DE10295684T9 - Verfahren zum spezifischen Hemmen von Histon-Deacetylase-4 - Google Patents

Verfahren zum spezifischen Hemmen von Histon-Deacetylase-4 Download PDF

Info

Publication number
DE10295684T9
DE10295684T9 DE10295684T DE10295684T DE10295684T9 DE 10295684 T9 DE10295684 T9 DE 10295684T9 DE 10295684 T DE10295684 T DE 10295684T DE 10295684 T DE10295684 T DE 10295684T DE 10295684 T9 DE10295684 T9 DE 10295684T9
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hdac
optionally
cell
substituted
alkylene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE10295684T
Other languages
English (en)
Other versions
DE10295684T1 (de
Inventor
Jeffrey M. Besterman
Claire Montreal Bonfils
Soon Hyung Beaconsfield Woo
Arkadii Kirkland Vaisburg
Daniel St-Lazara Delorme
Marielle Lasalle Fournel
Rico Hemden Lavoie
Zuomei Kirkland Li
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Methylgene Inc
Original Assignee
Methylgene Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Methylgene Inc filed Critical Methylgene Inc
Publication of DE10295684T1 publication Critical patent/DE10295684T1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE10295684T9 publication Critical patent/DE10295684T9/de
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4418—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having a carbocyclic group directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cyproheptadine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01098—Histone deacetylase (3.5.1.98), i.e. sirtuin deacetylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, wodurch HDAC-4-Aktivität gehemmt wird.

