JP2004520421A - ヒストンデアセチラーゼ−４を特異的に抑制する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の発現および酵素活性の抑制に関する。本発明は、発現を核酸レベルで抑制するか、または酵素活性をタンパク質レベルで抑制して、HDAC-4およびHDAC-1を抑制する方法および薬剤を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は、遺伝子発現および腫瘍学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
クロマチンは、真核細胞の核内に存在するタンパク質およびDNAの複合体である。クロマチンタンパク質は、核DNAを構造的そして機能的に組織化する。ヌクレオソームは、クロマチンの基本的な構造形成単位である。ヌクレオソームは、主に(1)会合してタンパク質コア粒子を形成するH2A、H2B、H3およびH4と呼ばれるコアヒストン、および(2)ヒストンコア粒子に巻き付いた約146塩基対のDNAから構成される。コアヒストン粒子とDNAとの間の物理的相互作用は、主に、DNAの負電荷を帯びたリン酸基とヒストンタンパク質の塩基性アミノ酸部分とによって起こる。(Csordas, Biochem. J., 286:23-38 (1990))による開示では、ヒストンは、そのN末端のリジン残基のイプシロンアミノ基に翻訳後アセチル化を受け易く、この反応は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(histone acetyltransferase; HAT)により触媒される。ヒストンの翻訳後アセチル化は、構造的ならびに機能的な結果、即ち、遺伝子制御に関する結果をもたらす。
【０００３】
アセチル化は、Ｎ末端リジン残基のεアミノ基の正電荷を中和し、これによりDNAとヌクレオソームのヒストンコア粒子との間の相互作用に影響を及ぼす。したがって、ヒストンのアセチル化および脱アセチル化(HDAC)は、クロマチン構造および遺伝子制御に影響を及ぼすと考えられる。例えば、Tauntonら、Science, 272:408-411 (1996)による開示では、クロマチンテンプレートへの転写因子の接近は、ヒストンの過度のアセチル化により促進される。更に、Tauntonらは、アセチル化が不十分なヒストンH4の増加がゲノムの転写サイレント領域に見られることを明らかにしたと開示している。
【０００４】
公知のHDAC阻害剤を利用した研究より、アセチル化と遺伝子発現の間の関係が確立された。Yoshidaら、Cancer Res. 47:3688-3691 (1987)によると(R)-トリコスタチン A(TSA)は、マウス赤白血病細胞において、強力な分化誘発剤となる。また、Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265:17174-17179 (1990)によるとTSAは、哺乳動物HDACの強力な阻害剤である。
【０００５】
数々の研究においてHDACおよび遺伝子発現の相関関係が調べられてきた。Tauntonら、Science 272:408-411 (1996)は酵母の転写制御因子に関連性を有するヒトHDACを明らかにしている。また、Cressら、J. Cell. Phys. 184:1-16 (2000)はヒトの癌においてHDACの役割が、転写のコリプレッサーであることを明らかにしている。Ngら、TIBS 25:March (2000)はHDACが、転写リプレッサーシステムの広播性に関連していることを明らかにしている。また、Magnaghi-Jaulinら、Prog. Cell Cycle Res. 4:41-47 (2000)は、HDACが、細胞周期の進行に重要な転写制御補助因子であることを明らかにしている。
【０００６】
HDAC活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列の分子クローニングにより、別々のHDAC酵素イソ型からなる群の存在が認められた。Grozingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4868-4873 (1999)によるとHDACは、二種類に分類してもよく、第一の種類は酵母Rpd3様タンパク質に代表され、第二の種類は、酵母Hda1様タンパク質に代表される。更に、Grozingerらによると、ヒトHDAC-1、HDAC-2、およびHDAC-3タンパク質は第一種HDACの一員であり、HDAC-4、HDAC-5、およびHDAC-6と呼ばれる新規のタンパク質が第二種HDACの一員である。Kaoら、Gene & Development 14:55-66 (2000)は、この第二種に属する追加の一員であるHDAC-7を明らかにしている。最近では、Hu, E.ら、J. Bio. Chem. 275:15254-13264 (2000)が第一種ヒストンデアセチラーゼに属する最新のものであるHDAC-8を明らかにしている。これらHDAC酵素の各々の役割は不明である。
【０００７】
遺伝子制御におけるHDACの役割を探るために、哺乳類HDACの公知の阻害剤がしばしば使用されてきた。Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265:17174-17179 (1990)は(R)-トリコスタチン A(TSA)が、哺乳類HDACの強力な阻害剤であることを明らかにしている。また、Yoshidaら、Cancer Res. 47:3688-3691 (1987)はTSAが、マウス赤白血病細胞において、強力な分化誘発剤となることを明らかにしている。
【０００８】
ヒストンデアセチラーゼの公知の阻害剤は、すべて低分子であり、これらはタンパク質レベルでヒストンデアセチラーゼ活性を抑制する。その上、すべての公知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型に対して非特異的であり、両方のヒストンデアセチラーゼファミリーのすべてのメンバーのほぼすべてを抑制する(Grozinger, C. M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4868-4873 (1999))。例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、および分化やアポトーシスを研究する上でのそれら阻害剤の役割の総説(Marksら、J. National Cancer Inst. 92:1210-1216 (2000))を参照されたい。
【０００９】
従って、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型を抑制するための薬剤を開発する必要性が存在する。また、これらの薬剤を使用して特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を調節し、そして、腫瘍発生およびその他の増殖性疾患および障害に関与するイソ型を特定する方法を開発する必要がある。
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)イソ型の活性を調節する方法および薬剤を提供する。例えば、本発明は、核酸レベルで発現を抑制するか、または、タンパク質レベルで酵素活性を抑制することによりHDACイソ型、具体的にはHDAC-1およびHDAC-4を抑制する方法および薬剤を提供する。本発明は、腫瘍発生に関与する特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、癌の治療法を提供する。更に本発明は、細胞増殖に関与する特定のHDACイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、細胞増殖疾患および障害の治療法を提供する。
【００１１】
本発明者等は、HDAC-4の特異的な抑制が癌細胞においてアポトーシスおよび増殖の停止を劇的に誘発するという驚くべき発見をした。したがって、一つの局面において、本発明は、HDAC-4イソ型の活性を抑制する薬剤を提供する。
【００１２】
本発明の第1の局面におけるある好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドである。HDAC-4イソ型をコードする核酸分子は、ゲノムDNA(例えば、遺伝子)、cDNA、またはRNAであり得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型をコードするmRNAの転写を抑制する。また、その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型の翻訳を抑制する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸分子の分解を引き起こす。
【００１３】
その好ましい態様において、本発明の第１の局面の薬剤は、HDAC-4の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-4の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。その一つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリッドオリゴヌクレオチドである。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11の配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、更に、長さが20〜26ヌクレオチドである。また、その別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾されて、オリゴヌクレオチドの5'末端にある終端の4ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの3'末端にある終端の4ヌクレオチドのその糖残基の各々には、2'-O-メチル基が結合している。
【００１４】
第1の局面のある好ましい態様において、細胞内でHDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現、またはHDAC-4タンパク質の活性を抑制する低分子阻害剤である。
【００１５】
第2の局面において、本発明は、細胞内でHDAC-4活性を抑制する方法を提供するものであり、細胞にHDAC-4に特異的な阻害剤を接触させることによりHDAC-4の活性を抑制する工程を含む。その態様において、本発明は、細胞内でHDAC-4イソ型を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-4の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることによりHDAC-4活性を抑制する工程を含む。その一つの態様においては、細胞に、キメラオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様においては、細胞にハイブリッドオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様においては、ヌクレオチド配列の長さが約13〜約35ヌクレオチドであって、配列番号：11のヌクレオチド配列を含むHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる。別の態様においては、ヌクレオチド配列の長さが約15〜約26個のヌクレオチドであって、配列番号：11のヌクレオチド配列を含むHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる。別の態様においては、細胞に、配列番号：11のHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様において、HDAC-4活性の抑制は、接触させた細胞において細胞増殖の抑制を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の成長遅延を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の成長停止を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞のプログラム細胞死を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の壊死性細胞死を引き起こす。ある態様において、細胞は、ヒトを含む動物内に存在し得る腫瘍細胞であり、腫瘍性成長の状態にあり得る。ある好ましい態様において、本方法は更に、HDAC-4ヒストンデアセチラーゼイソ型と相互作用して、その酵素活性を低下させるHDAC-4低分子阻害剤を細胞に接触させる工程を含む。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に接続している。
【００１６】
第3の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4特異的阻害剤を投与し、これにより動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む。その一つの態様において、本発明は、動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に治療的に有効な量の本発明の第1の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される担体と共に、治療的に有効な期間投与する工程を含む。その一つの態様において、動物には、キメラHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、ハイブリッドHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列から選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。また別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、動物には、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物はヒトである。別の態様において、この方法は更に、治療に有効な量の、HDAC-1の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-1の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に投与する工程を含む。その一つの態様において、動物には、キメラHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、ハイブリッドHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、動物には、配列番号：5のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：5のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。また、別の態様において、動物には、配列番号：5であるHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。
【００１７】
第4の局面において、本発明は、細胞内のHDAC-4活性を抑制する方法を提供するものであり、細胞にHDAC-4の低分子阻害剤を接触させることによりHDAC-4の活性を抑制する工程を含む。
【００１８】
その一つの態様においては、構造
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
で示される低分子阻害剤を細胞に接触させ、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００２１】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、Zが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。
【００２２】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。
【００２４】
別の態様において、本発明は、細胞に
【化７０】
【化７１】
および
【化７２】
からなる群より選択される構造を有する低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞において細胞増殖の抑制を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の成長遅延を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の成長停止を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞のプログラム細胞死を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の壊死性細胞死を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、接触させた細胞は、ヒトの細胞である。
【００２６】
第5の局面において、本発明は、動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4の低分子阻害剤を投与し、これにより動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む。一つの態様においては、構造
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
を有する低分子阻害剤を動物に投与し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Ｚ (3)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、Zが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。別の態様において、本発明は、動物に
【化７３】
【化７４】
および
【化７５】
からなる群より選択される構造を有する低分子阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、低分子阻害剤を投与される動物がヒトである方法を提供する。
【００２８】
第6の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる工程、および/またはHDAC-4の低分子阻害剤を細胞に接触させる工程からなる。ある好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞であり、そして細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。
【００２９】
第7の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導において必要であるHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供するものである。本方法は、HDAC-4イソ型に候補となる低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程からなり、ここで、接触されたHDAC-4イソ型の酵素活性の低下は、候補低分子阻害剤を、HDAC-4イソ型の低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【００３０】
第8の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に関与しているHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供するものである。この方法は、候補となる低分子阻害剤を細胞に接触させ、接触させたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程からなり、ここで、HDAC-4イソ型の酵素活性の低下が候補低分子阻害剤を、HDAC-4の低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【００３１】
第9の局面において、本発明は、本発明の第7または第8の局面における方法により特定される低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供する。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、好ましくは、実質的に純粋である。
【００３２】
第10の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させる工程からなる。ある態様において、接触させた細胞の細胞成長抑制は、一つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長抑制よりも大きい。特定の態様において、当該群より選択される薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞である。また、追加の態様において、当該群より選択される薬剤は機能的に結合している。
【００３３】
第11の局面において、本発明は、腫瘍細胞成長を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させる工程からなる。いくつかの態様において、接触させた細胞の細胞成長抑制は、一つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長抑制よりも大きい。ある態様において、当該群より選択される薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞である。また、追加の態様において、当該群より選択される薬剤は機能的に結合している。
【００３４】
好ましい態様の詳細な説明
ここで引用する特許および科学文献は、当業者が確実に入手可能な知識である。この明細書で引用した、発行済み特許、出願、およびGenBankデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的および個別に参照されているのと同程度に、この明細書においてその一部として引用されている。
【００３５】
本発明は、核酸レベルで発現を抑制するか、またはタンパク質レベルで酵素活性を抑制することによりヒストンデアセチラーゼ(HDAC)イソ型、具体的にはHDAC-1およびHDAC-4を調節する方法および薬剤を提供する。本発明は、腫瘍発生に関連する特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、癌の治療法を提供する。更に、本発明は、細胞増殖に関与している特定のHDACイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、細胞増殖性疾患の治療法を提供する。
【００３６】
本発明者等は、HDAC-4の特異的な抑制が癌細胞におけるアポトーシスおよび成長の停止を劇的に誘導するという驚くべき発見をした。この発見を利用して本発明がなされ、第1の局面において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤を提供する。
【００３７】
本発明の第1の局面における特定の好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドである。HDAC-4核酸分子は、ゲノムDNA(例えば、遺伝子)、cDNA、またはRNAであり得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型をコードするmRNAの転写を抑制する。その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型の翻訳を抑制する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸分子の分解を引き起こす。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナノモル濃度で強くて特異的なアンチセンス活性を有する。
【００３８】
特定の好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現またはHDAC-4タンパク質の活性を抑制する低分子阻害剤である。
【００３９】
ヒストンデアセチラーゼの抑制に対して使用される「低分子」という用語は、ヒストンデアセチラーゼと相互作用し、HDACイソ型またはHDACタンパク質の活性をコードする核酸分子の発現を抑制することが可能であり、分子量が好ましくは1000Da未満、より好ましくは800Da未満、そして最も好ましくは600Da未満である化合物を特定するために使用される。ヒストンデアセチラーゼの酵素活性を抑制するとは、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を低下させることを意味する。いくつかの好ましい態様において、このようなヒストンデアセチラーゼ活性の低下は、少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、そして、更に好ましくは少なくとも約90％である。その他の態様において、ヒストンデアセチラーゼ活性は、少なくとも95％、そして、より好ましくは少なくとも99％低下する。特に好ましい態様において、HDACの低分子阻害剤は、HDAC-1および/またはHDAC-4の阻害剤である。HDAC-4の低分子阻害剤が最も好ましい。
【００４０】
このような抑制は、好ましくは特異的であり、即ち、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、別の関連性の無い生物学的効果をもたらすために必要な阻害剤の濃度よりも低い濃度で、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を低下させる。好ましくは、ヒストンデアセチラーゼ抑制活性に必要な阻害剤の濃度は、関連性の無い生物学的効果をもたらすために必要な濃度より少なくとも2倍低く、より好ましくは少なくとも5倍低く、更に好ましくは少なくとも10倍低く、そして、最も好ましくは少なくとも20倍低い。
【００４１】
HDAC-4を抑制する好ましい薬剤は、p53の状態に依存せずヒト癌細胞の成長を抑制する。これらの薬剤は、癌細胞においてアポトーシスを誘発し、成長の停止を引き起こす。また、これらの薬剤は、p21WAF1(癌抑制遺伝子)、アポトーシスの制御に関係する非常に重要な遺伝子のBax、およびストレス誘発遺伝子であり細胞成長の重要な調節物質であるGADD45、の転写を誘導できる。これらの薬剤は、インビトロおよびインビボ抗腫瘍活性の両方を示し得る。これらの内の一つ以上の結果を達成する抑制剤は、本発明のこの局面の範囲内とみなされる。
【００４２】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のヒストンデアセチラーゼイソ型の一部をコードするRNAの領域、または二本鎖DNAの領域に相補的である(異なるイソ型間のホモロジーは、一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが一つ以上のイソ型の部分と相補的であってもよいことを考慮する)。本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、二つ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそのいかなる組み合わせのポリマーも含む。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約6〜約50個のヌクレオシド残基、そして、最も好ましくは、約12〜約30個のヌクレオシド残基を有する。ヌクレオシド残基は、数々の公知のいずれのヌクレオシド間結合によっても互いに連結し得る。このようなヌクレオシド間結合としては、特に制限されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンインターヌクレオチド結合等が挙げられる。これらのヌクレオシド間結合は、好ましくは、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロアミデート結合、またはその組み合わせである。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、2'-O-置換リボヌクレオチドを含み得る。本発明の目的において、「2'-O-置換」という用語は、ペントース部分の2'位置を、1-6個の飽和または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基、または2〜6個の炭素原子を有する-O-アリールまたはアリル基によって置換することを意味し、ここでこのようなアルキル、アリールまたはアリル基は、置換されないか、または例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシル、またはアミノ基で置換されるか；またはこのような2'置換は、(リボヌクレオシドを生成するための)水酸基、アミノまたはハロ基であり得るが、2'-H基ではない。ここで使用される「アルキル」という用語は、1〜12個の炭素原子、好ましくは1〜8個の炭素原子、そしてより好ましくは1〜6個の炭素原子を有し、一つ、二つまたは三つの置換基により選択的に置換されてもよい直鎖および分枝鎖脂肪族基を意味する。内容から明らかでない限り、「アルキル」という用語は、飽和、不飽和、および部分的に不飽和の脂肪族基を含むことを意味する。特に不飽和基を意味する場合、「アルケニル」または「アルキニル」という用語が使用される。飽和基のみを意味する場合、「飽和アルキル」という用語が使用される。好ましい飽和アルキル基としては、特に制限されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。
【００４４】
オリゴヌクレオチドという用語は、化学的に修飾された塩基または糖、および/または、特に制限されないが、親油基、挿入剤、ジアミン、およびアダマンタン等の追加の置換基を有するポリマーも含む。オリゴヌクレオチドという用語は、PNAおよびLNA等のポリマーも含む。
【００４５】
この発明の目的では、「相補的」という用語は、生理的条件下でゲノム領域、遺伝子、またはそのRNA転写体にハイブリダイズする能力を有することを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間の塩基特異的水素結合の結果によるものであり、塩基スタッキングや、他の様式の水素結合もハイブリダイゼーションにつながるが、ワトソン-クリックまたはフーグスティーン塩基対を形成することが好ましい。実際問題として、このようなハイブリダイゼーションは、転写または翻訳(又は、両方)のレベルにあり得る特定の遺伝子発現抑制の観察から推測できる。
【００４６】
本発明のこの局面で利用される、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
本発明の目的では、「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種類以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、ヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ヌクレオシド間結合およびホスホジエステルを含み、好ましくは約2〜約12個のヌクレオチドからなる。本発明のいくつかの有用なオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート連結領域、およびアルキルホスホノチオエート領域を有する(例えば、Pedersonら、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照されたい)。そのようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合、またはその組み合わせの少なくとも三つの連続したヌクレオシド間結合を含むことが好ましい。
【００４８】
本発明の目的では、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」とは、1種類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、リボヌクレオチド、または好ましくは約2〜約12個の2'-O-置換ヌクレオチドからなる2'-O-置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも三つの連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはその組合せを含むことが好ましい(例えば、MetelevおよびAgrawal, 米国特許第5,652,355号、および第5,652,356号を参照されたい)。
【００４９】
