DE10249280A1

DE10249280A1 - Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus Gemischen, die lipophile Verbindungen umfassen

Info

Publication number: DE10249280A1
Application number: DE10249280A
Authority: DE
Inventors: Dirk Dr. Fabritius
Original assignee: Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Current assignee: Celanese Sales Germany GmbH
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2004-05-13

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, das lipophile Verbindungen in Form eines Öls umfasst, wobei man DOLLAR A a) das Gemisch zentrifugiert und anschließend DOLLAR A b) die Phase, die die lipophilen Verbindungen enthält, von der Phase, die das Antischaummittel auf Silikonbasis enthält, trennt.

Description

Schaumbildung ist in der Biotechnologie ein weit verbreitetes Problem. Besonders bei der Kultivierung von Mikroorganismen kann die Schaumbildung zu einem äußerst kritischen Prozessparameter werden. Ohne entsprechende Kontrolle kann durch übermäßige Schaummengen die Kapazität der Bioreaktoren verringert werden, Prozesszeiten und -kosten können maßgeblich erhöht werden aber auch die Aktivität des Biokatalysators kann nachteilig beeinflußt werden. Aus diesem Grund werden dem Medium häufig Antischaummittel beigemischt.
Antischaummittel (Schaumverhütungsmittel, Schauminhibitoren, Schaumdämpfer, Schaumbremsen) ist eine Bezeichnung für Substanzen, die schäumenden Flüssigkeiten zugesetzt werden, um deren Schaumbildung zu reduzieren oder zu verhindern.
Es handelt sich dabei entweder um grenzflächenaktive Stoffe, die die Schaumbildner aus der Grenzfläche verdrängen, ohne selbst Schaum zu erzeugen, oder aber Produkte, die die Oberflächenspannung des Wassers erhöhen, wie z. B. natürliche Fette und Öle oder Fettalkohole.
In biotechnischen Verfahren ist die Verwendung von Entschäumern auf Silikonbasis weit verbreitet.

Die Zugabe von Silikonen als Antischaummittel kann aber zu erheblichen Problemen bei der Aufarbeitung der produzierten Wertstoffe führen. (Steele, Landon M. (2000): Antifoam: Friend or foe? A study of bio-process integration in industrial enzyme manufacturing. Bio-process engineering, Abstr. Paper.-Am. Chem. Soc., 221st BIOT-065). Insbesondere bei der Aufarbeitung lipophiler (wasserunlöslicher) Wertstoffe, wie beispielsweise bei Ölen hochungesättigter Fettsäuren (PUFAs für polyunsaturated fatty acids) gestaltet sich eine Abtrennung der Silikone schwierig, da die physikalischen Eigenschaften der Silikone denen der lipophilen Verbindungen sehr ähnlich sind.

Ein klassischer und weit verbreiteter Prozessschritt bei der Gewinnung von Biomasse aus einer Fermentation ist die Separation bzw. Zentrifugation. Dabei kommt es zur Abtrennung der Biofeuchtmasse von der Kulturbrühe (Fermenterbrühe). Gleichzeitig können bei diesem Verfahrensschritt auch hohe Anteile der Silikonöle in die Biofeuchtmasse gelangen. Die Zentrifugation kann dabei zur Aufkonzentrierung des Silikons führen (Freshour, Amy Rene; Hung, Stephen Lan-sun; Kim, Bang Mo; Moses, Mark Allan; North, Alan Frederick, Houston, Don Royall (2001): System and method for removing silicone oil from treatment plant sludge. US. Patent 6319406).

Wird die Biofeuchtmasse oder auch Biotrockenmasse (z.B. erhält man diese nach Trocknung der Biofeuchtmasse durch Verwendung eines Sprühtrockners oder durch Gefriertrocknung (Lyophilisation)) anschließend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, ev. nach vorherigem Aufschluss (beispielsweise mittels Kugelmühle oder Hochdruckhomogenisator) kann der Silikonentschäumer ebenfalls zum großen Teil in die organische Phase mit dem Produkt gelangen. Immer wenn ein organisches Lösungsmittel als Extraktionsmittel verwendet wird, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit des Übertrittes von Silikon in die organische Phase und damit der Kontamination des Produktes. Dies trifft auch auf die Verwendung von überkritischen Gasen (z.B. überkritisches Kohlendioxid bei der Supercritical Fluid Chromatography (SFC), oder bei der Supercritical Fluid Extraction (SFE)) zu, die Lösungseigenschaften aufweisen, die einem unpolaren organischen Lösungsmittel entsprechen.

