DE10239028B4

DE10239028B4 - Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten

Info

Publication number: DE10239028B4
Application number: DE10239028A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Phys. Dr. Teuchner; Dieter Dipl.-Phys. Dr. Leupold; Wolfgang Dipl.-Ing. Dr. Becker; Markus Dr.med. Stücker; Klaus Dr.med. Hoffmann
Original assignee: Becker & Hickl GmbH; Forschungsverbund Berlin FVB eV
Current assignee: Becker & Hickl GmbH; Forschungsverbund Berlin FVB eV
Priority date: 2001-08-21
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2022-08-22
Also published as: DE10239028A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten, insbesondere von Eumelanin und Pheomelanin, umfassend die Verfahrensschritte Anregung des die Melaninsorten aufweisenden Materials mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Absorption von Photonen und spektral aufgelöste Detektion des von der entnommenen oder synthetisch hergestellten Materialprobe emittierten Fluoreszenzlichts, wobei das von den in der Materialprobe vorhandenen Melaninsorten emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig zur spektralen Detektion auch zeitlich aufgelöst detektiert wird und anschließend aus der spektralen Verteilung der Fluoreszenz und aus der Fluoreszenz-Abklingfunktion die in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt werden und wobei in der zu untersuchenden Materialprobe die Fluoreszenz sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugt, die Ergebnisse verglichen und die Melaninsorten bestimmt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten.
Es ist bekannt, Fluoreszenzuntersuchungen beispielsweise in den Biowissenschaften und in der Hydrologie und Hydrogeologie zur Identifizierung eines bestimmten Stoffes auszunutzen, da die Fähigkeit des Stoffes, nach einer Lichteinstrahlung Licht zu emittieren, stoffspezifisch ist, d.h. jeder Stoff andere Energiebeträge aussendet.

So ist zum Beispiel in J. Invest. Dermatol. 116/4 (April 2001) pp. 629-630 beschrieben, dass das Fluoreszenzspektrum des Melanins in malignen Melanomen bei stufenweiser Zweiphotonen-Anregung charakteristische Veränderungen gegenüber gesunder Haut zeigt. Die spektrale Verteilung der Fluoreszenz im gesunden Hautgewebe hat bei 800 nm-Anregung ein Maximum im Bereich um 500 nm und fällt ins Langwellige stark ab, hingegen ist die Fluoreszenz des malignen Melanom-Gewebes gerade im langwelligen Bereich intensiver. Das Emissionsmaximum liegt bei etwa 575 nm und die Intensität nimmt bis hin zu 700 nm nur wenig ab. Dieses Verhalten ist in 1 in erwähnter Veröffentlichung dargestellt. Bei dem beschriebenen Verfahren wird zunächst das zu untersuchende Gewebe mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Zweiphotonen-Absorption zur Fluoreszenz angeregt und das vom Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht spektral aufgelöst detektiert.

Zwar ermöglicht dieses Verfahren die Feststellung einer eingetretenen Veränderung des untersuchten Materials, jedoch ist eine weitergehende Analyse, z. B. die eindeutige Bestimmung verschiedener Melaninsorten, die für die Veränderung verantwortlich sein können, nicht möglich. Das generelle Problem bei der Charakterisierung von Melaninsorten besteht darin, dass die genaue Struktur unbekannt ist, z. B. da sich Melanine nicht kristallisieren lassen und somit keine Kristall-Röntgenstrukturanalyse möglich ist. Es sind nur bestimmte Teil-Strukturblöcke bekannt.

Die in US 5 419 323 beschriebene Lösung ermöglicht die Identifizierung verschiedener Chromophore im Gewebe. Die Anregung des zu untersuchenden Gewebes erfolgt mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen, das vom Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht wird sowohl spektral als auch zeitlich aufgelöst untersucht.