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Molekularbiobiologie und Medizin. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gebiete der Genexpression und Onkologie.
  • Zusammenfassung des Standes der Technik
  • Bei Chromatin handelt es sich um einen Komplex aus Proteinen und DNA in den Nucleinen von Eukaryoten. Chromatinproteine stellen für Nuclein-DNA strukturelle und funktionelle Organisation bereit. Bei dem Nucleosom handelt es sich um die Grundeinheit der strukturellen Organisation von Chromatin. Das Nucleosom besteht prinzipiell aus (1) den Nucleinhistonen mit den Bezeichnungen H2A, H2B, H3 und H4, die zur Bildung eines Proteinkernpartikels assoziieren, und (2) den ungefähr 146 Basenpaaren von DNA, die um das Histonkernpartikel geschlungen bzw. gewickelt sind. Die physikalische Interaktion zwischen dem Histonkernpartikel und der DNA findet prinzipiell über die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA und den basischen Aminosäurehälften der Histonproteine statt. Csordas, Biochem. J., 286: 24–38 (1990) lehrt, dass Histone einer posttranslationellen Acetylisierung ihrer ε-Amino-Gruppen von N-terminalen Lysinresten unterliegen, mithin einer Reaktion, die durch Histonacetyltransferase (HAT) katalysiert wird. Die posttranslationelle Acetylisierung von Histonen hat sowohl strukturelle wie funktionelle, d.h. Gen-regelnde Konsequenzen.
  • Die Acetylisierung neutralisiert die positive Ladung der ε-Aminogruppen von N-terminalen Lysinresten, wodurch die Interaktion von DNA mit dem Histonkernpartikel des Nucleosoms beeinflusst wird." Die Histon-Acetylisierung und die Histon-Deacetylisierung (HDAC) beeinflussen die Chromatin-Struktur und die Gen-Regulierung. Beispielsweise lehren Taunton et al., Science, 272: 408–411 (1996), dass der Zugang von Translationsfaktoren auf Chromatin Schablonen durch Histon-Hyperacetylisierung verbessert wird. Tauton et al. lehren außerdem, dass eine Anreicherung in unteracetylisiertem Histon H4 in transkriptionell ruhigen Bereichen der Genome gefunden wurde.
  • Studien unter Verwendung bekannter HDAC-Hemmstoffe haben eine Verbindung zwischen der Acetylisierung und der Genexpression erbracht. Yoshida et al., Cancer Res., 47: 3688–3691 (1987) offenbaren, dass es, sich bei (R)-Trichostatin A (TSA) um einen potenten Induzierer für die Differenzierung in Murin-Erythroleukämie-Zellen handelt. Yoshida et al., J. Biol. Chem., 265: 17174–17179 (1990), lehren, dass es sich bei DAS um einen potenten Hemmstoff für Säugetier-HDAC handelt.
  • Zahlreiche Studien haben die Beziehung zwischen HDAC und Genexpression untersucht. Taunton et al., Science, 272: 408–411 (1996), offenbaren eine menschliche HDAC, die einen Hefe-Transkriptionsregulierer betrifft. Cress et al., J. Cell. Phys., 184: 1–16 (2000) offenbaren, dass im Zusammenhang mit menschlichem Krebs die Rolle von HDAC in einem Transkriptions-Korepressor besteht. Ng et al., TIBS, 25: März (2000), offenbaren HDAC als pervasives Merkmal von Transkriptionsrepressor-Systemen. Magnaghi-Jaulin et al., Prog. Cell Cycle Res., 4: 41–47 (2000), offenbaren HDAC als Transkriptions-Koregulator, der für die Zell-Cycle-Progression wichtig ist.
  • Molekulares Klonen von Gensequenzen-kodierenden Proteinen mit HDAC-Aktivität hat die Existenz eines Satzes diskreter HDAC-Enzym-Isoformen ergeben. Grozinger et al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 96: 4868–4873 (1999), lehren, dass HDAC in zwei Klassen unterteilt werden kann, von denen die erste durch Hefe-Rpd3-artige Proteine repräsentiert sind, während die zweiten durch Hefe-Hda1-artigen Proteinen repräsentiert sind. Grozinger et al. lehren außerdem, dass die menschliche HDAC-1-, HDAC-2- und HDAC-3-Proteine Elemente der ersten Klasse von HDAC sind, und sie offenbaren neue Proteine mit den Bezeichnungen HDAC-4, HDAC-5 und HDAC-6, bei denen es sich um Elemente der zweiten Klasse von HDAC handelt. Kao et al., Gene & Development, 14: 55–66 (2000), offenbaren ein zusätzliches Element dieser zweiten Klasse mit der Bezeichnung HDAC-7. In allerletzter Zeit offenbarten Hu, E. et al., J. Bio. Chem., 275: 15254–13264 (2000), dass neueste Element de ersten Klasse von Histon-Deacetylasen, nämlich HDAC-8. Es war nicht klar, welche Rolle diese einzelnen HDAC-Enzyme spielen.
  • Bekannte Hemmstoffe von Säugetier-HDAC sind eine bestimmte Zeit lang verwendet worden, um die Rolle von HDAC bei der Gen-Regulierung zu sondieren. Yoshida et al., J. Biol. Chem., 265: 17174–17179 (1990}, offenbaren, dass es sich bei (R)-Trichostatin A (TSA) um einen potenten Hemmstoff für Säugetier-HDAC handelt. Yoshida et al., Cancer Res., 47: 3688–3691 (1987), offenbaren, dass es sich bei TSA um einen potenten Induzierer für die Differenzierung in Murin-Erythroleukämie-Zellen handelt.
  • Bekannte Hemmstoffe von bzw. aus Histon-Deactylase bilden jeweils kleine Moleküle, die die Histon-Deactylase-Aktivität auf dem Protein-Niveau hemmen. Sämtliche der bekannten Histon-Deactylase-Hemmstoffe sind insbesondere nicht spezifisch für eine spezielle Histon-Deactylase-Isoform und hemmen mehr oder weniger sämtliche Elemente von beiden Histon- Deactylase-Familien gleichermaßen (Grozinger, C.M. et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A., 96: 4868–4873 (1999). In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf Marks et al., National Cancer Inst., 96: 1210–1216 (2000), verwiesen, die Histon-Deactylase-Hemmstoffe und ihre Rolle beim Studieren der Differenzierung und Apoptose sichten.
  • Es verbleibt deshalb ein Bedarf an einer Entwicklung von Reagenzien zum Hemmen spezifischer Histon-Deactylase-Isoformen. Es besteht außerdem ein Bedarf an einer Entwicklung von Verfahren zur Verwendung mit diesen Reagenzien zum Modulieren der Aktivität spezifischer Histon-Deactylase-Isoformen und zum Identifizieren derjenigen Isoformen, die in Tumorigenese und anderen proliferativen Erkrankungen und Störungen einbezogen sind.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung schafft Verfahren und Reagenzien zum Modulieren der Aktivität von Histon-Deactylase-(HDAC)-Isoformen. Beispielsweise stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien zum Hemmen von HCAC-Isoformen, insbesondere HDAC-1 und HDAC-4, durch Hemmen der Expression auf dem Nucleinsäure-Niveau oder der enzymatischen Aktivität auf dem Protein-Niveau bereit. Die Erfindung stellt außerdem eine spezielle Hemmung von spezifischen Histon-Deactylase-Isoformen bereit, die in der Tumorigenese teilnehmen und dadurch ein Heilmittel für Krebs bereitstellen. Die Erfindung stellt außerdem die spezifische Hemmung spezieller HDAC-Isoformen bereit, die in der Zellenproliferation einbezogen sind, und sie stellt dadurch eine Behandlung für zellproliferative Erkrankungen und Störungen bereit.
  • Die Erfinder haben die überraschende Entdeckung gemacht, dass die spezifische Hemmung von HDAC-4 in dramatischer Weise Apoptose und Wachstumsabstoppung in kanzerogenen Zellen indu ziert. Gemäß einem ersten Aspekt stellt demnach die Erfindung Mittel bereit, welche die Aktivität der HDAC-4-Isoform hemmen.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem Mittel, das die HDAC-4-Isoform hemmt, um ein Oligonucleotid, welches die Expression eines Nucleinsäuremoleküls hemmt, das die HDAC-4-Isoform kodiert. Bei dem Nucleinsäuremolekül, welches die HDRC-4-Isoform kodiert, kann es sich um Genom-DNA (beispielsweise ein Gen), cDNA oder RNA handeln. In einigen Ausführungsformen hemmt das Oligonucleotid die Transkription der mRNA-Kodierung der HDAC-4-Isoform. In weiteren Ausführungsformen hemmt das Oligonucleotid die Translation der HDAC-4-Isoform. In bestimmten Ausführungsformen ruft das Oligonuoleotid die Beeinträchtigung des Nucleinsäuremoleküls hervor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mittel gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung um ein Antisense-Oligonucleotid komplementär um einen RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, oder um ein Bereich der doppelsträngigen DNA, der einen Teil von HDAC-4 kodiert. In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Antisense-Oligonucleotid um ein chimäres Oligonucleotid. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Antisense-Oligonucleotid um ein Hybrid-Oligonucleotid. In einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nueleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausge wählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, und es umfasst die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden auf und es umfasst die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden auf und es umfasst die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID. NR:11. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antisense-Oligonucleotid um SEQ ID NR:11. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine oder mehrere Phosphorthioat-Internucleotid-Verknüpfungen auf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonucleotid außerdem eine Länge von 20 bis 26 Nucleotiden auf. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Oligonucleotid derart modifiziert, dass die letzten vier Nucleotide am 5'-Ende des Oligonucleotids und das Ende der vier Nucleotide am 3'-Ende des Oligonucleotids jeweils 2'-O-Methylgruppen aufweisen, die an ihren Zuckerresten vorgesehen sind.
  • Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen gemäß dem ersten Aspekt handelt es sich bei dem Mittel, welches die HDAC-4-Isoform hemmt, um eine Zelle, die aus einem kleinen Molekül-Hemmstoff besteht, der die Expression eines Nucleinsäuremoleküls hemmt, das die HDAC-4-Isoform kodiert oder die Aktivität des HDAC-4-Proteins.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem spezifischen Hemmstoff von HDAC-4, wodurch die HDAC-4-Aktivität gehemmt wird. Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfin dung ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Isoform in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich, welcher einen Teil von HDAC-4 kodiert, oder einem Bereich der doppelsträngigen DNA, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, wodurch die HDAC-9-Aktivität gehemmt wird. Gemäß einer Ausführungsform wird die Zelle in Kontakt mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid gebracht, bei dem es sich um ein chimäres Oligonucleotid handelt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht, bei dem es sich um ein Hybridoligonucleotid handelt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht, das eine Nucleotid-Sequenz-Länge von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, und das die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11 umfasst. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform wird die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht, das eine Sequenzlänge von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, und das die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11 umfasst. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht, bei dem es sich um SEQ ID NR:11 handelt. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform führt das Hemmen der HDAC-4-Aktivität zu dem Hemmen der Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle. Gemäß einer noch weiteren Ausführungs form führt das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Wachstums-Retadierung der kontaktierten Zelle. Gemäß einer weiteren Ausführungsform führt das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu dem Wachstumsabstoppen bzw. -blockieren der kontaktierten Zelle. Gemäß einer weiteren Ausführungsform führt das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform führt das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum nekrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle. Gemäß bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle, die in einem Tier, einschließlich einem Menschen, vorliegen kann, und die sich in einem neoplastischen Wachstum befinden kann. Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem das Kontaktieren der Zelle mit einem kleinmolekularen HDAC-4-Hemmstoff, der mit der enzymatischen Aktivität der HDAC-4-Histon-Deactylase-Isoform interagiert und diese reduziert. In einigen Ausführungsformen ist der kleinmolekulare Histon-Deactylase-Hemmstoff betriebsmäßig mit dem Antisense-Oligonucleotid verbunden.
  • Gemäß einem. dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der neoplastischen Zellenproliferation in einem Tier bereit, aufweisend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines spezifischen HDAC-4-Hemmstoffs für ein Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle in seinem Körper aufweist, dem Tier, wobei die neoplastische Zellenproliferation in dem Tier gehemmt wird. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des neoplastischen Zellenwachstums in einem Tier bereit, aufweisend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Antisense-Oligonucleotids gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine therapeutisch wirksame Zeitdauer einem Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle in seinem Körper aufweist. In einer Ausführungsform wird dem Tier ein chimäres HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein hybrides HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, und die die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11 umfasst. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, und das die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:11 umfasst. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, bei dem es sich um SEQ ID NR:11 handelt. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Tier um einen Mensch. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-1 kodiert, oder einer doppelsträngigen DNA, die einen Teil von HDAC-1 kodiert, und zwar einem Tier. Gemäß einer Ausführungsform wird dem Tier ein chimäres HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein hybrides HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht. Gemäß einer weiteren Ausführungs form weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden auf, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, und das die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:5 umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, und das die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:5 umfasst. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform wird dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht, bei dem es sich um SEQ ID NR:5 handelt.
  • Gemäß einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4, wobei die HDAC-4-Aktivität gehemmt ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht, der folgende Struktur aufweist: Cy-CH(Ome)-Y1-C(O)-NH-Z (1)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; Y1 ein C4-C6- Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus O; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. verträgliches Kation steht, wobei Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem Kleinmolekülhemmstoff in Kontakt gebracht wird, der folgende Struktur aufweist: Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die optional substituiert sein können; Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteratomhälfte, die ausgewählt aus der Gruppe, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, die optional jeweils substituiert sein können;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird und folgende Struktur aufweist: Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3) wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, wobei jedes optional substituiert sein kann; B aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -CH(OMe), Keton und Methylen; Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome von Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation steht, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird, der folgende Struktur aufweist: Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; L1 -(CH2)m-Wist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH-; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert. sein kann; Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen sein kann, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht, vorausgesetzt, dass dann, wenn L1 -C(O)NHist, Y1 -(CH2)n- ist, n 1, 2 oder 3 ist und Z -O-M ist, Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroxyphenyl ist; und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist und Z Pyridyl ist, Cy kein substituiertes Indolinyl ist;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird, aufweisend die Struktur: Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)hetero- cyclyl ist; L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen handelt, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass L2 nicht -C(O) – ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional. ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann, und Y2 ein chemisch gebundenes oder gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes A1kylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H steht oder für ein pharmazeutisch akzeptables Kation; unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, Cy und Z nicht beide Pyridyl sind;
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle in Kontakt mit einem kleinmolekularen Hemmstoff gebracht ist, aufweisend die Struktur: Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyelyl ist; L3 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH; und (b) C1-C6-Alkylen oder C2-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass L3 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; NR', wobei R' ein Alky1, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein, und Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkinylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Aklenylens optional ersetzt sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, und M für H oder ein pharmazeutisch akzeptabels Kation steht; vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen:
  • In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird, der die Struktur aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
    Figure 00150001
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einem Hemmen der Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle führt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, demnach das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Wachstums-Retardierung der kontaktierten Zelle führt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einem Wachstumsabstoppen der kontaktierten Zelle führt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach das Hemmen der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum nekrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der kontaktierten Zelle um eine menschliche Zelle.
  • Gemäß einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der neoplastischen Zellenproliferation in einem Tier bereit, aufweisend das Verabreichen einer therapeutischen wirksamen Menge eines kleinmolekularen Hemmstoffs von HDAC-4 einem Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle in seinem Körper aufweist, wobei eine neoplastische Zellenproliferation gehemmt wird. Gemäß einer Ausführungsform wird dem Tier ein kleinzelliger Hemmstoff verabreicht, der folgende Struktur aufweist: Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; Y1 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus O; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. verträgliches Kation steht, wobei Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem Kleinmolekül hemmstoff in Kontakt gebracht wird, der folgende Struktur aufweist: Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die optional substituiert sein können; Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteratomhälfte, die ausgewählt aus der Gruppe, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, die optional jeweils substituiert sein können;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird und folgende Struktur aufweist: Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, wobei jedes optional substituiert sein kann; B aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -CH(OMe), Keton und Methylen; Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome von Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation steht, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird, der folgende Struktur aufweist: Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; L1 -(CH2)m-Wist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH-; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein kann; Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen sein kann, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht, vorausgesetzt, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist, Y1 -(CH2)n- ist, n 1, 2 oder 3 ist und Z -O-M ist, Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroryphenyl ist; und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist und Z Pyridyl ist, Cy kein substituiertes Indolinyl ist;
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff in Kontakt gebracht wird, aufweisend die Struktur: Cy-L2-Ar-Y2-C(O)-NH-Z (5) wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)hetero- cyclyl ist; L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen handelt, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass L2 nicht -C(O)ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) ; oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann, und Y2 ein chemisch gebundenes oder gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H steht oder für ein pharmazeutisch akzeptables Kation; unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, Cy und Z nicht beide Pyridyl sind;
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, demnach die Zelle in Kontakt mit einem kleinmolekularen Hemmstoff gebracht ist, aufweisend die Struktur: Cy-L3-Ar-Y3-C(O)-NH-Z (6) wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L3 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O) -, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH; und (b) C1-C6-Alkylen oder C2-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass L3 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; NR', wobei R' ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O),; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein, und Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkenylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Alkenylens optional ersetzt sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe; die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, und M für H oder ein pharmazeutisch akzeptabels Kation steht; vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen:
    Figure 00200001
    Figure 00210001
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem einem Tier ein kleinmolekularer Hemmstoff verabreicht wird, ein Mensch ist.
  • Gemäß einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Hemmen der Induktion von Zellenproliferation, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression von HDAC-4 hemmt und/oder das Kontaktieren einer Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle, und die Induktion der Zellenproliferation stellt eine Tumorigenese bereit.
  • Gemäß einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Identifizieren eines kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs, der die HDAC-4-Isoform hemmt, wobei die Isoform für die Induktion der Zellenproliferation benötigt wird. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren der HDAC-4-Isoform mit einem kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff und das Messen der enzymatischen Aktivität der kontaktierten Histon-Deacetylase-Isoform, wobei eine Reduktion der enzymatischen Aktivität der kontaktierten HDAC-4-Isoform den kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff als kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff der HDAC-4-Isoform identifiziert.
  • Gemäß einem achten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Identifizieren eines kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs, der die HDAC-4-Isoform hemmt, die bei der Induktion der Zellenproliferation beteiligt ist. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer Zelle mit einem kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff und das Messen der enzymatischen Aktivität der kontaktierten Histon-Deacetylase-Isoform, wobei eine Reduktion der enzymatischen Aktivität der HDAC-4-Isoform den kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff als kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff von HDAC-4 identifiziert.
  • Gemäß einen neunten Aspekt stellt die Erfindung einen kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff bereit, identifiziert durch das Verfahren gemäß dem siebten oder achten Aspekt der Erfindung. Bevorzugt ist der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff im wesentlichen rein.
