DE10259885B4 - Verfahren zur quantitativen Beurteilung des Schädigungsgrades von reinen Nukleotiden oder reinen nukleotidhaltigen Verbindungen - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur quantitativen Beurteilung des Schädigungsgrades von reinen Nukleotiden oder reinen nukleotidhaltigen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass deren antiradikale Aktivität gemessen wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der oxidativen Modifizierung reiner Nukleotide und nukleotidhaltiger Stoffe (z.B. DNS) bzw. des oxidativen Stress im biologischen Material wie Zellen und Geweben.
  • Stand der Technik
  • Oxidativer Stress als Merkmal der Störung des Gleichgewichtes zwischen pro-oxidativen Stoffen (freie Radikale, reaktive Sauerstoffmetabolite u.a.) und antioxidativen Substanzen im Organismus ist ein allgemeines Phänomen, welches in die Ätiopathogenese mehrerer Krankheiten wie Atherosklerose, Krebs, Diabetes u.v.a. involviert ist. Oxidative Schädigung der DNS wird auch als wichtiger Faktor der Alterung postuliert.
  • Die Schädigung der DNS schließt biochemische (oxidationsprodukte) und mechanische (Strangbrüche) Veränderungen ein.
  • Das Problem des Nachweises der biochemischen Veränderungen besteht darin, dass nach der Schädigung mehr als 100 verschiedene Substanzen entstehen (1), so dass eine vollständige Analyse praktisch unmöglich ist. Das Problem wird gelöst, indem nur einige charakteristische Stoffe, die sog. „Marker", bestimmt werden. Oft wird z.B. der oxidative C-8 Addukt des Guanins 8-oxo-2'-Deoxyguanosin bestimmt, obwohl dieser Stoff nur ca. 5% der Gesamtmenge der oxidierten Basen in DNS darstellt (2).
  • Zu den Nachteilen selektiver biochemischer Methoden gehören üblicherweise die relativ umständliche Präparationsphase, z.B. Dünnschichtchromatographie mit radioaktiver Markierung, komplizierte Analytik wie Gas- bzw. Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie (1–6).
  • Die Kettenbrüche können mittels der Einzelzell-Gelelektrophorese (sog. „comet-assay") semi-quantitativ nachgewiesen werden (7). Diese Methode ist sehr aufwändig in der Präparation und Durchführung, subjektiv in der manuellen Auswertung und nur für Zellsuspensionen geeignet.
  • Aufgabenstellung
  • Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine einfache, aber genaue Expressmethode zu entwickeln, die geeignet ist für die pauschale Beurteilung der schädigenden Wirkung verschiedener physikalischer und chemischer oxidierender Faktoren wie UV- und ionisierende Strahlung, Peroxide, freie Radikale u.ä. sowohl auf einzelne Nukleotide als auch auf die DNS aus verschiedenen Quellen.
  • Die Aufgabe der Erfindung wurde dadurch gelöst, dass für die genannten Ziele die Messung der antiradikalen Eigenschaften verwendet wurde.
  • Die Untersuchung der Veränderung der antiradikalen Eigenschaften von vier Nukleotiden dATP, dGTP, dCTP und dTTP sowie eines DNS Präparates nach UV-Bestrahlung hat überraschenderweise gezeigt (1., 2. und 3.), dass alle diese Stoffe nach der Bestrahlung die antiradikalen Eigenschaften nicht wie biologische Antioxidantien Vitamin C, Harnsäure, Bilirubin u.a. verlieren, sondern diese vergleichbar mit den sieben Aminosäuren (8) dosisabhängig erwerben.
  • Diese früher nicht bekannten Eigenschaften von Nukleotiden liefern die Voraussetzung auch für die Bestimmung des oxidativen Stresses in lebenden organismen mittels Messung des oxidativen Schädigungsgrades ihrer Nukleinsäuren und somit für die Anwendung in der Forschung und klinischen Praxis.
  • Versuche zur Veranschaulichung der antiradikalen Aktivität von Nukleotiden und Nukleinsäuren
  • Versuch 1
  • Vier Nukleotidlösungen in Form von Deoxynukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) in Konzentrationen von jeweils 2 mmol/l wurden mit dem Gerät FMR-10 (Präcitronic, Dresden) mit UV-Licht bei 254 nm bis maximal 10 Minuten bestrahlt und anschließend im Testsystem zum Nachweis von antiradikalen Eigenschaften mit 2,2'-Azo-bis-(Isobuttersäure-amidin) Dihidrochlorid als Radikalgenerator (9) und Luminol (3-Aminophthalsäurehydrazid) als chemoluminogene Nachweissubstanz für freie Radikale (CL-System) mit dem Chemolumineszenzmeßgerät MINILUMTM, ausgestattet mit einer thermostatierbaren Meßküvette (F.A.T. GmbH, Berlin), unter Verwendung des ARAP-KIT (ABCD GmbH, Berlin) zur Messung der antiradikalen Aktivität bei 37°C untersucht.