Ein ähnliches Verfahren ist in US 6 272 376 B1 beschrieben, hierbei wird mittels der zeitaufgelösten laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie der histologische Zustand von menschlichem Gewebe charakterisiert. Auch hierbei kann die Anregung der Fluoreszenz mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen erfolgen.

Neben der bekannten Ein-Photonen-Absorption ist in DE 199 39 706 A1 ein Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie angegeben, der zur Realisierung einer stufenweisen m-Photonen-Absorption mit m ≥ 2 ein einziges fluoreszierendes Niveau und zwischen Grundniveau und dem fluoreszierenden Niveau reelle Zwischenniveaus aufweist.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten, insbesondere Eumelanin und Pheomelanin, anzugeben. Unter Melaninsorten werden natürlich vorkommende bzw. auf verschiedene Weise synthetisch hergestellte Melanine verstanden. Diese synthetisch hergestellten Melanine sollen auch als identisch mit natürlich vorkommenden Melaninen oder als davon abweichend charkterisiert werden können.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.

Es hat sich nämlich gezeigt, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer verschiedener Melaninsorten unterschiedlich ist. Das Fluoreszenz-Abklingverhalten ist zwar für die Melaninsorten sehr komplex (dreifach exponentiell), aber die Fluoreszenz beispielsweise des Pheomelanins klingt deutlich schneller ab als die von Eumelanin. Damit wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten neben der bekannten Veränderung des Fluoreszenz-Spektrums auch die bisher unbekannte Tatsache der unterschiedlichen Fluoreszenz-Lebensdauern verschiedener Melaninsorten ausgenutzt, was eine selektive, sicherere und eindeutigere Identifizierung spezieller Melaninsorten ermöglicht. Die sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugten Fluoreszenzspektren der Eumelaninsorten sMela, eMela, nMela sind gegeneinander verschoben, die Fluoreszenzspektren für das Pheomelanin überlagern sich in beiden Anregungsfällen jedoch annähernd. Damit kann beispielsweise eine bessere Aussage bezüglich der „Reinheit" des Pheomelanins in der untersuchten Materialprobe gemacht oder dieses Ergebnis für eine quantitative Analyse der Bestandteile Pheomelanin / Eumelanin genutzt werden.

In einer Weiterbildung des Verfahrens wird zusätzlich auch die räumliche Verteilung der Fluoreszenz in der untersuchten Materialprobe bestimmt.

Ferner wird ein Histogramm der Photonendichte des emittierten Fluoreszenzlichts über der Wellenlänge und der Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der untersuchten Materialprobe erstellt.

Eine andere Weiterbildung sieht sieht vor, dass für jedes einzelne Photon des emittierten Fluoreszenzlichts die Wellenlänge und die Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der Ort innerhalb der untersuchten Materialflächen bestimmt werden und der entstehende Datenstrom on-line oder off-line analysiert wird. Damit kann eine flächenmäßige Verteilung unterschiedlicher Melaninsorten ermittelt werden.

Das Verfahren kann auch zur Ermittlung von malignem Melanom-Gewebe in entnommener Haut eingesetzt werden. Weist die Haut eine maligne Entartung auf, so haben sich die Bestandteile des Pigments Melanin geändert. Es kann also festgestellt werden, ob in der zu untersuchenden Materialprobe neben Eumelanin auch Pheomelanin vorhanden ist, und in welchem Verhältnis diese Substanz auch in Abhängigkeit vom Ortvorliegen.

Das Verfahren wird in der Folge anhand der Zeichnungen näher beschrieben.

Dabei zeigen

1: Fluoreszenzspektren von gesundem Hautgewebe und malignem Melanom-Gewebe, angeregt mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption bei 800 nm;

2: Abklingverhalten der Fluoreszenz für gesundes Hautgewebe und malignes Melanom-Gewebe, angeregt mit 100 fs-Impulsen bei 800 nm;

3: Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für sMela;

4: Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für eMela;

5: Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für nMela;

6: Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für pMela;

7: eine Anordnung zur gleichzeitigen Messung der spektralen Fluoreszenz und des Fluoreszenz-Abklingverhaltens, mit welcher das Verfahren durchgeführt werden kann.

