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Die
Erfindung betrifft eine Sonde zum Nachweis eines molekularen Ereignisses,
insbesondere zum Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotidsonden
mit einem Zieloligonukleotid, vorzugsweise mit Hilfe von molecular
beacons. Das erfindungsgemäße System
dient vorzugsweise dem Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln.
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Molecular
beacons (MB) sind Einzelstrang-DNA-Moleküle mit einer Haarnadelstruktur (hair
pin). Sie besitzen demnach eine "stem
and loop structure".
Die Schleife (loop) weist eine Nukleotidsequenz auf – die sog.
Probensequenz, die zu einer vorbestimmten Zielnukleotidsequenz komplementär ist. Der
Stamm (stem) wird durch die Hybridisierung zweier komplementärer Armsequenzen
gebildet, die die Probensequenz flankieren. Ein Fluoreszenzfarbstoff
befindet sich am Ende eines Armes, während ein Quencher am Ende
des anderen Arms gebunden ist. Durch den Stamm werden diese beiden
Einheiten in einer definierten räumlichen
Nähe zueinander
gehalten, die zu einem möglichst
vollständigen
Quenchen (Löschen)
der Fluoreszenz-Strahlung des Fluorophors durch den sog. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
(FRET) führt.
Dazu ist es erforderlich, das FRET-Paar "Fluorophor-Quencher" aufeinander abzustimmen.
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Trifft
der molecular beacon auf eine Zielsequenz, hybridisieren die Probensequenz
und die Zielsequenz über
einen Bereich, der stabiler und länger ist als der Stamm aus
den beiden Armsequenzen. Der Stamm wird daher in seine Arme getrennt
und der Fluorophor und der Quencher nehmen eine definierte räumliche
Distanz zueinander ein. Damit wird der FREI unterbrochen, da der
FREI mit der 6. Potenz Radius abnimmt. Fluoreszenz-Emission des Fluorophors
wird detektierbar.
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Die
Struktur und das Funktionsprinzip der molecular beacon sind ausführlich beschrieben
von Tyagi und Kramer (1996): "Molecular
beacons: grobes that fluoresce upon hybridization" in Nature Biotechnology
14, 303–308.
Ebenso sind sie Gegenstand der
US
Patentschrift 5,925,517 , die hiermit zu Offenbarungszwecken
hinsichtlich der Struktur und Funktion der MBs sowie der Wahl geeigneter FRET-Paare
vollumfänglich
in Bezug genommen wird.
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Als
bekanntes ideales Fluorophor-Quencher Paar, das in der Stammformation
des MB zu einem fast vollständigen
Löschen
der Fluoreszenz-Emisson führt, ist
die 5'-(2-Aminoethyl)Aminonaphtalin-1-Sulfonsäure (EDANS)
am 5'-Ende und als
Quencher die 4-(4'-Dimethylaminophenylazobenzolsäure (DABCYL)
am 3'-Ende bekannt.
Ebenso ist auch die Verwendung des DABCYL in Kombination mit Fluorescein
am 5'-Ende geeignet
(G. Leone, von Schijndel H., van Gemen B., Kramer R. F. und Schön D. (1998) "Molecular Beacon
Probes combined with Amplification by NASBA enable homogeneous real-time
Detection of RNA" in:
Nucleic Acids Research 26, 9, 2150–2155).
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Da
MBs aufgrund des durch FREI verursachten Quenchings im Ergebnis
solange keine oder kaum eine Fluoreszenzstrahlung emittieren, oder spektrale
Verschiebung bei Verwendung von zwei Fluorophoren verursachen und
damit das Signal aus dem Meßbereich
entfernen, wie die Probensequenz nicht mit der Zielsequenz hybridisiert
vorliegt, haben sich MBs in jüngerer
Vergangenheit besonders als Sonden in Nachweissystemen bewährt, in
denen das Auswaschen überschüssiger Sonden
nicht gewünscht
oder möglich
ist. Dies gilt insbesondere bei der real-time PCR oder bei der Detektion
von Nukleinsäuren
in lebenden Zellen (Liu X., Farmerie W., Schuster S., Tan W. (2000): "Molecular beacons
for DNA Biosensors with a Micrometer to Submicrometer Dimension" in: Analytical Biochemistry
283, 56–63).