  • Gemäß einem zehnten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Hemmen der Zellenproliferation in einer Zelle, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle mit zumindest zwei Reagenzien, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-4-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, die die Expression bei der Aktivität der HDAC-4-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-1-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression bzw. Aktivität der HDAC-1-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression einer DNA-Methyl-Transferase hemmt, und einem kleinmolekularen DNA-Methyl-Transferase-Hemmstoff. In bestimmten Ausführungsformen ist das Hemmen des Zellenwachstums der kontaktierten Zelle stärker ausgeprägt als das Hemmen des Zellenwachstums einer Zelle, die ausschließlich mit einem der Reagenzien in Kontakt gebracht ist. In bestimmten Ausführungsformen ist jeder der Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, im wesentlichen rein. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle und in noch weiteren zu- sätzlichen Ausführungsformen sind die Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, betriebsmäßig bzw. operativ verbunden.
  • In einer elften Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des neoplastischen Zellenwachstums bereit, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle mit zumindest zwei Reagenzien, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-4-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression bzw. Aktivität der HDAC-4-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-1-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression bzw. Aktivität der HDAC-1-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression einer DNA-Methyl-Transferase hemmt, und einem kleinmolekularen DNA-Methyl-Transferase-Hemmstoff. In einigen Ausführungsformen ist das Hemmen des Zellenwachstums der kontaktierten Zelle stärker ausgeprägt als das Hemmen des Zellenwachstums einer Zelle, die mit ausschließlich einem der Reagenzien in Kontakt gebracht ist. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes der Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, im wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle. In noch zusätzlich bevorzugten Ausführungsformen sind die Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, betriebsmäßig bzw. operativ verbunden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 AS1 und AS2 sind geeignet, die HDAC-4-Expression auf RNA-Niveau dosisabhängig zu hemmen. Menschliche Krebs-A549-Zellen werden mit gestuften Dosen von AS1-, AS2- bzw. MM2-Oligos für 24 Stunden behan delt. Für eine Northern-Analyse wurden sämtliche RNA geerntet.
  • 2 AS1 und AS2 sind geeignet, die HDAC-4-Expression auf Protein-Niveau zu hemmen. Menschliche Krebs-A549-Zellen wurden mit AS1-, AS2- oder MM2-Oligos für 48 Stunden behandelt. Gesamtzellen-Lysate wurden analysiert durch Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch sind gegenüber menschlicher HDAC-4.
  • 3 Wachstumskurven menschlicher Krebszellen A549, behandelt mit HDAC-4-AS1 bzw. -AS2. Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 Stunden plattiert auf 2,5 × 105/10 cm Dish. Zellen wurden behandelt mit 50 nM Oligos während 24 und 48 Stunden. Zellen wurden nach 24, 48 und 72 Stunden gezählt durch Trypan-Blau-Exklusion bzw. -Ausschluss.
  • 4 Wachstumskurven menschlicher Krebszellen Du145, behandelt mit HDAC-4-AS1 bzw. -AS2. Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 Stunden plattiert auf 2,5 × 105/10 cm Dish. Zellen wurden behandelt mit 50 nM Oligos während 1 Tag, 2 Tagen und 3 Tagen. Zellen wurden nach 1 Tage, 2 Tagen und 3 Tagen gezählt durch Trypan-Blau-Exklusion bzw. -Ausschluss.
  • 5 Eine graphische Darstellung der Demonstrierung der apoptischen Wirkung von HDAC-Isotyp-spezifischen Antisense-Oligos auf menschlichen A549-Krebszellen.
  • 6 zeigt eine graphische Darstellung der Demonstrierung der Zellenzyklus-Blockadewirkung von HDAC-4-Antisense-Oligos auf menschlichen A549-Krebszellen.
  • 7 zeigt eine Darstellung eines RNAse-Schutz-Assays unter Demonstrierung der Wirkung HDAC-Isotypspezifischer Antisense-Oligos auf den HDAC-Isotyp-mRNA-Expression in menschlichen A549-Zellen.
  • 8 zeigt eine Darstellung eines Western-Blots unter Demonstrierung, dass die Behandlung von menschlichen A549-Zellen mit HDRC-4-Antisense-Oligos die Expression des p21-Proteins induziert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜRUNGSFORMEN
  • Die in Bezug genommene Patentliteratur und wissenschaftliche Literatur betrifft Wissen, das dem Fachmann zur Verfügung steht. Die erteilten Patente, die Patentanmeldungen und Referenzen, einschließlich den GenBank-Datenbasis-Sequenzen, auf die vorliegend Bezug genommen wird, werden unter Bezugnahme auf eben deren Inhalt zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung erklärt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Modulieren von Histon-Deacetylase-(HDAC)-Isoformen, insbesondere HDAC-1 und HDAC-4, durch Hemmen der Expression auf dem Nucleinsäure-Niveau oder durch Hemmen der enzymatischen Aktivität auf dem Protein-Niveau bereit. Die Erfindung stellt außerdem eine spezifische Hemmung spezifischer Histon-Deacetylase-Isoformen bereit, die in der Tumorigenese beteiligt sind und dadurch eine Behandlung für Krebs. Die Erfindung stellt außerdem eine spezifische Hemmung spezifischer HDAC-Isoformen bereit, die in der Zellenproliferation beteiligt sind und sie stellt eine Behandlung für Zellenproliferationsstörungen bereit.
  • Die Erfinder haben die überraschende Entdeckung gemacht, dass die spezifische Hemmung von HDAC-4 Apoptose und Wachstumsabstoppung in Krebszellen dramatisch induziert. Diese Entde ckung ist genutzt worden, um die vorliegende Erfindung zu entwickeln, die gemäß einem ersten Aspekt Reagenzien bereitstellt, welche die HDAC-4-Isoform hemmt.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsförmen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem Agens, welches die HDAC-4-Isoform hemmt, um ein Oligonucleotid, welches die Expression eines Nucleinsäuremoleküls hemmt, das die HDAC-4-Isoform kodiert. Bei dem H-DAC-4-Nucleinsäuremolekül kann es sich um Genom-DNA (beispielsweise ein Gen), cDNA oder RNA handeln. In einigen Ausführungsformen hemmt das Oligonucleotid die Transkription von mRNA, das die HDAC-4-Isoform kodiert. In anderen Ausführungsformen hemmt das Oligonucleotid die Translation der HDAC-4-Isoform. In bestimmten Ausführungsformen verursacht das Oligonucleotid die Beeinträchtigung des Nucleinsäuremoleküls. Bevorzugte Antisense-Oligonucleotide besitzen potente und spezifische Antisense-Aktivität bei nanomolaren Konzentrationen.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Mittel, welches die HDAC-4-Isoform hemmt, um einen kleinmolekularen Hemmstoff, der die Expression eines Nucleinsäuremoleküls hemmt, das die HDAC-4-Isoform kodiert oder die Aktivität des HDAC-4-Proteins.
  • Bei dem Begriff "kleinmolekülig" handelt es sich, so wie er vorliegend verwendet wird, um das Hemmen von Histon-Deacetylase zum Identifizieren einer Verbindung mit einem Molekulargewicht von bevorzugt weniger als 1000 Da, stärker bevorzugt weniger als 800 Da und besonders bevorzugt weniger als 600 Da, die dazu geeignet ist, mit einer Histon-Deacetylase zu interagieren und die Expression des Nucleinsäuremoleküls zu hemmen, welches eine HDAC-4-Isoform kodiert oder die Aktivität eines HDAC-4-Proteins. Das Hemmen der Histon-Deacetylase-Enzymaktivität bedeutet das Reduzieren der Fähigkeit einer Histon-Deacetylase, eine Acetylgruppe von einem Histon zu entfernen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen beträgt diese Reduktion der Histon-Deacetylase-Aktivität zumindest etwa 50%, stärker bevorzugt zumindest etwa 75% und am stärksten bevorzugt von zumindest etwa 90%. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die Histon-Deacetylase-Aktivität um zumindest 95% verringert, stärker bevorzugt um zumindest 99%. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem kleinmolekularen Hemmstoff um HDAC um HDAC-1 und/oder HDAC-4. Am stärksten bevorzugt sind kleinmolekulare Hemmstoffe von HDAC-4.
  • Bevorzugt ist diese Hemmung spezifisch, d.h., der Histon-Deacetylase-Hemmstoff reduziert die Fähigkeit einer Histon-Deacetylase, eine Acetylgruppe von einem Histon bei einer Konzentration zu entfernen, die niedriger liegt als die Konzentration des Hemmstoffs, die erforderlich ist, eine weitere, in keiner Beziehung stehende biologische Wirkung zu erzeugen. Bevorzugt ist die Konzentration des Hemmstoffs, der für die Histon-Deacetylase-Hemmungsaktivität erforderlich ist, zumindest 2-fach, stärker bevorzugt 5-fach, und noch mehr bevorzugt zumindest 10-fach geringer und am stärksten bevorzugt zumindest 20-fach geringer als die Konzentration, die erforderlich ist, eine in keiner Beziehung stehende biologische Wirkung zu erzeugen.
  • Bevorzugte Mittel, die das HDAC-4-Hemmwachstum menschlicher Krebszellen hemmen, unabhängig von ihrem p53-Status. Diese Mittel induzieren Apoptose in Krebszellen und rufen Wachstumsabstoppung hervor. Sie bewirken auch die Transkription von p21WAF1 (ein Tumor-Unterdrücker-Gen) zu induzieren, nämlich Bax, wobei es sich hier um ein extrem wichtiges Gen handelt, das in der Apoptose-Regulierung beteiligt ist, und GADD45, einem Stress-induzierten Gen und wichtigen Regulierer des Zellenwachstums. Diese Mittel vermögen sowohl in vitro wie in vivo Antitumoraktivität zu zeigen. Hemmungsmittel, die ein oder mehrere dieser Ergebnisse erzielen, fallen in den Umfang der Erfindung gemäß diesem Aspekt.
  • Die Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung sind komplementär zu einem RNA-Bereich oder einem Bereich mit einer doppelsträngigen DNA, der einen Teil von einem oder mehreren Histon-Deacetylase-Isoformen kodiert (unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Homologie zwischen unterschiedlichen Isoformen es ermöglichen, dass ein einziges Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem Teil von mehr als einer Isoform ist). Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff "Oligonucleotid" Polymere von zwei oder mehr Desoxyribonucleosiden, Ribonucleosiden oder eine beliebige Kombination hieraus. Bevorzugt weisen derartige Oligonucleotide von etwa 6 bis etwa 50 Nucleosid-Reste auf auf, besonders von etwa 12 bis etwa 30 Nucleosid-Reste. Die Nucleosid-Reste können miteinander durch eine beliebige zahlreicher bekannter Internucleosid-Verknüpfungen verbunden sein. Diese Internucleosid-Verknüpfungen umfassen einschränkungslos Phosphorthioat, Phosphordithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonthioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, überbrücktes Phosphoramidat, überbrücktes Methylenphosphonat, überbrücktes Phosphorthioat und Sulfon-Internucleotid-Verknüpfungen. Diese Internucleosid-Verknüpfungen sind bevorzugt Phosphotriester-, Phosphorothioat- oder Phosphoramidat-Verknüpfungen oder Kombinationen davon.
  • Bevorzugt können die Oligonucleotide auch 2'-O-substituierte Ribonucleotide enthalten. Für die Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff "2'-O-substituiert" die Substitution der 2'-Position der Pentose-Hälfte mit einer um ein -O- niedriger liegenden Alkylgruppe, die 1 bis 6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält, oder mit einer -O-Aryl- oder -Allylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei solche Alkyl- oder Aryl oder Allylgruppe unsubstituiert oder substitu tiert sein kann (beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Trifluormethyl, Cyano, Nitro, Acyl, Acyloxy, Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxy oder Aminogruppen; oder solche 2'-Substitution kann mit einer Hydroxygruppe erfolgen (um ein Ribonucleosid zu erzeugen), einer Amino- oder Halogengruppe, nicht jedoch mit einer 2'-H-Gruppe. Der Ausdruck "Alkyl", wie er vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf gerad- und verzweigtkettige aliphatische Gruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevor- zugt 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sein können. Falls aus dem Zusammenhang nichts anderes hervorgeht, bedeutet der Begriff "Alkyl" gesättigte, ungesättigte und teilweise ungesättigte aliphatische Gruppen. Wenn ungesättigte Gruppen speziell angezielt sind, werden die Begriffe "Alkenyl" oder "Alkinyl" verwendet. Wenn ausschließlich gesättigte Gruppen angezielt sind, wird der Begriff "gesättigtes Alkyl" verwendet. Bevorzugt umfassen gesättigte Alkylgruppen ohne Beschränkung Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl; Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl und Hexyl.
  • Der Begriff Oligonucleotid schließt auch solche Polymere ein, die chemisch modifizierte Basen oder Zucker aufweisen und/oder zusätzliche Substituenten, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, lipophile Gruppen, interkalierende Mittel, Diamine und Adamantan. Der Begriff Oligonucleotid umschließt auch solche Polymere, wie PNA und LNA.
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff "komplementär" die Fähigkeit, einen Genombereich zu hybridiseren, ein Gen oder ein RNA-Transkript hiervon, und zwar unter physiologischen Bedingungen. Diese Hybridisierung ist üblicherweise das Ergebnis einer basenspezifsichen Wasserstoffbindung zwischen komplementären Strängen, bevorzugt zur Bildung von Watson-Crick- oder Hoogsteen-Basenpaaren, obwohl andere Modi der Wasserstoffbindung ebenso wie Basenstapelung ebenfalls zur Hybridisierung führen können. Diese Hybridisierung kann aus der Beobachtung spezifischer Gen-Expressionshemmung gefolgert werden, die auf dem Transkriptions- oder Translations-Niveau (oder auf beiden) beruhen kann.
  • Besonders bevorzugte Antisense-Oligonucleotide, die in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden, umfassen chimäre Oligonucleotide und hybride Oligonucleotide.
  • Für die Zwecke der Erfindung bezieht sich der Begriff "chimäres Oligonucleotid" auf ein Oligonucleotid mit mehr als einer Art einer Internucleotisid-Verknüpfung. Eine bevorzugte Ausführungsform eines derartigen chimären Oligonucleotids ist ein chimäres Oligonucleotid, aufweisend Internucleotid-Verknüpfungen, Phosphorthioat, Phosphordithioat, Internucleosid-Verknüpfungen und Phosphodiester, bevorzugt aufweisend von etwa 2 bis 12 Nucleotide. Einige nützliche Oligonucleotide gemäß der Erfindung weisen einen Alkylphosphonat-verknüpften Bereich und einen Alkylphosphonthioat-Bereich auf (siehe beispielsweise Pederson et al., US-Patent Nrn. 5 635 377 und 5 366 878). Bevorzugt enthalten derartige chimäre Oligonucleotide zumindest drei aufeinanderfolgende Internucleosid-Verknüpfungen, bei denen es sich um Phosphodiester- und Phosphorthioat-Verknüpfungen oder Kombinationen hiervon handelt.
  • Für die Zwecke der Erfindung bezieht sich der Begriff "hybrides Oligonucleotid" auf ein Oligonucleotid mit mehr als einer Art von Nucleosid. Eine bevorzugte Ausführungsform eines derartigen hybriden Oligonucleotids umfasst ein Ribonucleotid oder einen 2'-O-substituierten Ribonucleotid-Bereich, bevorzugt aufweisend von etwa 2 bis etwa 12 2'-O-substituierte Nucleotide, und einen Desoxyribonucleotid-Bereich. Bevorzugt enthält ein derartiges hybrides Oligonucleotid zumindest drei aufeinander folgende Desoxyribonucleoside und Ribonucleoside, 2'-O-substituierte Ribonucleoside oder Kombinationen hieraus (siehe beispielsweise Metelev und Agrawal, US-Patente Nrn. 5 652 355 und 5 652 356).
  • Die exakte Nucleotid-Sequenz und chemische Struktur eines Antisense-Oligonucleotids, das in der Erfindung verwendet wird, kann variiert werden; solange das Oligonucleotid seine Fähigkeit beibehält, die Expression der Ziel-Sequenz zu modulieren, beispielsweise die HDAC-4 oder HDAC-4-Isoform. Dies lässt sich leicht ermitteln durch Testen, ob das spezielle Antisense-Oligonucleotid aktiv ist durch Quantifizieren der Menge der mRNA, welche die HDAC-4 kodiert, oder die HDAC-1-Isoform, durch Quantifizieren der Menge des HDAC-4- oder HDAC-1-Isoform-Proteins, durch Quantifizieren der HDAC-4- oder HDAC-1-Isoform Enzymaktivität oder durch Quantifizieren der Fähigkeit der HDAC-4- oder der HDAC-1-Isoform beispielsweise das Zellenwachstum in einem in vitro- oder in vivo-Zellenwachstums-Assay zu hemmen, wobei sämtliche dieser Möglichkeiten in der vorliegenden Beschreibung im einzelnen erläutert sind. Der Begriff "Expression hemmen" und ähnliche Begriffe umschließen, so wie sie vorliegende verwendet werden, einen oder mehrere dieser Parameter.
  • Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung können problemlos auf einen geeigneten Feststoffträger bzw. Feststoff synthetisiert werden unter Verwendung an sich bekannter chemischer Ansätze, einschließlich der H-Phosphonat-Chemie, der Phosphoramidit-Chemie oder einer Kombination aus der H-Phosphonat-Chemie und der Phosphoramidit-Chemie (d.h., der H-Phosphonat-Chemie für einige Zyklen und der Phosphoramidit-Chemie für andere Zyklen). Geeignete Feststoffträger umfassen einen beliebigen von standardmäßigen Feststoffträgern, die für die Feststoffphasen Oligonucleotid-Synthese verwendet werden, wie etwa porengesteuertes Glas (CPG) (siehe beispielsweise Pon, R.T., Meth. Molec. Biol., 20: 465–496, 1993).
  • Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung sind für zahlreiche Zwecke nützlich. Beispielsweise können sie als "Sonden" für die physiologische Funktion spezifischer Histon-Deacetylase-Isoformen verwendet werden, die verwendet werden, um die Aktivität spezifischer Histon-Deacetylase-Isoformen in einer experimentellen Zellenkultur oder einem Tier-System zu hemmen, um die Wirkung der Hemmung derartiger spezifischer Histon-Deacetylase-Isoform-Aktivität zu evaluieren. Bewirkt wird dies durch Verabreichen eines Antisense-Oligonucleotids einer Zelle oder einem Tier, das einen oder mehrere Histon-Deacetylase-Isoform-Expressionen in Übereinstimmung mit der Erfindung hemmt, und durch Beobachten von sämtlichen phenotypischen Effekten. In dieser Verwendung sind die Antisense-Oligonucleotide, die in Übereinstimmung mit der Erfindung eingesetzt werden, bevorzugt gegenüber herkömmlichen "Gen-Knockout"-Ansätzen, weil sie problemloser einsetzbar sind, und weil sie verwendet werden können, um eine spezifische Histon-Deacetylase-Isoform-Aktivität in gewählten Stufen der Entwicklung oder Differenziation zu hemmen.
  • Bevorzugte Antisense-Oligonucleotide gemäß der Erfindung hemmen entweder die Transkription eines Nucleinsäuremoleküls, das die HDAC-4- oder die HDAC-1-Isoform kodiert, und/oder die Translation eines Nucleinsäuremoleküls, welches HDAC-4 oder HDAC-1 hemmt und/oder zur Beeinträchtigung dieser Nucleinsäuremoleküle führt. Bei dem HDAC-4- oder HDAC-1-kodierenden Nucleinsäuremolekülen kann es sich um RNA- oder Doppelstrang-DNA-Bereiche handeln, und sie umfassen ohne Beschränkung introne Sequenzen, nicht translatierte 5'- und 3'-Bereiche, Intronexon-Grenzen sowie Kodierungssequenzen von den HDAC-4- oder HDAC-1-Isoform-Genen. Für menschliche Sequenzen wird verwiesen auf beispielsweise: Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(23): 2845–12850, 1996; Furukawa et al., Cytogenet. Cell Genet., 73(1–2): 130–133; Yang et al., J. Biol. Chem., 272(44): 28001–28007, 1997; Betz et al., Genomics, 52(2) : 245–246, 1998; Taunton et al., Science, 272(5260): 408–411, 1996; und Dangond et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 242 (3) : 648–652, 1998) .
  • Antisense-Oligonucleotide für menschliche HDAC-Isotyp-Polynucleotide können aus bekannten HDAC-Isotyp-Sequenzdaten konstruiert werden. Beispielsweise stehen die folgenden Aminosäure-Sequenzen zur Verfügung von GenBank für HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7 und HDAC-8: AAC50475, AAC50814, AAC98927, BAA22957, AB011172, AAD29048, AAF63491 bzw. AAF73076 und die folgenden Nucleotid-Sequenzen stehen zur Verfügung von GenBank für HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5; HDAC-6, HDAC-7 und HDAC-8: U50079, U31814, AF039703, AB006626, AF039691, AJ011972, AF239243 bzw. AF230097.
  • Besonders bevorzugte nicht-beschränkende Beispiele von Antisense-Oligonucleotiden gemäß der Erfindung sind komplementär zu einem RNA-Bereich oder einem Doppelstrang-DNA-Bereich, die HDAC-4- oder die HDAC-1-Isoform kodieren (siehe beispielsweise GenBank-Zugangs-Nr. U50079 für menschliches HDAC-1 (1B) und GenBank-Zugangs-Nr. AB006626 für menschliches HDAC-4 (2B)).
  • Die Sequenzen, die Histon-Deacetylase von zahlreichen nichtmenschlichen Tierspezien kodieren, sind ebenfalls bekannt (siehe beispielsweise GenBank-Zugangs-Nrn. X98207 (Murin-HDAC-1) und AF006602 (Murin-HDAC-4)). Die Antisense-Oligonucleotide gemäß der Erfindung können deshalb auch komplementär zu einem RNA-Bereich oder einem Doppelstrang-DNA-Bereich sein, der die HDAC-4- oder die HDAC-1-Isoform von nicht-menschlichen Tieren kodieren. Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit diesen Ausführungsformen sind nützlich als Werkzeuge in Tiermodellen zum Studieren der Rolle spezi fischer Histon-Deacetylase-Isoformen.
  • Bevorzugte Oligonucleotide weisen insbesondere Nucleotid-Sequenzen von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden auf, welche die Nucleotid-Sequenzen umfassen, die in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt sind.
  • Diese Oligonucleotide weisen Nucleotid-Sequenzen von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden der Nucleotid-Sequenzen auf, die in der nachfolgend unten gezeigten Tabelle 1 aufgeführt sind. Insbesondere weisen die nachfolgend gezeigten Oligonucleotide Phosphorthioat-Rückgrate auf, weisen bezüglich ihrer Länge 20 bis 26 Nucleotide auf und sind derart modifiziert, dass die endständigen vier Nucleotide an dem 5'-Ende des Oligonucleotids und die endständigen vier Nucleotiden an dem 3'-Ende des Oligonucleotids jeweils 2'-O-Methyl-Gruppen aufweisen, die an ihren Zucker-Resten vorgesehen sind.
  • Tabelle I HDAC-Isotyp-spezifische Antisense- und Fehlanpassungs-Oligos
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Die Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung können optional mit einem beliebigen der an sich bekannten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert werden (siehe Zubereitung pharmazeutisch verträglicher Formulierungen in beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Hg. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) mit der Maßgabe, dass diese Träger oder Verdünnungsmittel ihre Fähigkeit nicht beeinträchtigen, die HDAC-Aktivität zu modulieren.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Mittel, welches die HDAC-9- und/oder HDAC-1-Isoformen hemmt, um ein kleines Molekül. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hemmt das kleine Molekül die Enzym-Aktivität der HDAC-4- oder HDAC-1-Isoform.
  • Bestimmte bevorzugte kleinmolekulare Hemmstoffe für die HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoformen umfassen Verbindungen mit der Formel (1): Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die jeweils optional substituiert sein können;
    Y1 ein C4-C6-Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, wie etwa O, NR1 (bei R1 handelt es sich um Alkyl, Acyl oder Wasserstoff), S, S(O) oder S(O)2; und
    Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M ausgewählt ist, wobei M H oder ein- pharmazeutisch verträgliches Kation ist, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können.
  • Bei einer "Alkylen"-Gruppe handelt es sich um eine Alkylgruppe gemäß der vorstehend genannten Definition, die zwischen zwei weiteren chemischen Gruppen zu liegen kommt und dazu dient, diese zu verbinden. Bevorzugte Alkylgruppen umfassen ohne Beschränkung Methylen, Ethylen, Propylen und Butylen.
  • Der Begriff "Cycloalkyl" umfasst, wie vorliegend verwendet, gesättigte und teilweise ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffgruppen mit 3 bis 12 Kohlenstoffen, bevorzugt 3 bis 8 Kohlenstoffen und stärker bevorzugt 3 bis 6 Kohlenstoffen, wobei die Cycloalkylgruppe zusätzlich optional substituiert sein kann. Bevorzugte Cycloalkylgruppen umfassen ohne Beschränkung Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cycloheptyl und Cyclooctyl.
  • Bei einer "Aryl"-Gruppe handelt es sich um eine aromatische C6-C14-Hälfte, aufweisend einen bis drei aromatische Ringe, die optional substituiert sein können. Bevorzugt handelt es sich bei der Arylgruppe um eine C6-C10-Arylgruppe. Bevorzugt umfassen Arylgruppen ohne Beschränkung Phenyl, Naphthyl, Anthracenyl und Fluorenyl. Eine "Aralkyl"- oder Arylalkyl"- Gruppe umfasst eine Arylgruppe, die kovalent mit einer Alkylgruppe verknüpft ist, von denen jede unabhängig optional substituiert oder unsubstituiert sein kann. Bevorzugt handelt es sich bei der Aralkylgruppe um (C1-C6)-Alk-(C6-C10)aryl, einschließlich, ohne Beschränkung, Benzyl, Phenetyl und Naphthylmethyl. Bei einer "Alkaryl"- oder "Alkylaryl"-Gruppe handelt es sich um eine Arylgruppe mit ein oder mehreren Alkyl-Substituenten. Beispiele von Alkarylgruppen umfassen ohne Beschränkung Tolyl, Xylyl, Mesityl, Ethylphenyl, tert-Butylphenyl und Methylnaphthyl.