In der Regel werden die primär gewonnenen Öle einer Raffination (engl. Refining) unterzogen. Diese führt in der Regel zu keiner Abtrennung der Silikonentschäumer. Bei weiteren Aufreinigungen der primären Fermentationsprodukte (z.B. Speiseöle, Triglyceride) zu hochkonzentrierten Fettsäuren (z.B. Docosahexaensäure, DHA) werden in aller Regel die Triglyceride in Ethylester umgeestert. Dabei werden bekannte Umesterungsverfahren mit sauren oder alkalischen Katalysatoren verwendet. Diese Ethylestergemische können im Weiteren durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen werden. Sehr häufig werden diese Estergemische dann durch chromatographische Verfahren (z.B. HPLC, SFC) aufgereinigt, die auch zu keiner ausreichenden Abtrennung der Silikone führen. Die Silikone können jedoch das Chromatographiematerial verunreinigen oder sogar auf der Säule ausfallen und die Säule verstopfen. Dann muß das gesamte Säulenmaterial ausgetauscht und entsorgt werden. Das stellt ein erhebliches ökonomisches Problem dar.

Zwar gelten Silikone in der Regel als physiologisch verträglich. Allerdings bestehen beispielsweise für bestimmte Lebensmittel sehr niedrige, gesetzlich festgelegte Grenzwerte von höchstens 10 ppm, so dass beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie ein Bedürfnis nach Fetten und Ölen besteht, die diese Grenzwerte erfüllen (vgl. u.a. Zulassung von Silikonölen nach amerikanischem Recht in Lebensmitteln: 21CFR173.340).

Eine Abtrennung von Silikonen aus lipophilen Verbindungen oder Gemischen, die lipophile Verbindungen umfassen, ist schwierig, da der amphiphile Charakter und Micellenbildung (z.B. Emulsion, Dispersion) eine artifizielle Löslichkeit vortäuschen. In der Regel sind Silikonentschäumer nicht löslich in Wasser und organischen Lösungsmitteln. Sie können jedoch Emulsionen bilden, die nur sehr schwer abgetrennt werden können.

Ein geeignetes Verfahren zur Abtrennung von Silikonen von lipophilen Verbindungen, wie Fettsäureestern stellt die Destillation dar. In der Regel ist dieses Verfahren jedoch sehr teuer und nicht zur Gewinnung labiler, bzw. thermisch nicht stabiler Verbindungen geeignet. Hierunter fallen beispielsweise die PUFAs, da deren Doppelbindungen leicht polymerisieren und oxidieren.

Ein weiteres Verfahren ist die unspezifische Absorption auf Bleicherden (Montgomery, Curtis Jerry; Patel, Chimanbhai Purhottamdas; Shetty, Jayarama Kadangod (1987): Method for removing antifoaming agents during processing of microbial fermentations. EP 86-112599 ; Toray Industries (1984): Treatment of waste gas containing silicone. JP 83-20994 ). Dieses Verfahren ist jedoch aufwendig und teuer, außerdem werden verschiedene lipophile Wertstoffe auch von den Bleicherden absorbiert, so dass dieses Verfahren zur Abtrennung der Antischaummittel auf Silikonbasis von lipophilen Wertstoffen, wie PUFAs, mit Nachteilen behaftet ist.

In Anbetracht des Standes der Technik war es nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus Gemischen, die lipophile Verbindungen umfassen, zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren eine schonende Reinigung (thermisch) labiler Verbindungen wie PUFAs oder deren Derivate ermöglichen. Das Verfahren sollte möglichst einfach durchführbar und kostengünstig sein und vor allem den gesetzlichen Auflagen betreffend Lebensmittel- Pharmaka- oder Kosmetikaqualität entsprechen.

Gelöst werden diese sowie weitere nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, das lipophile Verbindungen umfasst mit allen Merkmalen des Patentanpruchs 1. Zweckmäßige Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen unter Schutz gestellt.

Dadurch, dass man ein Gemisch, das lipophile Verbindungen in Form eines Öls sowie Antischaummittel auf Silikonbasis umfasst, zentrifugiert und anschließend die Phase, die die lipophilen Verbindungen enthält von der Phase, die das Antischaummittel auf Silikonbasis enthält trennt, gelingt es auf nicht ohne weiteres vorhersehbare Weise, ein Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, das lipophile Verhindungen enthält, zur Verfügung zu stellen.