本発明において利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドが、例えばHDAC-4またはHDAC-1イソ型の標的となる配列の発現を調節する能力を保持している限り、変動させることができる。これは、HDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするmRNAの量の定量、HDAC-4またはHDAC-1イソ型タンパク質の量の定量、HDAC-4またはHDAC-1イソ型酵素活性の定量、またはHDAC-4またはHDAC-1イソ型が、例えばインビトロもしくはインビボにおける細胞成長アッセイ法における細胞成長を抑制する能力の定量から、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるかどうかを試験することにより容易に決定され、この全ては、本明細書に詳細に記述されている。「発現を抑制」という用語、およびここで使用される類似の用語は、これらのパラメーターのいずれかを一つ以上包含する。
【００５０】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、H-ホスホネート化学反応、ホスホロアミダイト化学反応、またはH-ホスホネート化学反応およびホスホロアミダイト化学反応の組み合わせ(即ち、一部のサイクルにはH-ホスホネート化学反応、その他のサイクルにはホスホロアミダイト化学反応)を含む公知の化学的手法を使用して、適切な固体支持体上で好都合に合成してもよい。適切な固体支持体は、制御孔ガラス(CGP)等の個相オリゴヌクレオチド合成に使用されるいずれの標準固体支持体も含む(例えば、Pon, R. T., Meth. Molec. Biol. 20:465-496, 1993を参照されたい)。
【００５１】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、様々な目的に有用である。例えば、これらのものは、実験細胞培養または動物系において特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を抑制するため、そしてこのような特定のヒストンデアセチラーゼイソ型活性を抑制する効果を評価するために使用することにより、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の生理学的機能の「プローブ」として使用できる。これは、本発明による一つ以上のヒストンデアセチラーゼイソ型発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞又は動物に投与し、そして、表現型効果を観察することにより達成される。この用途において、本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の「遺伝子ノックアウト」手法よりも好ましく、その理由は、これらが使用しやすいため、そして、これらが発生または分化の選択された段階で特定のヒストンデアセチラーゼイソ型活性を抑制するのに使用できるためである。
【００５２】
本発明における好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-4もしくはHDAC-1イソ型をコードする核酸分子の転写および/またはHDAC-4もしくはHDAC-1をコードする核酸分子の翻訳を抑制するか、および/またはそのような核酸分子の分解を引き起こす。HDAC-4またはHDAC-1をコードする核酸分子は、RNAまたは二本鎖DNA領域であってよく、特に制限されないが、イントロン配列、5'および3'非翻訳領域、イントロン-エキソン境界、並びに、HDAC-4またはHDAC-1イソ型遺伝子からのコード配列が挙げられる。ヒト配列としては、Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(23)：2845-12850, 1996；Furukawaら、Cytogenet. Cell. Genet. 73(1-2)：130-133, 1996；Yangら、J. Biol. Chem. 272(44)：28001-28007, 1997；Betzら、Genomics 52(2)：245-246, 1998；Tauntonら、Science 272(5260)：408-411, 1996；およびDangondら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 242(3)：648-652, 1998を参照されたい。
【００５３】
ヒトHDACイソ型ポリヌクレオチドのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のHDACイソ型配列データより設計してもよい。例えば、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、およびHDAC-8のものとしては、以下のアミノ酸配列が、GenBankより入手可能であり、それぞれ、AAC50475、AAC50814、AAC98927、BAA22957、AB011172、AAD29048、AAF63491、およびAAF73076であり、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、およびHDAC-8のものとしては、以下のヌクレオチド配列が、GenBankより入手可能であり、それぞれ、U50079、U31814、AF039703、AB006626、AF039691、AJ011972、AF239243、およびAF230097である。
【００５４】
特に好ましい、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、HDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするRNAの領域または二本鎖DNAの領域に対して相補的である(ヒトHDAC-1については、GenBank アクセッション番号U50079を参照(図１B)、ヒトHDAC-4については、GenBank アクセッション番号AB006626を参照(図2B)のこと)。
【００５５】
多くの非ヒト動物種からのヒストンデアセチラーゼのコード配列も知られている(例えば、GenBank アクセッション番号X98207(マウスHDAC-1)およびAF006602(マウスHDAC-4)を参照されたい)。従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非ヒト動物からのHDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするRNAの領域または二本鎖DNAの領域に対して相補的であってよい。これらの態様におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の役割を研究するための動物モデルにおける道具として有用である。
【００５６】
特に好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の表1に示すヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。
【００５７】
これらのオリゴヌクレオチドは、以下の表1に示すヌクレオチド配列の約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。最も好ましくは、以下に示すオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有し、長さが20〜26ヌクレオチドであり、そして、オリゴヌクレオチドの5'末端にある終端の4ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの3'末端にある終端の4ヌクレオチドとの各々の糖残基に2'-O-メチル基が結合するように修飾されている。
【００５８】
（表１） HDACイソ型特異的なアンチセンスおよびミスマッチオリゴ
【００５９】
本発明に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤のいずれか(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版、A. Gennaro 編、Mack Publishing Co. ペンシルバニア州イーストン、1990、の薬学的に許容される製剤の調製を参照されたい)を使用して、このような担体または希釈剤がそれらのHDAC活性調節能力に影響を及ぼさないという条件下において、選択的に製剤化し得る。
【００６０】
ある好ましい態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型を抑制する薬剤は、低分子である。ある好ましい態様において、低分子は、HDAC-4またはHDAC-1イソ型の酵素活性を抑制する。
【００６１】
HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の、ある好ましい低分子阻害剤としては、式(1)
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
を有する化合物を含み、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Y1は、選択的に置換されてもよいC4-C6アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００６２】
上記定義のとおり、「アルキレン」基は、その他二つの化学基を連結する役割を果たし、その間に位置するアルキル基である。好ましいアルキレン基としては、特に制限されないが、メチレン、エチレン、プロピレン、およびブチレン等が挙げられる。
【００６３】
ここで使用される「シクロアルキル」という用語は、3〜12個の炭素、好ましくは3〜8個の炭素、そして、より好ましくは3〜6個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、ここでシクロアルキル基は、更に選択的に置換されてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、特に制限されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル等が挙げられる。
【００６４】
「アリール」基とは、1〜3個の芳香環を含むC6-C14芳香族部分であり、選択的に置換されてもよい。アリール基は、好ましくは、C6-C10アリール基である。好ましいアリール基としては、特に制限されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびフルオレニル等が挙げられる。「アラルキル」または「アリールアルキル」基は、アルキル基に共有結合により結合したアリール基からなり、どちらも独立して選択的に置換されてもよい。アラルキル基は、好ましくは、(C1-C6)アルク(C6-C10)アリールであり、特に制限されないが、ベンジル、フェネチル、およびナフチルメチル等が挙げられる。「アルクアリール」または「アルキルアリール」基は、一つ以上のアルキル置換基を有するアリール基である。アルクアリール基としては、特に制限されないが、トリル、キシリル、メシチル、エチルフェニル、第三級ブチルフェニル、およびメチルナフチル等が挙げられる。
【００６５】
上記定義のとおり、「アリレン」基は、その他二つの化学基を連結する役割を果たし、その間に位置するアリール基である。好ましいアリレン基としては、制限なく、フェニレンおよびナフチレンが含まれる。「アリレン」という用語は、ヘテロアリール架橋基をも含むことを意味し、特に制限されないが、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、キノリル、イソキノリル、およびインドリル等が挙げられる。
【００６６】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」基は、約3〜約8原子を有する環構造であり、ここで一つ以上の原子は、N、O、およびSからなる群より選択される。ヘテロ環式基は、一つ以上の位置で炭素が選択的に置換されていてもよい。また、ヘテロ環式基は、独立して、窒素がアルキル、アリール、アラルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニル、アリールカルボニル、アリールスルホニル、アルコキシカルボニル、もしくはアラルコキシカルボニルで、または硫黄がオキソもしくは低級アルキルで置換されていてもよい。好ましいヘテロ環式基としては、特に制限されないが、エポキシ、アジリジニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、およびモルホリノ等が挙げられる。ある好ましい態様において、ヘテロ環式基は、アリールまたはヘテロアリール基に縮合している。このような縮合ヘテロ環の例としては、特に制限されないが、テトラヒドロキノリンおよびジヒドロベンゾフラン等が挙げられる。
【００６７】
ここで使用されている「ヘテロアリール」という用語は、5〜14個の環構成原子、好ましくは5、6、9または10個の環構成原子を有し；環式アレイ状に共有した6、10、または14個のπ電子を有し；そして炭素原子に加えてN、O、およびSからなる群より選択される1〜約3個のヘテロ原子を有する基を意味する。好ましいヘテロアリール基としては、特に制限されないが、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、およびイソキサゾリル等が挙げられる。
【００６８】
ここで使用されている「置換された」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロ環式基とは、1〜約4個、好ましくは1〜約3個、より好ましくは1個または2個の非水素置換基を有するものである。適切な置換基としては、特に制限されないが、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルクアリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、およびウレイド基等が挙げられる。
【００６９】
ここで使用される「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素を意味する。
【００７０】
ここで使用される「アシル」という用語は、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニル置換基を意味する。
【００７１】
「アシルアミノ」という用語は、窒素原子が結合しているアミド基を意味する。「カルバモイル」という用語は、カルボニル炭素原子が結合しているアミド基を意味する。アシルアミノまたはカルバモイル置換基の窒素原子は、更に置換されていてもよい。「スルホンアミド」という用語は、硫黄または窒素原子により結合したスルホンアミド置換基を意味する。「アミノ」という用語は、NH2、アルキルアミノ、アリールアミノ、および環状アミノ基を含むことを意味する。
【００７２】
ここで使用される「ウレイド」という用語は、置換されてもよいウレア部分を意味する。
【００７３】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の低分子阻害剤は、式(2)
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Y2は、選択的に置換されてもよいC5-C7アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の好ましい低分子阻害剤としては、式(3)
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
の化合物が含まれ、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Bは-CH(OMe)、ケトン、またはメチレン；
Y3は、選択的に置換されてもよいC4-C6アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)であり、ここでアニリニルもしくはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００７４】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(4)
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、または-NH-C(O)-NH-であり；
Arは、アリレンであり、更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらの環はいずれも選択的に置換されてもよく；
Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよい；そして
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり(nは1、2または3)、そしてZが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、そしてZがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。
【００７５】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(5)
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；
L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-ではなく、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；
Arはアリレンであり、これは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；
Y2は、化学結合、または選択的に置換されてもよい直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ただしアルキレンは式-C(O)Rの置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分を含み；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZは両方ピリジルではない。
【００７６】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(6)
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；
L3は、
(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、もしくは4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、もしくは-NH-C(O)-NH-；または
(b) C1-C6アルキレンもしくはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、任意に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、
であり；
Arはアリレンであり、これは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に任意に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして
Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。
【００７７】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の低分子阻害剤は、
【化７６】
【化７７】
および
【化７８】
からなる群より選択される構造を有する。
【００７８】
本発明の方法において使用される低分子阻害剤の無制限の例は表2に示されている。
【００７９】
（表２） 選択されたMGアニリドのインビトロおよびインビボにおける性質(uMで表示)
注：インビボ抗癌研究について、括弧の外の数値はインビボにおける腫瘍発生の抑制％を示す；
括弧内の数値は、一日に使用した阻害剤の用量を示す(mg/体重kg/日)；
経口(PO)または腹腔内(IP)投与は、括弧内に示されている。
【００８０】
下記の反応式1〜3、またはその他の当技術分野において周知の方法に従って好都合に調製できる、式Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z、Cy-Y2-C(O)NH-Z、およびCy-B-Y3-C(O)-NH-Zの本発明の低分子阻害剤。
【００８１】
反応式1
ジアルキルアセタールIを、臭化亜鉛存在下、1-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、または1-トリメチルシリルオキシ-2,4-ジメチル-1,3-ブタジエンで処理し、アルデヒドIIを得た。IIのカルボアルコキシリンとのウイッテイヒ反応は、例えば、エチル(トリフェニルホスホルアニリデン)アセタートを生成し、ジエンエステルIIIを生成する。IIIのエステル基の加水分解は、水酸化リチウム等の水酸化物塩基で処理することにより行われ、相当する酸IVを生成する。
【００８２】
酸IVは、一般的な方法、例えば、水酸化ナトリウムおよび塩化オキサリルで処理することにより、相当する酸塩化物Vに変換される。Vを、好ましくは、塩化メチレン中、低温下で、1,2-フェニレンジアミンおよびN-メチルモルホリン等の3級塩基で処理し、アニリニルアミドVIを生成する。また、酸塩化物Vは、2-(t-BOC-アミノ)アニリン等の一方が保護された1,2-フェニレンジアミンで処理することが可能であり、続いて脱保護することによりVIを得た。
【化７９】
【００８３】
別の方法において、酸IVは、カルボニルジイミダゾール(CDI)で処理することにより活性化し得、続いて1,2-フェニレンジアミンおよびトリフルオロ酢酸で処理することによりアニリニルアミドVIを生成する。
【００８４】
式Cy-y2-C(O)-NH2(VII)の化合物であって、ここでY2が
【化８０】
であるものは、反応式2に示すとおり、対応するメトキシ置換化合物(VI)を2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン(DDQ)で酸化することにより調製できる。
【化８１】
【００８５】
式Cy-y2-C(O)-NH2の化合物であって、ここでy2が
【化８２】
の構造を有するものは、反応式3に示すように調製できる。反応式1に記載のとおり調製したメトキシ置換ジエンエステルIIIは、トリエチルシランおよび三フッ化ホウ素エーテル溶液で処理することにより、脱酸素化した化合物VIIIを生成する。VIIIのアニリニルアミドXへの変換は、反応式1に記載のものと類似の方法により達成される。
【００８６】
反応式3
【化８３】
【００８７】
式Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-Mの化合物であって、L1が-S(O)2NH-であるものは、反応式4〜6に示される合成ルートに従って調製できる。特定の好ましい態様において、化合物XIは、好ましくは、反応式4に示す一般的な合成経路により調製される。塩化スルホニル(XII)は、塩化メチレン等の溶媒中、トリエチルアミン等の有機塩基存在下、アミン(XIII)で処理される。粗生成物を、メタノール等のアルコール系溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基で処理すると、いかなるジアルキル化された物質も分解され、スルホンアミド(XIV)が提供される。XIVのエステル基の加水分解は、テトラヒドロフランおよびメタノール等の溶媒混合物中、水酸化リチウム等の水酸化塩基での処理により達成され、相当する酸(XV)が得られる。
【００８８】
反応式4
【化８４】
【００８９】
いくつかの態様において、酸XVのヒドロキサム酸XIへの変換は、XVを、テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン(NH2OTHP)等の保護されたヒドロキシルアミンとカップリングすることにより保護されたヒドロキサム酸塩XVIを得、続いてXVIの酸性加水分解によりヒドロキサム酸XIを得て達成される。カップリング反応は、好ましくは、塩化メチレン等の溶媒中、カップリング剤ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)により(方法A)、もしくは、ジメチルホルムアミド等の非プロトン性の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下、カップリング剤1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドにより(方法D)達成される。その他のカップリング剤は、当技術分野において周知であり、この反応にも使用してよい。XVIの加水分解は、好ましくは、メタノール等のプロトン性溶媒中、カンファースルホン酸等の有機酸で処理することにより達成される。
【００９０】
また、その他いくつかの態様において、酸XVは、好ましくは、塩化オキサリルで処理し、続いて、塩化メチレン等の溶媒中、O-トリメチルシリルヒドロキシルアミン等の保護されたヒドロキシルアミンの添加により相当する酸塩化物に変換され、後処理することにより、ヒドロキサム酸XIが提供される(方法C)。
【００９１】
更に、その他の態様において、エステルXIVは、メタノール等の溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基存在下、ヒドロキシルアミンで処理することにより、ヒドロキサム酸XIが直接得られる(方法B)。
【００９２】
反応式5
【化８５】
【００９３】
式XXおよびXXIVの化合物は、好ましくは、上記反応式5に概説した一般的手順に従って調製される。
【００９４】
アミノアリールハロゲン化物(XVII)は、トリエチルアミン等の塩基存在下、塩化スルホニルで処理し、続いてアルコキシド塩基で処理することにより、スルホンアミドXVIIIが生成する。当業者であれば、ハロアレーンスルホニルハロゲン化物をアリールアミンで処理するという類似の手順により逆型のスルホンアミドアナログを容易に調製できることがわかる。
【００９５】
化合物XVIIIを、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)等のパラジウム触媒存在下、ピロリジン等の溶媒中、末端アセチレンまたはオレフィン化合物とカップリングさせることにより、XIXが得られる。
【００９６】
式XIX(X=CH2OH)の化合物の酸化、続いてその結果得られたアルデヒドのホモログ化(カルベトキシメチレントリフェニルホスホラン等のウイッティヒ系薬剤をアセトニトリル等の溶媒中で使用する)は、式XXIの化合物を提供する。XXIの塩基性加水分解、例えば、THFおよび水の混合物中、水酸化リチウムでの処理は、酸XXIIを提供する。XXIIの水素化は、好ましくは、メタノール等のプロトン性溶媒中、Pd/C等のパラジウム触媒上で行われることにより、飽和酸XXIIIを生成する。酸XXIIIと、O-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン等のO-保護されたヒドロキシルアミンとのカップリングは、DMF等の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、またはN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)存在下、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド等のカップリング剤での処理により達成され、続いて脱保護により一般式XXIVの化合物が提供される。
【００９７】
酸XIX、ここでX=COOHのものは、O-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン等のO-保護されたヒドロキルアミンと直接結合でき、続いてヒドロキシ保護基の脱保護により、ヒドロキサム酸XXが提供される。
【００９８】
式Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-Mの化合物、ここでL1が-C(O)NH-であるものは、好ましくは、反応式4〜5に示されているものと類似の合成経路に従い、それらの反応式における塩化スルホニル出発物質を酸塩化物出発物質に置き換えて調製できる。
【００９９】
反応式6
【化８６】
【０１００】
式Cy-L2-Ar-Y2-C(O)-NH-O-Mの化合物は、好ましくは、反応式6〜8に概説される合成ルートに従って調製される。従って、特定の好ましい態様において、式XXIXおよびXXXI(L2=-C(O)-CH=CH-または-C(O)-CH2CH2-)の化合物は、好ましくは反応式6に記載の経路に従って調製される。従って、置換されたアリールアセトフェノン(XXV)は、メタノール等のプロトン性溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基存在下、アリールアルデヒド(XXVI)で処理され、エノンXXVIIが提供される。
【０１０１】
XXVII(R=H)の酸置換基とO-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン(R1=テトラヒドロピラニル)等のO-保護されたヒドロキシルアミンをカップリングさせ、O-保護された-N-ヒドロキシベンズアミドXXVIIIを生成する。カップリング反応は、好ましくは、塩化メチレン等の溶媒中、酸とヒドロキルアミンをジシクロヘキシルカルボジイミドで処理するか、ジメチルホルムアミド等の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドで処理することにより行われる。当技術分野において周知のその他のカップリング剤もこの反応に使用できる。O-脱保護は、メタノール等の溶媒中、XXVIIIをカンファースルホン酸等の酸で処理することにより達成され、ヒドロキサム酸XXIX(L2=-C(O)-CH=CH-)が提供される。
【０１０２】
式XXXI(L2=-C(O)-CH2CH2-)の飽和化合物の調製は、好ましくは、メタノール―テトラヒドロフラン等の溶媒中、10％Pd/C等のパラジウム触媒上、XXVII(R=Me)を水素化して行われる。上記のとおり、得られた飽和エステルXXXを水酸化リチウムで塩基性加水分解し、続いてN-ヒドロキシアミド形成および酸性加水分解を行うことにより、ヒドロキサム酸XXXIが生成する。
【０１０３】
反応式7
【化８７】
【０１０４】
式XXXVI(L2=-(CH2)o+2-)の化合物は、好ましくは、反応式7に記載の一般手順により調製される。従って、いくつかの態様において、アセトニトリル等の溶媒中、触媒量のパラジウムアセタートまたはトリス(ジベンンジリジンアセトン)ジパラジウム(0)等のパラジウム源、トリフェニルホスフィン等のホスフィン、およびトリエチルアミン等の塩基存在下、末端オレフィン(XXXII)をアリールハロゲン化物(XXXIII)とカップリングさせることにより、カップリング生成物XXXIVが提供される。上記のとおり、水素化後、N-ヒドロキサミド形成および酸性加水分解を行うことによりヒドロキサム酸XXXVIが得られる。
【０１０５】
反応式8
【化８８】
【０１０６】
また、その他のいくつかの態様において、テトラヒドロフラン等の溶媒中、リチウムヘキサメチルジシラジド等の塩基存在下、式XXXVIIのホスホニウム塩を式XXXVIIIのアリールアルデヒドで処理することにより、化合物XXXIVを生成する。水素化後、N-ヒドロキサミド形成および酸性加水分解を行うことにより化合物XXXVIが得られる(反応式8)。
【０１０７】
式Cy-L-Ar-Y-C(O)-NH-Zの化合物、ここで、前記のとおり、LはL1またはL2、前記のとおり、YはY1またはY2、そして、Zはアニリニルもしくはピリジルまたはチアジアゾリルであり、好ましくは、反応式9に概説された合成経路に従って調製される。
【０１０８】
反応式9
【化８９】
【０１０９】
反応式4〜8に示されるいずれか一つの方法により調製された式Cy-L-Ar-Y-C(O)-OH(XXXIX)の酸は、一般的な方法、例えば、水酸化ナトリウムと塩化オキサリルとで処理することにより相当する酸塩化物XLに変換される。XLを2-アミノピリジンおよびN-メチルモルホリン等の3級塩基で、好ましくは塩化メチレン中、低温で処理することにより、ピリジルアミドXLIが生成する。同様に、酸塩化物XLを1,2-フェニレンジアミンで処理することにより、アニリニルアミドXLIIを提供できる。また、酸塩化物XLは、2-(t-BOC-アミノ)アニリン等のモノ保護された1,2-フェニレンジアミンで処理してもよく、続いて脱保護することによりXLIIが生成する。
【０１１０】
別の手法において、酸XXXIXは、カルボニルジイミダゾール(CDI)で処理することにより活性化でき、続いて1,2-フェニレンジアミンおよびトリフルオロ酢酸で処理することによりアニリニルアミドXLIIが提供される。
【０１１１】
反応式10
【化９０】
【０１１２】
式XLVIII(L2=−C(O)-アルキレン-)の化合物は、好ましくは、反応式10に示される一般的手順に従って調製される。したがって、ケトンXLIII(R1=Hまたはアルキル)とアルデヒドXLIVとのアルドール縮合により、付加体XLVが提供される。付加体XLVは、相当するヒドロキサム酸XLVIに直接変換してもよい。XLVの水素化により、飽和化合物XLVIIを生成でき、このものはヒドロキサム酸XLVIIIに変換される。