  • Bei einer "Arylen"-Gruppe handelt es sich um eine Arylgruppe, wie sie vorstehend definiert ist, die zwischen zwei weiteren chemischen Gruppen zu liegen kommt und dazu dient, diese zu verbinden. Bevorzugte Arylengruppen umfassen ohne Beschränkung Phenylen und Naphthylen. Der Begriff "Arylen" bedeutet auch, dass er Heteroaryl-Brückengruppen umfasst, jedoch ohne Beschränkung, Benzothienyl, Benzofuryl, Chinolyl, Isochinolyl und Indolyl.
  • Bei einer "Heterocyclyl"- oder "heterocyclischen" Gruppe handelt es sich um eine Ringstruktur mit von etwa 3 bis etwa 8 Atomen, wobei ein oder mehrere Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus N, 0 und S besteht. Die heterocyclische Gruppe kann optional am Kohlenstoff in einer oder mehreren Positionen substituiert sein. Die heterocyclische Gruppe kann unabhängig an einem Stickstoff substituiert sein mit Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylcarbonyl, Alkylsulfonyl, Arylcarbonyl, Arylsulfonyl, Alkoxycarbonyl, Aralkoxycarbonyl oder an einem Schwefel mit Oxo oder niederem Alky1. Bevorzugte heterocyclische Gruppen umfassen ohne Beschränkung Epoxy, Aziridinyl, Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Thiazolidinyl, Oxazolidinyl, Oxazolidinonyl und Morpholino. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die heterocyclische Gruppe mit einer Aryl- oder Heteroarylgruppe verschmolzen. Beispiele derartiger verschmolzenen Heterocyclen umfassen ohne Beschränkung Tetrahydrochinolin und Dihydrobenzofuran.
  • Wie vorliegend verwendet, bezieht sich der Begriff "Heteroaryl" auf Gruppen mit 5 bis 14 Ringatomen, bevorzugt 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen; aufweisend 6, 10 oder 14 n-Elektronen, die sich ein cyclisches Array teilen, und aufweisend zusätzlich zu Kohlenstoffatomen zwischen ein und etwa drei Heteroatomen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus N, O und S. Bevorzugte Heteroarylgruppen umfassen ohne Beschränkung Thienyl, Benzothienyl, Furyl, Benzofuryl, Dibenzofuryl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Indolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Chinoxalinyl, Tetrazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl und Isoxazolyl.
  • Wie vorliegend verwendet, handelt es sich bei einer "substituierten" Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder heterocyclischen Gruppe um eine solche, die zwischen einem und etwa vier, bevorzugt zwischen einem und etwa drei, stärker bevorzugt zwischen einem oder zwei Nicht-Wasserstoff-Substituenten aufweisen. Geeignete Substituenten umfassen ohne Beschränkung Halogen-, Hydroxy-, Nitro-, Halogenalkyl-, Alkyl-, Alkaryl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Acylamino-, Alkylcarbamoyl-, Arylcarbamoyl-, Aminoalkyl-, Alkoxycarbonyl-, Carboxy-, Hydroxyalkyl-, Alkansulfonyl-, Arensulfonyl-, Alkansulfonamido-, Arensulfonamido-, Aralkylsulfonamido-, Alkylcarbonyl-, Acyloxy-, Cyano- und Ureidogruppen.
  • Der Begriff "Halogen" oder "Halo" bezieht sich, so wie er vorliegend verwendet wird, auf Chlor, Brom, Fluor oder Iod.
  • Wie vorstehend verwendet, bezieht sich der Begriff "Acyl" auf einen Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonyl-Substituenten.
  • Der Begriff "Acylamino" bezieht sich auf eine Amidgruppe, die an einem Stickstoffatom vorgesehen ist. Der Begriff "Carbamoyl" bezieht sich auf eine Amidgruppe, die an dem Carbonyl-Kohlenstoffatom vorgesehen ist. Das Stickstoffatom eines Acylamino- oder Carbamoyl-Substituenten kann zusätzlich substituiert sein. Der Begriff "Sulfonamido" bezieht sich auf einen Sulfonamid-Substituenten, der entweder an einem Schwefel- oder Stickstoffatom vorgesehen ist. Der Begriff "Amino" bedeutet, dass er NH2, Alkylamino, Arylamino und cyclische Aminogruppen umfasst.
  • Der Begriff "Ureido" bezieht sich, so wie er vorliegend verwendet wird, auf eine substituierte oder unsubstituierte Harnstoffhälfte.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die kleinmolekularen Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform durch folgende Formel (2) wiedergegeben: Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die jeweils optional substituiert sein können;
    Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, wie etwa O, NR1 (bei R1 handelt es sich um Alkyl, Acyl oder Wasserstoff), S, S(O) oder S(O)2; und
    Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl. ist, die jeweils optional substituiert sein können. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen bevorzugte kleinmolekulare Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform Verbindungen mit der Formel (3): Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3) wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die jeweils optional substituiert sein können;
    B -CH(OMe), Keton oder Methylen ist;
    Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, wie etwa O, NR1 (bei R1 handelt es sich um Alkyl, Acyl oder Wasserstoff), S, S(O) oder S(O)2; und
    Z Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl oder -O-M ist (M steht für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation), wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform durch folgende Formel (4) wiedergegeben: Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (3)wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die jeweils optional substituiert sein können; L1 -(CH2)m-W- ist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und wobei W -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- oder -NH-C(O)-NHist;
    Ar Arylen ist, welches zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, die jeweils optional substituiert sein können;
    Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann; und
    Z Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl oder -O-M ist (M steht für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation), unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH-, Y1 -(CH2)n- (n ist 1, 2 oder 3) und Z -O-M ist, ist Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroxyphenyl ist, und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NHist und Z Pyridyl ist, Cy ein nicht-substituiertes Indolinyl ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform der folgenden Formel (5) dargestellt: Cy-L2-Ar-Y2-C(O)-NH-Z (5)wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist;
    L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen ist, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass L2 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, wie O, NR' (bei R' handelt es sich um Alkyl, Acyl oder Wsaserstoff), S, S(O) oder S(O)2; Ar Arylen ist, das optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann;
    Y2 eine chemische Bindung oder ein, gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält; und
    Z Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl oder -O-M ist (wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht); unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, dann Cy und Z nicht beide Pyridyl sind.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform durch die Formel (6) wiedergegeben: Cy-L3-Ar-Y3-C(O)-NH-Z (6)wobei:
    Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L3 folgendes ist:
    • (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und wobei W -C(O NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH ist; oder
    • (b) C1-C6-Alkylen oder C2-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass es sich bei L3 nicht um -C(O)- handelt, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; wobei NR', R' Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2;
    Ar Arylen ist, das optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein; und
    Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkenylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Aklenylens optional substituiert sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und
    Z Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl oder -O-M ist (M steht für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation);
    vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen die kleinmolekulare Hemmstoffe von HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform eine Struktur auf, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht:
    Figure 00430001
  • Nicht-beschränkende Beispiele kleinmolekularer Hemmstoffe zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind in der Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2 Eigenschaften ausgewählter MG-Anilide in vitro und in vivo (gezeigt in μM)
    Figure 00440001
  • Kleinmolekulare Hemmstoffe gemäß der Erfindung der Formeln Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z, Cy-Y2-C(O)NH-Z und Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z, die in Übereinstimmung mit den folgenden Schemata 1 bis 3 oder unter Verwendung anderer artverwandter Verfahren in geeigneter Weise zubereitet werden.
  • Schema 1
  • Ein Dialkylacetal wird behandelt mit 1-Trimethylsilyloxy-1,3-butadien oder mit 1-Trimethylsilyloxy-2,4-dimethyl-l,3-butadien in Gegenwart von Zinkbromid, um das Aldehyd II zu erzeugen. Mit einer Wittig-Reaktion von II mit einer Carboalkoxyphosphor-Ausbeute, wie Ethyl(triphenylphosphoranyliden)-acetat erzeugt das Dienester III. Die Hydrolyse der Ester funktion in III kann durch die Behandlung mit einer Hydroxidbase, wie beispielsweise Lithiumhydroxid, bewirkt werden, um die entsprechende Säure IV zu erzeugen.
  • Die Säure IV wird zu dem entsprechenden Säurechlorid V umgewandelt gemäß den Standardverfahren, z.B. durch Behandlung mit Natriumhydrid und Oxalylchlorid. Die Behandlung von V mit 1,2-Phenylendiamin und einer tertiären Base, wie N-Methylmorpholin, bevorzugt in Dichlormethan, bei reduzierter Temperatur, erzeugt dann das Anilinylamid VI. Alternativ kann das Säurechlorid
    Figure 00450001
    V mit einem mono-geschützten 1,2-Phenylendiamin behandelt werden, wie beispielsweise 2-(t-BOC-amino)anilin, gefolgt von einer Entschützung, um VI zu erzeugen.
  • Bei einem alternativen Verfahren kann die Säure IV durch Behandlung mit Carbonyldiimidazol (DCI) aktiviert werden, gefolgt von einer Behandlung mit 1,2-Phenylendiamin und Trifluoressigsäure, um das Anilinylamid VI zu erzeugen.
  • Verbindungen der Formel Cy-Y2-C(O)-NH2(VII), wobei Y2:
    Figure 00460001
    Ist, können aus den entsprechenden Methoxy-substituierten Verbindungen (VI) durch Oxidation mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon (DDQ) hergestellt werden, wie im Schema 2 gezeigt
    Figure 00460002
  • Verbindungen der Formel Cy-Y2-C(O)-NH2, wobei Y2 folgende Struktur aufweist:
    Figure 00460003
    können wie in Schema 3 gezeigt hergestellt werden. Das Methoxy-substituierte Dienester III, hergestellt wie im Schema 1 beschrieben, wird mit Triethylsilan und Bortrifluoridetherat behandelt, um die deoxygenierte Verbindung VIII zu erzeugen. Die Umwandlung von VIII zu Anilinylamid X wird vervollständigt durch Verfahren analog zu denen, die in Schema 1 beschrieben sind.
  • Schema 3
    Figure 00470001
  • Verbindungen der Formel Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-M, wobei L1 -S(O)2NH- ist, können in Übereinstimmung mit den synthetischen Routen zubereitet werden, die in den Schemata 4 bis 6 dargestellt sind. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden Verbindungen XI bevorzugt zubereitet in Übereinstimmung mit der allgemeinen synthetischen Route, die im Schema 4 dargestellt ist. Ein Sulfonylchlorid (XII) wird mit einem Amin (XIII) in einem Lösungsmittel, wie etwa Methylenchlorid, in Anwesenheit einer organischen Base, wie etwa Triethylamin, behandelt. Die Behandlung des Rohprodukts mit einer Base, wie etwa Natriummethoxid, in einem alkoholischen Lösungsmittel, wie etwa Methanol, bewirkt die Abspaltung von jeglichem dialkylierten Material und ergibt das Sulfonamid (XIV). Die Hydrolyse der Esterfunktion in XIV kann bewirkt werden durch Behandlung mit einer Hydroxid-Base, wie etwa Lithiumhydroxid, in einem Lösungsmittelgemisch, wie etwa Tetrahydrofuran und Methanol, um die entsprechende Säure (XV) zu erzeugen.
  • Schema 4
    Figure 00480001
  • In einigen Ausführungsformen wird die Umwandlung bzw. Umsetzung der Säure XV in die Hydroxamsäure XI ausgeführt durch Koppeln von XV mit einem geschützten Hydroxylamin, wie etwa Tetrahydropyranylhydroxylamin (NH2OTHP), um das geschützte Hydroxyamat XVI zu erzeugen, gefolgt von saurer Hydrolyse von XVI, um die Hydroxamsäure XI bereitzustellen. Die Kopplungsreaktion wird bevorzugt ausgeführt mit dem Kopplungsreagenz Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in einem Lösungsmittel, wie etwa Methylenchlorid (Verfahren A), oder mit dem Kopplungsreagenz 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid in Anwesenheit von N-Hydroxybenzotriazol in einem aprotischen Lösungsmittel, wie etwa Dimethylformamid (Verfahren D). Andere Kopplungsreagenzien gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls in dieser Reaktion verwendet werden. Die Hydrolyse von XVI wird bevorzugt bewirkt durch Behandlung mit einer organischen Säure, wie etwa Camphorsulfonsäure in einem protischen Lösungsmittel, wie etwa Methanol.
  • Alternativ wird in einigen weiteren Ausführungsformen die Säure XV in ein entsprechendes Säurechlorid umgesetzt bzw. gewandelt, bevorzugt durch Behandlung mit Oxalsäurechlorid, gefolgt durch das Zusetzen eines geschützten Hydroxylamins, wie etwa O-Trimethylsilylhydroxylamin in einem Lösungsmittel, wie etwa Methylenchlorid, das daraufhin die Hydroxamsäure XI beim Aufarbeiten ergibt (Verfahren C).
  • In noch weiteren Ausführungsformen wird der Ester XIV mit Hydroxylamin in einem Lösungsmittel, wie etwa Methanol, in Anwesenheit einer Base, wie etwa Natriummethoxid, behandelt, um die Hydroxamsäure XI direkt zu erhalten (Verfahren B).
  • Schema 5
    Figure 00490001
  • Verbindungen der Formel XX und XXIV werden bevorzugt in Übereinstimmung mit der allgemeinen Prozedur zubereitet, die im vorstehend angeführten Schema 5 ausgeführt ist.
  • Ein Aminoarylhalogenid (XVII) wird mit einem Sulfonylchlorid in Anwesenheit einer Base, wie etwa Triethylamin, behandelt, gefolgt von einer Behandlung mit einer Alkoxid-Base, um das Sulfonamid XVIII zu liefern. Einem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik erschließt sich, dass Umkehr-Sulfonamid-Analoga problemlos durch eine analoge Prozedur zubereitet werden können, wobei ein Halogenarensulfonylhalogenid mit einem Arylamin behandelt wird.
  • Die Verbindung XVIII wird mit einem endständigen Acetylen oder einer Olefinverbindung in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators, wie etwa Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in einem Lösungsmittel, wie etwa Pyrrolidin, gekoppelt, um XIX zu gewinnen.
  • Die Oxidation der Verbindung der Formel XIX (X=CH2OH), gefolgt von Homologation des resultierenden Aldehyds (unter Verwendung eines Wittig-Reagenz-Typs, wie beispielsweise Carbethoxymethylentriphenylphosphoran in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril) ergibt die Verbindung der Formel XXI. Basische Hydrolyse von XXI, wie etwa durch Behandlung mit Lithiumhyddroxid in einem Gemisch aus THF und Wsaser, stellt die Säure XXII bereit. Ein Hydrierung von XXII kann bevorzugt über einen Palladium-Katalysator, wie etwa Pd/C, in einem erotischen Lösungsmittel, wie etwa Methanol, durchgeführt werden, um die gesättigte Säure XXIII zu erzeugen. Das Koppeln der Säure XXIII mit einem O-geschützten Hydroxylamin, wie etw O-Tetrahydropyranylhydroxylamin, wird bewirkt durch Behandlung mit einem Kopplungsreagenz, wie etwa 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, in Anwesenheit von N-Hydroxybenzotriazol (HOBT) oder N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), einem Lösungsmittel, wie etwa DMF, gefolgt durch Entschützung, um die Verbindung der allgemeinen Formel XXIV zu liefern.
  • Die Säure XIX, wobei X=COOH, kann direkt mit einem O-geschützten Hydroxylamin, wie etwa O-Tetrahydropyranylhydroxylamin, gekoppelt werden, gefolgt von einer Entschüt zung der Hydroxy-Schutzgruppe, um die Hydroxamsäure XX zu liefern.
  • Verbindungen der Formel Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-M, wobei L1 -C(O)NH- ist, kann bevorzugt zubereitet werden in Übereinstimmung mit den synthetischen Routen analog zu denjenigen, die in den Schemata 4 und 5 gezeigt sind, unter Substituieren von Säurechlorid-Ausgangsmaterialien für die Sulfonylchlorid-Ausgangsmaterialien in diesen Schemata.
  • Schema 6
    Figure 00510001
  • Verbindungen der Formel Cy-L2-Ar-Y2-C(O)-NH-O-M sind vorzugsweise in Übereinstimmung mit den synthetischen Routen herge- stellt, die in den Schemata 6 bis 8 ausgeführt sind. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden demnach Verbindungen der Formeln XXIX und XXXI (L2 = -C(O)-CH=CH- oder -C(O)-CH2CH2-) bevorzugt in Übereinstimmung mit der im Schema 6 erläuterten Route zubereitet. Ein substituiertes Arylacetophenon (XXV) wird mit einem Arylaldehyd (XXVI) in einem protischen Lösungsmittel behandelt, wie etwa Methanol, in Anwesenheit einer Base, wie etwa Natriummethoxid, um das Enon XXVII zu gewinnen.
  • Der Säure-Substituent von XXVII (R = H) wird mit einem O-geschützten Hydroxylamin, wie etwa O-Tetrahydropyranylhydroxylamin (R1 = Tetrahydropyranyl) gekoppelt, um das O-geschützte N-Hydroxybenzamid XXVIII zu gewinnen. Die Kopplungsreaktion wird bevorzugt durchgeführt durch Behandeln der Säure und Hydroxylamin mit Dicyclohexylcarbodiimid in einem Lösungsmittel, wie etwa Methylenchlorid, oder mit 1-(3-Dimethylaminoipropyl)-3-ethylcarbodiimid in Anwesenheit von N-HYDroxybenzotriazol, m einem Lösungsmittel, wie etwa Dimethylformamid. Andere Kopplungsreagenzien sind auf diesem Gebiet der Technik bekannt und können in dieser Reaktion ebenfalls eingesetzt werden. Eine O-Entschützung wird ausgeführt durch Behandlung von XXVIII mit einer Säure, wie etwa Camphorsulfonsäure XXIX (L2 = -C(O)-CH=CH-), zu gewinnen.
  • Gesättigte Verbindungen der Formel XXXI (L2 = -C(O)-CH2CH2-) werden bevorzugt zubereitet durch Hydrierung von XXVII (R = Me) über einen Palladium-Katalysator, wie etwa 10% Pd/C, in einem Lösungsmittel, wie etwa Methanol-Tetrahydrofuran. Basische Hydrolyse des resultierenden gesättigten Esters XXX mit Lithiumhydroxid, gefolgt von N-Hydroxyamid-Bildung und Säurehydrolyse, wie vorstehend erläutert, wodurch sich die Hydroxamsäure XXXI ergibt.
  • Schema 7
    Figure 00530001
  • Verbindungen der Formel XXXVI (L2 = (CH2)0+2-) werden bevorzugt durch die in Schema 7 erläuterten allgemeinen Prozeduren zubereitet. In einigen Ausführungsformen wird demnach endständiges Olefin (XXXII) mit einem Arylhalogenid (XXXIII) in Anwesenheit eines katalytischen Menge einer Palladiumquelle gekoppelt, wie etwa Palladiumacetat oder Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0), gekoppelt, einem Phosphin, wie etwa Triphenylphosphin, und einer Base, wie etwa Triethylamin, in einem Lösungsmittel, wie etwa Acetonitril, um das gekoppelte Produkt XXXIV zu gewinnen. Hydrierung, gefolgt von N-Hydroxyamid-Bildung und Säurehydrolyse, wie vorstehend erläutert, ergibt die Hydroxamsäure XXXVI.
  • Schema 8
    Figure 00540001
  • Alternativ wird in einigen Ausführungsformen ein Phosphoniumsalz der Formel XXXVII mit einem Arylaldehyd der Formel XXXVIII bei Anwesenheit einer Base behandelt, wie etwa Lithiumhexamethyldisilazid, in einem Lösungsmittel, wie etwa Tetrahydrofuran, um die Verbindung XXXIV herzustellen. Die Hydrierung, gefolgt von N-Hydroxyamid-Bildung und saurer Hydrolyse, ergibt daraufhin die Verbindungen XXXVI (Schema 8).
  • Verbindungen der Formel Cy-L-Ar-Y-C(O)-NH-Z, wobei L L1 oder L2 ist, wie vorstehend, erläutert, Y Y1 oder Y2 ist, wie vorstehend erläutert, und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, werden bevorzugt in Übereinstimmung mit den im Schema 9 ausgeführten synthetischen Routen zubereitet.
  • Schema 9
    Figure 00550001
  • Eine Säure der Formel Cy-L-Ar-Y-C(O)-OH (XXXIX), hergestellt durch eines der in den Schemata 4 bis 8 gezeigten Verfahren, wird in ein entsprechendes Säurechlorid XL in Übereinstimmung mit Standardverfahren umgesetzt bzw. umgewandelt, beispielswise durch Behandlung mit Natriumhydrid und Oxalylchlorid. Die Behandlung von XL mit 2-Aminopyridin und einer tertiären Base, wie N-Methylmorpholin; bevorzugt in Dichlormethan, bei verringerter Temperatur, ergibt daraufhin das Pyridylamid XLI. In ähnlicher Weise kann das Säurechlorid XL behandelt werden mit 1,2-Phenylendiamin, um das Anilinylamid XLII zu gewinnen. Alternativ kann das Säurechlorid XL mit einem monogeschützten 1,2-Phenylendiamin, wie 2-(t-BOC-Amino)anilin, behandelt werden, gefolgt von einer Entschützung zur Erzeu gung von XLII.
  • In einer alternativen Prozedur kann die Säure XXXIX aktiviert werden durch Behandlung mit Carbonyldiimidazol (CDI), gefolgt von einer Behandlung mit 1,2-Phenylendiamin und Trifluoressigsäure, um Anilinylamid XLII zu gewinnen.
  • Schema 10
    Figure 00560001
  • Verbindungen der Formel XLVIII (L2 = -C(O)-Alkylen-) werden bevorzugt in Übereinstimmung mit der in Schema 10 angeführten allgemeinen Prozedur zubereitet. Eine Aldol-Kondensierung von Keton XLIII (R1 = H oder Alkyl) mit Aldehyd XLIV ergibt dadurch das Addukt XLV. Das Addukt XLV kann direkt in eine entsprechende Hydroxamsäure XLVI umgewandelt werden. Die Hydrierung von XLV kann die gesättigte Verbindung XLVII ergeben und sie wird daraufhin umgesetzt in die Hydroxamsäure XLVIII.
  • Schema 11
    Figure 00570001
  • Verbindungen der Formel (5), in denen eines der Kohlenstoffatome in L2 ersetzt ist durch S; S(O) oder S(O)2, werden bevorzugt in Übereinstimmung mit der in Schema 11 ausgeführten allgemeinen Prozedur zubereitet. Thiol XLIX wird deshalb dem Olefin L zugeführt, um LI zu erzeugen. Die Reaktion wird bevorzugt durchgeführt bei Anwesenheit eines Radikalinitiators, wie etwa 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) oder 1,1'-Azobis(cyclohexancarbonitril) (VAZOTM). Sulfidoxidation, bevorzugt durch Behandlung mit m-Chlorperbenzoesäure (mCPBR), ergibt das entsprechende Sulfon, das in geeigneter Weise isoliert wird nach einer Umwandlung zu Methylester durch Behandlung mit Diazomethan. Esterhydrolyse ergibt daraufhin die Säure LII, die umgesetzt wird in die Hydroxamsäure LIII in Übereinstimmung mit einer der vorstehend erläuterten Prozeduren. Das Sulfid LI kann auch direkt in die entsprechende Hydroxamsäure LIV umgewandelt werden, die daraufhin selektiv oxidiert werden kann in Sulfoxid LV, beispielsweise durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid und Tellurdioxid.
  • Die Reagenzien in Übereinstimmung mit der Erfindung sind nützlich als analytische Werkzeuge und als therapeutische Werkzeuge, einschließlich Gentherapie-Werkzeuge. Die Erfindung stellt außerdem Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die manipuliert und fein abgestimmt werden können, um an die Bedingungen) anpassbar zu sein, um behandelt zu werden, während weniger Nebenwirkungen erzeugt werden.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem spezifischen Hemmstoff von HDAC-4, wodurch die HDAC-4-Aktivität gehemmt wird. Wie vorstehend verwendet, bedeutet der Begriff "spezifischer Hemmstoff" ein beliebiges Molekül oder eine beliebige Verbindung, die den Gehalt an HDAC-RNA, HDAC-Protein und/oder HDAC-Protein-Aktivität in einer Zelle verringert. Besonders bevorzugte spezifische Hemmstoffe verringern den Gehalt an RNR, Protein und/oder die Protein-Aktivität in einer Zelle für HDAC-1 und/oder HDAD-4.
  • Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Isoform in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Bevorzugt wird die Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle gehemmt. In bevorzugten Ausführungsformen kann es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle handeln, bei der es sich um ein Tier handeln kann, einschließlich um einen Menschen, und sie kann sich in einem neoplastischen Wachstum befinden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung das Kontaktieren der Zelle mit einem kleinmolekularen HDAC-4-Hemmstoff, das mit der Enzymaktivität der HDAC-4-Isoform interagiert und diese reduziert. In einigen Ausführungsformen ist der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff betriebsmäßig mit dem Antisense-Oligonucleotid verbunden.
  • Die Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung sind nützlich für therapeutische Ansätze bzw. Annäherungen an menschliche Erkrankungen, einschließlich benigne und maligne Neoplasmen durch Hemmen von Proliferation in Zellen, die mit den Antisense-Oligonucleotiden kontaktiert werden. Der Ausdruck "Hemmen von Zellenproliferation" wird verwendet, um die Fähigkeit eines HDAC-4-Antisense-Oligonucleotids oder eines kleinmolekularen HDAC-4-Hemmstoffs (oder eine Kombination hieraus) zu bezeichnen, um das Wachstum von Zellen zu retadieren, die mit dem Oligonucleotid oder kleinmolekularen Hemmstoff kontaktiert werden, im Vergleich zu Zellen, die nicht kontaktiert werden.