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Gerade
in komplexen biologischen Systemen wie lebenden Zellen hat sich
jedoch die unspezifische Fluoreszenz beispielsweise zellulärer Bestandteile
als wesentliche systematische Fehlerquelle erwiesen, die die Aussagekraft
und Spezifität
der Nachweismethoden selbst mit den bekannten MB deutlich vermindert.
So zeigen beispielsweise Hämoglobine
oder aromatische Kohlenwasserstoffe bei Anregung mit UV-Licht ungewollt
eine unspezifische Fluoreszenz, die sich als Hintergrundstrahlung
bemerkbar macht. Das eigentliche Meßsignal wird somit überlagert.
Diese Hintergrundstrahlung wird nachfolgend auch als Autofluoreszenz
der Probenumgebung oder des Probenmilieus bezeichnet.
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EP 0 973 036 B1 betrifft
ein Testverfahren auf der Basis eines an den distalen Enden eines
Peptidmoleküls
angeordneten FRET-Systems, in dem aufgrund ihrer langen Emissionszeiten
Seltene-Erde-Fluorophoren als Donatoren verwendet werden (Absatz
36). Die Signaldetektion erfolgt über eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung,
die als besonders vorteilhaft für
die Reduktion der Hintergrundstrahlung beschrieben wird.
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LEONE
et al. ("Molecular
beacon grobes combined with amplification by NASBA enable homogeneous,
real-time detection of RNA",
Oxford University Press Vol.. 26 1998, Seiten 2150–2155),
beschreibt allgemein den Einsatz von Molecular Beacons in einem
NASBA-System.
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TAN
et al. („Molecular
Beacons: A novel DNA probe for nucleic acid and Protein studies", Journal of Chemistry,
No. 6, 2000, Seiten 1107–1111),
beschreibt den allgemeinen technologischen Hintergrund zu Molecular
Beacons u.a. in ihrer Anwendung in der Real-time PCR oder der RNA-Detektion in lebenden
Zellen.
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FLUIT
et al. („Molecular
detection of antimicrobial resistance", Clinical Microbiology Reviews, October
2001, Seiten 836–871),
betrifft die Detektion bakterieller Resistenzen und offenbart dazu
u.a. auch die Verwendung von Molecular Beacons. Diese Druckschrift
offenbart daher die Verwendung von Molecular Beacons für den Nachweis
von Bakterien.
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Ferner
war ein Europium-Chelat bekannt, das als Fluoreszenzmarker eingesetzt
wird.
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US 5,720,923 betrifft eine
PCR-Maschine für die
Real-time-Amplifikation, die einen UV-Detektor aufweist (
30). Dieser weist zur Fluoreszenzmessung
eine UV-Lichtquelle und Photodioden auf.
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EP 1 049 806 offenbart Methoden
zur zeitaufgelösten
Fluoreszenzmessung (Absätze
42 bis 45). Ferner wurden Molecular Beacons mit einem FRET-System
bestehend aus FAM als Fluorophor und Methylrot als Quencher offenbart
(Absätze
89 und 139). Beispiele für
Molecular Beacons mit einem Seltene-Erde-Farbstoff werden hingegen
nicht offenbart.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes
System zum Nachweis von Ereignissen in einer Probenumgebung zur
Verfügung
zu stellen, wobei der Nachweis des Ereignisses insbesondere dem
Nachweis der Gegenwart eines Zielmoleküls dient. Das Zielmolekül kann beispielsweise
ein Oligonukleotid oder auch ein Peptid oder Protein (Enzym) sein.
Damit soll insbesondere eine Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren, sowie
ein entsprechendes Auswertesystem unter Verwendung dieses Systems
bereitgestellt werden, mit dem vor allem das Problem der ungewollten
Hintergrundstrahlung bei UV-Anregung reduziert wird. Des weiteren
soll eine Vorrichtung zur Durchführung
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
dieses Verfahrens bereitgestellt werden.