【０１１３】
反応式11
【化９１】
【０１１４】
式(5)の化合物、ここでL2における炭素原子の一つがS、S(O)、またはS(O)2で置換されているものは、好ましくは、反応式11に概説した一般的手順に従って調製される。したがって、チオールXLIXをオレフィンLに加え、LIを生成する。この反応は、好ましくは、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)または1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)(VAZO(商標))等のラジカル開始剤の存在下で行われる。スルフィド酸化は、好ましくはm-クロロ過安息香酸(mCPBA)で処理することにより、相当するスルホンが得られ、ジアゾメタンで処理し、メチルエステルに変換後、好都合に単離される。次に、エステルの加水分解により酸LIIが得られ、このものは上記の手順のいずれかに従ってヒドロキサム酸LIIIに変換される。スルフィドLIも、相当するヒドロキサム酸LIVに直接変換され、次にこのものは、例えば、過酸化水素と酸化テルルで処理することにより、スルホキシドLVに選択的に酸化される。
【０１１５】
本発明に記載の薬剤は、分析手段、および遺伝子治療手段を含む治療手段として有用である。更に、本発明は、副作用の発生をより少なくしながら、治療する症状に合わせて操作および微調整できる方法および組成物を提供する。
【０１１６】
本発明は、更に、細胞においてHDAC-4活性を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4の特異的阻害剤を接触させることにより、HDAC-4活性が抑制される工程を含む方法を提供する。ここで使用される「特異的阻害剤」という用語は、細胞においてHDAC RNA量、HDACタンパク質量、および/またはHDACタンパク質活性を低下させるいかなる分子または化合物も意味する。特に好ましい特異的阻害剤は、細胞において、HDAC-1および/またはHDAC-4のRNA量、タンパク質量、および/またはタンパク質活性を低下させる。
【０１１７】
その一つの態様において、本発明は、細胞においてHDAC-4イソ型を抑制する方法であって、細胞に本発明の第1の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含む方法を提供する。細胞増殖は、好ましくは、接触させた細胞において抑制される。好ましい態様において、細胞は、ヒトを含む動物に存在しうる腫瘍細胞であり、腫瘍成長状態にあってもよい。特定の好ましい態様において、本発明の第2の局面の方法は、HDAC-4イソ型と相互作用し、その酵素活性を低減させるHDAC-4低分子阻害剤を細胞に接触させることを更に含む。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。
【０１１８】
したがって、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接触した細胞における細胞増殖を抑制することにより、良性および悪性腫瘍を含むヒトの疾病に対する治療手段において有用である。「細胞増殖を抑制する」という表現は、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子HDAC-4阻害剤(またはその組合せ)が、オリゴヌクレオチドまたは低分子阻害剤に接触させた細胞の成長を、接触させていない細胞と比べて遅延させる能力を意味する。
【０１１９】
細胞増殖の評価は、コールターセルカウンタ(Coulter、フロリダ州マイアミ)または血球計を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドまたは低分子に接触させた細胞を数え、その数を非接触細胞の数と比較することにより行うことができる。細胞が固形成長している場合(例えば、固形腫瘍または器官)、細胞増殖のこのような評価は、ノギスで組織または器官の成長を測定し、接触細胞と非接触細胞の成長サイズを比較することにより、行うことができる。好ましくは、この用語は、細胞増殖の遅延が非接触細胞の少なくとも50％であることを包含する。より好ましくは、この用語は、細胞増殖の遅延が非接触細胞の100％である(すなわち、接触細胞は、数もサイズも増加しない)ことを包含する。最も好ましくは、この用語は、非接触細胞と比較した場合の、接触細胞の数またはサイズの減少を包含する。したがって、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチド、または接触細胞において細胞増殖を抑制するHDAC-4低分子阻害剤は、接触細胞において成長遅延、成長停止、プログラム細胞死(即ち、アポトーシス)、または壊死性細胞死を誘導する。
【０１２０】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖抑制能力によって、a-同調成長細胞群の同調が可能となる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで成長した非腫瘍細胞群を、細胞周期のG1またはG2期において停止させるために使用できる。このような同調により、例えば、遺伝子および/または細胞周期のG1またはG2期の間に発現した遺伝子産物が特定できる。培養細胞のこのような同調は、形質移入の効率が、形質移入される細胞の特定の細胞周期相に依存して変化するような新しい形質移入手順において、その有効性を試験する際にも有用であり得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用により細胞群の同調が可能となるため、形質移入効率の向上を検出するために役立つ。
【０１２１】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有用性は、本明細書の別の箇所で詳細に説明されている。
【０１２２】
また別の好ましい態様において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた細胞は、HDAC-4低分子阻害剤とも接触させる。
【０１２３】
ここで使用されるように、「ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤」という用語は、タンパク質レベルで一つ以上の特定のヒストンデアセチラーゼイソ型と相互作用し、そのヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を低下させることのできる活性部分を示す。特に好ましくは、HDAC-1および/またはHDAC-4イソ型を抑制するヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤である。HDAC-1低分子阻害剤は、HDAC-1イソ型の活性を低下させる分子である。HDAC-4低分子阻害剤は、HDAC-4イソ型の活性を低下させる分子である。好ましい態様において、活性の低下は少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。別の態様において、ヒストンデアセチラーゼイソ型の活性は100倍低下する。後述のとおり、好ましいヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、腫瘍形成に関与するHDAC-4および/またはHDAC-1イソ型と相互作用し、その酵素活性を低下させるものである。
【０１２４】
いくつかの好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。上記のとおり、本発明によりアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤を使用して選択的に製剤化されてもよい。この製剤は、一つ以上の追加のヒストンデアセチラーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、および/または一つ以上のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を更に含み、あるいはその他のいかなる薬理学的に活性な薬剤を含んでもよい。
【０１２５】
「機能的に結合した」または「機能的結合」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つ以上の特定のヒストンデアセチラーゼイソ型をコードする核酸の発現を抑制し、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤が特定のヒストンデアセチラーゼイソ型酵素活性を抑制できるようにする、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤との間のいかなる結合をも含む。本発明の一つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤と機能的に結合している。いくつかの好ましい態様において、ある特定のヒストンデアセチラーゼイソ型(例えば、HDAC-4)を標的とする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じヒストンデアセチラーゼイソ型(例えば、HDAC-4)を標的とする低分子阻害剤と機能的に結合している。好ましい機能的結合は、加水分解可能である。加水分解可能な結合は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤との間の共有結合である。このような共有結合は、例えば、エステラーゼおよび/またはアミダーゼにより加水分解可能である。このような加水分解可能な結合の例は、当技術分野において周知である。リン酸エステルは特に好ましい。
【０１２６】
ある好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤をオリゴヌクレオチドの主鎖と一体化できるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤とを直接共有結合させてもよい。あるいは、共有結合は拡張された構造によるものでもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の両方を炭水化物、ペプチド、脂質、または糖脂質等の担体分子に結合することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドをヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤に共有結合させて生成してもよい。別の有用な機能的結合としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤が親油性分子に共有結合したものを含むリポソームの生成等の親油性結合が挙げられる。このような親油性分子としては、特に制限されないが、ホスホチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、シアリラックNAc-HDPE等の合成ネオ糖脂質が挙げられる。ある好ましい態様において、機能的な結合は物理的結合ではなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つのリポソームと結合し、低分子阻害剤が別のリポソームと結合している場合のように、体内で単に同時に共存しているだけでもよい。
【０１２７】
第3の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4の特異的阻害剤を投与することにより、動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む方法を提供する。一つの態様において、本発明は、動物における腫瘍細胞成長を阻害する方法を提供する。この方法において、治療的に有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、体内に少なくとも1つの腫瘍細胞が存在する動物に投与され、このオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される担体と共に治療的に有効な期間投与される。動物は、好ましくは哺乳類、特に家畜である。動物は、最も好ましくはヒトである。
「腫瘍細胞」という用語は、異常な細胞成長を示す細胞を意味する。腫瘍細胞は、過形成細胞、インビトロにおいて成長の接触抑制の欠如を示す細胞、インビボにおいて転移が不可能な良性腫瘍細胞、またはインビボにおいて転移が可能であり、除去施行後も再発の恐れがある癌細胞であってもよい。「腫瘍形成」という用語は、腫瘍成長の発展を引き起こす、特徴的でないかまたは時宜を得ていない細胞増殖の誘導を示すのに用いられる。
【０１２８】
ここで使用される、「治療的に有効な量」という用語は、医薬品組成物の各有効成分の総量、または患者において有意義な利益を示すのに十分な方法、即ち、HDAC活性、特にHDAC-1および/またはHDAC-4活性の抑制であるか、または増殖性疾患および障害を治療するための腫瘍成長の抑制を意味する。単独で投与する1つの有効成分に適用した場合、この用語はその成分のみを示す。組み合わせて適用した場合、この用語は、併用、連続または同時投与に関わらず、治療効果をもたらす有効成分の合わせた量を意味する。
【０１２９】
医薬品組成物に使用されている本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与、または本発明の方法の実施は、多様な従来からの方法、例えば、眼内投与、経口摂取、吸入、皮膚適用、皮膚内、筋肉内、または静脈内注射等により行うことが可能である。
【０１３０】
治療的に有効な量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを経口投与した場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液、またはエリキシル剤の形態となる。錠剤として投与した場合、本発明の医薬品組成物は、ゼラチンまたはアジュバント等の追加の固形担体を含んでもよい。錠剤、カプセル剤、および散剤は、約5％〜95％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約25％〜90％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体の形態で投与した場合、水、石油、動物由来もしくはラッカセイ油等の植物由来の油脂、鉱油、大豆油、胡麻油、または合成油等の液体担体を加えてもよい。液状の医薬品組成物は、更に、生理食塩水、デキストロースもしくはその他のサッカリド溶液、またはエチレングリコールプロピレングリコール、もしくは、ポリエチレングリコール等のグリコール類を更に含んでもよい。液状投与した場合、医薬品組成物は、重量比約0.5％〜90％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは、約1％〜50％の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１３１】
治療的に有効な量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、または腹腔内注射により投与した場合、合成オリゴヌクレオチドは、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の状態となる。pH、等張性、安定性等に十分配慮して調製されるこの様な非経口的に許容される溶液は、当技術分野の技術範囲内である。静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または眼内注射のための好ましい医薬品組成物は、合成オリゴヌクレオチドの他に、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸化リンゲル注射等の等張性媒体、または当技術分野において知られたその他の媒体を含むことが望ましい。本発明の医薬品組成物は、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に周知のその他の添加物を含み得る。
【０１３２】
本発明の医薬品組成物に存在する合成オリゴヌクレオチドの量は、治療される状態の性質および重症度、および患者が過去に受けた治療の性質に依存する。最終的に、担当医は、個々の患者を治療するための合成ヌクレオチドの量を決定する。まず、担当医は、低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の反応を観察する。合成オリゴヌクレオチドは、患者にとって最適な治療的効果が得られるまで、より多い用量で投与してもよく、その時点で、用量は更に増やさない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬品組成物は、体重または器官の重さ1kgあたり約10μg〜約20mgの合成オリゴヌクレオチドを含むことが望ましいと考えられる。
【０１３３】
本発明の医薬品組成物を使用した静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度と個々の患者の状態および潜在的な特有の反応とに応じて変化する。最終的に担当医は、本発明の医薬品組成物を使用して、静脈内療法の適当な期間を決定する。
【０１３４】
好ましい態様において、本発明の治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度が約0.01μM〜約20μMに達するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度が約0.05μM〜約15μMに達するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度は、約0.1μM〜約10μMである。
【０１３５】
局所投与の場合、これよりも更に低い濃度が治療的に有効と考えられる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、約0.1mg〜約200mgのオリゴヌクレオチドの範囲となる。より好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約1mg〜約20mgの範囲となる。最も好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約1mg〜約10mgの範囲となる。特に好ましい態様において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約5mgである。
【０１３６】
この方法は、HDAC-4低分子阻害剤の治療有効量を、薬学的に許容される担体とともに、治療有効期間、動物に投与することを更に含む。上述のとおり、いくつかの好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。
【０１３７】
本発明のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を含有する治療組成物は、約0.01μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度は約0.1μM〜約5μMである。局所投与の場合、これより更に低い濃度が有効であり得る。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、好ましくは、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約100mgの範囲となる。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約50mgの範囲となる。最も好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約25mgの範囲となる。特に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の治療有効相乗量(アンチセンスオリゴヌクレオチドとともに投与した場合)は、一日に体重1kgあたり5mgである。
【０１３８】
本発明の方法の結果抑制効果が向上する場合、定められた抑制効果を得るために必要な核酸レベル阻害剤(即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチド)およびタンパク質レベル阻害剤(即ち、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤)のいずれか、または両方の治療有効濃度は、どちらかを個別に使用した場合に必要な濃度よりも減少する。
【０１３９】
更に、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のどちらかの治療有効相乗量は、他の成分の量を微調整し、そして変更することにより増減できることを認識すると思われる。したがって、本発明は、定められた動物種または特定の患者に特異的な特定の緊急事態にあわせて、投与/治療を調整する方法を提供する。治療有効範囲は容易に決定され、例えば、比較的少ない量からの開始、および段階的増量と共に行う抑制の同時評価により、経験的に決定される。
【０１４０】
第4の局面において、本発明は、細胞においてHDAC-4イソ型を抑制する方法であって、細胞に、本発明の第1の局面の低分子阻害剤を接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の第4の局面の、ある好ましい態様において、細胞増殖は、接触させた細胞において抑制される。好ましい態様において、細胞は、ヒトを含む動物に存在しうる腫瘍細胞、および腫瘍成長中でありうる腫瘍細胞である。
【０１４１】
第5の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、その身体に少なくとも1つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量の本発明の第1の局面の低分子阻害剤を、薬学的に許容される担体とともに、治療的に有効な期間投与する工程を含む方法を提供する。
【０１４２】
本発明のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を含有する治療組成物は、約0.01μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度は約0.1μM〜約5μMである。局所投与の場合、これより更に低い濃度が有効であり得る。好ましくは、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約100mgの範囲である。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約50mgの範囲である。最も好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約25mgの範囲である。
【０１４３】
第6の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド接触させる工程、または細胞にHDAC-4の低分子阻害剤を接触させる工程を含む方法を提供する。ある好ましい態様において、細胞は、腫瘍細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。
【０１４４】
本発明は更に、細胞増殖を誘導するために必要なHDAC-1およびHDAC-4等のヒストンデアセチラーゼイソ型を特異的に抑制しつつ、一方で細胞増殖の誘導には必要とされないその他のヒストンデアセチラーゼイソ型を抑制しない、生産可能なヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を提供する。したがって、第7の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に必要なHDAC-4イソ型および/またはHDAC-1イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。本方法は、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型に候補低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程を含み、ここで、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性の低下により、候補低分子阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼイソ型、即ちHDAC-4および/またはHDAC-1を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として同定される。
【０１４５】
HDAC-4またはHDAC-1の酵素活性測定は、公知の方法論により達成してもよい。例えば、Yoshidaら(J. Biol. Chem. 265:17174-17179, 1990)は、トリコスタチンA処理した細胞におけるアセチル化されたヒストンの検出による、ヒストンデアセチラーゼの酵素活性の評価について説明している。Tauntonら(Science 272:408-411, 1996)も同様に、内在性および組換えHDACを使用してヒストンデアセチラーゼの酵素活性を測定する方法について説明している。Yoshidaら(J. Biol. Chem. 265:17174-17179, 1990)およびTauntonら(Science 272:408-411, 1996)の両者は、本明細書に参考文献として引用される。
【０１４６】
細胞増殖の誘導に必要なHDAC-4および/またはHDAC-1イソ型を抑制するヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、好ましくは、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型と相互作用し、その酵素活性を低下させるHDAC-4低分子阻害剤である。
【０１４７】
第8の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に関与するHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供する。本方法は、細胞に候補低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程を含み、ここで、HDAC-4イソ型の酵素活性の低下により候補低分子阻害剤を、HDAC-4を阻害する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【０１４８】
第9の局面において、本発明は、本発明の第7または第8の局面の方法により特定された低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供する。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、実質的に純粋であることが好ましい。
【０１４９】
第10の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を抑制する方法であって、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、接触細胞の細胞成長は、1つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長より大きく抑制される。ある態様において、当該群より選択された薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において細胞は腫瘍細胞である。また、追加の好ましい態様において、当該群より選択された薬剤は、機能的に結合している。
【０１５０】
第11の態様において、本発明は、腫瘍細胞成長を抑制する方法であって、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、接触細胞の細胞成長は、1つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長より大きく抑制される。ある態様において、当該群より選択された薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において細胞は腫瘍細胞である。また、追加の好ましい態様において、当該群より選択された薬剤は、機能的に結合している。
【０１５１】
DNAメチルトランスフェラーゼを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Szyfおよびvon Hofe、米国特許第5,578,716号に記載されている。DNAメチルトランスフェラーゼ低分子阻害剤としては、5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-アザ-dC)、5-フルオロ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン(5-アザ-C)、または5,6-ジヒドロ-5-アザ-シチジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに説明するものであり、本質的に本発明を制限するものではない。当業者は、通常の実験方法のみを使用して、本明細書に記載された特定の物質および手順と同等のものを数多く認識するか、または確認することができる。このような同等の物質および手順は、本発明の範囲内とみなされ、添付の特許請求の範囲内と見なされる。
【０１５３】
実施例 1 アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および同定
アンチセンス(antisense；AS)およびミスマッチ(mismatch；MM)オリゴデオキシヌクレオチド(oligo；オリゴ)は、標的遺伝子の5'-または3'-非翻訳領域(untranslated region；UTR)に対して設計された。オリゴは、自動合成機を使用してホスホロチオエート主鎖および4x4ヌクレオチド2'-O-メチル修飾で合成し、調製用逆相HPLCで精製した。使用されたオリゴの長さは、全て20塩基対であった。
【０１５４】
ヒト癌細胞においてHDAC-1発現を抑制できるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(oligodeoxynucleotide；ODN)を同定するために、ヒトHDAC-1遺伝子(GenBankアクセッション番号U50079)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む11個のホスホロチオエートODNを、まず、100nMでT24細胞においてスクリーニングした。24時間処理した後、細胞を回収し、HDAC-1 RNA発現をノーザンブロット解析で解析した。このスクリーニングにより、HDAC-1 ASが、ヒトHDAC-1に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-1 MM オリゴは対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを有する。
【０１５５】
ヒトHDAC-2遺伝子(GenBankアクセッション番号U31814)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む24個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-2 ASは、ヒトHDAC-2に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-2 MMは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、7塩基のミスマッチを含む。
【０１５６】
ヒトHDAC-3遺伝子(GenBankアクセッション番号AF039703)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む21個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-3 ASは、ヒトHDAC-3に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-3 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを含む。
【０１５７】
ヒトHDAC-4遺伝子(GenBankアクセッション番号AB006626)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む17個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-4 ASは、ヒトHDAC-4に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-4 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを含む。
【０１５８】
ヒトHDAC-6遺伝子(GenBankアクセッション番号AJ011972)の5'または3'非翻訳領域に相補的な配列を含む13個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-6 ASは、ヒトHDAC-6に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-6 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、7塩基のミスマッチを含む。