  • Eine Zuordnung der Zellenproliferation kann erfolgen durch Zählen von Zellen, die mit dem Oligonucleotid oder dem kleinen Molekül gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht werden, und durch Vergleich dieser Zahl mit der Zahl nichtkontaktierter Zellen unter Verwendung eines Coulter-Zellenzählers (Coulter, Miami, FL) oder einem Hemacytometers. Wenn die Zellen sich in einem soliden Wachstum befinden (beispielsweise ein fester Tumor oder ein Organ), kann eine derartige Zuordnung der Zellenproliferation erfolgen durch Messen des Wachstums des Gewebes oder Organs mit Schublehren und durch Vergleichen der Größe des Wachstums der kontaktierten Zellen mit nicht-kontaktierten Zellen. Bevorzugt umfasst der Begriff einer Retardierung der Zellenproliferation, der zumindest 50% der nicht-kontaktierten Zellen entspricht. Stärker bevorzugt umfasst der Begriff bzw. Term eine Retardierung der Zellenproliferation, der 100 der nicht-kontaktierten Zellen entspricht (d.h., die kontaktierten Zellen, die die Anzahl oder Größe nicht erhöhen). Am stärksten bevorzugt umfasst der Term bzw. Begriff eine Verringerung der Zahl oder Größe der kontaktierten Zellen, verglichen mit den nichtkontaktierten Zellen. HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid oder kleinmolekulare HDAC-4-Hemmstoffe, die die Zellenproliferati on in einer kontaktierten Zelle hemmen, können die kontaktierte Zelle veranlassen, eine Wachstumsretardation, einer Wachstumsabstoppung, einen programmierten Zellentod (d.h. Apoptose) oder einen nekrotischen Zellentod zu unterliegen.
  • Die Zellenproliferations-Hemmfähigkeit der Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung erlaubt die Synchronisation einer Population von asynchron wachsenden Zellen. Beispielsweise können die Antisense-Oligonucleotide gemäß der Erfindung genutzt werden, um eine Population nichtneoplastischer Zellen abzustoppen, die in vitro gewachsen sind, und zwar in der G1- oder G2-Phase des Zellenzyklus. Diese Synchronisierung erlaubt beispielsweise die Identifikation eines Gens und/oder von Genprodukten, ausgedrückt während der G1- oder G2-Phase des Zellenzyklus. Eine derartige Synchronisierung kultivierter Zellen kann auch nützlich sein zum Testen des Wirkungsgrads eines neuen Transfektionsprotokolls, wobei der Transfektionswirkungsgrad variiert und von der speziellen Zellzyklusphase der zu transfizierenden Zelle abhängt. Die Verwendung der Antisense-Oligonucleotide gemäß der Erfindung erlaubt die Synchronisation einer Population von Zellen, was zu Ermittlung von erhöhtem Transfektionswirkungsgrads beiträgt.
  • Die antineoplastische Nützlichkeit der Antisense-Oligonucleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung ist an anderer Stelle dieser Beschreibung erläutert.
  • Gemäß noch weiteren. bevorzugten Ausführungsformen wird die mit HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid kontaktierte Zelle auch in Kontakt gebracht mit einem kleinen molekularen HDAC-4-Hemmstoff.
  • Wie vorliegend verwendet, bezeichnet der Begriff "kleinmolekularer Histon-Deacetylase-Hemmstoff" eine aktive Hälfte, die dazu geeignet ist, mit einer oder mehreren spezifischen Histon-Deacetylase-Isoformen auf dem Protein-Niveau zu interagieren und die Aktivität dieser Histon-Deacetylase-Isoform zu reduzieren. Besonders bevorzugt sind kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoffe, welche die HDAC-1- und/oder die HDAC-4-Isoform hemmen. Ein kleinmolekularer HDAC-1-Hemmstoff ist ein Molekül, welches die Aktivität der HDAC-1-Isoform reduziert. Ein kleinmolekularer HDAC-4-Hemmstoff ist ein Molekül, welches die Aktivität der HDAC-4-Isoform reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Reduktion der Aktivität zumindest das 5-fache, stärker bevorzugt zumindest das 10-fache, besonders stark bevorzugt zumindest das 50-fache. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aktivität der Histon-Deacetylase-Isoform um das 100-fache reduziert. Wie nachfolgend angeführt, handelt es sich bei einem kleinmolekularen bevorzugten Histon-Deacetylase-Hemmstoff um einen solchen, der mit der Enzymaktivität der HDAC-4- und/oder HDAC-1-Isoform interagiert und diese Aktivität reduziert, die in der Tumorigenese beteiligt ist.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff betriebsmäßig mit dem Antisense-Oligonucleotid verbunden. Wie vorstehend angeführt, kann das Antisense-Oligonucleotid in Übereinstimmung mit der Erfindung optional mit an sich bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmittel formuliert sein. Diese Formulierung kann außerdem ein oder mehrere zusätzliche Histon-Deacetylase-Antisense-Oligonucleotide enthalten, und/ oder ein oder mehrere kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoffe, oder ein beliebiges anderes pharmakologisch aktives Agens.
  • Der Begriff "betriebsmäßig verbunden mit" oder "betriebsmäßige Verbindung" umfasst jegliche Verbindung bzw. Assoziation zwischen dem Antisense-Oligonucleotid und dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der es erlaubt, dass ein Antisense-Oligonucleotid eine oder mehrere spezifische Histon-Deacetylase-Isoformen hemmt, die die Nucleinsäure-Expression kodieren und es erlauben, dass der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff spezifische Histon-Deacetylase-Isoform-Enzymaktivität hemmt. Ein oder mehrere Antisense-Oligonucleotide gemäß der Erfindung kann betriebsmäßig verbunden sein mit einem oder mehreren kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist ein Antisense-Oligonucleotid gemäß der Erfindung, das auf eine spezielle Histon-Deacetylase-Isoform (beispielsweise HDAC-4) zielt, betriebsmäßig verbunden mit einem kleinmolekularen Hemmstoff, der auf dieselbe Histon-Deacetylase-Isoform (beispielsweise HDAC-4) zielt. Eine bevorzugte betriebsmäßige Verbindung ist hydrolysierbar. Bevorzugt handelt es sich bei der hydrolysierbaren Verbindung um eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung zwischen dem Antisense-Oligonucleotid und dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff. Eine derartige kovalente Verknüpfung ist hydroly-sierbar beispielsweise durch Esterasen und/oder Amidasen. Beispiele derartiger hydrolysierbarer Assoziationen bzw. Verbindungen sind auf dem Gebiet der Technik gut bekannt. Phosphatester sind besonders bevorzugt.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die kovalente Verknüpfung direkt zwischen dem Antisense-Oligonucleotid und dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff vorliegen, um den kleinmolekularen, Histon-Deacetylase-Hemmstoff in das Rückgrat des Oligonucleotids zu integrieren. Alternativ kann die kovalente Verknüpfung durch eine erweiterte Struktur erfolgen und gebildet sein durch kovalente Verknüpfung des Antisense-Oligonucleotids mit dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff durch Kopplung von sowohl dem Antisense-Oligonucleotid wie dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff mit einem Trägermolekül, wie etwa Carbohydrat, Peptid, Lipid oder Glykolipid. Weitere nützliche betriebsfähige Verbindungen bzw. Assoziationen umfassen eine lipophile Verbindung bzw. Assoziation, wie etwa die Bildung eines Liposoms, das ein Antisense-Oligonucleotid enthält, und den kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der kovalent mit einem lipophilen Molekül verknüpft ist. Derartige lipophile Moleküle enthalten ohne Beschränkung Phosphotidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin und synthetische Neoglykolipide, wie beispielsweise syalyllacNAc-HDPE. In bestimmten Ausführungsformen kann es sich bei der betreibbaren Verbindung nicht um eine physikalische Verbindung bzw. Assoziation handeln, sondern einfach um eine simultane Koexistenz in dem Körper, beispielsweise dann, wenn das Antisense-Oligonucleotid mit einem (einzigen) Liposom verbunden ist, während der kleinmolekulare Hemmstoff mit einem weiteren Liposom verbunden ist.
  • Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der neoplastischen Zellenproliferation in einem Tier bereit, aufweisend das Verabreichen an ein Tier mit zumindest einer neoplastischen Zelle, die in einem Tier vorhanden ist, einer therapeutisch wirksamen Menge eines spezifischen Hemmstoffs von HDAC-4, wobei die neoplastische Zellenproliferation in dem Tier gehemmt wird. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des neoplastischen Zellenwachstums in einem Tier bereit. In diesem Verfahren wird eine therapeutisch wirksame Menge des Antisense-Oligonucleotids gemäß der Erfindung einem Tier verabreicht, das zumindest eine neoplastische Zelle in seinem Körper aufweist, wobei das Oligonucleotid mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine therapeutisch wirksame Zeitdauer verabreicht wird. Bevorzugt handelt es sich bei dem Tier um ein Säugetier, insbesondere um ein domestiziertes Säugetier. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Tier um einen Menschen.
  • Der Begriff "neoplastische Zelle" wird verwendet, um eine Zelle zu bezeichnen, die ein regelwidriges Zellenwachstum zeigt. Eine neoplastische Zelle kann eine hyperplastische Zelle sein, eine Zelle, die das Nichtvorliegen einer Kontakthemmung des Wachstums in vitro zeigt, eine benigne Tumorzelle, die zu einer Metastase in vivo nicht in der Lage ist, oder eine Krebszelle, die zu Metastasen in vivo in der Lage ist und nach einer versuchten Entfernung rekuriert. Der Begriff "Tumorigenese" wird verwendet, um die Induktion einer nicht charakteristischen oder unzeitgemäßen Zellenproliferation zu bezeichnen, die zu der Entwicklung eines neoplastischen Wachstums führt.
  • Wie vorliegend verwendet, bedeutet der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge von jeder aktiven Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Verfahrens, das ausreicht, einen bedeutungsvollen Patientennutzen zu zeigen, d.h., das Hemmen der HDAC-Aktivität, insbesondere der HDAC-1- und/oder HDAC-4-Aktivität oder das Hemmen des neoplastischen Wachstums oder für die Behandlung proliferativer Erkrankungen und Störungen. Angewendet auf ein einzelnes aktives Ingredienz und alleine verabreicht bezieht sich der Begriff auf das Ingredienz allein. Angewendet auf eine Kombination bezieht sich der Begriff auf kombinierte Mengen der aktiven Ingredienzien, die in der therapeutischen Wirkung resultieren, unabhängig davon, ob er in Kombination, seriell oder simultan verabreicht wird.
  • Die Verabreichung des synthetischen Oligonucleotids gemäß der Erfindung, verwendet in der pharmazeutischen Zusammensetzung oder zur Ausführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, kann m einer Vielzahl herkömmlicher Weisen ausgeführt werden, wie etwa intraokular, durch orale Einnahmen, Inhalation oder über die Haut, unter die Haut, intramuskulär oder durch intravenöse Injektion.
  • Wenn eine therapeutisch wirksame Menge des synthetischen Oligonucleotids gemäß der Erfindung oral verabreicht wird, liegt das synthetische Oligonucleotid in Form einer Tablette, Kap sel, in Form eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vor. Wenn in Tablettenform verabreicht, kann die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zusätzlich einen festen Träger bzw. Feststoffträger, wie etwa Gelatine, oder einen Hilfsstoff zusätzlich enthalten. Die Tablette, die Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95% synthetisches Oligonucleotid und bevorzugt von etwa 25 bis 90% synthetisches Oligonucleotid. Wenn in flüssiger Form verabreicht, kann ein flüssiger Träger, wie etwa Wasser, Petroleum, Tieröle, oder Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie etwa Erdnussöl, Mineraöl, Sojabohnenöl, Sesamöl oder synthetische Öle zugesetzt sein. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann außerdem eine physiologische Salzlösung, Dextrose, oder eine andere Saccharidlösung oder Glykole enthalten, wie etwa Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol. Wenn in flüssiger Form verabreicht, enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% des synthetischen Oligonucleotids und bevorzugt von etwa 1 bis 50% synthetisches Oligonucleotid.
  • Wenn eine therapeutisch wirksame Menge des synthetischen Oligonucleotids gemäß der Erfindung durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraokulare oder intraperitoneale Injek- tion verabreicht wird, liegt das synthetische Oligonucleotid in der Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässerigen Lösung vor. Die Zubereitung derartiger parenteral verträglicher Lösungen unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität, der Stabilität und dergleichen, gehört zum Wissen des Fachmanns auf diesem Gebiet der Technik. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intraokulare Injektion sollte zusätzlich zu dem synthetischen Oligonucleotid ein isotonisches Vehikel enthalten, wie etwa eine Natriumchlorid-Injektion, Ringer's-Injektion, eine Dextrose-Injektion, eine Dextrose- und Natriumchlorid-Injektion, eine lactatierte Ringer's Injektion oder ein anderes Vehikel, das auf diesem Gebiet der Technik bekannt ist. Die pharmazeuti- sche Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidanzien oder andere Zusätze enthalten, die dem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik bekannt sind.
  • Die Menge des synthetischen Oligonucleotids in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung hängt ab von der Natur und Ernsthaftigkeit des behandelten Zustands und von der Natur der bisherigen Behandlungen, denen ein Patient unterlegen ist. Letztendlich entscheidet der behandelnde Arzt über die Menge des synthetischen Oligonucleotids, mit, welchem jeder einzelne Patient behandelt werden soll. Anfänglich verabreicht der behandelnde Arzt eine geringe Dosis des synthetischen Oligonucleotids und beobachtet die Reaktion des Patienten. Größere Dosen des synthetischen Oligonucleotids können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erhalten wurde, und zu diesem Zeitpunkt wird die Dosierung nicht weiter erhöht. Es wird in Betracht gezogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße Verfahren in die Praxis umzusetzen, etwa 10 μg bis etwa 20 mg synthetisches Oligonucleotid pro kg Körper- oder Organgewicht enthalten sollten.
  • Die Dauer einer intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung variiert abhängig von der Ernsthaftigkeit der Erkrankung, die behandelt wird, und dem Zustand sowie der potentiellen idiosynkratischen, Reaktion jedes einzelnen Patienten. Letztendlich entscheidet der behandelnde Arzt die geeignete Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung systemisch mit ausreichender Dosierung verabreicht, um einen Antisense-Oligonucleotid-Blutpegel von etwa 0,01 μM bis etwa 20 μM zu erreichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung in ausreichender Do- sierung verabreicht, um einen Antisense-Oligonucleotid-Blutpegel von etwa 0,05 μM bis etwa 15 μM zu erreichen. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt der Antisense-Oligonucleotid-Blutpegel von etwa 0,1 μM bis etwa 10 μM.
  • Für eine lokalisierte Verabreichung können viel geringere Konzentrationen als diese therapeutisch wirksam sein. Bevorzugt reicht eine Gesamtdosierung von Antisense-Oligonucleotid von etwa 0,1 mg bis etwa 200 mg Oligonueleotid pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht eine Gesamtdosierung von Antisense-Oligonucleotid von etwa 1 mg bis etwa 20 mg Oligonucleotid pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht die Gesamtdosierung von Antisense-Oligonucleotid von etwa 1 mg bis etwa 10 mg Oligonucleotid pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die therapeutisch wirksame Menge von HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid von etwa 5 mg Oligonucleotid pro kg Körpergewicht pro Tag.
  • Das Verfahren kann außerdem vorsehen das Verabreichen für ein Tier von einer therapeutisch wirksamen Menge eines kleinmolekularen HDAC-4-Hemmstoffs mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine therapeutisch wirksame Zeitdauer. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff betriebsmäßig verbunden mit einem Antisense-Oligonucleotid, wie supra erläutert.
  • Der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff, enthaltend eine therapeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung, wird systemisch mit einer ausreichenden Dosis verabreicht, um einen Blutpegel bezüglich des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,01 μM bis etwa 10 μM zu erzielen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung mit einer ausreichenden Dosierung verabreicht, um einen Blutpegel bezüglich des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,05 μM bis etwa 10 μM zu erreichen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt der Blutpegel bezüglich des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 μM bis etwa 5 μM. Für eine lokalisierte Verabreichung können viel geringere Konzentrationen als diese wirksam sein. Bevorzugt reicht die Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht die Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 mg bis etwa 50 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht die Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 mg bis etwa 25 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die therapeutisch wirksame synergistische Menge des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs (bei einer Verabreichung mit einem Antisense-Oligonucleotid) von etwa 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
  • Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einer verbesserten Hemmungswirkung resultiert, werden die therapeutisch wirksamen Konzentrationen von sowohl dem Nucleinsäurepegel-Hemmstoff (d.h. dem Antisense-Oligonucleotid) wie dem Prote- inpegel-Hemmstoff (d.h. dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff), die erforderlich sind, um eine gegebene Hemmungswirkung zu erzielen, verringert im Vergleich zu denjenigen, die erforderlich sind, wenn sie einzeln verwendet werden.
  • Einem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik erschließt sich außerdem, dass die therapeutisch wirksame synergistische Menge von entweder dem Antisense-Oligonucleotid oder dem Histon-Deacetylase-Hemmstoff verringert oder erhöht werden kann durch Feinabstimmung und Änderung der Menge der anderen Komponenten. Die Erfindung stellt deshalb ein Verfahren bereit, um die Verabreichung/Behandlung für spezielle Exigenzien, die für eine gegebene Tierspezies oder einen speziellen Patienten gegeben sind, zuzuschneidern. Therapeutisch wirksame Bereiche können problemlos beispielsweise empirisch ermittelt werden durch Starten bei relativ geringen Mengen und schrittweise Erhöhung bei gleichzeitiger Evaluierung der Hemmwirkung.
  • In einer vierten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Isoform in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff gemäß dem ersten Aspekt- der Erfindung. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des vierten Aspekts der Erfindung wird die Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle gehemmt. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle, die in einem Tier, einschließlich einem Menschen, vorliegen kann, und die sich in einem neoplastischen Wachstum befinden kann.
  • In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des neoplastischen Zellenwachstums in einem Tier bereit, aufweisend das Verabreichen für ein Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle in seinem Körper aufweist, eine therapeutisch wirksame Menge eines kleinmolekularen Hemmstoffs gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine therapeutisch wirksame Zeitdauer.
  • Der kleinmolekulare Histon-Deacetylase-Hemmstoff, enthaltend eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung wird systemisch mit einer ausreichenden Dosierung verabreicht, um einen Blutpegel bezüglich des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,01 μM bis etwa 10 μM zu erzielen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung mit einer ausreichenden Dosierung verabreicht, um einen Blutpegel bezüglich des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,05 μM bis etwa 10 μM zu erzielen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Blutpegel des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 μM bis etwa 5 μM. Für eine lokalisierte Verabreichung können viel geringere Konzentrationen als diese wirksam sein. Bevorzugt reicht eine Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 mg bis etwa 50 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamtdosierung des kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs von etwa 0,1 mg bis etwa 25 mg Protein-Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag.
  • In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der Induktion von Zellenproliferation bereit, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression von HDAC-4 hemmt, oder das Kontaktieren einer Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle und die Induktion der Zellenproliferation ist die Tumorigenese.
  • Die Erfindung stellt außerdem kleinmolekulare Histon- Deacetylase-Hemmstoffe bereit, die erzeugbar sind und spezifisch die Histon-Deacetylase-Isoform(en) hemmen, die erforderlich ist bzw. sind, Zellenproliferation zu induzieren, beispielsweise HDAC-1 und HDAC-4, während sie keine weiteren Histon-Deacetylase-Isoformen hemmen, die nicht erforderlich sind, die Zellenproliferation zu induzieren. Gemäß einem siebten Aspekt stellt die Erfindung demnach ein Verfahren zum Identifizieren eines kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs bereit, der die HDAC-4-Isoform und/oder die HDAC-1-Isoform hemmt, die erforderlich ist für die Induktion von Zellenproliferation. Das verfahren umfasst das Kontaktieren der HDAC-4- und/oder der HDAC-1-Isoform mit einem kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff und das Messen der Enzymaktivität der kontaktierten Histon-Deacetylase-Isoform, wobei eine Reduktion der Enzymaktivität der kontaktierten Histon-Deacetylase-Isoform den kleinmolekularen Kandidat-Hemmstoff identifiziert als kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Histon-Deacetylase-Isoform hemmt, d.h., HDAC-4 und/oder HDAC-1.
  • Das Messen der Enzymaktivität von HDAC-4 oder HDAC-1 kann erzielt werden unter Verwendung bekannter Methoden. Beispielsweise erläutern Yoshida et al. (J. Biol. Chem., 265: 17174–17179, 1990) die Bestimmung der Histon-Deacetylase-Enzymaktivität durch Ermittlung acetylierter Histone in Trichostatin A-behandelten Zellen. Taunton et al. (Science, 272: 408–411, 1996) erläutern in ähnlicher Weise Verfahren zum Messen der Histon-Deacetylase-Enzymaktivität unter Verwendung endogener und rekombinanter HDAC. Sowohl Yoshida et al. (J. Biol. Chem., 265: 17174–17179, 1990) wie Taunton et al. (Science, 272: 408–411, 1996) werden hiermit unter Bezug genommen.
  • Bevorzugt handelt es sich bei dem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die HDAC-4- und/oder die HDAC-1-Isoform hemmt, die erforderlich ist für die Induktion von Zellenproliferation, um einen kleinmolekularen HDAC-4-Hemmstoff, der mit der Enzymaktivität der HDAC-4- und/oder der HDAC-1-Isoform interagiert und diese Aktivität reduziert.
  • Gemäß einem achten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifzieren eines kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoffs bereit, der die HDAC-4-Isoform hemmt, die in der Induktion von Zellenproliferation beteiligt ist. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer Zelle mit einem kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff und das Messen der Enzymaktivität der kontaktierten Histon-Deacetylase-Isoform, wobei eine Reduktion der Enzymaktivität der HDAC-4-Isoform dem kleinmolekularen Kandidaten-Hemmstoff als kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff identifiziert, der HDAC-4 hemmt.
  • Gemäß einem neunten Aspekt stellt die Erfindung einen kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff bereit, der durch das Verfahren gemäß dem siebten oder achten Aspekt der Erfindung identifiziert wird. Bevorzugt ist der kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff im wesentlichen rein.
  • Gemäß einem zehnten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der Zellenproliferation in einer Zelle bereit, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle mit zumindest zwei Reagenzien, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die bestehen aus einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-4-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression der Aktivität der HDAC-4-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-1-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression der Aktivität der HDAC-I-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression einer DNA-Methyl-Transferase hemmt, und einem kleinmolekularen DNA-Methyl-Transferase-Hemmstoff. In einer Ausführungsform ist das Hemmen des Zellenwachstums der kontaktierten Zelle stärker ausgeprägt als das Hemmen des Zellenwachstums einer Zelle, die mit ausschließlich einem der Reagenzien in Kontakt gebracht ist. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes der Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, im wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle. In noch weiteren zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen sind die Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, betriebsmäßig zugeordnet bzw. verbunden.