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Die
erfindungsgemäße Lösung dieser
Aufgabe beruht im Kern darin, eine Sonde mit zwei ein FRET-Paar
bildenden Fluorophoren einzusetzen, wobei das Paar so gewählt ist,
daß der
Donor des FRET-Paares bei Anregung im Falle des Eintritts des Ereignisses
ein Meßsignal
emittiert, das eine gegenüber
der Floureszenz-Emission der Probenumgebung verlängerte Lebensdauer aufweist.
Durch die zeitliche Differenz der Lebensdauern des Meßsignals und
der Hintergrundstrahlung wird eine Diskriminierung der Emissionen
durch eine zeitaufgelöste
Fluoreszenzmessung möglich.
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Sofern
es sich um eine Sonde für
den Nukleinsäurenachweis
handelt, stellt das "Ereignis" beispielsweise die
Hybridisierung der Sonde mit dem Zieloligonukleotid dar. Umfaßt die erfindungsgemäße Sonde
jedoch einen Oligo- oder Polypeptidanteil, kann das Ereignis beispielsweise
auch die Spaltung oder aber die Bindung des Peptids an einen Liganden
sein. Das "Ereignis" kann somit generell
jede Aktivität
darstellen, die zu einer Veränderung
der räumlichen
Anordnung der FRET-Paare zueinander führt, die eine diskriminierende
Erfassung des Donor-Signals in der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung ermöglicht.
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Die
Diskriminierung zwischen der Fluoreszenz des gewünschten Meßsignals und der unspezifischen
Hintergrundstrahlung wird erfindungsgemäß daher erst möglich durch
einen Fluorophor, der sein Signal in zeitlicher Hinsicht um mindestens
den Faktor 10 länger
abgibt als die Fluoreszenz-Emission
der Probenumgebung. Damit wird das in den derzeit bekannten Verfahren
störende "Hintergrundrauschen" durch unspezifische
Autofluoreszenz bei Verwendung von bekannten MBs verhindert bzw.
erheblich reduziert. Klingt z. B. die Autofluoreszenz – d. h.
die Störfluoreszenz
der Probenumgebung – bereits
nach 200 ns nach Beendigung der UV-Anregung in Form eines Pulses
ab und emittiert der erfindungsgemäße molecular beacon bei Hybridisierung
an seine Targetsequenz insgesamt über einen Zeitraum von 0,5 ms
bis 2 ms sein Meßsignal,
so kann das nach dem Ablauf von 200 ns nach Beendigung des UV-Pulses erfaßbare Fluoreszenzsignal
ausschließlich
der Emission der erfindungsgemäßen Sonden
zugeordnet werden. Eine schematische Darstellung der Erfassung der
Autofluoreszenz sowie der SEF-Fluoreszenz mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung zeigt 1.