【０１５９】
実施例 2 mRNA レベルにおける、 HDAC AS ODN による特異的な発現抑制
AS ODN処理がmRNAレベルにおけるHDAC発現を低減させたか否かを決定するために、ヒトHDAC-3に対する50nMのアンチセンス(AS)オリゴ、またはそれに相当するミスマッチ(MM)オリゴでヒトA549細胞を48時間処理し、ヒトHDAC-4またはそのMM オリゴ(100nM)に対する50nMまたは100nMのAS オリゴでA549細胞を24時間処理した。
【０１６０】
簡潔に述べると、オリゴヌクレオチド処理の1日前に、ヒトA549および/またはT24ヒト膀胱癌細胞を10cm組織培養プレートに一時的に播種した。細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC)(ヴァージニア州マナッサス)より入手し、推薦されている培養条件で培養した。オリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞をPBS(リン酸緩衝食塩水)で洗浄した。次に、6.25μg/mlのリポフェクチントランスフェクション薬剤(GIBCO BRL、カナダ、オンタリオ州ミシサーガ)を無血清OPTIMEM培地(GIBCO BRL、メリーランド州ロックビル)に加え、次にこれを細胞に添加した。次いで、スクリーニングされるオリゴヌクレオチドを直接細胞に添加した(すなわち、1細胞プレート当たり１オリゴヌクレオチド)。ミスマッチオリゴヌクレオチドを対照として使用した。試験した各オリゴヌクレオチドに１細胞プレート当たり同じ濃度のオリゴヌクレオチド(例えば50nM)を使用した。
【０１６１】
細胞を収集し、ノーザンブロット解析により全RNAを分析した。簡潔に述べると、RNeasyミニプレップカラム(QIAGEN)を使用して、全RNAを抽出した。ホルムアルデヒド含有1％アガロースゲルに、0.5Mのリン酸ナトリウム(pH 7.0)を緩衝液系として、10〜20μgの全RNAを泳動した。次に、RNAをニトロセルロース膜に移し、指定された放射線標識DNAプローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフィーは、通常の手順を使用して行った。
【０１６２】
図3Aおよび図3Bにそれぞれ示されているとおり、ヒトA549細胞におけるHDAC-3 mRNAおよびHDAC-4 mRNAの発現は、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理により抑制された。これらの結果は、HDAC AS ODNが標的とされたHDAC発現をmRNAレベルで特異的に抑制できることを示す。
【０１６３】
実施例 3 HDAC OSDN による HDAC タンパク質発現の抑制
HDAC OSDNによる処理がHDACタンパク質発現を抑制するか否かを決定するために、ヒトHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6に対する50nMの対になったアンチセンスまたはそのミスマッチオリゴを用いてヒトA549癌細胞を48時間処理した。OSDN処理条件は、前述のとおりである。
【０１６４】
細胞は、1％トリトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、5mM EDTA、25mMトリス塩酸、pH7.5、およびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液で溶解した。総タンパク質量は、Bio-Rad製のタンパク質アッセイ薬剤(カリフォルニア州ヘラクレス)により定量した。100ugの総タンパク質は、SDS-PAGEにより分析した。次に、総タンパク質をPVDF膜に移し、様々なHDAC特異的一次抗体で探索した。ウサギ抗HDAC-1(H-51)、抗HDAC-2(H54)抗体(Santa CruzBiotechnologies、カリフォルニア州サンタクルーズ)は、1:500希釈で使用した。ウサギ抗HDAC-3抗体(Sigma、ミズーリ州セントルイス)は、1:1000希釈で使用した。抗HDAC-4抗体は、前述(Wang, S.H.ら、(1999) Mol. Cell. Biol. 19:7816-27)のように調製し、1:1000希釈で使用した。抗HDAC-6抗体は、HDAC-6タンパク質の断片(GenBankアクセッション番号AAD29048、アミノ酸番号990〜1216)を含むGST融合タンパク質でウサギを免疫することにより生産した。ウサギ抗血清を試験した結果、ヒトHDAC-6イソ型のみに特異的に反応することが明らかになった。HDAC-6抗血清は、ウエスタンブロットにおいて1:500希釈で使用して、全細胞可溶化物内のHDAC-6を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼを抱合した二次抗体を1:5000希釈で使用して、一次抗体結合を検出した。二次抗体の結合は、高度化学発光(Enhanced chemiluminescence；ECL)検出キット(Amersham-Pharmacia Biotech社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を利用して可視化した。
【０１６５】
図4に示すとおり、細胞をHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6 ODNで48時間処理することにより、各々のHDACイソ型タンパク質の発現が特異的に抑制される。
【０１６６】
HDACタンパク質発現レベルが癌細胞表現型において重要な要素であることを示すために実験を行い、正常細胞および癌細胞におけるHDACイソ型の発現レベルを測定した。ウエスタンブロット解析は、上記のとおりに実施した。
【０１６７】
表3に示した結果は、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6イソ型タンパク質が癌細胞系において過剰発現していることを明確に示す。
【０１６８】
（表３） ヒト正常細胞および癌細胞におけるHDACイソ型の発現レベル
(-)：検出不可能；(+):検出可能；(++)：(+)の2倍以上；(+++)：(+)の5倍以上；(++++)：(+)の10倍以上
【０１６９】
実施例 4 細胞成長およびアポトーシスに対する HDAC イソ型特異的 OSDN の効果
細胞成長およびアポトーシスによる細胞死に対するHDAC OSDNの効果を決定するために、A549またはT24細胞、MDAmb231細胞、およびHMEC細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)をHDAC OSDNによって前述のとおり処理した。
【０１７０】
アポトーシス研究のために、細胞死検出ELISAPlus キット(Cell Death Detection ELISAPlus、Roche Diagnostic GmBH、ドイツ、マンハイム)を使用して、製造者のマニュアルに従って細胞を分析した。典型的には、細胞の回収および溶解の2時間前に10,000個の細胞を96ウェル組織培養プレートに播種した。各サンプルを2回分析した。MR700プレートリーダー(DYNEX Technology、イングランド、ミドルセックス、アッシュフォード)を410nmで使用して、ELISA結果を読み取った。基準は、490nmとした。
【０１７１】
細胞成長分析には、ヒト癌または正常細胞を、ヒトHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6に対する50nMの対になったASまたはMMオリゴで72時間処理して行った。細胞を回収し、血球計数機を使用して、トリパンブルー排除法により細胞数を数えた。抑制率は、(100-AS細胞数/対照細胞数)％として計算した。
【０１７２】
研究の結果は、図5および図6、ならびに表4および表5に示す。ヒト癌細胞のHDAC-4 ASによる処理、そしてHDAC1 ASによる処理も多少は、様々なヒト癌細胞の成長停止およびアポトーシスを誘導する(図5および図6、表4および表5)。相当するミスマッチは影響を及ぼさない。成長抑制およびアポトーシスに対するHDAC-4 ASまたはHDAC-1 ASの効果は、ヒト正常細胞において優位に低減されている。HDAC-4またはHDAC-1 ASオリゴの効果と対照的に、ヒトHDAC-3およびHDAC-6 OSDNによる処理は、癌細胞成長またはアポトーシスに影響を及ぼさず、ヒトHDAC-2 OSDNでの処理は、癌細胞成長抑制に最小の効果を示す。T24細胞はp53ヌルであり、そしてA549細胞はp53野生型であるため、このアポトーシスの誘導は、p53活性に依存しない。
【０１７３】
（表４） HDAC-4 AS1により変化した遺伝子転写
cDNAアレイ分析のために全RNAを回収する2日前に、ヒトA549細胞を50nMのオリゴで処理した；
転写における変化の倍数は、をHDAC-4ミスマッチオリゴ(MM2)処理した細胞の値と比較したものである；
588個の遺伝子の内、39個の遺伝子発現がHDAC-4 AS1により変化した。
【０１７４】
（表５） 処理48時間後のヒト正常細胞および癌細胞のアポトーシスに対するHDACイソ型特異的OSDNの効果
「-」：非特異的バックグラウンドの2倍以下；「+」：2〜3倍；「++」：3〜5倍；「+++」：5〜8倍；「++++」：8倍
【０１７５】
実施例 5 HDAC イソ型の抑制による成長制御遺伝子発現の誘発
HDAC-1またはHDAC-4 AS処理により誘発された癌細胞の成長停止およびアポトーシスの機構を理解するために、RNase保護アッセイ法を使用して細胞成長制御因子(p21およびGADD45)およびアポトーシス促進性遺伝子BaxのmRNA発現を分析した。
【０１７６】
要するに、ヒト癌A549またはT24細胞をHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(各々50nM)で48時間処理した。全RNAを抽出し、RNase保護アッセイ法を行うことにより、p21およびGADD45のmRNA発現レベルを分析した。対照として、A549細胞を、TSA(250ng/ml)処理存在下または非存在下、リポフェクチンで16時間処理した。これらのRNase保護アッセイ法は下記の手順に従い行った。キアゲン(QIAGEN)社製の「RNeasyミニプレップキット」を使用し、製造者のマニュアルに従って細胞からの全RNAを調製した。保護アッセイ法に使用する標識されたプローブは、製造者のマニュアルに従ってファーミンジェン(Pharmingen)(米国カルフォルニア州サンディエゴ)社製の「hStress-1マルチプルプローブテンプレートセット(multiple-probe template sets)」を使用することにより合成した。製造者のマニュアルに従い、アンビオン(Ambion)社(テキサス州オースチン)製の「RPA II(商標)リボヌクレアーゼ保護アッセイキット(Ribonuclease Protection Assay Kit)」を使用して、保護手順を行った。オートラジオグラムのバンドの定量は、Cyclone(商標)ホスフォシステム(Phosphor System) (Packard Instruments社、コネチカット州メリデン)を使用して行った。結果を図7および表6に示す。
【０１７７】
（表６） 細胞をヒトHDACイソ型特異的アンチセンスで処理した後のp21、GADD45、およびBaxの上方制御
値は、AS対MM HDACイソ型特異的オリゴのそれぞれに対してRNase保護分析により測定した転写誘導の倍数を示す。
【０１７８】
図7に示されているように、A549およびT24癌細胞の両方におけるHDAC-4の抑制は、p21およびGADD45両方の発現の両方を劇的に上方制御する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるHDAC-1の抑制は、p21の発現を誘導するが、GADD45の発現をより強く誘導する。HDAC-4の抑制は、A549およびT24細胞の両方においてBaxの発現を上方制御する。A549細胞におけるp21誘導に対するHDAC-4 AS処理(50nM、48時間)の効果は、TSA(0.3〜0.8uM、16時間)の効果に匹敵する。
【０１７９】
HDACタンパク質発現に対するHDACアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べるために実験を更に行った。A549細胞において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、p21タンパク質量の劇的な増加に至る(図8)。
【０１８０】
実施例 7 低分子による HDAC イソ型の抑制
HDAC低分子阻害剤の同定を示すために、様々なヒトヒストンデアセチラーゼイソ型酵素(例えば、HDAC-1、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6)を使用してヒストンデアセチラーゼの酵素アッセイ法によりHDAC低分子阻害剤をスクリーニングした。クローニングされ、C末端がフラッグエピトープ(Grozinger, C.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4868-4873 (1999))により標識された組換えヒトHDAC-1、HDAC-3、およびHDAC-6酵素は、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現システムにより生産された。
【０１８１】
フラッグで標識したヒトHDAC-4酵素は、リン酸カルシウム沈殿法による形質転換後、ヒト腎胚293細胞において生産された。要するに、10％ウシ胎児血清と抗生物質とを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で293細胞を培養した。フラッグで標識したヒトHDAC-4をコードするプラスミドDNAは、エタノールで沈殿させ、精製水に再懸濁した。DNA、塩化カルシウム、および2xHEPES緩衝食塩水を混合して形成させたDNA-カルシウム沈殿物を293細胞上に12〜16時間放置した。細胞は、血清含有DMEM培地に戻し、フラッグで標識したHDAC-4酵素の精製のために遺伝子導入の48時間後に回収した。
【０１８２】
HDAC-1およびHDAC-6は、Q-セファロースカラムに続いて抗フラッグエピトープアフィニティーカラムを使用して精製した。その他のHDACイソ型、HDAC-3およびHDAC-4は、抗フラッグアフィニティーカラムで直接精製した。
【０１８３】
デアセチラーゼアッセイ法には、20,000cpmの[3H]-代謝標識アセチル化ヒストンを基質として使用した。ヒストンは、クローニングした組換えヒトHDAC酵素と37℃でインキュベーションした。インキュベーションの時間は、HDAC-1アッセイ法の場合10分であり、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6アッセイ法の場合は2時間である。全てのアッセイ条件は、各反応が確実に直線的であるよう、予め測定を行った。酢酸(最終濃度0.04M)、および塩酸(最終濃度250mM)を添加して反応を停止した。混合物を酢酸エチルで抽出し、遊離した[3H]-酢酸を液体シンチレーションで計数して定量した。抑制の研究において、HDAC酵素を、酵素アッセイ開始前に被験化合物と4℃で30分間、プレインキュベーションした。HDAC酵素阻害剤のIC50値は、各化合物の用量反応曲線により測定され、その結果、最大抑制の50％を達成する阻害剤濃度の値が得られた。
【０１８４】
実施例 8 低分子による細胞全体における HDAC 活性の抑制
培養液において成長しているT24ヒト膀胱癌細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)を被験化合物と共に16時間インキュベートした。ヒストンは、培養期間後、一般的な手法(前記Yoshidaらを参照)により細胞から抽出した。20μgの全コアヒストンタンパク質をSDS/PAGEにロードし、そしてニトロセルロース膜に移し、これをアセチル化したヒストンH-4に特異的なポリクローナル抗体(Upstate Biotech社、ワイオミング州レイクプラシッド)と反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型二次抗体を1:5000希釈で使用して、一次抗体の結合を検出した。二次抗体の結合は、高度化学発光(Enhanced chemiluminescence；ECL)検出キット(Amersham-Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を利用して可視化した。フイルム撮影後、アセチル化H-4シグナルは、デンシトメーターにより定量した。
【０１８５】
上記表2に示した結果は、HDAC-1および/またはHDAC-4に選択的な低分子阻害剤が、細胞全体においてヒストン脱アセチル化を抑制できることを示す。
【０１８６】
実施例 9 HDAC 低分子阻害剤による癌成長の抑制
4500個のヒト大腸癌HCT116細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)をMTT(3-[4,5-ジメチルチアゾル-2-イル]-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイ法で使用して、細胞増殖および細胞毒性を定量的に測定した。典型的には、HCT116細胞を96ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種し、プレートに付着させるために一晩放置した。様々な濃度(DMSO中、1uM、5uM、および25uM)で化合物を培地に添加し(最終DMSO濃度1％)、各々三連で、48時間インキュベートした。MTT溶液(粉末としてSigmaより入手)を添加し、細胞と5％CO2インキュベーター内で37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション中、生細胞は、MTTを水不溶性のホルマザン色素に変換する。溶解緩衝液(50％N,N-ジメチルホルムアミド、20％SDS、pH4.7)を細胞に加え、5％CO2インキュベーターで37℃にて一晩インキュベートした。溶解させた色素は、630nMを基準として、570nMで比色測定することにより定量した。
【０１８７】
上記表2に示した結果はHDAC-1および/またはHDAC-4に特異的な低分子阻害剤が細胞増殖に影響を及ぼしうることを示す。
【０１８８】
実施例 10 マウスモデルにおける、低分子による腫瘍成長の抑制
メスBALB/cヌードマウスはチャールスリバー研究所(Charles River Laboratories)(ニューヨーク州チャールスリバー)より入手し、8〜10週齢のものを使用した。動物のわき腹にヒト前立腺腫瘍細胞(DU145、2x106個)またはヒト大腸癌細胞(HCT116、2x106個)または2x106個の小肺コアA549を皮下注射し、固形腫瘍を形成させた。腫瘍断片を少なくとも3回連続的に継代させ、次に全身麻酔をかけて、約30mgの腫瘍断片を小さな外科的切開により皮下移植した。腹腔内投与または経口投与による低分子阻害剤の投与は、腫瘍の体積が100mm3に達した時に開始した。腹腔内投与には、HDACの低分子阻害剤(40〜50mg/体重1kg/日)を100％DMSOに溶解し、毎日腹腔内注射して投与した。経口投与には、HDACの低分子阻害剤(40〜50mg/体重1kg/日)を65％ポリエチレングリコール400(PEG400)(Sigma-Aldridge、カナダ、オンタリオ州ミシサウガ、カタログ番号P-3265)、5％エタノール、および30％水を含む溶液に溶解した。腫瘍の体積を20日間、週2回観測した。実験群の各々は、少なくとも6〜8匹の動物を含んだ。抑制率は、媒体処理したマウスを対照として腫瘍の体積から計算した。
【０１８９】
上記表2に示す結果は、HDAC-1および/またはHDAC-4に特異的な低分子阻害剤がインビボで腫瘍細胞の成長を抑制できることを示す。
【０１９０】
同等物
当業者は、決まった実験方法のみを用いて、本明細書に記載された本発明の特定の態様と同等のものを数多く認識し、あるいは確認することができると思われる。このような同等物は本発明の特許請求の範囲内と見なされる。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】AS1およびAS2が、HDAC4の発現をRNAレベルで用量依存的に抑制できることを示す図である。ヒト癌A549細胞は、用量を段階的に増大させたAS1、AS2、またはMM2オリゴで24時間処理した。全RNAを収集し、ノーザン解析を行った。
【図２】AS1およびAS2が、HDAC4の発現をタンパク質レベルで抑制できることを示す図である。ヒト癌A549細胞をAS1、AS2またはMM2オリゴで48時間処理した。ヒトHDAC4に対して特異的な抗体を用いて、細胞全体の可溶化物をウエスタンブロットにより解析した。
【図３】HDAC4 AS1またはAS2で処理したヒト癌細胞A549の成長曲線を示す図である。0時間の時点で、10cmプレートに2.5x105細胞/枚で播種した。細胞を24時間および48時間の時点で50nMのオリゴにより処理した。トリパンブルー排除法により、24時間、48時間および72時間の時点で細胞数を数えた。
【図４】HDAC4 AS1またはAS2で処理したヒト癌細胞Du145の増殖曲線を示す図である。0日目の時点で、10cmプレートに2.5x105細胞/枚で播種した。細胞を1日目、2日目、および3日目に50nMのオリゴで処理した。トリパンブルー排除法により、1日目、2日目、3日目および4日目に細胞数を数えた。
【図５】ヒトA549癌細胞に対するHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴのアポトーシス性効果を示すグラフ表示である。
【図６】ヒトA549癌細胞に対するHDAC-4アンチセンスオリゴの細胞周期遮断効果を示すグラフ表示である。
【図７】ヒトA549細胞におけるHDACイソ型mRNA発現に対するHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴの効果を示すRNAse保護アッセイを表示する図である。
【図８】ヒトA549細胞をHDAC-4アンチセンスオリゴで処理することによりp21タンパク質の発現が誘導されることを示すウエスタンブロットを表示する図である。
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は、遺伝子発現および腫瘍学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
クロマチンは、真核細胞の核内に存在するタンパク質およびDNAの複合体である。クロマチンタンパク質は、核DNAを構造的そして機能的に組織化する。ヌクレオソームは、クロマチンの基本的な構造形成単位である。ヌクレオソームは、主に(1)会合してタンパク質コア粒子を形成するH2A、H2B、H3およびH4と呼ばれるコアヒストン、および(2)ヒストンコア粒子に巻き付いた約146塩基対のDNAから構成される。コアヒストン粒子とDNAとの間の物理的相互作用は、主に、DNAの負電荷を帯びたリン酸基とヒストンタンパク質の塩基性アミノ酸部分とによって起こる。(Csordas, Biochem. J., 286:23-38 (1990))による開示では、ヒストンは、そのN末端のリジン残基のイプシロンアミノ基に翻訳後アセチル化を受け易く、この反応は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(histone acetyltransferase; HAT)により触媒される。ヒストンの翻訳後アセチル化は、構造的ならびに機能的な結果、即ち、遺伝子制御に関する結果をもたらす。
【０００３】
アセチル化は、Ｎ末端リジン残基のεアミノ基の正電荷を中和し、これによりDNAとヌクレオソームのヒストンコア粒子との間の相互作用に影響を及ぼす。したがって、ヒストンのアセチル化および脱アセチル化(HDAC)は、クロマチン構造および遺伝子制御に影響を及ぼすと考えられる。例えば、Tauntonら、Science, 272:408-411 (1996)による開示では、クロマチンテンプレートへの転写因子の接近は、ヒストンの過度のアセチル化により促進される。更に、Tauntonらは、アセチル化が不十分なヒストンH4の増加がゲノムの転写サイレント領域に見られることを明らかにしたと開示している。
【０００４】
公知のHDAC阻害剤を利用した研究より、アセチル化と遺伝子発現の間の関係が確立された。Yoshidaら、Cancer Res. 47:3688-3691 (1987)によると(R)-トリコスタチン A(TSA)は、マウス赤白血病細胞において、強力な分化誘発剤となる。また、Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265:17174-17179 (1990)によるとTSAは、哺乳動物HDACの強力な阻害剤である。
【０００５】
数々の研究においてHDACおよび遺伝子発現の相関関係が調べられてきた。Tauntonら、Science 272:408-411 (1996)は酵母の転写制御因子に関連性を有するヒトHDACを明らかにしている。また、Cressら、J. Cell. Phys. 184:1-16 (2000)はヒトの癌においてHDACの役割が、転写のコリプレッサーであることを明らかにしている。Ngら、TIBS 25:March (2000)はHDACが、転写リプレッサーシステムの広播性に関連していることを明らかにしている。また、Magnaghi-Jaulinら、Prog. Cell Cycle Res. 4:41-47 (2000)は、HDACが、細胞周期の進行に重要な転写制御補助因子であることを明らかにしている。
【０００６】
HDAC活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列の分子クローニングにより、別々のHDAC酵素イソ型からなる群の存在が認められた。Grozingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4868-4873 (1999)によるとHDACは、二種類に分類してもよく、第一の種類は酵母Rpd3様タンパク質に代表され、第二の種類は、酵母Hda1様タンパク質に代表される。更に、Grozingerらによると、ヒトHDAC-1、HDAC-2、およびHDAC-3タンパク質は第一種HDACの一員であり、HDAC-4、HDAC-5、およびHDAC-6と呼ばれる新規のタンパク質が第二種HDACの一員である。Kaoら、Gene & Development 14:55-66 (2000)は、この第二種に属する追加の一員であるHDAC-7を明らかにしている。最近では、Hu, E.ら、J. Bio. Chem. 275:15254-13264 (2000)が第一種ヒストンデアセチラーゼに属する最新のものであるHDAC-8を明らかにしている。これらHDAC酵素の各々の役割は不明である。
【０００７】
遺伝子制御におけるHDACの役割を探るために、哺乳類HDACの公知の阻害剤がしばしば使用されてきた。Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265:17174-17179 (1990)は(R)-トリコスタチン A(TSA)が、哺乳類HDACの強力な阻害剤であることを明らかにしている。また、Yoshidaら、Cancer Res. 47:3688-3691 (1987)はTSAが、マウス赤白血病細胞において、強力な分化誘発剤となることを明らかにしている。
【０００８】
ヒストンデアセチラーゼの公知の阻害剤は、すべて低分子であり、これらはタンパク質レベルでヒストンデアセチラーゼ活性を抑制する。その上、すべての公知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型に対して非特異的であり、両方のヒストンデアセチラーゼファミリーのすべてのメンバーのほぼすべてを抑制する(Grozinger, C. M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4868-4873 (1999))。例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、および分化やアポトーシスを研究する上でのそれら阻害剤の役割の総説(Marksら、J. National Cancer Inst. 92:1210-1216 (2000))を参照されたい。
【０００９】
従って、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型を抑制するための薬剤を開発する必要性が存在する。また、これらの薬剤を使用して特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を調節し、そして、腫瘍発生およびその他の増殖性疾患および障害に関与するイソ型を特定する方法を開発する必要がある。
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)イソ型の活性を調節する方法および薬剤を提供する。例えば、本発明は、核酸レベルで発現を抑制するか、または、タンパク質レベルで酵素活性を抑制することによりHDACイソ型、具体的にはHDAC-1およびHDAC-4を抑制する方法および薬剤を提供する。本発明は、腫瘍発生に関与する特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、癌の治療法を提供する。更に本発明は、細胞増殖に関与する特定のHDACイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、細胞増殖疾患および障害の治療法を提供する。
【００１１】
本発明者等は、HDAC-4の特異的な抑制が癌細胞においてアポトーシスおよび増殖の停止を劇的に誘発するという驚くべき発見をした。したがって、一つの局面において、本発明は、HDAC-4イソ型の活性を抑制する薬剤を提供する。
【００１２】
本発明の第1の局面におけるある好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドである。HDAC-4イソ型をコードする核酸分子は、ゲノムDNA(例えば、遺伝子)、cDNA、またはRNAであり得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型をコードするmRNAの転写を抑制する。また、その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型の翻訳を抑制する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸分子の分解を引き起こす。
【００１３】
その好ましい態様において、本発明の第１の局面の薬剤は、HDAC-4の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-4の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。その一つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリッドオリゴヌクレオチドである。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：11の配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、更に、長さが20〜26ヌクレオチドである。また、その別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾されて、オリゴヌクレオチドの5'末端にある終端の4ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの3'末端にある終端の4ヌクレオチドのその糖残基の各々には、2'-O-メチル基が結合している。
【００１４】
第1の局面のある好ましい態様において、細胞内でHDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現、またはHDAC-4タンパク質の活性を抑制する低分子阻害剤である。
【００１５】