  • Gemäß einem elften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums neoplastischer Zellen bereit, aufweisend das Kontaktieren einer Zelle von zumindest zweier Reagenzien, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression von HDAC-4-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression bzw. die Aktivität der HDRC-4-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression der HDAC-1-Isoform hemmt, einem kleinmolekularen Histon-Deacetylase-Hemmstoff, der die Expression bzw. Aktivität der HDAC-1-Isoform hemmt, einem Antisense-Oligonucleotid, das die Expression einer DNA-Methyl-Transferase hemmt, und einem kleinmolekularen DNA-Methyl-Transferase-Hemmstoff. Gemäß einer Ausführungsform ist das Hemmen des Zellenwachstums der kontaktierten Zelle stärker ausgeprägt als das Hemmen des Zellenwachstums einer Zelle, die mit ausschließlich einem der Reagenzien in Kontakt gebracht ist. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes der Reagenzien, ausgewählt ausgewählt aus der Gruppe, im wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zelle um eine neoplastische Zelle. In noch weiteren zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen sind die Reagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, betriebsmäßig assoziiert bzw. verbunden bzw. zugeordnet.
  • Antisense-Oligonucleotide, welche die DNA-Methyl-Transferase hemmen, sind beschrieben in Szyf und von Hofe, US-Patent Nr. 5 578 716. Die kleinmolekulare DNA-Methyl-Transferase-Hemmstoffe umfassten ohne Beschränkung 5-Aza-2'-deoxycytidin (5-Aza-dC), 5-Fluor-2'-deoxycytidin, 5-Azacytidin (5-Aza-C) oder 5,6-Dihydro-5-azacytidin.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ohne Beschränkung zu erläutern. Dem Fachmann auf diesem Gebiet erschließt sich, oder er ist in der Lage, sicherzustellen, nicht mehr als ein Routineexperiment einsetzen zu müssen, wie zahlreiche Äquivalente der spezifischen Substanzen und Prozeduren, die hierin erläutert sind, auszuführen. Diese Äquivalente fallen in den Umfang dieser Erfindung und sind durch die anliegenden Ansprüche abgedeckt.
  • Beispiel 1
  • Synthese und Identifikation von Antisense-Oligonucleotiden
  • Antisense(AS)- und Fehlanpassungs(MM)-Oligodesoxynucleotide (Oligos) wurden dazu bestimmt, gerichtet zu werden gegen den 5'- oder 3'-untranslatierten Bereich (UTR) des angezielten Gens. Oligos wurden mit dem Phosphorthioat-Rückgrat und der 4 × 4-Nucleotiden-2'-O-Methyl-Modifikation auf einem automatisierten Synthetisierer synthetisiert und gereinigt durch präparative Umkehrphasen-HPLC. Sämtliche verwendeten Oligos waren 20 Basenpaare lang.
  • Um ein Antisense-Oligodesoxynucleotid (ODN) zu identifizieren, das geeignet ist, die HDAC-1-Expression in menschlichen Krebszellen zu hemmen, wurden elf Phosphorthioat-ODNS, enthaltend Sequenzen komplementär zu dem 5'- oder 3'-UTR des menschlichen HDAC-1-Gens (GenBank Zugangs-Nr. U50079) anfäng lich in T24-Zellen bei 100 nM gescreent. Die Zellen wurden nach 24 Stunden der Behandlung geerntet und die HDAC-1-RNA-Expression wurde durch die Northern-Blot-Analyse analysiert. Dieser Screen identifizierte HDAC-1-AS als ein ODN mit Antisense-Aktivität für menschliches HDAC-1. Das HDAC-1-MM-Oligo wurde als Kontrolle im Vergleich zu dem Antisense-Oligo erzeugt, und es zeigte eine 6-Basen-Fehlanpassung.
  • 24 Phosphorthioat-ODN, enthaltend Sequenzen komplementär zu dem 5'- oder 3'UTR des menschlichen HDAC-2-Gens (GenBank Zugangs-Nr. U31814) wurden wie oben gescreent. Das HDAC-2-AS wurde als ein ODN identifiziert mit Antisense-Aktivität für menschliches HDAC-2. Das HDAC-2-MM wurde als Kontrolle erzeugt; im Vergleich zu dem Antisense-O1igo enthält es eine 7-basige Fehlanpassung.
  • 21 Phosphorthioat-ODN, enthaltend Sequenzen komplementär zu dem 5'- oder 3'-UTR des menschlichen HDRC-3-Gens (GenBank Zugangs-Nr. AF039703) wurden wie vorstehend angeführt gescreent. Das HDAC-3-AS wurde als ein ODN mit Antisense-Aktivität für menschliches HDAC-3 identifiziert. Das HDAC-3-MM-Oligo wurde als Kontrolle erzeugt; im Vergleich zu dem Antisense-Oligo enthält es eine 6-basige Fehlanpassung.
  • 17 Phosphorthioat-ODN, enthaltend Sequenzen komplementär zu dem 5'- oder 3'-UTR des menschlichen HDAC-4-Gens (GenBank Zugangs-Nr. AB006626) wurden wie vorstehend angeführt gescreent. Das HDAC-4-AS wurde als ein ODN mit Antisense-Aktivität für menschliches HDAC-4 identifiziert. HDAC-4-MM-Oligo wurde als Kontrolle erzeugt; im Vergleich zu dem Antisense-Oligo enthält es eine 6-basige Fehlanpassung.
  • 13 Phosphorthioat-ODN, enthaltend Sequenzen komplementär zu dem 5'- oder 3'-UTR des menschlichen HDAC-6-Gens (GenBank Zugangs-Nr. AJ011972) wurden wie oben gescreent. Das HDAC-6-AS wurde als ein ODN mit Antisense-Aktivität für menschliches HDAC-6 identifiziert. Ein HDAC-6-MM-Oligo wurde als Kontrolle erzeugt; im Vergleich zu dem Antisense-Oligo enthält es eine 7-basige Fehlanpassung.
  • Beispiel 2
  • HDAC-AS-ODN hemmen spezifisch die Expression auf dem mRNA-Niveau
  • Um zu Ermitteln, ob die AS-ODN-Behandlung die HDAC-Expression auf dem mRNA-Niveau reduziert hat, wurden menschliche A549-Zellen mit 50 nM Antisense(AS)-Oligo behandelt, gerichtet gegen menschliches HDAC-3, oder seine entsprechende Fehlanpassungs(MM)-Oligo für 48 Stunden, und die A549-Zellen wurden mit 50 nM bzw. 100 mM AS-Oligo behandelt, gerichtet gegen menschliches HDAC-4 oder sein MM-Oligo (100 nM) für 24 Stunden.
  • Kurz gesagt, wurden menschliche A549- und/oder menschliche T24-Blasenkarzinomzellen in 10 cm Gewebekulturschalen ein Tag vor der Oligonucleotidbehandlung gesät. Die Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, vA) erhalten und wachsen gelassen unter den empfohlenen Kulturbedingungen. Vor dem Hinzusetzen der Oligonucleotide wurden. Zellen mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) gewaschen. Als nächstes wurde Lipofektin-Transfektionsreagenz (GIBCO BRL Mississauga, Ontario, Kalifornien) mit einer Konzentration von 6,25 μg/ml dem serumfreien OPTIMEM-Medium (GIBCO BRL, Rockville, MD) zugesetzt, das daraufhin den Zellen zugesetzt wurde. Die Oligonucleotide, die gescreent werden sollten, wurden daraufhin direkt den Zellen zugesetzt (d.h., ein Oligonucleotid pro Zellenplatte). Fehlangepasste Oligonucleotide wurden als Kontrollen verwendet. Dieselbe Konzentration von Oligonucleotid (z.B. 50 nM) wurde pro Zellenplatte für jedes getestete Oligonucleotid verwendet.
  • Die Zellen wurden geerntet und sämtliche RNA wurden durch Northern-Blot-Analyse analysiert. Kurz gesagt, wurde die RNA extrahiert unter Verwendung von RNeasy-Miniprep-Säulen (QIAGEN). 10 bis 20 μg sämtlicher RNA wurde laufen gelassen auf einem formaldehydhaltigen 1%igen Agarosegel mit 0,5 M Natriumphosphat (pH 7,0) als Puffer-System. Daraufhin wurde die RNA auf Nitrocellulosemembranen und hybridisiert mit dem angezeigten bzw. indizierten radiomarkierten DNA-Sonden. Autoradiographie wurde durchgeführt unter Verwendung herkömmlicher Prozeduren.
  • Wie in 3A und 3B gezeigt, wurde die Expression von HDAC-3-mRNA und HDAC-4-mRNA in menschlichen A549-Zellen durch Behandlung mit den jeweiligen Antisense-Oligonucleotiden gehemmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass HDAC-ASODN spezifisch die angezielte HDAC-Expression auf dem mRNA-Niveau hemmen kann.
  • Beispiel 3
  • HDAC-OSDN hemmen die HDAC-Proteinexpression
  • Um zu ermitteln, ob eine Behandlung mit HDAC-OSDN die HDAC-Proteinexpression hemmen kann, wurden menschliche A549-Krebszellen mit 50 nM gepaarten Antisense- oder Fehlanpassungs-Oligos behandelt, die gerichtet waren gegen menschliches HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4 oder HDAC-6 für 48 Stunden. OSDN-Behandlungsbedingungen waren so, wie vorstehend erläutert.
  • Die Zellen wurde in einem Puffer lysiert, der 1% Triton X -100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 5 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthält, plus Protease-Hemmstoffe. Das Gesamtprotein wurde quantifiziert durch ein Protein-Assayreagenz von Bio-Rad (Hercules, CA). 100 μg des gesamten Proteins wurden analysiert durch SDS-PAGE. Als nächstes wurde das Gesamtprotein in eine PVDF-Membran übertragen und mit verschiedenen HDAC-spezifischen primären Antikörpern geprüft. Kaninchen-anti- HDAC-1- (N-51), anti-HDAC-2- (H-54) Antikörper (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) wurden mit einer Verdünnung von 1:500 verwendet. Ein Kaninchen-anti-HDAC-3-Antikörper (Sigam, St. Louis, MO) wurde mit einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Ein Anti-HDAC-4-Antikörper würde so zubereitet wie vorstehend erläutert (Wang, S.H. et al. (1999), Mol. Cell. Biol., 19: 7816–27), und verwendet mit einer Verdünnung von 1:1000. Ein Anti-HDAC-6-Antikörper wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem GST-Fusionsprotein aufgezogen, enthaltend ein Fragment von HDAC-6-Protein (Aminosäure #990 bis #1216, GenBank Zugangs-Nr. AAD29048). Kaninchen-Antiserum wurde getestet und als ausschließlich spezifisch mit dem menschlichen HDAC-6-Isoform reagierend ermittelt. HDAC-6-Antiserum wurde mit einer Verdünnung von 1:500 in Western-Blots verwendet, um das HDAC-6 in sämtlichen Zelllysaten zu ermitteln. Ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter sekundärer Antikörper wurde mit einer Verdünnung von 1:5000 verwendet, um die primäre Antikörper-Bindung zu ermitteln. Die sekundäre Antikörper-Bindung wurde visualisiert unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Detektions-Kits (Amersham-Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway, NJ).
  • Wie in 4 gezeigt, hemmt die Behandlung von Zellen mit HDAC-1-, HDAC-2-, HDAC-3-, HDAC-4- oder HDAC-6-ODN für 48 Stunden spezifisch die Expression des jeweiligen HDAC-Isotyp-Proteins.
  • Um zu demonstrieren, dass der Pegel der HDAC-Proteinexpression einen. wesentlichen Faktor im Krebszellen-Phenotyp darstellt, wurden Experimente ausgeführt, um den Pegel der HDAC-Isotyp-Expression in normalen Zellen und Krebszellen zu ermitteln. Eine Western-Blot-Analyse wurde so durchgeführt, wie vorstehend erläutert.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt. Diese zeigt deutlich, dass HDAC-1-, HDAC-2-, HDAC-3-, HDAC-4 und HDAC-6- Iso-typ-Proteine in den Krebszellenlinien überstark ausgedrückt (overexpressed) waren.
  • Tabelle 3 Expressionspegel von HDAC-Isotypen in menschlichen normalen und Krebszellen
    Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Beispiel 4
  • Wirkung HDAC-Isotop-spezifischer OSDN auf Zellenwachstum und Apoptose
  • Um die Wirkung der HDAC-OSDN auf das Zellenwachstum und den Zellentod durch Apoptose zu ermitteln, wurden A549- oder T24-Zellen, MDAmb231-Zellen und HMEC-Zellen (ATCC, Manassas, VA) mit HDAC-OSDN behandelt, wie vorstehend erläutert.
  • Für die Apoptose-Studien wurden Zellen aralysiert unter Verwendung des Zelltod-Ermittlungs-ELISAPlus-Kits (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Deutschland) in Übereinstimmung mit den Anleitungen des Herstellers. Typischerweise wurden 10.000 Zellen in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen für 2 Stunden plattiert vor der Ernte und Lyse. Jede Probe doppelt analysiert. ELISA-Lesen erfolgte unter Verwendung eines MR700-Plattenlesers (DYNEX Technology, Ashford, Middlesex, England) bei 410 nm. Als Referenz wurde eine Wellenlänge von 490 nm gewählt.
  • Für die Zellenwachstumsanalyse wurden menschliche Krebszellen oder normale Zellen mit 50 nM gepaarter RS- oder MM-Oligos behandelt, die gegen menschliches HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4 oder HDAC-6 gerichtet waren, und zwar für 72 Stunden. Die Zellen wurden geerntet und die Zellenanzahl wurde unter Verwendung von Trypan-Blau-Exklusion unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Der Prozentsatz der Hemmung wurde berechnet als (100 – AS-Zellenanzahl/Kontroll-Zellenanzahl).
  • Die Ergebnisse der Studie sind in den 5 und 6 gezeigt sowie in der Tabelle 4 und der Tabelle 5. Die Behandlung menschlicher Krebszellen durch HDAC-4-AS und zu einem geringeren Ausmaß HDAC-1-AS induziert eine Wachstumsblockade und Apoptose verschiedener menschlicher Krebszellen (5 und 6, Tabelle 4 und Tabelle 5). Die entsprechenden Fehlanpassungen hatten keine Wirkung. Die Wirkungen von HDAC-4-AS oder HDAC-1-AS auf die Wachstumshemmung und die Apoptose sind signifikant reduziert in menschlichen normalen Zellen. Im Gegensatz zu den Wirkungen von HDACA-4- oder HDAC-1-AS-Oligos zeigt die Behandlung mit menschlicher HDAC-3- und HDAC-6-OSDN keine Wirkung auf Krebszellenwachstum bzw. die Apoptose und die Behandlung mit menschlicher HDAC-2-OSDN hat eine minimale Auswirkung auf die Krebszellen-Wachstumshemmung. Da T24-Zellen p53-Null- und A549-Zellen vom p53-Wild-Typ sind, ist diese Apoptose-Induktion unabhängig von der p53-Aktivität.
  • Tabelle 4 Gen-Transkription, geändert durch HDAC-4-AS1
    Figure 00820001
  • Menschliche A549-Zellen wurden mit 50 nM-Oligos für zwei Tage behandelt, bevor sämtliche RNA für die cDNA-Array-Analyse geerntet wurden;
    eine Faltungsänderung auf Transkriptionen wurde mit derjenigen von HDAC-4-Fehlanpassungs-Oligo(MM2)-behandelten Zellen verglichen;
    Die Expression von 39 Genen, geändert durch HDACA-4-ASl von 588 Genen
  • Tabelle 5 Wirkung, von HDAC-Isotyp-spezifischen OSDN auf menschliche normale und Krebszellen-Apoptose nach 48 Stunden Behandlung
    Figure 00820002
  • Beispiel 5
  • Die Hemmung von HDAC-Isotypen induziert die Expression von Wachstumsregelungs-Genen
  • Um den Mechanismus des Wachstumsabstoppens und der Apoptose von Krebszellen, der durch HDAC-1- oder HDAC-4-AS-Behandlung zu verstehen, wurden RNase-Schutz-Assays verwendet, um die mRNA-Expression der Zellenwachstums-Regulatoren (p21 und GADD45) und des proapoptotischen Gens Bax zu analysieren.
  • Kurze gesagt, menschliche A549- oder T24-Krebszellen wurden mit HDAC-Isotyp-spezifischen Antisense-Oligonucleotiden (jedes 50 nM) für 48 Stunden behandelt. Die gesamt RNA wurde extrahiert und die RNase-Schutz-Assays wurden durchgeführt, um den mRNA-Expression-Pegel von p21 und GADD45 zu analysieren. Als eine Kontrolle wurden A599-Zellen mit Lipofektin behandelt, mit oder ohne TSA(250 ng/ml)-Behandlung, für 16 Stunden. Diese RNase-Schutz-Assays wurden in Übereinstimmung mit der folgenden Prozedur durchgeführt. Die gesamte RNA aus Zellen wurde unter Verwendung von "Rneasy miniprep kit" von QUIAGEN hergestellt, und zwar nach Anleitung des Herstellers. Markierte Sonden, die in den Schutz-Assays verwendet wurden, wurden unter Verwendung von "hStress-1 multiple-probe template sets" von Pharmingen (San Diego, Kalifornien, U.S.A.) in Übereinstimmung mit der Anleitung des Herstellers synthetisiert. Die Schutzprozeduren wurden unter Verwendung von "RPA IITM-Ribonuclease Protection Assay Kit" von Ambion (Austin, Tx) in Übereinstimmung mit der Anleitung des Herstellers ausgeführt. Eine Quantifizierung der Bänder von Autoradiogrammen erfolgte unter Verwendung des CycloneTM-Phosphor-Systems (Packard Instruments Co. Inc., Meriden, CT). Die Ergebnisse sind in 7 und Tabelle 6 gezeigt bzw. aufgeführt.
  • Tabelle 6 Hochregulierung von p21, GADD45- und Bax-Zellennachbehandlung mit menschlichen HDAC-Isotyp-spezifischen Antisensen
    Figure 00830001
  • Die Werte zeigen die Faltinduktion der Transkription, gemessen durch RNase-Schutzanalyse, für, die jeweiligen AS-versus-MM-HDAC-Isotyp-spezifischen Oligos an.
  • Wie aus 7 hervorgeht, reguliert die Hemmung von HDAC-4 sowohl in A549- wie T24-Krebszellen dramatisch sowohl den p21- wie die GADD45-Expression in Aufwärtsrichtung. Die Hemmung von HDAC-1 durch Antisense-Oligonucleotide induziert die p21-Expression, jedoch in größerem Umfang die GADD45-Expression. Die Hemmung von HDAC-4 regelt die Bax-Expression sowohl in A549- wie in T24-Zellen in Aufwärtsrichtung. Die Wirkung der HDAC-4-AS-Behandlung (50 nM, 48 Stunden) auf die p21-Induktion in A549-Zellen ist vergleichbar mit derjenigen von TSA (0,3 bis 0ü,8 μM, 16 Stunden).
  • Experimente wurden auch durchgeführt, um die Wirkung von HDAC-Antisense-Oligonucleotiden auf die HDAC-Proteinexpression zu untersuchen. In A549-Zellen führt die Behandlung mit HDAC-4-Antisense-Oligonucleotiden zu einer dramatischen Erhöhung des Pegels von p21-Protein (8).
  • Beispiel 7
  • Hemmung von HDAC-Isotopen durch kleine Moleküle
  • Um die Identifikation von kleinmolekularen HDAC-Hemmstoffen zu demonstrieren, wurden kleinmolekulare HDAC-Hemmstoffe in Histon-Deacetylase-Enzymassays aescreent unter Verwendung verschiedener menschlicher Histon-Deacetylase-Isotyp-Enzymen (d.h., HDAC-1, HDAC-3, HDAC-4 und HDAC-6). Geklonte rekombinante menschliche HDAC-1-, HDAC-3- und HDAC-6-Enzyme, markiert mit dem Flaggen-Epitop (Grozinger, C.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96: 4868–4873 (1999)) in ihren C-Termini, wurden hergestellt durch ein Bakulovirus-Expressionssystem in Insektenzellen.
  • Flaggen-markiertes menschliches HDAC-4-Enzym wurde in menschlichen Embrio-Nieren-293-Zellen nach Transformation durch das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren hergestellt. Kurz gesagt, wurden 293 Zellen kultiviert in dem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum und Antibiotika. Das Plasmid-DNA, das das menschliche Flaggenmarkierte menschliche HDAC-4 kodiert, wurde mit Ethanol präzipitiert und in sterilem Wasser resuspendiert. DNA-Calcium-Präzipitate, gebildet durch Mischen von DNA, Calcium- chlorid und 2XHEPES-gepufferte Salzlösung wurden auf 293 Zellen für 12 bis 16 Stunden belassen. Die Zellen wurden in Serum enthaltendes DMEM-Medium rückgeführt und nach 48 Stunden nach der Transfektion zur Reinigung des Flaggen-markierten HDAC-4-Enzyms geerntet.
  • HDAC-1 und HDAC-6 wurden auf einer Q-Sepharose-Säule gereinigt, gefolgt von einer Anti-Flaggen-Epitop-Affinitätssäule. Die übrigen HDAC-Isotypen, HDAC-3 und HDAC-4, wurden direkt auf einer Anti-Flaggen-Affinitätssäule gereinigt.
  • Für das Deacetylase-Assay wurden 20.000 cpm eines [3H]-metabolisch markierten acetylierten Histons als Substrat verwendet. Histon wurde inkubiert mit geklonten rekombinanten menschlichen HDAC-Enzymen bei 37°C. Für das HDAC-1-Assay betrug die Inkubationszeit 10 Minuten, und für die HDAC-3-, HDAC-4- und HDAC-6-Assays betrug die Inkubationszeit 2 Stunden. Sämtliche Assaybedingungen wurden vorermittelt, um sicher zu sein, dass jede Reaktion linear verläuft. Reaktionen wurden gestoppt durch Zusetzen von Essigsäure (0,04 M Endkonzentration) und HCl (250 mM Endkonzentration). Das Gemisch wurde extrahiert mit Ethylacetat und die freigesetzte [3H]-Essigsäure wurde quantifiziert durch Flüssigkeits-Szintillations-Zählung. Für die Hemmungsstudien wurde das HDAC-Enzym präinkubiert mit Testverbindungen für 30 Minuten bei 4°C vor dem Start des enzymatischen Assays. IC50-Werte für HDAC-Enzym-Hemmstoffe wurden identifiziert mit Dosisreaktionskurven für jede einzelne Verbindung, und dadurch wurde ein Wert für die Konzentration des Hemmstoffs gewonnen, der 50% der maximalen Hemmung erzeugt.
  • Beispiel 8
  • Hemmung der HDAC-Aktivität in sämtlichen Zellen durch Kleine Moleküle
  • Menschliche T24-Blasenkrebszellen (ATCC, Manassas, VA), die in Kultur wachsen gelassen wurden, wurden inkubiert mit Test- verbindungen für 16 Stunden. Histone wurden aus den Zellen durch Standardprozeduren (siehe beispielsweise Yoshida et al., supra) nach der Kulturperiode extrahiert. 20 μg Gesamt-Kern-Histonprotein wurden auf SDS/PAGE geladen und auf Nitrocellulosemembranen übertragen, die daraufhin mit einem Polyklonalen Antikörper zur Reaktion gebracht wurde, der spezifisch ist für acetyliertes Histon H-4 (Upstate Biotech Inc., Lake Placid, WY). Meerrettich-Peroxidase-konjugierter sekundärer Antikörper wurde mit einer Verdünnung von 1:5000 verwendet, um Primär-Antikörper-Bindung zu- ermitteln. Die sekundäre Antikörper-Bindung wurde visualisiert unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence (ECL) Ermittlungs-Kits (Amersham-Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway, NJ). Nach Auftragen auf einen Film bzw. Licht desselben wurde das acetylierte H-4-Signal durch Densitometrie quantifiziert.
  • Die Ergebnisse, die in der vorstehend angeführten Tabelle 2 gezeigt sind, demonstrieren, dass kleinmolekulare Hemmstoffe, die selektiv sind für HDAC-1 und/oder HDAC-4 Histon-Deacetylisierung in ganzen Zellen hemmen können.
  • Beispiel 9
  • Hemmen des Krebswachstumswachstums durch kleinmolekulare HDAC-Hemmstoffe
  • Viertausendfünfhundert (4.500) menschliche Dickdarmkrebs-HCT116-Zellen (ATCC, Manassas, VA) wurden in MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay zur quantitativen Ermittlung der Zellenproliferation und Cytotoxizität verwendet. Typischerweise wurden HCT116-Zellen in jeweils eine der 96 Eintiefungen der Kulturplatte plattiert und über Nacht stehen gelassen, um an der Platte zu haften. Die Verbindungen verschiedener Konzentrationen (1 μM, 5 μM und 25 μM in DMSO) wurden dreifach dem Kulturmedium zugesetzt (letztendliche DMSO-Konzentration 1%) und für 48 Stunden inkubiert. MTT-Lösung (erhalten von Sigma als Pulver) wurde zugesetzt und inkubiert mit den Zellen für 4 Stunden bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO2. Während der Inkubation konvertieren lebensfähige Zellen MTT in einen wasserlöslichen Formazan-Farbstoff. Lösungsfördernde Puffer (50% N,N-Dimethylformamid, 20% SDS, pH 4,7) wurde den Zellen hinzugesetzt und über Nacht bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO2 inkubiert. Gelöster Farbstoff wurde quantifiziert durch kolorimetrisches Lesen bei 570 nM unter Verwendung einer Referenz von 630 nM.
  • Die Ergebnisse, die in der vorstehend angeführten Tabelle 2 gezeigt sind, demonstrieren, dass kleinmolekulare Hemmstoffe, die selektiv sind für HDAC-1 und/oder HDAC-4, die Zellenproliferation beeinträchtigen können.
  • Beispiel 10
  • Hemmen des Tumorwachstums bei kleinen Molekülen in einem Maus-Modell
  • Weibliche nackte BALB/c-Mäuse wurden bezogen von Charles River Laboratories (Charles River, NY) und bei einem Alter von 8 bis 10 Wochen verwendet. Menschliche Prostata-Tumorzellen (DU145, 2 × 106) bzw. menschliche Dickdarm-Krebszellen (HTC116; 2 × 106) bzw. kleiner Lungen-Kern-A549-2 × 106 wurden subkutan in die Flanke der Tiere injiziert, um die Bildung von festen Tumoren zu erlauben. Tumorfragmente wurden seriell mindestens dreimal durchlaufen gelassen, woraufhin ungefähr 30 mg Tumorfragmente subkutan durch einen kleinen chirurgi schen Einschnitt unter allgemeiner Anästhesie implantiert wurden. Eine Verabreichung eines kleinmolekularen Hemmstoffs durch intraperitoneale bzw. orale Verabreichung wurde initiiert, wenn die Tumor ein Volumen von 100 mm3 erreicht hatte. Für die intraperitoneale Verabreichung wurden kleinmolekulare Hemmstoffe von HDAC (40–50 mg/kg Körpergewicht/Tag) in 100 DMSO aufgelöst und durch Injektion täglich intraperitoneal verabreicht. Für die orale Verabreichung wurden kleinmolekulare Hemmstoffe von HDAC (40–50 mg/kg Körpergewicht/Tage) in einer Lösung gelöst, die 65% Polyethylenglykol 400 (PEG 400 (Sigma-Aldridge, Mississauga, Ontario, CA, Katalog Nr. P-3265), 5% Ethanol und 30% Wasser enthält. Tumor-Volumina wurden zweimal wöchentlich bis hin zu 20 Tagen überwacht. Jede experimentelle Gruppe enthielt zumindest 6 bis 8 Tiere. Die Hemmung in Prozent wurde berechnet unter Verwendung des Tumorvolumens von Vehikel-behandelten Mäusen als Kontrollen.
  • Die in der vorstehend angeführten Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse demonstrieren, dass kleinmolekulare Hemmstoffe, die selektiv sind für HDAC-1 und/oder HDAC-4, das Wachstum von Tumorzellen in vivo hemmen kann.
  • Äquivalente
  • Dem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik erschließt sich bzw. der Fachmann vergewissert sich durch lediglich Routineexperimente, dass zahlreiche Äquivalente der speziellen vorstehend erläuterten Ausführungsformen der Erfindung existieren. Derartige Äquivalente sind durch die nachfolgenden Ansprüche umfasst:
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung betrifft die Hemmung von Histon-Deacetylase (HDAC)-Expression und von Enzymaktivität. Die Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien bereit, um HDAC-4 und HDAC-1 durch Hemmen der Expression auf dem Nucleinsäure-Niveau oder Hemmen der Erzymaktivität auf dem Protein-Niveau zu hemmen.