  • Die Endkonzentrationen der Substanzen in der Meßküvette waren:
    • • Nukleotide: 100 μmol/l,
    • • 2,2'-Azo-bis-(Isobuttersäureamidin) Dihidrochlorid: 15 μmol/l,
    • • 3-Aminophthalsäurehydrazid: 30 μmol/l.
  • Die Auswertung der Messung der antiradikalen Aktivität (ARA) erfolgte in relativen Einheiten als Differenz zwischen der Lag-Phase der registrierten Kurve der Chemolumineszenzintensität und der Lag-Phase des Leerwertes in Sekunden. Die Ergebnisse sind in 1. dargestellt. Bei allen vier Substanzen wurde die Erhöhung der ARA mit steigender Bestrahlungsdosis beobachtet.
  • Versuch 2
  • Zur Absicherung der Ergebnisse wurden die gleichen Substanzen nach Bestrahlung in einem anderen Meßsystem gemessen, in dem die Generation von freien Radikale photochemisch und der Nachweis chemoluminometrisch (Gerät PHOTOCHEMTM, F.A.T. GmbH, Berlin) erfolgte (PCL-System). Für die Messungen wurde der ACW-KIT (antioxidative Kapazität wasserlöslicher Stoffe) verwendet (10). Die Ergebnisse stimmten mit denen aus dem Versuch 1 überein. Ein Vergleich beider Methoden ist in 2. für dTTP dargestellt.
  • Versuch 3
  • UV-bestrahlt (in Konzentration von 1 mg/ml) und im PCL-System untersucht wurde ein Präparat der Deoxyribonukleinsäure (FERAK, Berlin): 3. Auch in diesem Fall stieg die ARA proportional der Bestrahlungsdauer an.
  • Literaturliste
    • 1. Loft, S., Poulsen, H.E.: Markers of oxidative damage to DNA: Antioxidants and molecular damage. In: METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 300, Part B, (Ed. L. Packer), Academic Press, Inc., 1999, p.p. 166–184.
    • 2. Helbock, H.J., Beckman, K.B., Ames, B.N.: 8-hydroxydeoxyguanosine and 8-hydroxyguanine as biomarkers of oxidative DNA damage. In: METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 300, Part B, (Ed. L. Packer), Academic Press, Inc., 1999, p.p. 156–166.
    • 3. Wagner, J.R., van Lier, J.E., Decarroz, C., Berger, M., Cadet, J.: Photodynamic methods for oxy radical-induced DNA damage. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Eds. L. Packer, A.N. Glazer), Academic Press 1990, Vol. 186, p.p. 502–511.
    • 4. von Sonntag, C., Schuhmann, H.-P.: Radical-mediated DNA damage in presence of oxygen. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Eds. L. Packer, A.N. Glazer), Academic Press 1990, Vol. 186, p.p. 511–520.
    • 5. Shigenaga, M.K., Park, J.-W., Cundy, K.C., Gimeno, C.J., Ames, B.N.: In vivo oxidative DNA damage: Measurement of 8-hydrohy-2'-deoxyguanosine in DNA and urine by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Eds. L. Packer, A.N. Glazer), Academic Press 1990, Vol. 186, p.p. 521–530.
    • 6. Dizdaroglu, M., Gajewski, E.: Selected-ion mass spectrometry: Assays of oxidative DNA damage. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Eds. L. Packer, A.N. Glazer), Academic Press 1990, Vol. 186, p.p. 530–544.
    • 7. Piperakis, S.M., Visvardis, E.-E., Tassiou, A.M.: Comet assay for nuclear DNA damage. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Ed. L. Packer), Academic Press 1999, Vol. 300, p.p. 184–194.
    • 8. Popov, I., Lewin, G.: Verfahren zur Beurteilung der oxidativen Modifikation proteinhaltiger Stoffe mittels Messung ihrer antiradikalen Aktivität. Patent DE 198 46 148 C2 .
    • 9. Niki, E.: Free radical initiators as source of water- or lipid-soluble peroxyl radicals. In: METHODS IN ENZYMOLOGY (Eds. L. Packer, A.N. Glazer), Academic Press 1990. Vol. 186, p.p. 100–108.
    • 10. Popov, I., Lewin, G.: Verfahren zur Bestimmung der antiradikalen Aktivität von Stoffen. Patent DD 249618 .
    • 11. Popov, I., Lewin, G.: Photochemiluminescent detection of antiradical activity. II. Testing of nonenzymic water-soluble antioxidants. Free Rad. Biol. & Med. 17 (1994) 267–271.

Claims (4)

  1. Verfahren zur quantitativen Beurteilung des Schädigungsgrades von reinen Nukleotiden oder reinen nukleotidhaltigen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass deren antiradikale Aktivität gemessen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Maß für den Schädigungsgrad die Erhöhung der antiradikalen Aktivität im Vergleich zum nativen Zustand genutzt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des Schädigungsgrades anhand des Vergleiches mit der im selben System gemessenen antiradikalen Aktivität einer Kalibrationssubstanz erfolgt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem als Kalibrationssubstanz ein antiradikale Eigenschaften aufweisender Stoff dient, z.B. Ascorbinsäure oder TroloxTM.
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