Dieses Verfahren ist äußerst einfach und entsprechend kostengünstig durchzuführen. Dem Produkt müssen keine – auch nicht zeitweilig – weiteren Komponenten wie beispielsweise organische Lösungsmittel zugefügt werden, so dass die Qualität nicht beeinträchtigt wird. Insbesondere kann bei einem derartigen Reinigungsverfahren auf den Zusatz von Komponenten, die den geltenden gesetzlichen Regelungen bezüglich Lebensmittel-, Pharmaka- oder Kosmetikaqualität zuwider laufen würden, verzichtet werden. Auch ist das Verfahren denkbar schonend, was besonders für die Aufreinigung labiler Verbindungen, wie z. B. ungesättigter Verbindungen, wie PUFAs vorteilhaft ist.

Das Gemisch aus dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Antischaummittel auf Silikonbasis abgetrennt werden, umfasst neben den Antischaummitteln mindestens eine lipophile Verbindung in Form eines Öls.

Unter Öl wird erfindungsgemäß in diesem Zusammenhang eine mit Wasser nicht mischbare, bei 40°C flüssige Phase, mit einer geringeren Dichte als Wasser verstanden.

Das Gemisch kann erfindungsgemäß natürliche Öle umfassen, wie beispielsweise mikrobiell hergestellte Öle, Fischöle, Pflanzenöle, kann aber auch prozessierte Öle, Estergemische, freie Fettsäuregemische, gesättigte oder ungesättigte organische Verbindungen und/oder Derivate solcher Verbindungen enthalten.

Das die lipophilen Verbindungen enthaltende Öl kann gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung durch die Fermentation (=Kultivierung) von Mikroorganismen erhalten werden. Die entsprechenden Techniken sind in der Fachwelt gut bekannt.

Insbesondere wird dies durch Animpfen eines geeigneten Kultivierungsmediums mit einem Mikroorganismus, Kultivierung des Mikroorganismus und anschließende Isolierung des Öls aus der die Mikroorganismen umfassenden Biofeuchtmasse erreicht.

Vor der Isolierung des Öls kann die Biofeuchtmasse aufgeschlossen werden, beispielsweise mittels Kugelmühle oder Hochdruckhomogenisator. Vor dem Aufschluss kann die Biofeuchtmasse aufkonzentriert werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Tangentialfiltration, Mikrofiltration, Sedimentation, Flotation oder mittels Separatoren. Andere Methoden sind aber ebenfalls denkbar. Der Feuchteanteil der Biofeuchtmasse beträgt nach der Aufkonzentrierung bevorzugterweise 5-60%, bevorzugt 5-50%, besonders bevorzugt 10-40% und ganz besonders bevorzugt 10-30%. Dieser Feuchteanteil der Biomasse kann beispielsweise ermittelt werden, indem eine bestimmte Menge der Biofeuchtmasse im Trockenschrank bei 180°C für 24h getrocknet wird und anschließend der Gewichtsunterschied ermittelt wird, der dem Feuchteanteil entspricht.

Die Kultivierung selbst kann im Batch-, Fed-Batch aber auch in kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultivierung in einem Rühr-, Blasensäulen- oder Airliftfermenter oder in Spinnerflaschen durchgeführt. Während der Fermentation kann der pH-Wert reguliert werden, vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von pH 4 bis pH 9. Die Kultivierungstemperatur liegt ja nach Spezies der Mikroorganismen zwischen 10°C und 45°C.

Das Kultivierungsmedium (Fermentationsmedium) umfasst erfindungsgemäß alle zur Kultivierung der entsprechenden Mikroorganismen notwendigen Komponenten. Diese umfassen
Kohlenstoffquellen wie Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, Stärke, Fucose, Glucosamin, Lactose, Melasse, Dextran, Sojaöl, Sonnenblumenöl, Glycerin, Glutaminsäure, Mannitol; Magermilchpulver oder Acetat,
Stickstoffquellen, wie Peptone, Hefeextrakt, Malzextrakt, Fleischextrakt, Casamino Acids, Corn Steep Liquor, Harnstoff oder Ammoniumsalze,
Phosphatquellen, wie Kaliumphosphat oder Kalium-Dihydrogenphosphat
Vitamine,
Spurenelemente, wie Eisen, Kupfer, Calcium oder Magnesium
oder Wachstumsfaktoren.

Erfindungsgemäß kann es sich bei den Mikroorganismen, aus denen das Ö1 gewonnen wird, beispielsweise um Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Algen oder Protozoen handeln.

Bevorzugte Bakterien entstammen den Gattungen Butyrivibrio und Lactobacillus.

Bevorzugte Pilze entstammen den Gattungen Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Phycomycetes, oder Rhizopus. Besonders bevorzugt sind die Spezies Mortierella ramanniana, Mucor rouxii, M. alpina, Phycomycetes blakesleeanus und Rhizopus arrhizus.

Bevorzugte Algen entstammen der Gattung Spirulina, besonders bevorzugt ist die Spezies S. platensis.