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Die
Applikation der dafür
erforderlichen gepulsten UV-Anregung sowie die Vorrichtung und die Verfahren
zur zeitaufgelösten
Fluoreszenzmessung entsprechen dabei den im Stand der Technik bekannten
Verfahren. Diese sind beispielsweise aus der
deutschen Patentanmeldung 196 34
873 A1 bekannt (siehe auch R. Müller, C. Sander, M. Sauer,
M. Deimel, D.S. Ko, S. Siebert, J. Arden-Jacob, G. Deltau, N.J.
Marx, K.H. Drexhage, J. Wolfrum: Time-resolved identification of
single molecules in solution with a pulsed semiconductor diode laser,
Chem. Phys. Lett. 262, 716–722
(1996). Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Sonden besteht in der Möglichkeit, eine
sehr viel höhere
Anregungsenergie zu applizieren, ohne daß damit die Störung durch
eine anderenfalls ebenso erfaßte
Autofloureszenz der Probenumgebung zunähme. Diese erfindungsgemäß verwendete
Anregungsenergie (UV-Diode) kann beispielsweise 300 % über der üblicherweise
verwendeten Anregungsenergie liegen. Die hohe Quantenausbeute und
das extrem schmalbandige Emissionsspektrum der verwendeten Sonden
führen
zu einer hohen Emissionsintensität
in einem engen Frequenzbereich, während die UV-Diode die Sonde
optimal anregen kann. Damit erhöht
sich auch das spezifische Meßsignal
(Ausgangssignal) der Fluorophor-Emission deutlich gegenüber konventionellen
Fluorophoren. Des weiteren geht damit vorteilhafterweise die Erniedrigung
der Nachweisgrenze des Detektionssystems einher.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden Seltene-Erden-Farbstoffe
(nachfolgend auch SEF) als Fluorophore für den erfindungsgemäßen molecular
beacon eingesetzt. Dabei handelt es sich um Farbstoffe, die unter
anderem Lanthanide wie Europium oder Terbium enthalten. SEF weisen
in der Regel Fluoreszenzlebensdauern von etwa 0,5 bis 2,5 ms nach
einem Anregungsimpuls auf (Hemmilä, I. (1990) Applications of
fluorescence in Immunoassays, Wiley-Interscience). Dagegen sind
organische Farbstoffe meist durch Fluoreszenzlebensdauern von nur
wenigen ns bis zu μs gekennzeichnet.
So emittiert der Farbstoff Cy5 nur bis zu etwa 1 ns nach der Anregung
ein Fluoreszenzsignal (Quelle: Amersham Bioscience).
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Die
Seltenerd-Komponente kann bevorzugt ein Diketonato-Komplex sein,
der koordiniert mit einem Chelatbildner ist.
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Als
Diketonat können
Euttaphen oder substituierte Derivate, als Chelatbildner können Phenanthrolin
oder Bipyridin und ihre substituierten Abkömmlinge verwandt werden. Als
Substituenten sind solche funktionellen Gruppen geeignet, die zur
einer Kopplung (mit dem Linker) befähigt sind. Zu nennen sind insbesondere
Amin-, Carboxylat-, Isocyanat-, Thioisocaynat-, Epoxy-, Thiol- oder
Hydroxy-Substituenten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die erfindungsgemäßen Sonden
Euttaphen (1-thenyl-,4,4,4-trifluor-1,3-butane-,1,3-dionato)(1,10-phenanthrolinato)
Eu (+III)) als SEF auf (2). Dieser Farbkomplex ist gekennzeichnet durch
eine Fluoreszenz-Emission noch bis etwa 1 ms nach seiner Anregung.
Das Lumineszenzspektrum von Euttaphen zeigt 3.
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Zur
Bildung eines erfindungsgemäßen MB kann
beispielsweise Euttaphen als Donor mit Cy5 als Akzeptor-Chromophor
zu einem FRET-Pärchen kombiniert
werden.
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Die
Auswahl von Chromophoren als geeignete FRET-Partner kann mittels
der Untersuchung der Fluoreszenz-Emission eines möglichen
Donors in Gegenwart eines möglichen
Akzeptors erfolgen, wobei die Konzentration des Akzeptors variiert
wird. Das Absorptionsspektrum muß dabei mit dem Emissionsspektrum
des Donors deutlich überlappen.
Die für
einen Quenching-Effekt erforderliche Wechselwirkung (insbesondere
der räumlichen
Nähe) zwischen Donor
und Akzeptor wird z. B. durch Konzentration der potentiellen FRET-Partner
eingestellt. Die räumliche
Nähe kann
ggf. auch dadurch erzielt werden, daß ein Partner chemisch an ein
Linker- oder Spacer-Molekül
gebunden ist, welches bei Zusatz des zweiten Partners diesen zusätzlich anzubinden
vermag. Nimmt die Emission des Donors bei steigender Konzentration
des Akzeptors ab, ist dies ein deutliches Zeichen für die Quenchingaktivität des Akzeptors und
damit für
die Kompatibilität
der verwendeten Farbstoffe als FRET-Paar. Beispielhaft für dieses Vorgehen
ist die Darstellung der Abnahme der Fluoreszenz-Emission von Euttaphen
in Abhängigkeit von
der Konzentration von Cy5 in 4.
