen. Insbesondere ist der zur Verfügung stehende
Bauraum nun nicht mehr ausschlaggebend für die Auswahl und die Ausgestaltung
der zur verwendeten Detektoren. Mit dem Lichtleiter kann das Non-Descan-Detektionslicht
ausreichend weit vom Mikroskopstativ weggeleitet werden, um jeden
beliebigen Detektor verwenden zu können. Insbesondere ist hierdurch
die Verwendung von mehrkanaligen Detektoren, wie beispielsweise
Multibanddetektoren einfach realisierbar. Erfindungsgemäß ist zur Non-Descan-Detektion
ein Kondensor nicht mehr erforderlich, so dass hierdurch ein enormer
Bauraum eingespart wird.
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Üblicherweise
ist die Probe auf einem Probenträgerglas
angeordnet. Der Lichtleiter ist in einer bevorzugten Ausgestaltung
optisch direkt an das Probenträgerglas
angekoppelt. Dies kann beispielsweise dadurch realisiert sein, dass
das Einkoppelende des Lichtleiters unmittelbar dem Probenträgerglas angeordnet
ist. Vorzugsweise ist zwischen dem Probenträgerglas und dem Lichtleiter
zur optischen Ankopplung Immersionsöl eingefügt.
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Als
Koppelelement zwischen der Probe und dem Lichtleiter ist in einer
anderen Variante ein Prisma, das beispielsweise als Bauernfeindprisma
ausgeführt
sein kann, vorgesehen. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Koppelelement
eine Linse oder eine diffraktive Optik. Insgesamt ist unabhängig von
der Wahl des Koppelelements vorteilhafter Weise ein aufwendiger
und komplizierter Strahlengang vermieden und damit die Gefahr des
Verlusts an Non-Descan-Detektionslicht reduziert.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltungsform sind Justierelemente vorgesehen,
mit denen die räumliche
Lage und/oder die Ausrichtung des Einkoppelendes des Lichtleiters
einstellbar ist. Mit Hilfe der Justierelemente kann die Anordnung
des Einkoppelendes der Lichtleitfaser beispielsweise im Bezug auf
eine hohe Detektionseffizienz optimiert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführung
weist der Lichtleiter einen Kerndurchmesser auf, der größer als 2
mm ist. Vorzugsweise liegt der Kerndurchmesser im Bereich von 3
bis 7 mm. In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform
beträgt
der Kerndurchmesser ca. 5 mm. Insgesamt sollte der Lichtleiter einen
möglichst
großen
Kerndurchmesser aufweisen.
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Ganz
besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der der Lichtleiter als
Flüssiglichtleiter
ausgebildet ist.
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Vorzugsweise
weist das Einkoppelende und/oder das Auskoppelende des Lichtleiters
eine Antireflexbeschichtung auf, was die Detektionseffizienz erhöht.
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Um
zu gewährleisten,
dass ausschließlich Detektionslicht
und kein Beleuchtungslicht zu den Detektoren gelangt, ist in einer
bevorzugten Ausführungsform
ein Sperrfilter vorgesehen, der beispielsweise am Einkoppel- und/oder am Auskoppelende des
Lichtleiters angeordnet sein kann. Vorzugsweise ist der Sperrfilter
als dielektrischer Filter auf das Einkoppel- oder das Auskoppelende des Lichtleiters
direkt aufgebracht.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsvariante des Rastermikroskops
ist ein Umschaltmechanismus vorgesehen, mit dem wahlweise das Einkoppelende
des Lichtleiters zur Non-Descan-Detektion oder ein Kondensor zur
konventionellen Durchlichtdetektion in den Strahlengang einbringbar
ist. Der Umschaltmechanismus kann beispielsweise als Revolverumschaltung
oder als Schwenkumschaltung ausgebildet sein.
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Als
Detektor kann beispielsweise ein einzelner Photomultiplier oder
eine Anordnung von mehreren Photomultipliern denen Detektionslicht
unterschiedlicher Detektionswellenlängen mit Hilfe von dichroitischen
Strahlteilern zugeordnet wird, oder beispielsweise ein Multibanddetektor
vorgesehen sein. In einer bevorzugten Variante ist der Detektor
unmittelbar optisch an das Auskoppelende des Lichtleiters gekoppelt.
Für diese "Head-On-Anordnung" ist vorzugsweise
ein weiteres Koppelelement zwischen dem Lichtleiter und dem Detektor
vorgesehen.
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In
einer bevorzugten Variante ist das Rastermikroskop als konfokales
Rastermikroskop ausgebildet.
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich
wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei
zeigen:
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1 eine bekannte Anordnung
zur Non-Descan-Detektion mit einem Rastermikroskop,
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2 einen Teil eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
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3 eine Variante des erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
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4 eine weitere Variante
des erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
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5 eine weitere Variante
des erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
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1 zeigt eine aus dem Stand
der Technik bekannte Anordnung zur Non-Descan-Detektion mit einem Rastermikroskop.
Das Beleuchtungslicht 1 wird mit Hilfe einer nicht gezeigten
Strahlablenkeinrichtung durch das Objektiv 3 über bzw.
durch die 5 geführt,
die auf einem Probenträgerglas 7 angeordnet
ist. Das von der Probe ausgehende Non-Descan-Detektionslicht 9 wird
von einem Kondensor 11 gesammelt und zu einem Non-Descan-Detektionslichtstrahl 13 geformt.
Dieser wird mit Hilfe eines in den Strahlengang einfügbaren Klappspiegels 15 über die
Strahlformungslinsen 17 und 19 dem Detektor 21 zugeführt. Zur
besseren Orientierung ist die Durchlichtbeleuchtungsachse 23 eingezeichnet.
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2 zeigt einen Teil einen
erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
bei dem das Non-Descan-Detektionslicht mit Hilfe eines Lichtleiters 23, dessen
Einkoppelende weitgehend unmittelbar im Bereich der Probe angeordnet
ist, zum Detektor 21 geleitet wird. Das Einkoppelende 25 des
Lichtleiters 23 ist mit Hilfe von Immersionsöl 27 unmittelbar
an das die Probe 5 tragende Probenträgerglas 7 optisch angekoppelt.
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3 zeigt eine erfindungsgemäße Variante des
Rastermikroskops, bei der die Ankopplung des Lichtleiters 23 an
das Probenträgerglas 7 mit
einem Koppelelement 29, das als Prisma 31 ausgeführt ist, realisiert
ist. Das Auskoppelende 33 des Lichtleiters 23 ist
unmittelbar an den Detektor 21 optisch angekoppelt.
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4 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Variante,
bei der als Koppelelement 29 eine Linse 35 vorgesehen
ist.
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In
der in 5 gezeigten Ausgestaltungsform
ist als Koppelelement 29 eine Kombination aus einer Linse 35 und
einer diffraktiven Optik 37 vorgesehen.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Beleuchtungslicht
- 3
- Objektiv
- 5
- Probe
- 7
- Probenträgerglas
- 9
- Detektionslicht
- 11
- Kondensor
- 13
- Detektionslichtstrahl
- 15
- Klappspiegels
- 17
- Strahlformungslinse
- 19
- Strahlformungslinse
- 21
- Detektor
- 23
- Durchlichtbeleuchtungsachse
- 25
- Einkoppelende
- 27
- Immersionsöl
- 29
- Koppelelement
- 31
- Prisma
- 33
- Auskoppelende
- 35
- Linse
- 37
- diffraktive
Optik