Bevorzugte Protozoen entstammen den Familien Amoebozoa, Apicomplexa, Choanozoa, Ciliophora, Dinozoa, Entamoeba, Euglenozoa, Haplosporidina, Heliozoa, Labyrinthulomycota, Mycetozoa, Opalozoa, Parabasalia, Paramyxia, Percolozoa, Radiozoa oder Rhizopoda, besonders bevorzugt Ciliophora ("Ciliaten").

Bevorzugte Ciliatenunterklassen sind Holotricha, Petritricha, Spirotricha und Suctoria.

Bevorzugte Gattungen sind Colpoda, Colpidium, Crypthecodinium, Cyclotella, Engelmanniella, Euglena, Euplotes, Glaucoma, Gonyoaulax, Gymnodinium, Navicula, Nitzschia, Paramecium, Parauronema, Stylonichia, Schizochytrium, Tetrahymena, Thraustochytrium und Ulkenia, besonders bevorzugt sind Colpidium, Tetrahymena, sowie Ulkenia.

Bevorzugte Arten sind Tetrahymena pyriformis, T. rostrata, T, setosa, T. thermophila und Colpidium campylum. (Klassifizierung der Protozoen nach K. Hausmann: Protozoologie, Thieme Verlag, 1985.)

Ein besonders geeignetes Fermentationsverfahren von Ciliaten zur Produktion biogener Wertstoffe, wie beispielsweise ein Fettsäuren enthaltendes Öl1, wird in der internationalen Patentanmeldung WO 99115634 A1 beschrieben.

Ein weiteres geeignetes Verfahren zur Gewinnung von GLA aus Protozoen wird beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 1 024 199 A2 beschrieben.

Die Isolation, des Öls erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt durch Zentrifugation. Andere Methoden, die in der Fachwelt gut bekannt sind, können auch zur Anwendung kommen.

Die lipophilen Verbindungen sind erfindungsgemäß bevorzugt Lipide, Fettsäuren oder Fettsäurederivate, beispielsweise seien Mono-, Di- oder Triglyceride, Fettsäureester, oder -ether genannt. Bevorzugte Fettsäureester sind Fettsäureethylester. Es kann sich bei den lipophilen Verbindungen erfindungsgemäß auch um Phospholipide, Taurolipide oder Tetrahymanol handeln.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind Fettsäuren mit einer Kettenlänge von bis zu 30 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind ungesättigte Fettsäuren, d.h. Fettsäuren die eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen, bzw. hochungesättigte Fettsäuren (PUFAs). Ganz besonders bevorzugt sind Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der ω-3-ungesättigten Fettsäuren und der ω-6-ungesättigten Fettsäuren.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Fettsäuren sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hexadecadiensäuren, Hexadecatriensäuren, Hexadecatetraensäuren, Linolsäure, α-Linolensäure, γ-Linolensäure (GLA), Stearidonsäure, Arachidonsäure (ARA), Eicosatriensäuren, Eicosatetraensäuren, Eicosapentaensäuren (EPA), Docosapentaensäuren, Docosahexaensäure (DHA), Tetracosadiensäuren, Octacosaoctaensäuren.

Die erfindungsgemäßen natürlichen Öle enthalten einen unterschiedlichen Anteil an den verschiedenen Fettsäuren. Fischöle können beispielsweise 10-20% DHA enthalten, Mikrobiell hergestellte Öle enthalten bis zu 60 % DHA und bis zu 33% GLA, Nachtkerzenöl enthält bis zu 14% GLA, Borretschöl bis zu 27% GLA.

Bei dem Antischaummittel auf Silikonbasis handelt es sich erfindungsgemäß bevorzugt um ein Siloxan.

Silikonentschäumer sind ölige, pastöse oder wässrige emulgierte Silikon-Präparate (gewöhnlich Polydimethylsiloxane), die bereits in sehr geringen Mengen (1 ppm) wirken und als Antischaummittel in der Textilveredlungs-, Kunststoff-, Lack-, Papier-, Seifen-, Nahrungsmittel-, Bio- und Mineralöl-Industrie verwendet werden.

Die Silikone stellen eine umfangreiche Gruppe von synthetischen polymeren Verbindungen, in denen Silicium-Atome über Sauerstoff-Atome ketten- und/oder netzartig verknüpft und die restlichen Valenzen des Siliciums durch Kohlenwasserstoff-Reste (meist Methyl-, seltener Ethyl-, Propyl-, Phenyl-Gruppen und andere) abgesättigt sind. Einfache linear-polymere Silikone sind nach dem Schema (R2SiO)x aufgebaut.