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Nach
der Wahl geeigneter FRET-Paare werden diese zur Bildung der erfindungsgemäßen Sonden
miteinander verbunden. Diese kann beispielsweise mittels des Protokolls
von Min Li und Paul R. Sevin (Amine-Reactive Forms of a Luminescent Diethylenetriaminepentaacteic
Acid Chelate of Terbium an Europium: Attachment to DNA and Energy
Transfer Measurements. Bioconjugate Chem. 1997, 8, 127–132) erfolgen.
Dazu wird beispielsweise das Euttaphen-NH2 verwendet
und zunächst
durch die Behandlung mit CSCl2 an seinem
NH2 isothiocynatisiert. Anschließend erfolgt
an dem Thiocynat-Rest eine Kopplung an einen aminomodifizierten
Linker, beispielsweise ein aminomodifiziertes Oligonukleotid. Für die Kopplung
des Linkers kann ebenso auf das Protokoll von Li und Sevin zurückgegriffen
werden. Der Linker trägt
ebenso einen Chromophor, beispielsweise Cy5. Die Kopplung des Farbstoffs
an den Linker ist über
bekannte Standardmethoden möglich.
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Wie
bereits ausgeführt,
ermöglichen
die erfindungsgemäßen Sonden
die Diskriminierung zwischen Sondensignal und unspezifischer Hintergrund strahlung über die
zeitaufgelöste
Fluoreszenzmessung. Gleichzeitig zeigen die erfindungsgemäß an die
MB gekoppelten Farbstoffe ein Emissionsspektrum mit scharfen Emissionsbanden.
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Die
beiden Faktoren – nämlich die
scharfen Emissionsbanden der Farbstoffe und die weitgehende Ausschaltung
der unspezifischen Autofluoreszenz selbst bei Erhöhung der
Anregungsenergie – ermöglichen
den Verzicht auf aufwendige Laser- und Auswertesysteme (z.B. ICCD
(Intensified Coupled Charge Device)), die in dem Stand der Technik
zur Optimierung der Meßsignale
vor dem Hintergrund störender
Autofloureszenz entwickelt wurden. Diese befinden sich in den handelsüblichen
real-time PCR Thermocyclern in der Peripherie der Geräte – d.h. außerhalb
des eigentlichen Thermoblocks – und
kommunizieren mit den Proben über
Lichtleitsysteme, in denen ggf. Filter oder Verstärker untergebracht
sind.
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Solche
konstruktiv aufwendigen Systeme zur UV-Anregung können erfindungsgemäß nunmehr durch
eine handelsübliche
UV-Leuchtdiode zur Anregung der Fluorophore und eine handelsübliche Photodiode
zur Erfassung des Meßsignals
ersetzt werden. Vorteilhafterweise wird damit die Konstruktion einer
auf die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
angepaßte
Vorrichtung erheblich vereinfacht und kostengünstiger.
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In
einer vorteilhaften Ausführungsform
sind die handelsüblichen
Dioden unmittelbar in den Thermoblock eines Thermocyclers für eine real-time-PCR integriert. Die
Integration der Dioden unmittelbar in den Thermoblock ermöglicht eine
kompakte Bauweise des Thermocyclers, so daß dieser vorzugsweise auch
tragbar oder mobil konstruiert sein kann.
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Die
erfindungsgemäßen Sonden
erlauben demnach u.a. die spezifische und aussagekräftige real-time
Detektion der Amplifikation von Zielnukleinsäuren mit einer niedrigen Nachweisgrenze,
insbesondere die real-time-PCR
in einem kompakt und einfach gestalteten Thermocycler. Die gegen über z.B.
einem Photomultiplier möglicherweise
verringerte Empfindlichkeit einer Photodiode wird durch das intensive
sowie zeitaufgelöste
Signal der erfindungsgemäßen Sonden
ausgeglichen. Darüber
hinaus sind die erfindungsgemäßen Sonden
jedoch auch in isothermalen Amplikationsverfahren wie die Nucleic Acid
Sequence Based Amplification (NASBA) einsetzbar. Auch können die
erfindungsgemäßen Sonden
in der Array-Technologie
Verwendung finden. Dies ist bereits für die klassischen molecular
beacons bekannt (Liu X. et al. (2000)). Damit eröffnet sich für die erfindungsgemäßen Sonden
das breite Anwendungsfeld der gesamten medizinischen, molekularbiologischen
oder biochemischen Analytik und Diagnostik.