Claims (91)

  1. Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, wodurch HDAC-4-Aktivität gehemmt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um ein chimäres Oligonucleotid handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um ein hybrides Oligonucleotid handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, das SEQ ID NR:11 ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in einer kontaktierten Zelle außerdem zu einer Hemmung der Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle führt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Wachstumsverzögerung der kontaktierten Zelle führt.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Wachstumsblockade der kontaktierten Zelle führt.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum nektrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  12. Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht:
    Figure 00920001
    Figure 00930001
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hemmung der HDAC-9-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Hemmung der Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle führt.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zur Wachstumsverzögerung der kontaktierten Zelle führt.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Wachstumsblockade der kontaktierten Zelle führt.
  16. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Hemmung der HDAC-9-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einem nektrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  18. Verfahren zur Hemmung der neoplastischen Zellenprolife ration in einem Tier, aufweisend das Verabreichen für ein Tier mit zumindest einer neoplastischen Zelle, die in seinem Körper vorhanden ist, einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids, komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, wodurch neoplastische Zellenproliferation gehemmt wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei dem Tier ein chimäres HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei dem Tier ein hybrides HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4 ausgewählt ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4 ausgewählt ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4 ausgewählt ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei der es sich um SEQ ID NR:11 handelt.
  25. Verfahren nach Anspruch 18; wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Hemmung der Zellenproliferation in der kontaktierten Zelle führt.
  26. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Zellenwuchsretardierung bzw. -verzögerung in der kontaktierten Zelle führt.
  27. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Zellenwachstumsblockade in der kontaktierten Zelle führt.
  28. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  29. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Hemmung der HDRC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum nekrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  30. Verfahren zur Hemmung der neoplastischen Zellenproliferation in einem Tier, aufweisend das Verabreichen für ein Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle aufweist, die in seinem Körper vorhanden ist, einer therapeutisch wirksamen Menge eines kleinmolekularen Hemmstoffs, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht:
    Figure 00960001
    Figure 00970001
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Hemmung der Zellenproliferation der kontaktierten Zelle führt.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Zellenwuchsretardierung in der kontaktierten Zelle führt
  33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zu einer Zellenwachstumsblockade in der kontaktierten Zelle führt.
  34. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  35. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle außerdem zum nekrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  36. Verfahren nach Anspruch 18 oder 30, wobei es sich bei dem Tier um einen Menschen handelt.
  37. Verfahren nach Anspruch 18 oder 30, außerdem aufweisend das Verabreichen für ein Tier einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-1 kodiert.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei dem Tier ein chimäres HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei dem Tier ein hybrides HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2.
  41. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2 ausgewählt ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2 ausgewählt ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 37, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, bei dem es sich um SEQ ID NR:5 handelt.
  44. Zusammensetzung, aufweisend ein Agens, das die Aktivität von HDAC-4 spezifisch hemmt.
  45. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bzw. 44, wobei es sich bei dem Agens um ein Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich handelt, der einen Teil von HDAC-4 kodiert.
  46. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei es sich bei dem Antisense-Oligonucleotid um ein chimäres Oligonucleotid handelt.
  47. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei es sich bei dem Antisense-Oligonucleotid um ein hybrides Oligonucleotid handelt.
  48. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  49. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei das Antisense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  50. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei das Anti sense-Oligonucleotid eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  51. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei es sich bei dem Antisense-Oligonucleotid um SEQ ID NP:11 handelt.
  52. Zusammensetzung nach Anspruch 2 bzw. 45, wobei das Antisense-Oligonucleotid ein oder mehrere Phosphorthioat-Internucleosid-Verknüpfungen aufweist.
  53. Zusammensetzung nach Anspruch 9 bzw. 52, wobei das Antisense-Oligonucleotid außerdem eine Länge von 20 bis 26 Nucleotiden aufweist.
  54. Zusammensetzung nach Anspruch 10 bzw. 53, wobei das Oligonucleotid derart modifiziert ist, dass die endständigen vier Nucleotide am 5'-Ende des Oligonucleotids und die endständigen vier Nucleotide am 3'-Ende des Oligonucleotids jeweils 2'-O-Methylgruppen aufweisen, die an ihren Zucker-Resten vorgesehen sind.
  55. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bzw. 44, wobei es sich bei dem Agens um einen kleinmolekularen Hemmstoff von HDACA-4 handelt.
  56. Zusammensetzung nach Anspruch 12 bzw. 44, wobei die Struktur des kleinmolekularen Hemmstoffs aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; Y1 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional sub stituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus O; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. verträgliches Kation steht, wobei Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können; (b) Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die optional substituiert sein können; Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Al-kylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteratomhälfte, die ausgewählt aus der Gruppe, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, die optional jeweils substituiert sein können; (c) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, wobei jedes optional substituiert sein kann; B aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -CH(OMe), Keton und Methylen; Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome von Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)4; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyri dyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation steht, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können, (d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; L1 -(CH2)m-W- ist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- und -NH-C(O) -NH-; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein kann; Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen sein kann, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht, vorausgesetzt, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist, Y1 –(CH2)n- ist, n 1, 2 oder 3 ist und Z -O-M ist, Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroxyphenyl ist; und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist und Z Pyridyl ist, Cy kein substituiertes Indolinyl ist; (e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen handelt, wobei das Alkylen oder Alkenylen op tional substituiert sein kann, vorausgesetzt, das: L2 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann, und Y2 ein chemisch gebundenes oder gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H steht oder für ein pharmazeutisch akzeptables Kation; unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, Cy und Z nicht beide Pyridyl sind; (f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6) wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclcyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L3 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH; und (b) C1-C6-Alkylen oder C1-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass L3 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; NR', wobei R' ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein, und Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkinylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Aklenylens optional ersetzt sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, und M für H oder ein pharmazeutisch akzeptabels Kation steht; vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen:
    Figure 01040001
  57. Zusammensetzung nach Anspruch 13 bzw. 56, wobei der kleinmolekulare Hemmstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus dem folgenden besteht:
    Figure 01050001
    Figure 01060001
  58. Verfahren zum Hemmen der HDAC-4-Aktivität in einer Zelle, aufweisend das Kontaktieren der Zelle mit einem spezifischen Hemmstoff von HDAC-4, wodurch die HDAC-4-Aktivität gehemmt wird.
  59. Verfahren nach Anspruch 15 bzw. 58, wobei die Zelle mit einem spezifischen Hemmstoff für die HDACA-4-Aktivität in Kontakt gebracht wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einem Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, und (b) einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4.
  60. Verfahren nach Anspruch 16 bzw. 59, wobei der spezifische Hemmstoff ein Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich ist, der einen Teil von HDAC-4 kodiert.
  61. Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um ein chimäres Oligonucle otid handelt.
  62. Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um ein hybrides Oligonucleotid handelt.
  63. Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDRC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, das eine Nucleotid-Sequenz-Länge von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  64. Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, das eine Nucleotid-Sequenz-Länge von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  65. Verfahren nach Anspruch 1 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, das eine Nucleotid-Sequenz-Länge von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  66. Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 60, wobei die Zelle mit einem HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um SEQ ID NR:11 handelt.
  67. Verfahren nach Anspruch 16 bzw. 59, wobei der kleinmolekulare Hemmstoff von HDAC-4 eine Struktur aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: (a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1) wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; Y1 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus O; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. verträgliches Kation steht, wobei Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können; (b) Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die optional substituiert sein können; Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteratomhälfte, die ausgewählt aus der Gruppe, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ist Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, die optional jeweils substituiert sein können; (3) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, wobei jedes optional substituiert sein kann; B aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -CH(OMe), Keton und Methylen; Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome von Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation steht, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können; (d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; L1 -(CH2)m-W- ist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH-; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein kann; Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen sein kann, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht; wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht, vorausgesetzt, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist, Y1 -(CH2)n- ist, n 1, 2 oder 3 ist und Z -O-M ist, Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroxyphenyl ist; und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist und Z Pyridyl ist, Cy kein substituiertes Indolinyl ist; (e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen handelt, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass L2 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Hete roatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus O besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann, und Y2 ein chemisch gebundenes oder gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H steht oder für ein pharmazeutisch akzeptables Kation; unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, Cy und Z nicht beide Pyridyl sind; (f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L3 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH; und (b) C1-C6-Alkylen oder C2-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass L3 nicht -C(O)ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; NR', wobei R' ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein, und Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkenylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Aklenylens optional ersetzt sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, und M für H oder ein pharmazeutisch akzeptabels Kation steht; vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen:
    Figure 01110001
  68. Verfahren nach Anspruch 67, wobei der kleinmolekulare Hemmstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus folgendem besteht:
    Figure 01120001
    Figure 01130001
  69. Verfahren nach Anspruch 15 bzw. 61 bzw. 68, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einer Hemmung der Zellenproliferation der kontaktierten Zelle führt.
  70. Verfahren nach Anspruch 15 bzw. 61 bzw. 68, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einer Wachstumsretardierung der kontaktierten Zelle führt.
  71. Verfahren nach Anspruch 15 bzw. 61 bzw. 68, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einer Wachstumsblockade der kontaktierten Zelle führt.
  72. verfahren nach Anspruch 15 bzw. 61 bzw. 68, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einem programmierten Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  73. Verfahren nach Anspruch 26 bzw. 72, wobei die Hemmung der HDAC-4-Aktivität in der kontaktierten Zelle zu einem nekrotischen Zellentod der kontaktierten Zelle führt.
  74. Verfahren zum Hemmen der neoplastischen Zellenproliferation in einem Tier, aufweisend das Verabreichen für ein Tier, das zumindest eine neoplastische Zelle aufweist, die in seinem Körper vorhanden ist, eine therapeutisch wirksame Menge, von zumindest einem spezifischen Hemmstoff von HDAC-4, wodurch die neoplastische Zellenproliferation in dem Tier gehemmt wird.
  75. Verfahren nach Anspruch 31 bzw. 74, wobei dem Tier ein spezifischer Hemmstoff von HDACA-4 verabreicht wird, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: (a) einem Antisense-Oligonucleotid komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, und (b) einem kleinmolekularen Hemmstoff von HDAC-4.
  76. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, wobei dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge eines Antisense-Oligonucleotids komplementär zu einem RNA-Bereich verabreicht wird, der einen Teil von HDAC-4 kodiert, wodurch die neoplastische Zellenproliferation in dem Tier gehemmt wird.
  77. Verfahren nach Anspruch 33 bzw. 76, wobei dem Tier ein chimäres HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  78. Verfahren nach Anspruch 33 bzw. 76, wobei dem Tier ein hybrides Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  79. Verfahren nach Anspruch 33 bzw. 76, wobei dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis etwa 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  80. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, wobei dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  81. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, wobei dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis etwa 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt sind aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:4.
  82. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, wobei dem Tier ein HDAC-4-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, bei dem es sich um SEQ ID NR:11 handelt.
  83. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, wobei ein spezifischer Hemmstoff ein kleinmolekularer Hemmstoff von HDAC-4 ist, der eine Struktur aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: (a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; Y1 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das A1kylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional durch eine Heteroatomhälfte ersetzt sein kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus O; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables bzw. verträgliches Kation steht, wobei Ani linyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können; (b) Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, die optional substituiert sein können; Y2 ein C5-C7-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteratomhälfte, die ausgewählt aus der Gruppe, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl ist, die optional jeweils substituiert sein können. (3) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, wobei jedes optional substituiert sein kann; B aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -CH(OMe), Keton und Methylen; Y3 ein C4-C6-Alkylen ist, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und wobei eines der Kohlenstoffatome von Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O) oder S(O)2; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation steht, wobei das Anilinyl oder Pyridyl oder Thiadiazolyl optional substituiert sein können; (d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann; L1 -(CH2)m-W- ist, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH-; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert und optional mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring verschmolzen sein kann, oder mit einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein kann; Y1 eine chemische Bindung oder ein gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen sein kann, wobei das Alkylen optional substituiert sein kann, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M besteht, wobei M für H oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation steht, vorausgesetzt, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist, Y1 -(CH2)n- ist, n 1, 2 oder 3 ist und Z -O-M ist, Cy nicht Aminophenyl, Dimethylaminophenyl oder Hydroxyphenyl ist; und außerdem unter der Voraussetzung, dass dann, wenn L1 -C(O)NH- ist und Z Pyridyl ist, Cy kein substituiertes Indolinyl ist; (e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L2 ein C1-C6-gesättigtes Alkylen oder C2-C6-Alkenylen handelt, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass L2 nicht -C(O)- ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylen optional ersetzt sein kann durch eine Heteroatomhälfte, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 0 besteht; NR1, wobei R1 ein Alky1, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional an einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring geschmolzen sein kann, oder an einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder einem heterocyclischen Ring, welches optional substituiert sein kann, und Y2 ein chemisch gebundenes oder gerad- oder verzweigtkettiges gesättigtes Alkylen ist, das optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Alkylen nicht substituiert ist durch einen Substituenten der Formel -C(O)R, wobei R eine α-Aminoacylhälfte enthält, und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, wobei M für H steht oder für ein pharmazeutisch akzeptables. Kation; unter der Voraussetzung, dass dann, wenn das Kohlenstoffatom, an welchem Cy vorgesehen ist, Oxo-substituiert ist, Cy und Z nicht beide Pyridyl sind; (f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)wobei Cy Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl ist, von denen jedes optional substituiert sein kann, unter der Voraussetzung, dass Cy kein (Spirocycloalkyl)heterocyclyl ist; L3 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus (a) -(CH2)m-W-, wobei m 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, und W ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus -C(O)NH-, -S(O)2NH-, -NHC(O)-, NHS(O)2- und -NH-C(O)-NH; und (b) C1-C6-Alkylen oder C2-C6-Alkenylen, wobei das Alkylen oder Alkenylen optional substituiert sein kann unter der Voraussetzung, dass L3 nicht -C(O)ist, und wobei eines der Kohlenstoffatome des Alkylens optional ersetzt sein kann durch O; NR', R' Alkyl, Acyl oder Wasserstoff ist; S; S(O); oder S(O)2; Ar Arylen ist, wobei das Arylen optional zusätzlich substituiert sein kann und optional verschmolzen sein kann mit einem Aryl- oder Heteroaryl-Ring, oder einem gesättigten oder teilweise ungesättigten Cycloalkyl- oder heterocyclischen Ring, von denen jeder optional substituiert sein, und Y3 C2-Alkenylen oder C2-Alkenylen ist, wobei eines oder beide Kohlenstoffatome des Aklenylens optional ersetzt sein können durch Alkyl, Aryl, Alkaryl oder Aralkyl; und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Anilinyl, Pyridyl, Thiadiazolyl und -O-M, und M für H oder ein pharmazeutisch akzeptabels Kation steht; vorausgesetzt, dass dann, wenn Cy ein unsubstituiertes Phenyl ist, Ar kein Phenyl ist, wobei L3 und Y3 ortho bzw. meta zu einander stehen:
    Figure 01190001
  84. Verfahren nach Anspruch 40 bzw. 83, wobei der kleinmolekulare Hemmstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus folgendem besteht:
    Figure 01190002
    Figure 01200001
    Figure 01210001
  85. Verfahren nach Anspruch 32 bzw. 75, außerdem aufweisend das Ver- abreichen für ein Tier einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids komplementär zu einem RNA-Bereich, der einen Teil von HDAC-1 kodiert.
  86. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein chimäres HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  87. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein hybrides HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird.
  88. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 13 bis 35 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt ist aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2.
  89. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 15 bis 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt ist aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2.
  90. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das eine Nucleotid-Sequenz von etwa 20 bis 26 Nucleotiden aufweist, die ausgewählt ist aus der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NR:2.
  91. Verfahren nach Anspruch 42 bzw. 85, wobei dem Tier ein HDAC-1-Antisense-Oligonucleotid verabreicht wird, das SEQ ID NR:11 ist.
DE10295684T 2001-01-12 2002-01-14 Verfahren zum spezifischen Hemmen von Histon-Deacetylase-4 Expired - Fee Related DE10295684T9 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26167401P 2001-01-12 2001-01-12
US26152201P 2001-01-12 2001-01-12
US60/261,674 2001-01-12
US60/261,522 2001-01-12
PCT/IB2002/002002 WO2002069947A2 (en) 2001-01-12 2002-01-14 Antisense oligonucleotides and trichostatin analogue histone deacetylase-4 inhibitors against cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE10295684T1 DE10295684T1 (de) 2003-11-20
DE10295684T9 true DE10295684T9 (de) 2004-10-14