Systematisch werden die Silikone als Polyorganosiloxane bezeichnet; diese Namensbildung basiert auf der Benennung der Si-O-Si-Bindung als Siloxan-Bindung und hat sich in der wissenschaftlichen Literatur eingebürgert. Ein Polymer der allgemeinen Formel

wird als Poly(dimethylsiloxan) bezeichnet, kann aber nach den IUPAC-Regeln zur Benennung linearer organischer Polymere auch Poly[oxy(dimethylsilylen)], nach den Regeln für anorganische Makromoleküle catena-Poly[(dimethylsilicium)-m-oxo] genannt werden. Der internationale Freiname der entsprechenden Verbindung ist Dimeticon.

Die Silikone nehmen eine Zwischenstellung zwischen anorganischen und organischen Verbindungen, insbesondere zwischen Silikaten und organischen Polymeren ein. Die Silikone können je nach Kettenlänge, Verzweigungsgrad und Substituenten niedrig- bis hochviskos oder fest sein. Sie sind wärmebeständig und hydrophob.

Silikone sind lineare Polydimethylsiloxane der oben dargestellten allgemeinen Struktur, die zu Emulsionen, Antischaummitteln, Pasten, Fetten und dergleichen verarbeitet werden; auch Poly(methylphenylsiloxane} kommen zum Einsatz. Die Silikon-Öle stellen gewöhnlich klare, farblose, neutrale, geruchsfreie, hydrophobe Flüssigkeiten dar mit MR 1000-150 000, Dichte: 0,94-0,97 g/l und Viskositäten zwischen 10 und 1 000 000 mPa s (nur wenig Temperatur-abhängig). Sie sind an der Luft dauerwärmebeständig bis ca. 180 °C, haben Stockpunkte von –80 °C bis –40 °C, Sdp. >200 °C und sind löslich in Benzol, Toluol und aliphatischen, auch chlorierten Kohlenwasserstoffen.

Zum Nachweise der Silikone sind physikalische Analysenverfahren einsetzbar, z.B. die IR-Spektroskopie und die Pyrolyse-Gaschromatographie. Eine Analyse des Silkongehaltes läßt sich aber auch indirekt über eine Elementaranalyse von Silicium durchführen. Dabei kann jedes allgemein bekannte und offiziell anerkannte Verfahren zur Anwendung kommen (z.B. §35 Lebensmittelbedarfsgegenstände (LMBG), L00.00-19/1). Die Analyse erfolgt in diesem Falle – ev. nach Aufschluß der Probe – per Massenspektrometrie (ICP-MS).

Ein Siloxane mit einem geringen Molekulargewicht sind bevorzugt, da es beispielsweise bei der Kultur von Mikroorganismen, insbesondere von Ciliaten im Gegensatz zu Siloxanen mit höherem Molekulargewicht nicht zu einer negativen Beeinflussung des Biokatalysators kommt. So kann beispielsweise eine Wachstumsinhibierung oder ein Absterben der Mikroorganismen beobachtet werden. Darüber hinaus ist bekannt, dass bei geringer Verträglichkeit die Mikroorganismen keine Produkte bilden.

Das Gewichtsmittel des Molekulargewicht des Siloxans beträgt erfindungsgemäß bevorzugterweise 510000 Da, besonders bevorzugt ≤ 5000 Da und ganz besonders bevorzugt ≤ 1040 Da.

Die Molmassenverteilung ist mittels Gel-Permeations-Chromatographie bestimmbar.

Bevorzugte Antischaummittel auf Silikonbasis sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Shin-Etsu KM72-F oder M-Compound, Transchemco Trans-series (z.B.Trans-1030), New London Chemicals C-series (z.B. C-21030), Ambersil Antifoam 4016, Elkay LK-AF630.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Phase, die die gereinigten lipophilen Verbindungen enthält, die Phase mit der geringsten Dichte.

Zur Abtrennung der Antischaummittel wird gemäß eines bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung eine Zentrifuge verwendet.

Die Temperatur, bei der zentrifugiert wird, ist an sich nicht kritisch. Nach unten hin ist der Temperaturbereich durch den entsprechenden Aggregatzustand bzw. die entsprechende Viskosität des Gemisches begrenzt, nach oben hin durch die Temperaturempfindlichkeit der zu reinigenden Verbindungen. Im Allgemeinen erfolgt die Zentrifugation daher bei einer Temperatur zwischen 20°C und 100°C. Bevorzugt wird sie bei einer Temperatur zwischen 30°C und 60°C durchgeführt und ganz besonders bevorzugt bei 40°C.

Die Zentrifugation erfolgt erfindungsgemäß bei einer g-Zahl von über 150-1000 m/s², bevorzugt 1000-2000 m/s² und ganz besonders bevorzugt 2000-3000 m/s².