第2の局面において、本発明は、細胞内でHDAC-4活性を抑制する方法を提供するものであり、細胞にHDAC-4に特異的な阻害剤を接触させることによりHDAC-4の活性を抑制する工程を含む。その態様において、本発明は、細胞内でHDAC-4イソ型を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-4の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることによりHDAC-4活性を抑制する工程を含む。その一つの態様においては、細胞に、キメラオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様においては、細胞にハイブリッドオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に、別の態様においては、ヌクレオチド配列の長さが約13〜約35ヌクレオチドであって、配列番号：11のヌクレオチド配列を含むHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる。別の態様においては、ヌクレオチド配列の長さが約15〜約26個のヌクレオチドであって、配列番号：11のヌクレオチド配列を含むHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる。別の態様においては、細胞に、配列番号：11のHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる。別の態様において、HDAC-4活性の抑制は、接触させた細胞において細胞増殖の抑制を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の成長遅延を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の成長停止を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞のプログラム細胞死を引き起こす。別の態様において、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制は、更に、接触させた細胞の壊死性細胞死を引き起こす。ある態様において、細胞は、ヒトを含む動物内に存在し得る腫瘍細胞であり、腫瘍性成長の状態にあり得る。ある好ましい態様において、本方法は更に、HDAC-4ヒストンデアセチラーゼイソ型と相互作用して、その酵素活性を低下させるHDAC-4低分子阻害剤を細胞に接触させる工程を含む。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に接続している。
【００１６】
第3の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4特異的阻害剤を投与し、これにより動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む。その一つの態様において、本発明は、動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に治療的に有効な量の本発明の第1の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される担体と共に、治療的に有効な期間投与する工程を含む。その一つの態様において、動物には、キメラHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、ハイブリッドHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列から選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。更に別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。また別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、動物には、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物はヒトである。別の態様において、この方法は更に、治療に有効な量の、HDAC-1の一部をコードするRNAの領域、またはHDAC-1の一部をコードする二本鎖DNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に投与する工程を含む。その一つの態様において、動物には、キメラHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、ハイブリッドHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。また、別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：2のヌクレオチド配列から選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。別の態様において、動物には、配列番号：5のヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。別の態様において、動物には、配列番号：5のヌクレオチド配列を含む約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。また、別の態様において、動物には、配列番号：5であるHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。
【００１７】
第4の局面において、本発明は、細胞内のHDAC-4活性を抑制する方法を提供するものであり、細胞にHDAC-4の低分子阻害剤を接触させることによりHDAC-4の活性を抑制する工程を含む。
【００１８】
その一つの態様においては、構造
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
で示される低分子阻害剤を細胞に接触させ、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００２１】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、Zが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。
【００２２】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、細胞に構造
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
で示される低分子阻害剤を接触させることを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。
【００２４】
別の態様において、本発明は、細胞に
【化７０】
【化７２】
【００２５】
別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞において細胞増殖の抑制を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の成長遅延を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の成長停止を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞のプログラム細胞死を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、更に、接触させた細胞の壊死性細胞死を引き起こすことを含む方法を提供する。別の態様において、接触させた細胞は、ヒトの細胞である。
【００２６】
第5の局面において、本発明は、動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法を提供し、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4の低分子阻害剤を投与し、これにより動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む。一つの態様においては、構造
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
を有する低分子阻害剤を動物に投与し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Ｚ (3)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここでアルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、Zが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない。別の態様において、本発明は、構造
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
を有する低分子阻害剤を動物に投与することを含む方法を提供し、式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここでアリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。別の態様において、本発明は、動物に
【化７３】
【化７５】
【００２７】
別の態様において、本発明は、低分子阻害剤を投与される動物がヒトである方法を提供する。
【００２８】
第6の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる工程、および/またはHDAC-4の低分子阻害剤を細胞に接触させる工程からなる。ある好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞であり、そして細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。
【００２９】
第7の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導において必要であるHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供するものである。本方法は、HDAC-4イソ型に候補となる低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程からなり、ここで、接触されたHDAC-4イソ型の酵素活性の低下は、候補低分子阻害剤を、HDAC-4イソ型の低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【００３０】
第8の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に関与しているHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供するものである。この方法は、候補となる低分子阻害剤を細胞に接触させ、接触させたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程からなり、ここで、HDAC-4イソ型の酵素活性の低下が候補低分子阻害剤を、HDAC-4の低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【００３１】
第9の局面において、本発明は、本発明の第7または第8の局面における方法により特定される低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供する。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、好ましくは、実質的に純粋である。
【００３２】
第10の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させる工程からなる。ある態様において、接触させた細胞の細胞成長抑制は、一つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長抑制よりも大きい。特定の態様において、当該群より選択される薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞である。また、追加の態様において、当該群より選択される薬剤は機能的に結合している。
【００３３】
第11の局面において、本発明は、腫瘍細胞成長を抑制する方法を提供するものであり、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させる工程からなる。いくつかの態様において、接触させた細胞の細胞成長抑制は、一つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長抑制よりも大きい。ある態様において、当該群より選択される薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は腫瘍細胞である。また、追加の態様において、当該群より選択される薬剤は機能的に結合している。
【００３４】
好ましい態様の詳細な説明
ここで引用する特許および科学文献は、当業者が確実に入手可能な知識である。この明細書で引用した、発行済み特許、出願、およびGenBankデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的および個別に参照されているのと同程度に、この明細書においてその一部として引用されている。
【００３５】
本発明は、核酸レベルで発現を抑制するか、またはタンパク質レベルで酵素活性を抑制することによりヒストンデアセチラーゼ(HDAC)イソ型、具体的にはHDAC-1およびHDAC-4を調節する方法および薬剤を提供する。本発明は、腫瘍発生に関連する特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、癌の治療法を提供する。更に、本発明は、細胞増殖に関与している特定のHDACイソ型の特異的な抑制を提供し、したがって、細胞増殖性疾患の治療法を提供する。
【００３６】
本発明者等は、HDAC-4の特異的な抑制が癌細胞におけるアポトーシスおよび成長の停止を劇的に誘導するという驚くべき発見をした。この発見を利用して本発明がなされ、第1の局面において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤を提供する。
【００３７】
本発明の第1の局面における特定の好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドである。HDAC-4核酸分子は、ゲノムDNA(例えば、遺伝子)、cDNA、またはRNAであり得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型をコードするmRNAの転写を抑制する。その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、HDAC-4イソ型の翻訳を抑制する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸分子の分解を引き起こす。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナノモル濃度で強くて特異的なアンチセンス活性を有する。
【００３８】
特定の好ましい態様において、HDAC-4イソ型を抑制する薬剤は、HDAC-4イソ型をコードする核酸分子の発現またはHDAC-4タンパク質の活性を抑制する低分子阻害剤である。
【００３９】
ヒストンデアセチラーゼの抑制に対して使用される「低分子」という用語は、ヒストンデアセチラーゼと相互作用し、HDACイソ型またはHDACタンパク質の活性をコードする核酸分子の発現を抑制することが可能であり、分子量が好ましくは1000Da未満、より好ましくは800Da未満、そして最も好ましくは600Da未満である化合物を特定するために使用される。ヒストンデアセチラーゼの酵素活性を抑制するとは、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を低下させることを意味する。いくつかの好ましい態様において、このようなヒストンデアセチラーゼ活性の低下は、少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、そして、更に好ましくは少なくとも約90％である。その他の態様において、ヒストンデアセチラーゼ活性は、少なくとも95％、そして、より好ましくは少なくとも99％低下する。特に好ましい態様において、HDACの低分子阻害剤は、HDAC-1および/またはHDAC-4の阻害剤である。HDAC-4の低分子阻害剤が最も好ましい。
【００４０】
このような抑制は、好ましくは特異的であり、即ち、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、別の関連性の無い生物学的効果をもたらすために必要な阻害剤の濃度よりも低い濃度で、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を低下させる。好ましくは、ヒストンデアセチラーゼ抑制活性に必要な阻害剤の濃度は、関連性の無い生物学的効果をもたらすために必要な濃度より少なくとも2倍低く、より好ましくは少なくとも5倍低く、更に好ましくは少なくとも10倍低く、そして、最も好ましくは少なくとも20倍低い。
【００４１】
HDAC-4を抑制する好ましい薬剤は、p53の状態に依存せずヒト癌細胞の成長を抑制する。これらの薬剤は、癌細胞においてアポトーシスを誘発し、成長の停止を引き起こす。また、これらの薬剤は、p21WAF1(癌抑制遺伝子)、アポトーシスの制御に関係する非常に重要な遺伝子のBax、およびストレス誘発遺伝子であり細胞成長の重要な調節物質であるGADD45、の転写を誘導できる。これらの薬剤は、インビトロおよびインビボ抗腫瘍活性の両方を示し得る。これらの内の一つ以上の結果を達成する抑制剤は、本発明のこの局面の範囲内とみなされる。
【００４２】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のヒストンデアセチラーゼイソ型の一部をコードするRNAの領域、または二本鎖DNAの領域に相補的である(異なるイソ型間のホモロジーは、一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが一つ以上のイソ型の部分と相補的であってもよいことを考慮する)。本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、二つ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそのいかなる組み合わせのポリマーも含む。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約6〜約50個のヌクレオシド残基、そして、最も好ましくは、約12〜約30個のヌクレオシド残基を有する。ヌクレオシド残基は、数々の公知のいずれのヌクレオシド間結合によっても互いに連結し得る。このようなヌクレオシド間結合としては、特に制限されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンインターヌクレオチド結合等が挙げられる。これらのヌクレオシド間結合は、好ましくは、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロアミデート結合、またはその組み合わせである。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、2'-O-置換リボヌクレオチドを含み得る。本発明の目的において、「2'-O-置換」という用語は、ペントース部分の2'位置を、1-6個の飽和または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基、または2〜6個の炭素原子を有する-O-アリールまたはアリル基によって置換することを意味し、ここでこのようなアルキル、アリールまたはアリル基は、置換されないか、または例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシル、またはアミノ基で置換されるか；またはこのような2'置換は、(リボヌクレオシドを生成するための)水酸基、アミノまたはハロ基であり得るが、2'-H基ではない。ここで使用される「アルキル」という用語は、1〜12個の炭素原子、好ましくは1〜8個の炭素原子、そしてより好ましくは1〜6個の炭素原子を有し、一つ、二つまたは三つの置換基により選択的に置換されてもよい直鎖および分枝鎖脂肪族基を意味する。内容から明らかでない限り、「アルキル」という用語は、飽和、不飽和、および部分的に不飽和の脂肪族基を含むことを意味する。特に不飽和基を意味する場合、「アルケニル」または「アルキニル」という用語が使用される。飽和基のみを意味する場合、「飽和アルキル」という用語が使用される。好ましい飽和アルキル基としては、特に制限されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。
【００４４】
オリゴヌクレオチドという用語は、化学的に修飾された塩基または糖、および/または、特に制限されないが、親油基、挿入剤、ジアミン、およびアダマンタン等の追加の置換基を有するポリマーも含む。オリゴヌクレオチドという用語は、PNAおよびLNA等のポリマーも含む。
【００４５】
この発明の目的では、「相補的」という用語は、生理的条件下でゲノム領域、遺伝子、またはそのRNA転写体にハイブリダイズする能力を有することを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間の塩基特異的水素結合の結果によるものであり、塩基スタッキングや、他の様式の水素結合もハイブリダイゼーションにつながるが、ワトソン-クリックまたはフーグスティーン塩基対を形成することが好ましい。実際問題として、このようなハイブリダイゼーションは、転写または翻訳(又は、両方)のレベルにあり得る特定の遺伝子発現抑制の観察から推測できる。
【００４６】
本発明のこの局面で利用される、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
本発明の目的では、「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種類以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、ヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ヌクレオシド間結合およびホスホジエステルを含み、好ましくは約2〜約12個のヌクレオチドからなる。本発明のいくつかの有用なオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート連結領域、およびアルキルホスホノチオエート領域を有する(例えば、Pedersonら、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照されたい)。そのようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合、またはその組み合わせの少なくとも三つの連続したヌクレオシド間結合を含むことが好ましい。
【００４８】
本発明の目的では、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」とは、1種類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、リボヌクレオチド、または好ましくは約2〜約12個の2'-O-置換ヌクレオチドからなる2'-O-置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも三つの連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはその組合せを含むことが好ましい(例えば、MetelevおよびAgrawal, 米国特許第5,652,355号、および第5,652,356号を参照されたい)。
【００４９】
本発明において利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドが、例えばHDAC-4またはHDAC-1イソ型の標的となる配列の発現を調節する能力を保持している限り、変動させることができる。これは、HDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするmRNAの量の定量、HDAC-4またはHDAC-1イソ型タンパク質の量の定量、HDAC-4またはHDAC-1イソ型酵素活性の定量、またはHDAC-4またはHDAC-1イソ型が、例えばインビトロもしくはインビボにおける細胞成長アッセイ法における細胞成長を抑制する能力の定量から、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるかどうかを試験することにより容易に決定され、この全ては、本明細書に詳細に記述されている。「発現を抑制」という用語、およびここで使用される類似の用語は、これらのパラメーターのいずれかを一つ以上包含する。
【００５０】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、H-ホスホネート化学反応、ホスホロアミダイト化学反応、またはH-ホスホネート化学反応およびホスホロアミダイト化学反応の組み合わせ(即ち、一部のサイクルにはH-ホスホネート化学反応、その他のサイクルにはホスホロアミダイト化学反応)を含む公知の化学的手法を使用して、適切な固体支持体上で好都合に合成してもよい。適切な固体支持体は、制御孔ガラス(CGP)等の個相オリゴヌクレオチド合成に使用されるいずれの標準固体支持体も含む(例えば、Pon, R. T., Meth. Molec. Biol. 20:465-496, 1993を参照されたい)。
【００５１】
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、様々な目的に有用である。例えば、これらのものは、実験細胞培養または動物系において特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を抑制するため、そしてこのような特定のヒストンデアセチラーゼイソ型活性を抑制する効果を評価するために使用することにより、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の生理学的機能の「プローブ」として使用できる。これは、本発明による一つ以上のヒストンデアセチラーゼイソ型発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞又は動物に投与し、そして、表現型効果を観察することにより達成される。この用途において、本発明に従って使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の「遺伝子ノックアウト」手法よりも好ましく、その理由は、これらが使用しやすいため、そして、これらが発生または分化の選択された段階で特定のヒストンデアセチラーゼイソ型活性を抑制するのに使用できるためである。
【００５２】
本発明における好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-4もしくはHDAC-1イソ型をコードする核酸分子の転写および/またはHDAC-4もしくはHDAC-1をコードする核酸分子の翻訳を抑制するか、および/またはそのような核酸分子の分解を引き起こす。HDAC-4またはHDAC-1をコードする核酸分子は、RNAまたは二本鎖DNA領域であってよく、特に制限されないが、イントロン配列、5'および3'非翻訳領域、イントロン-エキソン境界、並びに、HDAC-4またはHDAC-1イソ型遺伝子からのコード配列が挙げられる。ヒト配列としては、Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(23)：2845-12850, 1996；Furukawaら、Cytogenet. Cell. Genet. 73(1-2)：130-133, 1996；Yangら、J. Biol. Chem. 272(44)：28001-28007, 1997；Betzら、Genomics 52(2)：245-246, 1998；Tauntonら、Science 272(5260)：408-411, 1996；およびDangondら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 242(3)：648-652, 1998を参照されたい。
【００５３】
ヒトHDACイソ型ポリヌクレオチドのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のHDACイソ型配列データより設計してもよい。例えば、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、およびHDAC-8のものとしては、以下のアミノ酸配列が、GenBankより入手可能であり、それぞれ、AAC50475、AAC50814、AAC98927、BAA22957、AB011172、AAD29048、AAF63491、およびAAF73076であり、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、およびHDAC-8のものとしては、以下のヌクレオチド配列が、GenBankより入手可能であり、それぞれ、U50079、U31814、AF039703、AB006626、AF039691、AJ011972、AF239243、およびAF230097である。
【００５４】
特に好ましい、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、HDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするRNAの領域または二本鎖DNAの領域に対して相補的である(ヒトHDAC-1については、GenBank アクセッション番号U50079を参照(図１B)、ヒトHDAC-4については、GenBank アクセッション番号AB006626を参照(図2B)のこと)。
【００５５】
多くの非ヒト動物種からのヒストンデアセチラーゼのコード配列も知られている(例えば、GenBank アクセッション番号X98207(マウスHDAC-1)およびAF006602(マウスHDAC-4)を参照されたい)。従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非ヒト動物からのHDAC-4またはHDAC-1イソ型をコードするRNAの領域または二本鎖DNAの領域に対して相補的であってよい。これらの態様におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のヒストンデアセチラーゼイソ型の役割を研究するための動物モデルにおける道具として有用である。
【００５６】
特に好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の表1に示すヌクレオチド配列を含む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。
【００５７】
これらのオリゴヌクレオチドは、以下の表1に示すヌクレオチド配列の約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。最も好ましくは、以下に示すオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有し、長さが20〜26ヌクレオチドであり、そして、オリゴヌクレオチドの5'末端にある終端の4ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの3'末端にある終端の4ヌクレオチドとの各々の糖残基に2'-O-メチル基が結合するように修飾されている。
【００５８】
（表１） HDACイソ型特異的なアンチセンスおよびミスマッチオリゴ
本発明に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤のいずれか(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版、A. Gennaro 編、Mack Publishing Co. ペンシルバニア州イーストン、1990、の薬学的に許容される製剤の調製を参照されたい)を使用して、このような担体または希釈剤がそれらのHDAC活性調節能力に影響を及ぼさないという条件下において、選択的に製剤化し得る。
【００６０】
ある好ましい態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型を抑制する薬剤は、低分子である。ある好ましい態様において、低分子は、HDAC-4またはHDAC-1イソ型の酵素活性を抑制する。
【００６１】
HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の、ある好ましい低分子阻害剤としては、式(1)
Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
を有する化合物を含み、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Y1は、選択的に置換されてもよいC4-C6アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００６２】
上記定義のとおり、「アルキレン」基は、その他二つの化学基を連結する役割を果たし、その間に位置するアルキル基である。好ましいアルキレン基としては、特に制限されないが、メチレン、エチレン、プロピレン、およびブチレン等が挙げられる。
【００６３】
ここで使用される「シクロアルキル」という用語は、3〜12個の炭素、好ましくは3〜8個の炭素、そして、より好ましくは3〜6個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、ここでシクロアルキル基は、更に選択的に置換されてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、特に制限されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル等が挙げられる。
【００６４】