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Darüber hinaus
kann das System der Seltene-Erde-Farbstoffe als Fluorophor und einem
dazu angepaßten
Quencher – also
das FRET-Pärchen – auch in
einer Bindung an Oligopeptide oder Proteine erfolgreich eingesetzt
werden. Der Einsatz des erfindungsgemäß verwendeten FRET-Pärchens ist
somit nicht auf die Kopplung an Nukleinsäuren beschränkt. So ist es ebenso möglich, daß es zunächst in
definierter Nachbarschaft zueinander gebunden an einem Protein vorliegt
und im Falle einer Spaltung des Proteins oder auch aufgrund einer
Konformationsänderung
im Falle der Bindung an einen Liganden in räumlicher Distanz zueinander
liegt, so daß die
Fluoreszenz-Emission des Donor-Fluorophors nachweisbar wird. Damit
sind diese hier vorgeschlagenen FRET-Pärchen auch in der Protein-
oder Peptid-Analytik vorteilhaft einsetzbar.
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Zur
Bildung eines Protein-FRET-Komplexes kann beispielsweise über das
Protokoll von Li and Selvin erfolgen (Min Li and Paul R. Selvin:
Amine-Reactive Forms
of a Luminescent Diethylenetriaminepentaacetic Acid Chelate of Terbium
and Europium: Attachment to DNA and Energy Transfer measurements,
Bioconjugate Chem., 1997, 8, 127–132). Dazu wird Euttaphen-NH2 wiederum in seine Isothiocyanat-Form überführt. Dieser
Schritt kann analog zur Kopplung an DNA erfolgen.
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In
einem zweiten Schritt wird die Isothiocyanat-Form von Euttaphen
mit einem Protein/Peptid gekoppelt, welches mit Cy5 markiert ist.
Dies kann nach Takalo et al. erfolgen (Harri Takalo, Veli-Matti Mukkala,
Heikki Mikola, Päivi
Liitti, and Ilkka Hemmilä:
Synthesis of Europium (III) Chelates suitable for Labelling of Bioactive
Molecules, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 278–282, siehe Synthesis of Chelates.pdf).
Dazu wird das Protein/Peptid in Gegenwart der Isothiocyanat-Form
von Euttaphen in Carbonat-Puffer (pH 9,3) bei Raumtemperatur für 16 h inkubiert.
Die Aufreinigung ist anschließend über Gelchromatographie
möglich.
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Alternativ
kann die Kopplung von Euttaphen-NH2 über Derivate
von DTA (4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-ylamin) nach einem Protokoll
von Karsilayan et al. (Huriye Karsilayan, Ilkka Hemmilä, Harri
Takalo, Airi Toivonen, Kim Petterson, Timo Lövgren, and Veli-Matti Mukkala:
Influence of coupling Method an the Luminescence Properties, coupling Efficiency,
and binding Affinity of Antibodies labelled with Europium(III) Chelates,
Bioconjugate Chem., 1997, 8, 71–75,
siehe Influence of Coupling Method an the Luminescence Properties.pdf)
geschehen. Für eine
spätere
industrielle Herstellung mittels Syntheseautomaten ließe sich
das Euttaphen-NH2 auch nach einem Protokoll
von Peuralahti et al. (Jari Peuralahti, Harri Hakal, Veli-Matti
Mukkala, Kristiina Loman, Pertti Hurskainen, Outi Mulari, and Jari
Hovinen: Introduction of Lanthanide(III) Chelates to Oligopeptides
an Solid Phase, Bioconjugate Chem, 2002, 13, 870–875, siehe Introduction of
Lanthanide(III) Chelates to Oligopeptides an Solid.pdf) an Peptide anbinden.