Vor der Zentrifugation kann das Gemisch, insbesondere wenn es Biomasse umfasst, bei erhöhter Temperatur inkubiert werden. Diese Inkubation kann bei 30°C bis 100°C, bevorzugt 40°C bis 70°C und ganz besonders bevorzugt bei 60°C erfolgen. Erfindungsgemäß erfolgt diese Inkubation für 30 min bis 6 h, bevorzugt zwischen 1 h und 3 h und ganz besonders bevorzugt für 2 h.

Unter einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht das Gemisch im Wesentlichen aus einem Öl. In diesem Falle erfolgt die Zentrifugation bevorzugterweise bei ≥ 2000 U/min, besonders bevorzugt bei ≥ 3000 U/min und ganz besonders bevorzugt bei ≥ 4000 U/min.

Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht das Gemisch aus einer Kulturbrühe umfassend aufgeschlossene Biomasse sowie Öl. Der Wasseranteil beträgt in diesem Falle bevorzugterweise ≥ 20%, besonders bevorzugt ≥ 35% und ganz besonders bevorzugt ≥ 50%. Die Zentrifugation erfolgt unter diesem Aspekt der Erfindung bevorzugterweise in einem Tellerseparator, bei einer Geschwindigkeit von ≥ 5000 U/min, bevorzugt ≥ 7500 U/min und ganz besonders bevorzugt ≥ 10000 U/min und einem Durchsatz von ≥ 101/h, bevorzugt ≥ 20 l/h und ganz besonders bevorzugt ≥ 30 l/h.

Das Gemisch kann erfindungsgemäß Wasser, Lösungsmittel, organische oder anorganische Verbindungen, Salze u.a. umfassen.

Bevorzugterweise werden dem Gemisch aus dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Antischaummittel auf Silikonbasis abgetrennt werden, weniger als 10 Gew.-% organische Lösungsmittel, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-% beigefügt. Besonders bevorzugt werden keine organischen Lösungsmittel beigefügt. Zu diesen organischen Lösungsmitteln gehören insbesondere Alkane, wie n-Hexan, Heptan, und Ketone, wie Cyclohexanon.

Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren von der Fermentation bis nach der Abtrennung des Antischaummittels keinen Extraktionsschritt mit organischen Lösungsmitteln. Hierdurch kann gewährleistet werden, dass das gewünschte Produkt zu keiner Zeit einem den geltenden gesetzlichen Regelungen bezüglich Lebensmittel-, Pharmaka- oder Kosmetikaqualität widersprechenden organischen Lösungsmittel ausgesetzt ist, bzw. dass Spuren derartiger Lösungsmittel die zu gewinnenden lipophilen Verbindungen schlussendlich verunreinigen.

Erfindungsgemäß beträgt der Silicium-Gehalt des Produktes nach Abtrennung des Antischaummittels auf Silikonbasis ≤ 1000 ppm, bevorzugt ≤ 100 ppm und ganz besonders bevorzugt ≤ 10 ppm.

Die vom Antischaummittel auf Silikonbasis abgetrennten lipophilen Verbindungen können anschließend mit weiteren technischen Verfahren aufgereinigt werden. Bei diesen Verfahren kann es sich um Raffinationen, Extraktionen, chromatographische Verfahren, wie HPLC oder SFC, Destillationen, Winterisierungen oder andere dem Fachmann gut bekannte Methoden handeln.

Neben einer klassischen Lösungsmittelextraktion (beispielsweise mit n-Hexan, ev. unter Zusatz von Ethanol) ist insbesondere eine Extraktion mit Hilfe überkritischer Flüssigkeiten oder Gase (verdichtete Gase, beispielsweise SFE mit überkritischem Kohlendioxid) geeignet. Die SFE-Methode stellt unter Wahrung der biologischen Kompatibilität ein vielbeschriebenes schonendes Extraktionsverfahren dar.

Insbesondere können die lipophilen Verbindungen daher zur Aufreinigung mit einem überkritischen Fluid behandelt werden. Der Begriff Fluid soll verdeutlichen, dass sich das Gas bzw. die Flüssigkeit im überkritischen Zustand befindet. Derartige Fluide sind an sich bekannt, wobei im allgemeinen die überkritischen Daten der Stoffe, d.h., der jeweils überkritische Druck bzw. die überkritische Temperatur, aus Tabellen oder Nachschlagewerken entnommen werden können.

Zu den bevorzugten Stoffen, die als Fluid dienen können, gehören unter anderem Kohlendioxid (CO₂), Ethylen, Propan, Ammoniak, Distickstoffoxid, Distickstoffdioxid, Wasser und Toluol.