「アリール」基とは、1〜3個の芳香環を含むC6-C14芳香族部分であり、選択的に置換されてもよい。アリール基は、好ましくは、C6-C10アリール基である。好ましいアリール基としては、特に制限されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびフルオレニル等が挙げられる。「アラルキル」または「アリールアルキル」基は、アルキル基に共有結合により結合したアリール基からなり、どちらも独立して選択的に置換されてもよい。アラルキル基は、好ましくは、(C1-C6)アルク(C6-C10)アリールであり、特に制限されないが、ベンジル、フェネチル、およびナフチルメチル等が挙げられる。「アルクアリール」または「アルキルアリール」基は、一つ以上のアルキル置換基を有するアリール基である。アルクアリール基としては、特に制限されないが、トリル、キシリル、メシチル、エチルフェニル、第三級ブチルフェニル、およびメチルナフチル等が挙げられる。
【００６５】
上記定義のとおり、「アリレン」基は、その他二つの化学基を連結する役割を果たし、その間に位置するアリール基である。好ましいアリレン基としては、制限なく、フェニレンおよびナフチレンが含まれる。「アリレン」という用語は、ヘテロアリール架橋基をも含むことを意味し、特に制限されないが、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、キノリル、イソキノリル、およびインドリル等が挙げられる。
【００６６】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」基は、約3〜約8原子を有する環構造であり、ここで一つ以上の原子は、N、O、およびSからなる群より選択される。ヘテロ環式基は、一つ以上の位置で炭素が選択的に置換されていてもよい。また、ヘテロ環式基は、独立して、窒素がアルキル、アリール、アラルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニル、アリールカルボニル、アリールスルホニル、アルコキシカルボニル、もしくはアラルコキシカルボニルで、または硫黄がオキソもしくは低級アルキルで置換されていてもよい。好ましいヘテロ環式基としては、特に制限されないが、エポキシ、アジリジニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、およびモルホリノ等が挙げられる。ある好ましい態様において、ヘテロ環式基は、アリールまたはヘテロアリール基に縮合している。このような縮合ヘテロ環の例としては、特に制限されないが、テトラヒドロキノリンおよびジヒドロベンゾフラン等が挙げられる。
【００６７】
ここで使用されている「ヘテロアリール」という用語は、5〜14個の環構成原子、好ましくは5、6、9または10個の環構成原子を有し；環式アレイ状に共有した6、10、または14個のπ電子を有し；そして炭素原子に加えてN、O、およびSからなる群より選択される1〜約3個のヘテロ原子を有する基を意味する。好ましいヘテロアリール基としては、特に制限されないが、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ジベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、およびイソキサゾリル等が挙げられる。
【００６８】
ここで使用されている「置換された」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロ環式基とは、1〜約4個、好ましくは1〜約3個、より好ましくは1個または2個の非水素置換基を有するものである。適切な置換基としては、特に制限されないが、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルクアリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、およびウレイド基等が挙げられる。
【００６９】
ここで使用される「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素を意味する。
【００７０】
ここで使用される「アシル」という用語は、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニル置換基を意味する。
【００７１】
「アシルアミノ」という用語は、窒素原子が結合しているアミド基を意味する。「カルバモイル」という用語は、カルボニル炭素原子が結合しているアミド基を意味する。アシルアミノまたはカルバモイル置換基の窒素原子は、更に置換されていてもよい。「スルホンアミド」という用語は、硫黄または窒素原子により結合したスルホンアミド置換基を意味する。「アミノ」という用語は、NH2、アルキルアミノ、アリールアミノ、および環状アミノ基を含むことを意味する。
【００７２】
ここで使用される「ウレイド」という用語は、置換されてもよいウレア部分を意味する。
【００７３】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の低分子阻害剤は、式(2)
Cy-Y2-C(O)NH-Z (2)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Y2は、選択的に置換されてもよいC5-C7アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい。別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の好ましい低分子阻害剤としては、式(3)
Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
の化合物が含まれ、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
Bは-CH(OMe)、ケトン、またはメチレン；
Y3は、選択的に置換されてもよいC4-C6アルキレンであり、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR1（R1は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)であり、ここでアニリニルもしくはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい。
【００７４】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(4)
Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；
L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、または-NH-C(O)-NH-であり；
Arは、アリレンであり、更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらの環はいずれも選択的に置換されてもよく；
Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよい；そして
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり(nは1、2または3)、そしてZが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、そしてZがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない。
【００７５】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(5)
Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；
L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-ではなく、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2等のヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；
Arはアリレンであり、これは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；
Y2は、化学結合、または選択的に置換されてもよい直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ただしアルキレンは式-C(O)Rの置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分を含み；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZは両方ピリジルではない。
【００７６】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の阻害剤は、式(6)
Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
で示され、式中、
Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；
L3は、
(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、もしくは4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、もしくは-NH-C(O)-NH-；または
(b) C1-C6アルキレンもしくはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、任意に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O、NR'（R'は、アルキル、アシル、または水素である）、S、S(O)、またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、
であり；
Arはアリレンであり、これは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に任意に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして
Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、
Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、または-O-M(Mは、Hまたは薬学的に許容される陽イオン)である；
ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している。
【００７７】
別の態様において、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型の低分子阻害剤は、
【化７６】
【化７８】
【００７８】
本発明の方法において使用される低分子阻害剤の無制限の例は表2に示されている。
【００７９】
（表２） 選択されたMGアニリドのインビトロおよびインビボにおける性質(uMで表示)
括弧内の数値は、一日に使用した阻害剤の用量を示す(mg/体重kg/日)；
経口(PO)または腹腔内(IP)投与は、括弧内に示されている。
【００８０】
下記の反応式1〜3、またはその他の当技術分野において周知の方法に従って好都合に調製できる、式Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z、Cy-Y2-C(O)NH-Z、およびCy-B-Y3-C(O)-NH-Zの本発明の低分子阻害剤。
【００８１】
反応式1
ジアルキルアセタールIを、臭化亜鉛存在下、1-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、または1-トリメチルシリルオキシ-2,4-ジメチル-1,3-ブタジエンで処理し、アルデヒドIIを得た。IIのカルボアルコキシリンとのウイッテイヒ反応は、例えば、エチル(トリフェニルホスホルアニリデン)アセタートを生成し、ジエンエステルIIIを生成する。IIIのエステル基の加水分解は、水酸化リチウム等の水酸化物塩基で処理することにより行われ、相当する酸IVを生成する。
【００８２】
酸IVは、一般的な方法、例えば、水酸化ナトリウムおよび塩化オキサリルで処理することにより、相当する酸塩化物Vに変換される。Vを、好ましくは、塩化メチレン中、低温下で、1,2-フェニレンジアミンおよびN-メチルモルホリン等の3級塩基で処理し、アニリニルアミドVIを生成する。また、酸塩化物Vは、2-(t-BOC-アミノ)アニリン等の一方が保護された1,2-フェニレンジアミンで処理することが可能であり、続いて脱保護することによりVIを得た。
【化７９】
別の方法において、酸IVは、カルボニルジイミダゾール(CDI)で処理することにより活性化し得、続いて1,2-フェニレンジアミンおよびトリフルオロ酢酸で処理することによりアニリニルアミドVIを生成する。
【００８４】
式Cy-y2-C(O)-NH2(VII)の化合物であって、ここでY2が
【化８０】
【化８１】
式Cy-y2-C(O)-NH2の化合物であって、ここでy2が
【化８２】
【００８６】
反応式3
【化８３】
式Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-Mの化合物であって、L1が-S(O)2NH-であるものは、反応式4〜6に示される合成ルートに従って調製できる。特定の好ましい態様において、化合物XIは、好ましくは、反応式4に示す一般的な合成経路により調製される。塩化スルホニル(XII)は、塩化メチレン等の溶媒中、トリエチルアミン等の有機塩基存在下、アミン(XIII)で処理される。粗生成物を、メタノール等のアルコール系溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基で処理すると、いかなるジアルキル化された物質も分解され、スルホンアミド(XIV)が提供される。XIVのエステル基の加水分解は、テトラヒドロフランおよびメタノール等の溶媒混合物中、水酸化リチウム等の水酸化塩基での処理により達成され、相当する酸(XV)が得られる。
【００８８】
反応式4
【化８４】
いくつかの態様において、酸XVのヒドロキサム酸XIへの変換は、XVを、テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン(NH2OTHP)等の保護されたヒドロキシルアミンとカップリングすることにより保護されたヒドロキサム酸塩XVIを得、続いてXVIの酸性加水分解によりヒドロキサム酸XIを得て達成される。カップリング反応は、好ましくは、塩化メチレン等の溶媒中、カップリング剤ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)により(方法A)、もしくは、ジメチルホルムアミド等の非プロトン性の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下、カップリング剤1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドにより(方法D)達成される。その他のカップリング剤は、当技術分野において周知であり、この反応にも使用してよい。XVIの加水分解は、好ましくは、メタノール等のプロトン性溶媒中、カンファースルホン酸等の有機酸で処理することにより達成される。
【００９０】
また、その他いくつかの態様において、酸XVは、好ましくは、塩化オキサリルで処理し、続いて、塩化メチレン等の溶媒中、O-トリメチルシリルヒドロキシルアミン等の保護されたヒドロキシルアミンの添加により相当する酸塩化物に変換され、後処理することにより、ヒドロキサム酸XIが提供される(方法C)。
【００９１】
更に、その他の態様において、エステルXIVは、メタノール等の溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基存在下、ヒドロキシルアミンで処理することにより、ヒドロキサム酸XIが直接得られる(方法B)。
【００９２】
反応式5
【化８５】
式XXおよびXXIVの化合物は、好ましくは、上記反応式5に概説した一般的手順に従って調製される。
【００９４】
アミノアリールハロゲン化物(XVII)は、トリエチルアミン等の塩基存在下、塩化スルホニルで処理し、続いてアルコキシド塩基で処理することにより、スルホンアミドXVIIIが生成する。当業者であれば、ハロアレーンスルホニルハロゲン化物をアリールアミンで処理するという類似の手順により逆型のスルホンアミドアナログを容易に調製できることがわかる。
【００９５】
化合物XVIIIを、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)等のパラジウム触媒存在下、ピロリジン等の溶媒中、末端アセチレンまたはオレフィン化合物とカップリングさせることにより、XIXが得られる。
【００９６】
式XIX(X=CH2OH)の化合物の酸化、続いてその結果得られたアルデヒドのホモログ化(カルベトキシメチレントリフェニルホスホラン等のウイッティヒ系薬剤をアセトニトリル等の溶媒中で使用する)は、式XXIの化合物を提供する。XXIの塩基性加水分解、例えば、THFおよび水の混合物中、水酸化リチウムでの処理は、酸XXIIを提供する。XXIIの水素化は、好ましくは、メタノール等のプロトン性溶媒中、Pd/C等のパラジウム触媒上で行われることにより、飽和酸XXIIIを生成する。酸XXIIIと、O-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン等のO-保護されたヒドロキシルアミンとのカップリングは、DMF等の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、またはN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)存在下、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド等のカップリング剤での処理により達成され、続いて脱保護により一般式XXIVの化合物が提供される。
【００９７】
酸XIX、ここでX=COOHのものは、O-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン等のO-保護されたヒドロキルアミンと直接結合でき、続いてヒドロキシ保護基の脱保護により、ヒドロキサム酸XXが提供される。
【００９８】
式Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-O-Mの化合物、ここでL1が-C(O)NH-であるものは、好ましくは、反応式4〜5に示されているものと類似の合成経路に従い、それらの反応式における塩化スルホニル出発物質を酸塩化物出発物質に置き換えて調製できる。
【００９９】
反応式6
【化８６】
式Cy-L2-Ar-Y2-C(O)-NH-O-Mの化合物は、好ましくは、反応式6〜8に概説される合成ルートに従って調製される。従って、特定の好ましい態様において、式XXIXおよびXXXI(L2=-C(O)-CH=CH-または-C(O)-CH2CH2-)の化合物は、好ましくは反応式6に記載の経路に従って調製される。従って、置換されたアリールアセトフェノン(XXV)は、メタノール等のプロトン性溶媒中、ナトリウムメトキシド等の塩基存在下、アリールアルデヒド(XXVI)で処理され、エノンXXVIIが提供される。
【０１０１】
XXVII(R=H)の酸置換基とO-テトラヒドロピラニルヒドロキシルアミン(R1=テトラヒドロピラニル)等のO-保護されたヒドロキシルアミンをカップリングさせ、O-保護された-N-ヒドロキシベンズアミドXXVIIIを生成する。カップリング反応は、好ましくは、塩化メチレン等の溶媒中、酸とヒドロキルアミンをジシクロヘキシルカルボジイミドで処理するか、ジメチルホルムアミド等の溶媒中、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドで処理することにより行われる。当技術分野において周知のその他のカップリング剤もこの反応に使用できる。O-脱保護は、メタノール等の溶媒中、XXVIIIをカンファースルホン酸等の酸で処理することにより達成され、ヒドロキサム酸XXIX(L2=-C(O)-CH=CH-)が提供される。
【０１０２】
式XXXI(L2=-C(O)-CH2CH2-)の飽和化合物の調製は、好ましくは、メタノール―テトラヒドロフラン等の溶媒中、10％Pd/C等のパラジウム触媒上、XXVII(R=Me)を水素化して行われる。上記のとおり、得られた飽和エステルXXXを水酸化リチウムで塩基性加水分解し、続いてN-ヒドロキシアミド形成および酸性加水分解を行うことにより、ヒドロキサム酸XXXIが生成する。
【０１０３】
反応式7
【化８７】
式XXXVI(L2=-(CH2)o+2-)の化合物は、好ましくは、反応式7に記載の一般手順により調製される。従って、いくつかの態様において、アセトニトリル等の溶媒中、触媒量のパラジウムアセタートまたはトリス(ジベンンジリジンアセトン)ジパラジウム(0)等のパラジウム源、トリフェニルホスフィン等のホスフィン、およびトリエチルアミン等の塩基存在下、末端オレフィン(XXXII)をアリールハロゲン化物(XXXIII)とカップリングさせることにより、カップリング生成物XXXIVが提供される。上記のとおり、水素化後、N-ヒドロキサミド形成および酸性加水分解を行うことによりヒドロキサム酸XXXVIが得られる。
【０１０５】
反応式8
【化８８】
また、その他のいくつかの態様において、テトラヒドロフラン等の溶媒中、リチウムヘキサメチルジシラジド等の塩基存在下、式XXXVIIのホスホニウム塩を式XXXVIIIのアリールアルデヒドで処理することにより、化合物XXXIVを生成する。水素化後、N-ヒドロキサミド形成および酸性加水分解を行うことにより化合物XXXVIが得られる(反応式8)。
【０１０７】
式Cy-L-Ar-Y-C(O)-NH-Zの化合物、ここで、前記のとおり、LはL1またはL2、前記のとおり、YはY1またはY2、そして、Zはアニリニルもしくはピリジルまたはチアジアゾリルであり、好ましくは、反応式9に概説された合成経路に従って調製される。
【０１０８】
反応式9
【化８９】
反応式4〜8に示されるいずれか一つの方法により調製された式Cy-L-Ar-Y-C(O)-OH(XXXIX)の酸は、一般的な方法、例えば、水酸化ナトリウムと塩化オキサリルとで処理することにより相当する酸塩化物XLに変換される。XLを2-アミノピリジンおよびN-メチルモルホリン等の3級塩基で、好ましくは塩化メチレン中、低温で処理することにより、ピリジルアミドXLIが生成する。同様に、酸塩化物XLを1,2-フェニレンジアミンで処理することにより、アニリニルアミドXLIIを提供できる。また、酸塩化物XLは、2-(t-BOC-アミノ)アニリン等のモノ保護された1,2-フェニレンジアミンで処理してもよく、続いて脱保護することによりXLIIが生成する。
【０１１０】
別の手法において、酸XXXIXは、カルボニルジイミダゾール(CDI)で処理することにより活性化でき、続いて1,2-フェニレンジアミンおよびトリフルオロ酢酸で処理することによりアニリニルアミドXLIIが提供される。
【０１１１】
反応式10
【化９０】
式XLVIII(L2=−C(O)-アルキレン-)の化合物は、好ましくは、反応式10に示される一般的手順に従って調製される。したがって、ケトンXLIII(R1=Hまたはアルキル)とアルデヒドXLIVとのアルドール縮合により、付加体XLVが提供される。付加体XLVは、相当するヒドロキサム酸XLVIに直接変換してもよい。XLVの水素化により、飽和化合物XLVIIを生成でき、このものはヒドロキサム酸XLVIIIに変換される。
【０１１３】
反応式11
【化９１】
式(5)の化合物、ここでL2における炭素原子の一つがS、S(O)、またはS(O)2で置換されているものは、好ましくは、反応式11に概説した一般的手順に従って調製される。したがって、チオールXLIXをオレフィンLに加え、LIを生成する。この反応は、好ましくは、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)または1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)(VAZO(商標))等のラジカル開始剤の存在下で行われる。スルフィド酸化は、好ましくはm-クロロ過安息香酸(mCPBA)で処理することにより、相当するスルホンが得られ、ジアゾメタンで処理し、メチルエステルに変換後、好都合に単離される。次に、エステルの加水分解により酸LIIが得られ、このものは上記の手順のいずれかに従ってヒドロキサム酸LIIIに変換される。スルフィドLIも、相当するヒドロキサム酸LIVに直接変換され、次にこのものは、例えば、過酸化水素と酸化テルルで処理することにより、スルホキシドLVに選択的に酸化される。
【０１１５】
本発明に記載の薬剤は、分析手段、および遺伝子治療手段を含む治療手段として有用である。更に、本発明は、副作用の発生をより少なくしながら、治療する症状に合わせて操作および微調整できる方法および組成物を提供する。
【０１１６】
本発明は、更に、細胞においてHDAC-4活性を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4の特異的阻害剤を接触させることにより、HDAC-4活性が抑制される工程を含む方法を提供する。ここで使用される「特異的阻害剤」という用語は、細胞においてHDAC RNA量、HDACタンパク質量、および/またはHDACタンパク質活性を低下させるいかなる分子または化合物も意味する。特に好ましい特異的阻害剤は、細胞において、HDAC-1および/またはHDAC-4のRNA量、タンパク質量、および/またはタンパク質活性を低下させる。
【０１１７】
その一つの態様において、本発明は、細胞においてHDAC-4イソ型を抑制する方法であって、細胞に本発明の第1の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含む方法を提供する。細胞増殖は、好ましくは、接触させた細胞において抑制される。好ましい態様において、細胞は、ヒトを含む動物に存在しうる腫瘍細胞であり、腫瘍成長状態にあってもよい。特定の好ましい態様において、本発明の第2の局面の方法は、HDAC-4イソ型と相互作用し、その酵素活性を低減させるHDAC-4低分子阻害剤を細胞に接触させることを更に含む。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。
【０１１８】
したがって、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接触した細胞における細胞増殖を抑制することにより、良性および悪性腫瘍を含むヒトの疾病に対する治療手段において有用である。「細胞増殖を抑制する」という表現は、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子HDAC-4阻害剤(またはその組合せ)が、オリゴヌクレオチドまたは低分子阻害剤に接触させた細胞の成長を、接触させていない細胞と比べて遅延させる能力を意味する。
【０１１９】
細胞増殖の評価は、コールターセルカウンタ(Coulter、フロリダ州マイアミ)または血球計を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドまたは低分子に接触させた細胞を数え、その数を非接触細胞の数と比較することにより行うことができる。細胞が固形成長している場合(例えば、固形腫瘍または器官)、細胞増殖のこのような評価は、ノギスで組織または器官の成長を測定し、接触細胞と非接触細胞の成長サイズを比較することにより、行うことができる。好ましくは、この用語は、細胞増殖の遅延が非接触細胞の少なくとも50％であることを包含する。より好ましくは、この用語は、細胞増殖の遅延が非接触細胞の100％である(すなわち、接触細胞は、数もサイズも増加しない)ことを包含する。最も好ましくは、この用語は、非接触細胞と比較した場合の、接触細胞の数またはサイズの減少を包含する。したがって、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチド、または接触細胞において細胞増殖を抑制するHDAC-4低分子阻害剤は、接触細胞において成長遅延、成長停止、プログラム細胞死(即ち、アポトーシス)、または壊死性細胞死を誘導する。
【０１２０】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖抑制能力によって、a-同調成長細胞群の同調が可能となる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで成長した非腫瘍細胞群を、細胞周期のG1またはG2期において停止させるために使用できる。このような同調により、例えば、遺伝子および/または細胞周期のG1またはG2期の間に発現した遺伝子産物が特定できる。培養細胞のこのような同調は、形質移入の効率が、形質移入される細胞の特定の細胞周期相に依存して変化するような新しい形質移入手順において、その有効性を試験する際にも有用であり得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用により細胞群の同調が可能となるため、形質移入効率の向上を検出するために役立つ。
【０１２１】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有用性は、本明細書の別の箇所で詳細に説明されている。
【０１２２】
また別の好ましい態様において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた細胞は、HDAC-4低分子阻害剤とも接触させる。
【０１２３】
ここで使用されるように、「ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤」という用語は、タンパク質レベルで一つ以上の特定のヒストンデアセチラーゼイソ型と相互作用し、そのヒストンデアセチラーゼイソ型の活性を低下させることのできる活性部分を示す。特に好ましくは、HDAC-1および/またはHDAC-4イソ型を抑制するヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤である。HDAC-1低分子阻害剤は、HDAC-1イソ型の活性を低下させる分子である。HDAC-4低分子阻害剤は、HDAC-4イソ型の活性を低下させる分子である。好ましい態様において、活性の低下は少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。別の態様において、ヒストンデアセチラーゼイソ型の活性は100倍低下する。後述のとおり、好ましいヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、腫瘍形成に関与するHDAC-4および/またはHDAC-1イソ型と相互作用し、その酵素活性を低下させるものである。
【０１２４】
いくつかの好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。上記のとおり、本発明によりアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤を使用して選択的に製剤化されてもよい。この製剤は、一つ以上の追加のヒストンデアセチラーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、および/または一つ以上のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を更に含み、あるいはその他のいかなる薬理学的に活性な薬剤を含んでもよい。
【０１２５】
「機能的に結合した」または「機能的結合」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つ以上の特定のヒストンデアセチラーゼイソ型をコードする核酸の発現を抑制し、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤が特定のヒストンデアセチラーゼイソ型酵素活性を抑制できるようにする、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤との間のいかなる結合をも含む。本発明の一つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤と機能的に結合している。いくつかの好ましい態様において、ある特定のヒストンデアセチラーゼイソ型(例えば、HDAC-4)を標的とする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じヒストンデアセチラーゼイソ型(例えば、HDAC-4)を標的とする低分子阻害剤と機能的に結合している。好ましい機能的結合は、加水分解可能である。加水分解可能な結合は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤との間の共有結合である。このような共有結合は、例えば、エステラーゼおよび/またはアミダーゼにより加水分解可能である。このような加水分解可能な結合の例は、当技術分野において周知である。リン酸エステルは特に好ましい。
【０１２６】