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In
einem weiteren alternativen Verfahren kann ein Oligopeptid zunächst mit
einem Isocyanat bestückt
werden. In einem zweiten Schritt erfolgt die Kondensation mit einem
Amin-Liganden und dann erst die Komplexbildung mit Euttaphen. Auch
hier kann das Oligopeptid zuvor mit einem Farbstoff gekoppelt werden.
Dieses Vorgehen ist schematisch gezeigt in 5.
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Ausführungsbeispiel:
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Die
Sonden, das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung lassen sich
bevorzugt zum Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln sowie ihrer
Quantifizierung in der Ausgangsprobe einsetzen.
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Zur
Bestimmung von Pathogenen in Proben wie beispielsweise Lebensmitteln
sind vielfältige
Verfahren bekannt, die überwiegend
auf der Bestimmung der Keimzahl bzw. die Erfassung der vermehrungsfähigen Keime
oder auf immunologischen oder biochemischen Nachweisreaktionen beruhen.
Insbesondere die Keimzahlbestimmung impliziert eine vorherige Anreicherung
der Pathogene, die einerseits zu einer langen Dauer (bis zu 72 Stunden)
des Nachweises führt
und das Verfahren aufgrund der Gefahr der Vermehrung auch potentiell
pathogener Mikroorganismen nach dem Infektionsschutzgesetz anzeige- und
genehmigungspflichtig macht.
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Mit
den erfindungsgemäßen Sonden
kann dazu eine einfache, kostengünstige
und auch von wenig geschultem Personal durchführbare Alternative zum Nachweis
und zur Quantifizierung pathogener Keime bereitgestellt werden.
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Dieses
komplexe Nachweisverfahren umfaßt folgende
Schritte, die nachfolgend im einzelnen beschrieben werden:
- 1. Isolierung der Pathogene aus der Lebensmittelprobe
- 1a. ggf. Lyseschritt
- 2. Amplifikation der Zielnukleinsäuren durch eine real-time-PCR
mit verzögerter
Fluoreszenzmessung als Marker für
die Pathogene
- 3. Quantifizierung der Pathogen-Konzentration in der Ausgangsprobe über eine
Standardkurve mit Kalibrierfaktoren.
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zu 1. Isolierung der Pathogene (Beispiel
Salmonella)
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Die
Keime werden vorzugsweise durch immunologische Verfahren aus der
Probenumgebung spezifisch isoliert. Dabei wird bevorzugt auf die
mit Antikörpern
gegen spezifische Oberflächenmoleküle der nachzuweisenden
Mikroorganismen beschichtete paramagnetische Partikel zurückgegriffen.
Zum Nachweis von Salmonella kann dazu auf die sogenannten "Dynabeads anti-Salmonella" (Prod. No. 710.02)
von der Fa. Dyna Biotech zurückgegriffen werden.
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In
einem konkreten Ausführungsbeispiel werden
25 g Lebensmittel mit 225 ml PBS Puffer suspendiert. Der Suspension
werden Immunomagnetische Partikel hinzugegeben. Die Partikel tragen
Antikörper
gegen Oberflächenmoleküle der nachzuweisenden
Keime. Die Inkubation erfolgt für
30 Minuten unter Rühren.
Nachfolgend werden die magnetischen Partikel über einen Magneten entfernt.
Das Pellet wird einmal mit 20 ml PBS-Puffer oder TEST Puffer (10
mmol/l Tris [pH 8], 150 mmol/l NaCl, 0,05 % TWEEN 20) gewaschen.
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zu 1a. Lyse der isolierten Mikroorganismen
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Für Mikroorganismen,
die nicht durch den ersten Schritt der PCR lysiert werden, erfolgt
ein Lyseschritt mit einem Lysepuffer mit Proteinase K (z. B. 50
mmol/l Tris-HCl (pH 8,5) 1 mmol/l EDTA, 0,1 % SDS und 1 mg/ml Proteinase
K). Die Lyse erfolgt für eine
Stunde bei 55°C,
wobei permanent geschüttelt/gerührt wird.