Bevorzugterweise kann CO₂ in einem Bereich von 50 bis 500 bar als Fluid eingesetzt werden.

Einem derartigen Verfahren ist eigen, dass das Öl oder das ölhaltige Gemisch mit überkritischem Gas oder einer überkritischen Flüssigkeit behandelt wird. Hierzu wird das Fluid mit der Mischung in Kontakt gebracht. Das kann batchweise oder kontinuierlich geschehen, wobei die fluide Phase als Lösungsmittel die Mischung je nach Fahrweise der Aufarbeitung entweder durchströmt oder umspült. Dies kann auf jede dem Fachmann bekannte Weise durchgeführt werden.

Das aufzureinigende Gemisch kann hierzu auch auf eine feste Phase aufgebracht werden. Besonders bevorzugt sind unter anderem Seesand und Kieselgel.

Die das zu reinigende Gemisch enthaltende feste Phase kann anschließend mit Fluid umspült oder durchströmt werden, wobei die einzelnen Bestandteile der Mischung unterschiedlich auf bzw. an der festen Phase haften. Durch diese Unterschiede ist eine Auftrennung der Mischung möglich. Dementsprechend kann man die Mischung mittels Chromatographie trennen.

Überragende Ergebnisse können hierbei durch eine Variation des Druckes, dem das Fluid ausgesetzt ist, erzielt werden.

Die Extraktion von Fettsäuren erfolgt vorzugsweise mittels einer vorgestellten Reaktion zur Spaltung der Lipide in einzelne Fettsäuren mittels (katalytischer) Umesterung in die Ester niederer Alkohole oder mittels (katalytischer) Hydrolyse zu den freien Säuren. Die Katalyse kann auf eine dem Fachmann an sich bekannte Art und Weise erfolgen. Beispielhaft seien organische Säuren (z.B. Ameisensäure, Essigsäure oder Zitronensäure), feste Katalysatoren (z.B. Ionenaustauscherharze oder saures Aluminiumoxid} oder Lipasen als Katalysatoren genannt. Lipasen können in Lösung oder aber immobilisiert vorliegen.

Die Spaltung der Lipide kann auch direkt in Gegenwart eines verdichteten Gases im Reaktionsmedium (SFR = supercritical fluid reaction) erfolgen. Ein Verfahren das die Verfahrensstufen Extraktion, Reaktion und Chromatographie zu einer funktionellen Einheit kombiniert (präparative in-situ-Extraktion-Reaktion-Chromatographie mit verdichteten Gasen) wird beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 00/05395 genauer beschrieben.

Das vorliegende Verfahren eignet sich insbesondere zur Aufreinigung von lipophilen Verbindungen, die in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden können. Unter anderen können die lipophilen Verbindungen als Wirkstoff oder Bestandteil in pharmazeutischen Zubereitungen, als Lebensmittelzusatzstoff und als Bestandteil funktioneller Nahrungsmittel verwendet werden. Hierbei zeichnen sich die lipophilen Verbindungen durch einen besonders geringen Silikonölanteil aus.

Abkürzungsverzeichnis

DHA: Docosahexaensäure
DHAEE: Docosahexaensäureethylester
HPLC: High Pressure Liquid Chromatography
PUFA: Polyunsaturated Fatty Acid
SFC: Supercritical Fluid Chromatography
SFE: Supercritical Fluid Extraction
SFR: Supercritical Fluid Reaction
Nachfolgend wird die Erfindung durch zwei Beispiele eingehender erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt werden soll.
Beispiel 1:
Abtrennen von Silikon aus DHA-Öl durch Zentrifugation Die Analyse des Silkongehaltes erfolgte über eine Elementaranalyse von Silicium, nach §35 Lebensmittelbedarfsgegenstände (LMBG), L00.00-19/1) per Massenspektrometrie (ICP-MS).
Schizochytrium limacinum sp. novo (IFO 32693, Yokochi et al., Appl. Microb. Biotechnol., (1998) 49, S. 72-76) wurde in einem 5 1 STR (stirred tank reactor) in 3 1 Medium der folgenden Zusammensetzung unter folgenden Kultivierungsbedingungen kultiviert (Yaguchi, et al., JAOCS, (1997) 74, S. 1431-1434):
(1) Mediumszusammensetzung:

1) Glucose (g/l): 120

2) Corn Steep Liquor (g/l) 1,4

3) (NH₄)₂SO₄ (g/l) 4

4) KH₂PO₄ (g/l) 3

5) KM72-F (Shin-Etsu, Japan) (g/l): 0,5^*)