ある好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤をオリゴヌクレオチドの主鎖と一体化できるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤とを直接共有結合させてもよい。あるいは、共有結合は拡張された構造によるものでもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の両方を炭水化物、ペプチド、脂質、または糖脂質等の担体分子に結合することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドをヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤に共有結合させて生成してもよい。別の有用な機能的結合としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤が親油性分子に共有結合したものを含むリポソームの生成等の親油性結合が挙げられる。このような親油性分子としては、特に制限されないが、ホスホチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、シアリラックNAc-HDPE等の合成ネオ糖脂質が挙げられる。ある好ましい態様において、機能的な結合は物理的結合ではなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つのリポソームと結合し、低分子阻害剤が別のリポソームと結合している場合のように、体内で単に同時に共存しているだけでもよい。
【０１２７】
第3の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量のHDAC-4の特異的阻害剤を投与することにより、動物において腫瘍細胞増殖が抑制される工程を含む方法を提供する。一つの態様において、本発明は、動物における腫瘍細胞成長を阻害する方法を提供する。この方法において、治療的に有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、体内に少なくとも1つの腫瘍細胞が存在する動物に投与され、このオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される担体と共に治療的に有効な期間投与される。動物は、好ましくは哺乳類、特に家畜である。動物は、最も好ましくはヒトである。
「腫瘍細胞」という用語は、異常な細胞成長を示す細胞を意味する。腫瘍細胞は、過形成細胞、インビトロにおいて成長の接触抑制の欠如を示す細胞、インビボにおいて転移が不可能な良性腫瘍細胞、またはインビボにおいて転移が可能であり、除去施行後も再発の恐れがある癌細胞であってもよい。「腫瘍形成」という用語は、腫瘍成長の発展を引き起こす、特徴的でないかまたは時宜を得ていない細胞増殖の誘導を示すのに用いられる。
【０１２８】
ここで使用される、「治療的に有効な量」という用語は、医薬品組成物の各有効成分の総量、または患者において有意義な利益を示すのに十分な方法、即ち、HDAC活性、特にHDAC-1および/またはHDAC-4活性の抑制であるか、または増殖性疾患および障害を治療するための腫瘍成長の抑制を意味する。単独で投与する1つの有効成分に適用した場合、この用語はその成分のみを示す。組み合わせて適用した場合、この用語は、併用、連続または同時投与に関わらず、治療効果をもたらす有効成分の合わせた量を意味する。
【０１２９】
医薬品組成物に使用されている本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与、または本発明の方法の実施は、多様な従来からの方法、例えば、眼内投与、経口摂取、吸入、皮膚適用、皮膚内、筋肉内、または静脈内注射等により行うことが可能である。
【０１３０】
治療的に有効な量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを経口投与した場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液、またはエリキシル剤の形態となる。錠剤として投与した場合、本発明の医薬品組成物は、ゼラチンまたはアジュバント等の追加の固形担体を含んでもよい。錠剤、カプセル剤、および散剤は、約5％〜95％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約25％〜90％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体の形態で投与した場合、水、石油、動物由来もしくはラッカセイ油等の植物由来の油脂、鉱油、大豆油、胡麻油、または合成油等の液体担体を加えてもよい。液状の医薬品組成物は、更に、生理食塩水、デキストロースもしくはその他のサッカリド溶液、またはエチレングリコールプロピレングリコール、もしくは、ポリエチレングリコール等のグリコール類を更に含んでもよい。液状投与した場合、医薬品組成物は、重量比約0.5％〜90％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは、約1％〜50％の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１３１】
治療的に有効な量の本発明の合成オリゴヌクレオチドを、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、または腹腔内注射により投与した場合、合成オリゴヌクレオチドは、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の状態となる。pH、等張性、安定性等に十分配慮して調製されるこの様な非経口的に許容される溶液は、当技術分野の技術範囲内である。静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または眼内注射のための好ましい医薬品組成物は、合成オリゴヌクレオチドの他に、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸化リンゲル注射等の等張性媒体、または当技術分野において知られたその他の媒体を含むことが望ましい。本発明の医薬品組成物は、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に周知のその他の添加物を含み得る。
【０１３２】
本発明の医薬品組成物に存在する合成オリゴヌクレオチドの量は、治療される状態の性質および重症度、および患者が過去に受けた治療の性質に依存する。最終的に、担当医は、個々の患者を治療するための合成ヌクレオチドの量を決定する。まず、担当医は、低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の反応を観察する。合成オリゴヌクレオチドは、患者にとって最適な治療的効果が得られるまで、より多い用量で投与してもよく、その時点で、用量は更に増やさない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬品組成物は、体重または器官の重さ1kgあたり約10μg〜約20mgの合成オリゴヌクレオチドを含むことが望ましいと考えられる。
【０１３３】
本発明の医薬品組成物を使用した静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度と個々の患者の状態および潜在的な特有の反応とに応じて変化する。最終的に担当医は、本発明の医薬品組成物を使用して、静脈内療法の適当な期間を決定する。
【０１３４】
好ましい態様において、本発明の治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度が約0.01μM〜約20μMに達するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度が約0.05μM〜約15μMに達するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度は、約0.1μM〜約10μMである。
【０１３５】
局所投与の場合、これよりも更に低い濃度が治療的に有効と考えられる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、約0.1mg〜約200mgのオリゴヌクレオチドの範囲となる。より好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約1mg〜約20mgの範囲となる。最も好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約1mg〜約10mgの範囲となる。特に好ましい態様において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量は、一日に体重1kgあたり、オリゴヌクレオチド約5mgである。
【０１３６】
この方法は、HDAC-4低分子阻害剤の治療有効量を、薬学的に許容される担体とともに、治療有効期間、動物に投与することを更に含む。上述のとおり、いくつかの好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと機能的に結合している。
【０１３７】
本発明のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を含有する治療組成物は、約0.01μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度は約0.1μM〜約5μMである。局所投与の場合、これより更に低い濃度が有効であり得る。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、好ましくは、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約100mgの範囲となる。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約50mgの範囲となる。最も好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約25mgの範囲となる。特に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の治療有効相乗量(アンチセンスオリゴヌクレオチドとともに投与した場合)は、一日に体重1kgあたり5mgである。
【０１３８】
本発明の方法の結果抑制効果が向上する場合、定められた抑制効果を得るために必要な核酸レベル阻害剤(即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチド)およびタンパク質レベル阻害剤(即ち、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤)のいずれか、または両方の治療有効濃度は、どちらかを個別に使用した場合に必要な濃度よりも減少する。
【０１３９】
更に、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のどちらかの治療有効相乗量は、他の成分の量を微調整し、そして変更することにより増減できることを認識すると思われる。したがって、本発明は、定められた動物種または特定の患者に特異的な特定の緊急事態にあわせて、投与/治療を調整する方法を提供する。治療有効範囲は容易に決定され、例えば、比較的少ない量からの開始、および段階的増量と共に行う抑制の同時評価により、経験的に決定される。
【０１４０】
第4の局面において、本発明は、細胞においてHDAC-4イソ型を抑制する方法であって、細胞に、本発明の第1の局面の低分子阻害剤を接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の第4の局面の、ある好ましい態様において、細胞増殖は、接触させた細胞において抑制される。好ましい態様において、細胞は、ヒトを含む動物に存在しうる腫瘍細胞、および腫瘍成長中でありうる腫瘍細胞である。
【０１４１】
第5の局面において、本発明は、動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、その身体に少なくとも1つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量の本発明の第1の局面の低分子阻害剤を、薬学的に許容される担体とともに、治療的に有効な期間投与する工程を含む方法を提供する。
【０１４２】
本発明のヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を含有する治療組成物は、約0.01μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度を達成するのに十分な用量で投与される。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の血中濃度は約0.1μM〜約5μMである。局所投与の場合、これより更に低い濃度が有効であり得る。好ましくは、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約100mgの範囲である。更に好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約50mgの範囲である。最も好ましい態様において、ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤の総用量は、一日に体重1kgあたり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約25mgの範囲である。
【０１４３】
第6の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド接触させる工程、または細胞にHDAC-4の低分子阻害剤を接触させる工程を含む方法を提供する。ある好ましい態様において、細胞は、腫瘍細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。
【０１４４】
本発明は更に、細胞増殖を誘導するために必要なHDAC-1およびHDAC-4等のヒストンデアセチラーゼイソ型を特異的に抑制しつつ、一方で細胞増殖の誘導には必要とされないその他のヒストンデアセチラーゼイソ型を抑制しない、生産可能なヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤を提供する。したがって、第7の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に必要なHDAC-4イソ型および/またはHDAC-1イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。本方法は、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型に候補低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程を含み、ここで、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性の低下により、候補低分子阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼイソ型、即ちHDAC-4および/またはHDAC-1を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として同定される。
【０１４５】
HDAC-4またはHDAC-1の酵素活性測定は、公知の方法論により達成してもよい。例えば、Yoshidaら(J. Biol. Chem. 265:17174-17179, 1990)は、トリコスタチンA処理した細胞におけるアセチル化されたヒストンの検出による、ヒストンデアセチラーゼの酵素活性の評価について説明している。Tauntonら(Science 272:408-411, 1996)も同様に、内在性および組換えHDACを使用してヒストンデアセチラーゼの酵素活性を測定する方法について説明している。Yoshidaら(J. Biol. Chem. 265:17174-17179, 1990)およびTauntonら(Science 272:408-411, 1996)の両者は、本明細書に参考文献として引用される。
【０１４６】
細胞増殖の誘導に必要なHDAC-4および/またはHDAC-1イソ型を抑制するヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、好ましくは、HDAC-4および/またはHDAC-1イソ型と相互作用し、その酵素活性を低下させるHDAC-4低分子阻害剤である。
【０１４７】
第8の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に関与するHDAC-4イソ型を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を特定する方法を提供する。本方法は、細胞に候補低分子阻害剤を接触させ、接触されたヒストンデアセチラーゼイソ型の酵素活性を測定する工程を含み、ここで、HDAC-4イソ型の酵素活性の低下により候補低分子阻害剤を、HDAC-4を阻害する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として特定する。
【０１４８】
第9の局面において、本発明は、本発明の第7または第8の局面の方法により特定された低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供する。ヒストンデアセチラーゼ低分子阻害剤は、実質的に純粋であることが好ましい。
【０１４９】
第10の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を抑制する方法であって、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、接触細胞の細胞成長は、1つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長より大きく抑制される。ある態様において、当該群より選択された薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において細胞は腫瘍細胞である。また、追加の好ましい態様において、当該群より選択された薬剤は、機能的に結合している。
【０１５０】
第11の態様において、本発明は、腫瘍細胞成長を抑制する方法であって、HDAC-4イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-4イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HDAC-1イソ型の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、HDAC-1イソ型の発現または活性を抑制する低分子ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも二つの薬剤を細胞に接触させることを含む方法を提供する。1つの態様において、接触細胞の細胞成長は、1つの薬剤のみと接触させた細胞の細胞成長より大きく抑制される。ある態様において、当該群より選択された薬剤の各々は、実質的に純粋である。好ましい態様において細胞は腫瘍細胞である。また、追加の好ましい態様において、当該群より選択された薬剤は、機能的に結合している。
【０１５１】
DNAメチルトランスフェラーゼを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Szyfおよびvon Hofe、米国特許第5,578,716号に記載されている。DNAメチルトランスフェラーゼ低分子阻害剤としては、5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-アザ-dC)、5-フルオロ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン(5-アザ-C)、または5,6-ジヒドロ-5-アザ-シチジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに説明するものであり、本質的に本発明を制限するものではない。当業者は、通常の実験方法のみを使用して、本明細書に記載された特定の物質および手順と同等のものを数多く認識するか、または確認することができる。このような同等の物質および手順は、本発明の範囲内とみなされ、添付の特許請求の範囲内と見なされる。
【０１５３】
実施例 1 アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および同定
アンチセンス(antisense；AS)およびミスマッチ(mismatch；MM)オリゴデオキシヌクレオチド(oligo；オリゴ)は、標的遺伝子の5'-または3'-非翻訳領域(untranslated region；UTR)に対して設計された。オリゴは、自動合成機を使用してホスホロチオエート主鎖および4x4ヌクレオチド2'-O-メチル修飾で合成し、調製用逆相HPLCで精製した。使用されたオリゴの長さは、全て20塩基対であった。
【０１５４】
ヒト癌細胞においてHDAC-1発現を抑制できるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(oligodeoxynucleotide；ODN)を同定するために、ヒトHDAC-1遺伝子(GenBankアクセッション番号U50079)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む11個のホスホロチオエートODNを、まず、100nMでT24細胞においてスクリーニングした。24時間処理した後、細胞を回収し、HDAC-1 RNA発現をノーザンブロット解析で解析した。このスクリーニングにより、HDAC-1 ASが、ヒトHDAC-1に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-1 MM オリゴは対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを有する。
【０１５５】
ヒトHDAC-2遺伝子(GenBankアクセッション番号U31814)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む24個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-2 ASは、ヒトHDAC-2に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-2 MMは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、7塩基のミスマッチを含む。
【０１５６】
ヒトHDAC-3遺伝子(GenBankアクセッション番号AF039703)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む21個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-3 ASは、ヒトHDAC-3に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-3 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを含む。
【０１５７】
ヒトHDAC-4遺伝子(GenBankアクセッション番号AB006626)の5'または3'UTRに相補的な配列を含む17個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-4 ASは、ヒトHDAC-4に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-4 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、6塩基のミスマッチを含む。
【０１５８】
ヒトHDAC-6遺伝子(GenBankアクセッション番号AJ011972)の5'または3'非翻訳領域に相補的な配列を含む13個のホスホロチオエートODNを、上記のようにスクリーニングした。HDAC-6 ASは、ヒトHDAC-6に対してアンチセンス活性を有するODNであることが確認された。HDAC-6 MM オリゴは、対照として作製されたものであり、アンチセンスオリゴと比較して、7塩基のミスマッチを含む。
【０１５９】
実施例 2 mRNA レベルにおける、 HDAC AS ODN による特異的な発現抑制
AS ODN処理がmRNAレベルにおけるHDAC発現を低減させたか否かを決定するために、ヒトHDAC-3に対する50nMのアンチセンス(AS)オリゴ、またはそれに相当するミスマッチ(MM)オリゴでヒトA549細胞を48時間処理し、ヒトHDAC-4またはそのMM オリゴ(100nM)に対する50nMまたは100nMのAS オリゴでA549細胞を24時間処理した。
【０１６０】
簡潔に述べると、オリゴヌクレオチド処理の1日前に、ヒトA549および/またはT24ヒト膀胱癌細胞を10cm組織培養プレートに一時的に播種した。細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC)(ヴァージニア州マナッサス)より入手し、推薦されている培養条件で培養した。オリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞をPBS(リン酸緩衝食塩水)で洗浄した。次に、6.25μg/mlのリポフェクチントランスフェクション薬剤(GIBCO BRL、カナダ、オンタリオ州ミシサーガ)を無血清OPTIMEM培地(GIBCO BRL、メリーランド州ロックビル)に加え、次にこれを細胞に添加した。次いで、スクリーニングされるオリゴヌクレオチドを直接細胞に添加した(すなわち、1細胞プレート当たり１オリゴヌクレオチド)。ミスマッチオリゴヌクレオチドを対照として使用した。試験した各オリゴヌクレオチドに１細胞プレート当たり同じ濃度のオリゴヌクレオチド(例えば50nM)を使用した。
【０１６１】
細胞を収集し、ノーザンブロット解析により全RNAを分析した。簡潔に述べると、RNeasyミニプレップカラム(QIAGEN)を使用して、全RNAを抽出した。ホルムアルデヒド含有1％アガロースゲルに、0.5Mのリン酸ナトリウム(pH 7.0)を緩衝液系として、10〜20μgの全RNAを泳動した。次に、RNAをニトロセルロース膜に移し、指定された放射線標識DNAプローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフィーは、通常の手順を使用して行った。
【０１６２】
図3Aおよび図3Bにそれぞれ示されているとおり、ヒトA549細胞におけるHDAC-3 mRNAおよびHDAC-4 mRNAの発現は、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理により抑制された。これらの結果は、HDAC AS ODNが標的とされたHDAC発現をmRNAレベルで特異的に抑制できることを示す。
【０１６３】
実施例 3 HDAC OSDN による HDAC タンパク質発現の抑制
HDAC OSDNによる処理がHDACタンパク質発現を抑制するか否かを決定するために、ヒトHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6に対する50nMの対になったアンチセンスまたはそのミスマッチオリゴを用いてヒトA549癌細胞を48時間処理した。OSDN処理条件は、前述のとおりである。
【０１６４】
細胞は、1％トリトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、5mM EDTA、25mMトリス塩酸、pH7.5、およびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液で溶解した。総タンパク質量は、Bio-Rad製のタンパク質アッセイ薬剤(カリフォルニア州ヘラクレス)により定量した。100ugの総タンパク質は、SDS-PAGEにより分析した。次に、総タンパク質をPVDF膜に移し、様々なHDAC特異的一次抗体で探索した。ウサギ抗HDAC-1(H-51)、抗HDAC-2(H54)抗体(Santa CruzBiotechnologies、カリフォルニア州サンタクルーズ)は、1:500希釈で使用した。ウサギ抗HDAC-3抗体(Sigma、ミズーリ州セントルイス)は、1:1000希釈で使用した。抗HDAC-4抗体は、前述(Wang, S.H.ら、(1999) Mol. Cell. Biol. 19:7816-27)のように調製し、1:1000希釈で使用した。抗HDAC-6抗体は、HDAC-6タンパク質の断片(GenBankアクセッション番号AAD29048、アミノ酸番号990〜1216)を含むGST融合タンパク質でウサギを免疫することにより生産した。ウサギ抗血清を試験した結果、ヒトHDAC-6イソ型のみに特異的に反応することが明らかになった。HDAC-6抗血清は、ウエスタンブロットにおいて1:500希釈で使用して、全細胞可溶化物内のHDAC-6を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼを抱合した二次抗体を1:5000希釈で使用して、一次抗体結合を検出した。二次抗体の結合は、高度化学発光(Enhanced chemiluminescence；ECL)検出キット(Amersham-Pharmacia Biotech社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を利用して可視化した。
【０１６５】
図4に示すとおり、細胞をHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6 ODNで48時間処理することにより、各々のHDACイソ型タンパク質の発現が特異的に抑制される。
【０１６６】
HDACタンパク質発現レベルが癌細胞表現型において重要な要素であることを示すために実験を行い、正常細胞および癌細胞におけるHDACイソ型の発現レベルを測定した。ウエスタンブロット解析は、上記のとおりに実施した。
【０１６７】
表3に示した結果は、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6イソ型タンパク質が癌細胞系において過剰発現していることを明確に示す。
【０１６８】
（表３） ヒト正常細胞および癌細胞におけるHDACイソ型の発現レベル
【０１６９】
実施例 4 細胞成長およびアポトーシスに対する HDAC イソ型特異的 OSDN の効果
細胞成長およびアポトーシスによる細胞死に対するHDAC OSDNの効果を決定するために、A549またはT24細胞、MDAmb231細胞、およびHMEC細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)をHDAC OSDNによって前述のとおり処理した。
【０１７０】
アポトーシス研究のために、細胞死検出ELISAPlus キット(Cell Death Detection ELISAPlus、Roche Diagnostic GmBH、ドイツ、マンハイム)を使用して、製造者のマニュアルに従って細胞を分析した。典型的には、細胞の回収および溶解の2時間前に10,000個の細胞を96ウェル組織培養プレートに播種した。各サンプルを2回分析した。MR700プレートリーダー(DYNEX Technology、イングランド、ミドルセックス、アッシュフォード)を410nmで使用して、ELISA結果を読み取った。基準は、490nmとした。
【０１７１】
細胞成長分析には、ヒト癌または正常細胞を、ヒトHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、またはHDAC-6に対する50nMの対になったASまたはMMオリゴで72時間処理して行った。細胞を回収し、血球計数機を使用して、トリパンブルー排除法により細胞数を数えた。抑制率は、(100-AS細胞数/対照細胞数)％として計算した。
【０１７２】
研究の結果は、図5および図6、ならびに表4および表5に示す。ヒト癌細胞のHDAC-4 ASによる処理、そしてHDAC1 ASによる処理も多少は、様々なヒト癌細胞の成長停止およびアポトーシスを誘導する(図5および図6、表4および表5)。相当するミスマッチは影響を及ぼさない。成長抑制およびアポトーシスに対するHDAC-4 ASまたはHDAC-1 ASの効果は、ヒト正常細胞において優位に低減されている。HDAC-4またはHDAC-1 ASオリゴの効果と対照的に、ヒトHDAC-3およびHDAC-6 OSDNによる処理は、癌細胞成長またはアポトーシスに影響を及ぼさず、ヒトHDAC-2 OSDNでの処理は、癌細胞成長抑制に最小の効果を示す。T24細胞はp53ヌルであり、そしてA549細胞はp53野生型であるため、このアポトーシスの誘導は、p53活性に依存しない。
【０１７３】
（表４） HDAC-4 AS1により変化した遺伝子転写
転写における変化の倍数は、をHDAC-4ミスマッチオリゴ(MM2)処理した細胞の値と比較したものである；
588個の遺伝子の内、39個の遺伝子発現がHDAC-4 AS1により変化した。
【０１７４】
（表５） 処理48時間後のヒト正常細胞および癌細胞のアポトーシスに対するHDACイソ型特異的OSDNの効果
【０１７５】
実施例 5 HDAC イソ型の抑制による成長制御遺伝子発現の誘発
HDAC-1またはHDAC-4 AS処理により誘発された癌細胞の成長停止およびアポトーシスの機構を理解するために、RNase保護アッセイ法を使用して細胞成長制御因子(p21およびGADD45)およびアポトーシス促進性遺伝子BaxのmRNA発現を分析した。