Danach wird die DNA über
eine Affinitätschomatographiesäule (z.
B. QI Aamp DNA Mini Kit von Qiagen) gebunden und eluiert. Ein Aliquot
(< 50 μl) wird für die PCR
verwendet.
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zu 2. Amplifikation der Target-Nukleinsäuren
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Die
paramagnetischen Partikel einschließlich der gebundenen Mikroorganismen – oder ggf.
ein Aliquot aus der Lyse – werden
in ein PCR-Gefäß überführt, das
mit den für
die PCR erforderlichen Komponenten bestückt ist.
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Die
PCR für
Salmonella entspricht dem Protokoll von W. Chen, G. Martinez, A.
Mulchandani (2000): Molecular Beacon: A real time Polymerase Chain
Reaction Assay for Detecting Salmonella, Analytical Biochemistry,
280, 166–172.
Dabei werden allerdings die erfindungsgemäßen Sonden verwendet.
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Die
PCR für
Legionella pneumophila wird nach dem Protokoll von N. Wellinghausen,
C. Frost, R. Marre (2001): Detection of Legionellae in Hospital Water
Samples by Quantitative real time Lightcycler PCR. Appl. Environ.
Microbiol. 67, 3985–3993
durchgeführt.
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Zuvor
wurde über
eine serielle Verbindung eine Kalibrierfunktion (Standardfunktion)
für den Keim
sowie für
den Referenzkeim unter genau diesen konkreten PCR Bedingungen durchgeführt. Das Prinzip
der Aufstellung einer Kalibrierfunktion und der nachfolgenden Quantifizierung
der Pathogene in der Ausgangsprobe entspricht dabei dem dem Durchschnittsfachmann
bekannten Verfahren, das beispielsweise von Fortin N Y, Mulchandani
A. und Chen W. beschrieben wird ("Use of real-time Polymerase Chain Reaction
and Molecular Beacons for the Detection of Escherichia coli O157:H7
(2001) in: Analytical Biochemistry 289, 281 bis 288).
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In
dem PCR-Verfahren werden erfindungsgemäße Sonden eingesetzt, die folgende
Struktur aufweisen:
5' SEF-CGCTATACTGACACTGAGCGACGAAAGCGTAGCG_Cy5
3'
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Als
SEF wurde Euttaphen eingesetzt. Als Linker diente ein C6 Aminolinker
mit der in 6 gezeigten Struktur.
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Thermocycler mit Thermoblock
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Der
Thermocycler 1 (7) weist einen Patterngenerator 2 mit
einem Ausgang 3 auf, zur Triggerung und Synchronisation
der Pulssignale. Für
den Generator kann je nach Bedarf und Ausbaustufe ein programmierbarer
Timerstein, ein handelsübliches Microcontroller-Board
oder ein PC mit I/O-Karte
inklusive entsprechender Zusatzfunktion verwendet werden. Daneben
ist ein über
das Triggersignal getaktetes Ansteuermodul 4 für die UV-Diode
sowie ein synchronisierter Leseverstärker mit Sample/Hold-Schaltung 5 für die Photodiode
vorgesehen. Das analoge getaktete Ausgangssignal 6 kann
für die weitere
Auswertung mit handelsüblichen
Analog/Digital-Konvertern digital gespeichert und weiterverarbeitet
werden.
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Der
Thermoblock 8 (siehe 8) kann
aus einem quaderförmigen
Aluminium-Heizblock zur Aufnahme des Probengefäßes und der Sensorbauelemente
für die
real-time-Detektion bestehen. Dazu umfaßt er Peltier-Elemente 9 mit
Kühlern 10 und
Lüftern 11.
Eine UV-LED-Diode 12 ist unterhalb des Probengefäßes 13 in
einer Bohrung 14 untergebracht. Seitlich neben dem Probengefäß ist eine
handelsübliche
Photodiode 15 angeordnet.