6) 50% Künstliches Meerwasser (1): 1

7) pH: 4,0

^*)ev. weitere Zugabe im Laufe der Kultivierung, bis insgesamt höchstens 2 g/l.
(2) Kultivierungsbedingungen:

1) Temperatur (°C): 28

2) Belüftungsrate (vvm) 1

3) Rührerdrehzahl (rpm): 300
Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und anschließend gefriergetrocknet. Aufschluss der Zellen und Extraktion der Lipide erfolgte durch Zugabe von 100 Volumina Hexan zu den getrockneten Zellen pro Gewichtseinheit der Zellen und anschließende Homogenisierung mit Glass Beads. Das Lösungsmittel wurde abgezogen, um das Roh-Öl zu erhalten.
Dieses wurde bei 40°C mit 4000 U/min in 250 ml Zentrifugenbechern für 30 Minuten zentrifugiert (Heraeus Megafuge 1.0R). Vor der Zentrifugation wurde die Zentrifugenbecher und die Zentrifuge bei 40°C vorinkubiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgegossen und noch einmal unter den Bedingungen zentrifugiert.
Das Ausgangsöl enthielt einen Silicium-Gehalt von 35,0 ppm und das zentrifugierte Öl (Überstand) einen Silicium-Gehalt von 5,6 ppm. Das entspricht einer Reduzierung des Silicium-Gehaltes um 84% auf 16% Restgehalt.
Beispiel 2:
Abtrennen von Silikon aus einem DHA-Öl durch Separation einer aufgeschlossenen Biofeuchtmasse Schizochytrium limacinum sp. novo wurde wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert.
Nach der Kultivierung wurden die Zellen mittels Zentrfugation geerntet. Die erhaltene Biofeuchtmasse-Suspension wurde über einen konventionellen Hochdruckhomogenisator (800 bar) aufgeschlossen und anschließend für die Gewinnung von DHA-Öl eingesetzt.
In einem ersten Versuch wurde die Biofeuchtmasse mittels organischer Lösungsmittel (n-Hexan/Ethanol; 16:1; v/v) extrahiert, um das DHA-Öl zu gewinnen. Das DHA-Ö1 wies einen Silicium-Gehalt von 1800 ppm auf. Es zeigte sich, dass ein großer Teil des Antischaummittels im Öl wiedergefunden werden kann.
Als weiterer Versuch wurde die aufgeschlossene Biofeuchtmasse bei 60°C für 2 h inkubiert und anschließend in einem Tellerseparator (Westfalia LWA 205 mit Tellertrommel) bei 10000 U/min mit einem Durchsatz von 30 L/h separiert. Es ließ sich direkt ein Öl gewinnen, das einen Silicium-Gehalt von lediglich 66 ppm enthielt. Durch die Verwendung von Biofeuchtmasse mit einem hohem Wasseranteil (> 50%, w/w) verbleibt das Silikon im Wasser und es läßt sich ein reines DHA-Öl gewinnen. Die Silicium-Analyse wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Claims

Verfahren zur Abtrennung von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, das lipophile Verbindungen in Form eines Öls umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass man a) das Gemisch zentrifugiert und anschließend b) die Phase, die die lipophilen Verbindungen enthält, von der Phase, die das Antischaummittel auf Silikonbasis enthält, trennt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch weniger als 10% organische Lösungsmittel enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Ö1 Lipide, Fettsäuren oder Fettsäureester umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antischaummittel ein Siloxan mit einem Molekulargewicht von ≤ 10000 Da ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation bei einer Temperatur zwischen 20°C und 100°C erfolgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aufgeschlossenene Biofeuchtmasse enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das die Biofeuchtmasse enthaltende Gemisch vor der Zentrifugation bei einer Temperatur zwischen 40°C und 100°C inkubiert.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass die Inkubation bei erhöhter Temperatur für ≥ 30 min erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Biofeuchtmasse durch Fermentation von Ciliaten gewonnen wurde.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile Verbindung mehrfach ungesättigte Fettsäuren umfasst.
Lipophilen Verbindungen erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 10.
Verwendung einer lipophilen Verbindung nach Anspruch 9 als Wirkstoff oder Bestandteil in pharmazeutischen Zubereitungen.
Verwendung einer lipophilen Verbindung nach Anspruch 9 Verwendung einer Fettsäure nach Anspruch 8 als Lebensmittelzusatzstoff.
Verwendung einer lipophilen Verbindung nach Anspruch 9 als Bestandteil funktioneller Nahrungsmittel.
Verwendung einer Zentrifuge zum Abtrennen von Antischaummitteln auf Silikonbasis aus einem Gemisch, enthaltend lipophile Verbindungen in Form eines Öls.