【０１７６】
要するに、ヒト癌A549またはT24細胞をHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(各々50nM)で48時間処理した。全RNAを抽出し、RNase保護アッセイ法を行うことにより、p21およびGADD45のmRNA発現レベルを分析した。対照として、A549細胞を、TSA(250ng/ml)処理存在下または非存在下、リポフェクチンで16時間処理した。これらのRNase保護アッセイ法は下記の手順に従い行った。キアゲン(QIAGEN)社製の「RNeasyミニプレップキット」を使用し、製造者のマニュアルに従って細胞からの全RNAを調製した。保護アッセイ法に使用する標識されたプローブは、製造者のマニュアルに従ってファーミンジェン(Pharmingen)(米国カルフォルニア州サンディエゴ)社製の「hStress-1マルチプルプローブテンプレートセット(multiple-probe template sets)」を使用することにより合成した。製造者のマニュアルに従い、アンビオン(Ambion)社(テキサス州オースチン)製の「RPA II(商標)リボヌクレアーゼ保護アッセイキット(Ribonuclease Protection Assay Kit)」を使用して、保護手順を行った。オートラジオグラムのバンドの定量は、Cyclone(商標)ホスフォシステム(Phosphor System) (Packard Instruments社、コネチカット州メリデン)を使用して行った。結果を図7および表6に示す。
【０１７７】
（表６） 細胞をヒトHDACイソ型特異的アンチセンスで処理した後のp21、GADD45、およびBaxの上方制御
【０１７８】
図7に示されているように、A549およびT24癌細胞の両方におけるHDAC-4の抑制は、p21およびGADD45両方の発現の両方を劇的に上方制御する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるHDAC-1の抑制は、p21の発現を誘導するが、GADD45の発現をより強く誘導する。HDAC-4の抑制は、A549およびT24細胞の両方においてBaxの発現を上方制御する。A549細胞におけるp21誘導に対するHDAC-4 AS処理(50nM、48時間)の効果は、TSA(0.3〜0.8uM、16時間)の効果に匹敵する。
【０１７９】
HDACタンパク質発現に対するHDACアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べるために実験を更に行った。A549細胞において、HDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、p21タンパク質量の劇的な増加に至る(図8)。
【０１８０】
実施例 7 低分子による HDAC イソ型の抑制
HDAC低分子阻害剤の同定を示すために、様々なヒトヒストンデアセチラーゼイソ型酵素(例えば、HDAC-1、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6)を使用してヒストンデアセチラーゼの酵素アッセイ法によりHDAC低分子阻害剤をスクリーニングした。クローニングされ、C末端がフラッグエピトープ(Grozinger, C.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4868-4873 (1999))により標識された組換えヒトHDAC-1、HDAC-3、およびHDAC-6酵素は、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現システムにより生産された。
【０１８１】
フラッグで標識したヒトHDAC-4酵素は、リン酸カルシウム沈殿法による形質転換後、ヒト腎胚293細胞において生産された。要するに、10％ウシ胎児血清と抗生物質とを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で293細胞を培養した。フラッグで標識したヒトHDAC-4をコードするプラスミドDNAは、エタノールで沈殿させ、精製水に再懸濁した。DNA、塩化カルシウム、および2xHEPES緩衝食塩水を混合して形成させたDNA-カルシウム沈殿物を293細胞上に12〜16時間放置した。細胞は、血清含有DMEM培地に戻し、フラッグで標識したHDAC-4酵素の精製のために遺伝子導入の48時間後に回収した。
【０１８２】
HDAC-1およびHDAC-6は、Q-セファロースカラムに続いて抗フラッグエピトープアフィニティーカラムを使用して精製した。その他のHDACイソ型、HDAC-3およびHDAC-4は、抗フラッグアフィニティーカラムで直接精製した。
【０１８３】
デアセチラーゼアッセイ法には、20,000cpmの[3H]-代謝標識アセチル化ヒストンを基質として使用した。ヒストンは、クローニングした組換えヒトHDAC酵素と37℃でインキュベーションした。インキュベーションの時間は、HDAC-1アッセイ法の場合10分であり、HDAC-3、HDAC-4、およびHDAC-6アッセイ法の場合は2時間である。全てのアッセイ条件は、各反応が確実に直線的であるよう、予め測定を行った。酢酸(最終濃度0.04M)、および塩酸(最終濃度250mM)を添加して反応を停止した。混合物を酢酸エチルで抽出し、遊離した[3H]-酢酸を液体シンチレーションで計数して定量した。抑制の研究において、HDAC酵素を、酵素アッセイ開始前に被験化合物と4℃で30分間、プレインキュベーションした。HDAC酵素阻害剤のIC50値は、各化合物の用量反応曲線により測定され、その結果、最大抑制の50％を達成する阻害剤濃度の値が得られた。
【０１８４】
実施例 8 低分子による細胞全体における HDAC 活性の抑制
培養液において成長しているT24ヒト膀胱癌細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)を被験化合物と共に16時間インキュベートした。ヒストンは、培養期間後、一般的な手法(前記Yoshidaらを参照)により細胞から抽出した。20μgの全コアヒストンタンパク質をSDS/PAGEにロードし、そしてニトロセルロース膜に移し、これをアセチル化したヒストンH-4に特異的なポリクローナル抗体(Upstate Biotech社、ワイオミング州レイクプラシッド)と反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型二次抗体を1:5000希釈で使用して、一次抗体の結合を検出した。二次抗体の結合は、高度化学発光(Enhanced chemiluminescence；ECL)検出キット(Amersham-Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を利用して可視化した。フイルム撮影後、アセチル化H-4シグナルは、デンシトメーターにより定量した。
【０１８５】
上記表2に示した結果は、HDAC-1および/またはHDAC-4に選択的な低分子阻害剤が、細胞全体においてヒストン脱アセチル化を抑制できることを示す。
【０１８６】
実施例 9 HDAC 低分子阻害剤による癌成長の抑制
4500個のヒト大腸癌HCT116細胞(ATCC、ヴァージニア州マナッサス)をMTT(3-[4,5-ジメチルチアゾル-2-イル]-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイ法で使用して、細胞増殖および細胞毒性を定量的に測定した。典型的には、HCT116細胞を96ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種し、プレートに付着させるために一晩放置した。様々な濃度(DMSO中、1uM、5uM、および25uM)で化合物を培地に添加し(最終DMSO濃度1％)、各々三連で、48時間インキュベートした。MTT溶液(粉末としてSigmaより入手)を添加し、細胞と5％CO2インキュベーター内で37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション中、生細胞は、MTTを水不溶性のホルマザン色素に変換する。溶解緩衝液(50％N,N-ジメチルホルムアミド、20％SDS、pH4.7)を細胞に加え、5％CO2インキュベーターで37℃にて一晩インキュベートした。溶解させた色素は、630nMを基準として、570nMで比色測定することにより定量した。
【０１８７】
上記表2に示した結果はHDAC-1および/またはHDAC-4に特異的な低分子阻害剤が細胞増殖に影響を及ぼしうることを示す。
【０１８８】
実施例 10 マウスモデルにおける、低分子による腫瘍成長の抑制
メスBALB/cヌードマウスはチャールスリバー研究所(Charles River Laboratories)(ニューヨーク州チャールスリバー)より入手し、8〜10週齢のものを使用した。動物のわき腹にヒト前立腺腫瘍細胞(DU145、2x106個)またはヒト大腸癌細胞(HCT116、2x106個)または2x106個の小肺コアA549を皮下注射し、固形腫瘍を形成させた。腫瘍断片を少なくとも3回連続的に継代させ、次に全身麻酔をかけて、約30mgの腫瘍断片を小さな外科的切開により皮下移植した。腹腔内投与または経口投与による低分子阻害剤の投与は、腫瘍の体積が100mm3に達した時に開始した。腹腔内投与には、HDACの低分子阻害剤(40〜50mg/体重1kg/日)を100％DMSOに溶解し、毎日腹腔内注射して投与した。経口投与には、HDACの低分子阻害剤(40〜50mg/体重1kg/日)を65％ポリエチレングリコール400(PEG400)(Sigma-Aldridge、カナダ、オンタリオ州ミシサウガ、カタログ番号P-3265)、5％エタノール、および30％水を含む溶液に溶解した。腫瘍の体積を20日間、週2回観測した。実験群の各々は、少なくとも6〜8匹の動物を含んだ。抑制率は、媒体処理したマウスを対照として腫瘍の体積から計算した。
【０１８９】
上記表2に示す結果は、HDAC-1および/またはHDAC-4に特異的な低分子阻害剤がインビボで腫瘍細胞の成長を抑制できることを示す。
【０１９０】
同等物
当業者は、決まった実験方法のみを用いて、本明細書に記載された本発明の特定の態様と同等のものを数多く認識し、あるいは確認することができると思われる。このような同等物は本発明の特許請求の範囲内と見なされる。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】AS1およびAS2が、HDAC4の発現をRNAレベルで用量依存的に抑制できることを示す図である。ヒト癌A549細胞は、用量を段階的に増大させたAS1、AS2、またはMM2オリゴで24時間処理した。全RNAを収集し、ノーザン解析を行った。
【図２】AS1およびAS2が、HDAC4の発現をタンパク質レベルで抑制できることを示す図である。ヒト癌A549細胞をAS1、AS2またはMM2オリゴで48時間処理した。ヒトHDAC4に対して特異的な抗体を用いて、細胞全体の可溶化物をウエスタンブロットにより解析した。
【図３】HDAC4 AS1またはAS2で処理したヒト癌細胞A549の成長曲線を示す図である。0時間の時点で、10cmプレートに2.5x105細胞/枚で播種した。細胞を24時間および48時間の時点で50nMのオリゴにより処理した。トリパンブルー排除法により、24時間、48時間および72時間の時点で細胞数を数えた。
【図４】HDAC4 AS1またはAS2で処理したヒト癌細胞Du145の増殖曲線を示す図である。0日目の時点で、10cmプレートに2.5x105細胞/枚で播種した。細胞を1日目、2日目、および3日目に50nMのオリゴで処理した。トリパンブルー排除法により、1日目、2日目、3日目および4日目に細胞数を数えた。
【図５】ヒトA549癌細胞に対するHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴのアポトーシス性効果を示すグラフ表示である。
【図６】ヒトA549癌細胞に対するHDAC-4アンチセンスオリゴの細胞周期遮断効果を示すグラフ表示である。
【図７】ヒトA549細胞におけるHDACイソ型mRNA発現に対するHDACイソ型特異的アンチセンスオリゴの効果を示すRNAse保護アッセイを表示する図である。
【図８】ヒトA549細胞をHDAC-4アンチセンスオリゴで処理することによりp21タンパク質の発現が誘導されることを示すウエスタンブロットを表示する図である。
Claims (91)
- 細胞においてHDAC-4活性を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4の一部をコードするRNAの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含み、これによりHDAC-4活性が抑制される方法。
- 細胞に、キメラオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項1記載の方法。
- 細胞に、ハイブリッドオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項1記載の方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の方法。
- 細胞に、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項1記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における細胞増殖の抑制を更に引き起こす、請求項1記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長遅延を更に引き起こす、請求項1記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長停止を更に引き起こす、請求項1記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞におけるプログラム細胞死を更に引き起こす、請求項1記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における壊死性細胞死を更に引き起こす、請求項8記載の方法。
- 細胞においてHDAC-4活性を抑制する方法であって、細胞に、
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における細胞増殖の抑制を更に引き起こす、請求項12記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長遅延を更に引き起こす、請求項12記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長停止を更に引き起こす、請求項12記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞におけるプログラム細胞死を更に引き起こす、請求項12記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における壊死性細胞死を更に引き起こす、請求項13記載の方法。
- 動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量の、HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を含み、これにより腫瘍細胞増殖が抑制される方法。
- 動物にキメラHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項18記載の方法。
- 動物にハイブリッドHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項18記載の方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項18記載の方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項18記載の方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項18記載の方法。
- 細胞に、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項18記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における細胞増殖の抑制を更に引き起こす、請求項18記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長遅延を更に引き起こす、請求項18記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長停止を更に引き起こす、請求項18記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞におけるプログラム細胞死を更に引き起こす、請求項18記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における壊死性細胞死を更に引き起こす、請求項25記載の方法。
- 動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量の、
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における細胞増殖の抑制を更に引き起こす、請求項30記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長遅延を更に引き起こす、請求項30記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長停止を更に引き起こす、請求項30記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞におけるプログラム細胞死を更に引き起こす、請求項30記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における壊死性細胞死を更に引き起こす、請求項31記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項18または30記載の方法。
- 動物に、治療的に有効な量の、HDAC-1の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を更に含む、請求項18または30記載の方法。
- 動物にキメラHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- 動物にハイブリッドHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- 動物に、配列番号：5であるHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項37記載の方法。
- HDAC-4の活性を特異的に抑制する薬剤を含む、組成物。
- 薬剤が、HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリッドオリゴヌクレオチドである、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：11である、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項2記載の組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが20〜26ヌクレオチドであることを更に含む、請求項9記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドが修飾されて、オリゴヌクレオチドの5'末端にある終端の4ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの3'末端にある終端の4ヌクレオチドのその糖残基の各々に2'-O-メチル基が結合している、請求項10記載の組成物。
- 薬剤がHDAC-4の低分子阻害剤である、請求項1記載の組成物。
- 低分子阻害剤の構造が、
(a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(b) Cy-Y2-C(O)-NH-Z (2)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい；
(c) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、かつZが-O-Mである場合は、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合は、Cyは置換されたインドリニルではない；
(e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合は、CyとZの両方はピリジルではない；
(f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
ここでCyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している；
- 低分子阻害剤が、
- 細胞においてHDAC-4活性を抑制する方法であって、細胞にHDAC-4特異的阻害剤を接触させる工程を含み、これによりHDAC-4活性を抑制する方法。
- 細胞に、
(a)HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド；および
(b)HDAC-4の低分子阻害剤
からなる群より選択されるHDAC-4活性に特異的な阻害剤を接触させる、請求項15記載の方法。 - 特異的な阻害剤が、HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項16記載の方法。
- 細胞に、キメラオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- 細胞に、ハイブリッドオリゴヌクレオチドであるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- 細胞に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、長さが約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- 細胞に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、長さが約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- 細胞に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、長さが約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- 細胞に、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項17記載の方法。
- HDAC-4の低分子阻害剤が、
(a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(b) Cy-Y2-C(O)-NH-Z (2)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい；
(c) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、Zが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない；
(e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない；
(f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している；
- 低分子阻害剤が、
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における細胞増殖の抑制を更に引き起こす、請求項15記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長遅延を更に引き起こす、請求項15記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における成長停止を更に引き起こす、請求項15記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞におけるプログラム細胞死を更に引き起こす、請求項15記載の方法。
- 接触させた細胞におけるHDAC-4活性の抑制が、接触させた細胞における壊死性細胞死を更に引き起こす、請求項26記載の方法。
- 動物において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、体内に少なくとも一つの腫瘍細胞が存在する動物に、治療的に有効な量の少なくとも一つのHDAC-4特異的阻害剤を投与する工程を含み、これにより動物において腫瘍細胞増殖が抑制される方法。
- 動物に、
(a)HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド；および
(b)低分子阻害剤
からなる群より選択されるHDAC-4に特異的な阻害剤を投与する、請求項31記載の方法。 - 動物に、治療的に有効な量の、HDAC-4の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、動物において腫瘍細胞増殖が抑制される、請求項32記載の方法。
- 動物に、キメラHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項33記載の方法。
- 動物に、ハイブリッドHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項33記載の方法。
- 動物に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項33記載の方法。
- 動物に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項32記載の方法。
- 細胞に、配列番号：4のヌクレオチド配列より選択される、長さが約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させる、請求項32記載の方法。
- 動物に、配列番号：11であるHDAC-4アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項32記載の方法。
- 特異的な阻害剤が、
(a) Cy-CH(OMe)-Y1-C(O)-NH-Z (1)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そしてここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(b) Cy-Y2-C(O)-NH-Z (2)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、C5-C7アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニルもしくはピリジル、またはチアジアゾリルであり、いずれも選択的に置換されてもよい；
(c) Cy-B-Y3-C(O)-NH-Z (3)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；Bは-CH(OMe)、ケトン、およびメチレンからなる群より選択され；Y3は、C4-C6アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR1、ここでR1は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；そしてZは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンであり、ここでアニリニルまたはピリジルまたはチアジアゾリルは選択的に置換されてもよい；
(d) Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z (4)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく；L1は、-(CH2)m-W-であり、ここでmは0、1、2、3、または4であり、Wは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y1は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、ここで該アルキレンは、選択的に置換されてもよく；Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしL1が-C(O)NH-であり、Y1が-(CH2)n-であり、nが1、2、または3であり、かつZが-O-Mである場合、Cyはアミノフェニル、ジメチルアミノフェニル、またはヒドロキシフェニルではなく；そして更に、L1が-C(O)NH-であり、Zがピリジルである場合、Cyは置換されたインドリニルではない；
(e) Cy-L2-Ar-Y2-C(O)NH-Z (5)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく；L2は、C1-C6飽和アルキレンまたはC2-C6アルケニレンであり、ここでアルキレンまたはアルケニレンは選択的に置換されてもよく、ただしL2は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；およびS(O)2からなる群より選択されるヘテロ原子部分により選択的に置換されてもよく；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；Y2は、化学結合、または直鎖もしくは分枝鎖飽和アルキレンであり、これは、選択的に置換されてもよく、ただしアルキレンは、式-C(O)Rで示される置換基により置換されておらず、ここでRはαアミノアシル部分からなり；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyの結合している炭素原子がオキソ置換されている場合、CyとZの両方はピリジルではない；
(f) Cy-L3-Ar-Y3-C(O)NH-Z (6)
式中、Cyは、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、いずれも選択的に置換されてもよく、ただしCyは(スピロシクロアルキル)ヘテロシクリルでなく、；L3は、(a) -(CH2)m-W-、ここでmは、0、1、2、3、または4であり、そしてWは、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NHC(O)-、-NHS(O)2-、および-NH-C(O)-NH-からなる群より選択される；および(b) C1-C6アルキレンまたはC2-C6アルケニレン、ここでアルキレンまたはアルケニレンは、選択的に置換されてもよく、ただしL3は-C(O)-でなく、そして、ここでアルキレンの炭素原子の一つは、O；NR'、ここでR'は、アルキル、アシル、または水素である；S；S(O)；またはS(O)2で選択的に置換されてもよい、からなる群より選択され；Arはアリレンであり、ここで該アリレンは、選択的に更に置換されてもよく、そして、アリールもしくはヘテロアリール環、または飽和もしくは部分的に不飽和のシクロアルキル環もしくはヘテロ環に選択的に縮合されてもよく、これらはいずれも選択的に置換されてもよく；そして、Y3は、C2アルケニレンまたはC2アルキニレンであり、ここでアルケニレンの炭素原子の一つまたは両方は、アルキル、アリール、アルクアリール、またはアラルキルで選択的に置換されてもよく；そして、Zは、アニリニル、ピリジル、チアジアゾリル、および-O-Mからなる群より選択され、ここでMは、Hまたは薬学的に許容される陽イオンである；ただしCyが無置換のフェニルである場合、Arはフェニルではなく、ここでL3およびY3は、互いにオルト又はメタに配向している；
- 低分子阻害剤が、
- 動物に、治療的に有効な量の、HDAC-1の一部をコードするRNA領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を更に含む、請求項32記載の方法。
- 動物に、キメラHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
- 動物に、ハイブリッドHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される、約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される、約15〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
- 動物に、配列番号：2のヌクレオチド配列より選択される、約20〜約26ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
- 動物に配列番号：5のHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する、請求項42記載の方法。
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