Family

ID=26948670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10295684T Expired - Fee Related DE10295684T9 (de) 2001-01-12 2002-01-14 Verfahren zum spezifischen Hemmen von Histon-Deacetylase-4

Country Status (6)

Country Link
JP (1) JP2004520421A (de)
KR (1) KR20040018328A (de)
CA (1) CA2434601A1 (de)
DE (1) DE10295684T9 (de)
GB (1) GB2389365A (de)
WO (1) WO2002069947A2 (de)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA04002397A (es) 2001-09-14 2004-12-02 Methylgene Inc Inhibidores de histona deacetilasa.
US7868204B2 (en) 2001-09-14 2011-01-11 Methylgene Inc. Inhibitors of histone deacetylase
US6897220B2 (en) 2001-09-14 2005-05-24 Methylgene, Inc. Inhibitors of histone deacetylase
GB0226855D0 (en) 2002-11-18 2002-12-24 Queen Mary & Westfield College Histone deacetylase inhibitors
CA2528003A1 (en) * 2003-06-10 2004-12-23 Kalypsys, Inc. Carbonyl compounds as inhibitors of histone deacetylase for the treatment of disease
US7271195B2 (en) 2003-06-10 2007-09-18 Kalypsys, Inc. Carbonyl compounds as inhibitors of histone deacetylase for the treatment of disease
CA2539117A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 Methylgene Inc. Inhibitors of histone deacetylase
DE602004014895D1 (de) * 2004-03-11 2008-08-21 Asan Lab Company Cayman Ltd Verwendung von Histone Deacetylase Hemmern zur Steigerung der therapeutischen Wirkung in der Radiotherapie und Chemotherapie
US7253204B2 (en) 2004-03-26 2007-08-07 Methylgene Inc. Inhibitors of histone deacetylase
EP1819669A2 (de) * 2004-12-09 2007-08-22 Kalypsys, Inc. Neue inhibitoren von histondeacetylase zur krankheitsbehandlung
GB0509225D0 (en) 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of enzymatic activity
GB0509223D0 (en) 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
EA200800321A1 (ru) 2005-07-14 2008-06-30 Такеда Сан Диего, Инк. Ингибиторы гистондеацетилазы
GB0518237D0 (en) 2005-09-07 2005-10-19 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
JP5554988B2 (ja) 2006-04-07 2014-07-23 メチルジーン インコーポレイテッド ヒストンデアセチラーゼの阻害剤
GB0619753D0 (en) 2006-10-06 2006-11-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
GB0620823D0 (en) 2006-10-19 2006-11-29 Univ London Histone deacetylase inhibitors
EP2077999B1 (de) 2006-10-30 2014-07-30 Chroma Therapeutics Limited Hydroxamate als inhibitoren von histondeacetylase
US8030344B2 (en) 2007-03-13 2011-10-04 Methylgene Inc. Inhibitors of histone deacetylase
GB0903480D0 (en) 2009-02-27 2009-04-08 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme Inhibitors
US9636298B2 (en) 2014-01-17 2017-05-02 Methylgene Inc. Prodrugs of compounds that enhance antifungal activity and compositions of said prodrugs

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777217B1 (en) * 1996-03-26 2004-08-17 President And Fellows Of Harvard College Histone deacetylases, and uses related thereto
CA2347003A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Methylgene, Inc. Modulation of gene expression by combination therapy
CA2366408A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-30 Methylgene, Inc. Inhibition of histone deacetylase

Also Published As

Publication number Publication date
CA2434601A1 (en) 2002-09-12
KR20040018328A (ko) 2004-03-03
JP2004520421A (ja) 2004-07-08
GB2389365A (en) 2003-12-10
WO2002069947A3 (en) 2003-10-09
GB0316313D0 (en) 2003-08-13
DE10295684T1 (de) 2003-11-20
WO2002069947A2 (en) 2002-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10295684T9 (de) Verfahren zum spezifischen Hemmen von Histon-Deacetylase-4
US20020061860A1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of specific histone deacetylase isoforms
WO2004005513A2 (en) Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-7 and 8
WO2019032607A1 (en) OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
DE69533697T2 (de) ANTISENSE OLIGONUKLEOTIDMODULATION DER raf GENEXPRESSION
EP1590340B1 (de) Histondeacetylase-hemmer
DE69432934T2 (de) Oligonukleotidmodulation der expression von multiwirkstoff-resistenz -assoziiertem protein
EP3965780A2 (de) Oligonukleotidzusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
EP4037695A2 (de) Oligonukleotidzusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
AU781577B2 (en) Therapeutic phosphodiesterase inhibitors
EP3689420A1 (de) Icariin-derivate zur anwendung in einem verfahren zur behandlung von myelodysplastischem syndrom
AU2011256978B2 (en) siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
US20030152557A1 (en) Methods for inhibiting histone deacetylase-4
US20030148970A1 (en) Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-4
JP2008535836A5 (de)
EP1556486A2 (de) Wirksame und stabile dna-enzyme
US20020137162A1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of specific histone deacetylase isoforms
EP1414961A2 (de) Neue oligoribonucleotid-derivate zur gezielten hemmung der genexpression
DE10296800T5 (de) Inhibitoren von Isoformen der DNA Methyltransferase
JP7486577B2 (ja) Ｒｉｐキナーゼ阻害剤を含む脱毛防止または発毛促進用組成物
EP1937242A2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung neuropsychiatrischer erkrankungen und suchtkrankheiten
AU2002304328A1 (en) Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-4
DE19731609C3 (de) Cholesterylester-Transferprotein (CETP)-mRNA als Zielmolekül in der Therapie von Atherosklerose
EP1896585A2 (de) Doppelsträngige synthetische oligonukleotide mit eignung zur induktion der apoptose von osteoklasten für die behandlung von osteopenie-krankheitsbildern

Legal Events

Date Code Title Description
8697 Reprint of erroneous translation
8139 Disposal/non-payment of the annual fee