Das Verfahren wird im Folgenden am Beispiel der Eigenfluoreszenz des Melanins in der menschlichen Haut beschrieben. Hierbei werden die im entnommenen Hautgewebe enthaltenen Melaninsorten beispielsweise durch schrittweise Absorption von zwei Photonen bei Bestrahlung mit Impulsen im fs-Bereich im Spektralbereich um 800 nm angeregt. Diesem Anregungsverfahren liegt das spezifische spektrale Absorptionsverhalten des Melanins zugrunde, worüber im Zusammenhang mit einem Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie, insbesondere Melanin als einem Fluorophor für die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie, in DE 199 39 706 A1 berichtet wurde. Andere endogene Fluorophore oder auch körperfremde organische Stoffe (aufgenommene oder als Verunreinigung aufgetragene) werden dabei nicht angeregt. Die gemessenen Fluoreszenzspektren, d.h. die Abhängigkeit der Intensität von der Wellenlänge, sind in 1 für gesundes und krankes Gewebe dargestellt und zeigen deutliche Unterschiede, wie bereits erwähnt.

2 zeigt das charakteristische Fluoreszenz-Abklingverhalten für untersuchtes gesundes Hautgewebe und malignes Melanom-Gewebe. Wie erkennbar ist, klingt die Fluoreszenz des malignen Melanom-Gewebes, das durch die (krankhafte) Veränderung mehr Pheomelanin enthält, schneller ab als das der gesunden Haut. In 2 ist auch das Quadrat der Apparatefunktion (gestrichelte Kurve) dargestellt sowie die bezüglich dieser Funktion durch globale Datenanalyse (Entfaltung) berechneten Fluoreszenzverläufe, die als duchgezogene Kurven eingezeichnet sind. Ermittelt wurde ein dreifach exponentielles Abklingen der Fluoreszenz mit folgenden Abklingzeiten: τ₁ = (100 ± 30) ps; τ₂ = (788 ± 100) ps; τ₃ = (4,3 ± 0,3)ns. Für gesundes Hautgewebe erhält man die Amplituden a₁ = 0,80; a₂ = 0,14; a₃ = 0,06 und für malignes Melanom-Gewebe die Amplituden a₁ = 0,95; a₂ = 0,04; a₃ = 0,01.

Aus den Messergebnissen, die in den 1 und 2 dargestellt sind, wird Folgendes deutlich: Die Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Spektren für maligne Melanome, die einen wesentlichen Anteil Pheomelanin enthalten, weisen im Vergleich zu denen der gesunden Haut eine deutliche bathochrome Verschiebung auf, die mit einer starken Verkürzung des Fluoreszenzabklingens gekoppelt ist.

Als Detektionsverfahren zur kombinierten spektral-zeitlichen Untersuchung kann beispielsweise das Verfahren der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (beschrieben in DD 282 518 A5 in Verbindung mit einem schnellen ADC-Prinzip (dargestellt in DE 43 39 784 A1 , mit mehrkanaliger Detektortechnik ( DE 43 39 787 A1 ) und mit einem Scan-Verfahren (beschrieben in der Zeitschrift „Photonik", 3/2000, S. 16-19) eingesetzt werden.

Selbstverständlich kann das Verfahren in Abhängigkeit von der gewünschten Aussage vereinfacht werden. So kann auf das Scan-Verfahren verzichtet werden. Die Aufzeichnung des Fluoreszenzspektrums kann auf wenige (bis herab zu zwei) Spektralkanäle reduziert werden.

Die Auswertung der gewonnenen Messdaten kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen. Entweder wird ein Histogramm der Photonendichte über der Wellenlänge, der Zeit und der gescanten Fläche erzeugt, hierbei entsteht ein Datensatz, der für jeden Punkt der untersuchten Fläche für jeden Spektralkanal eine volle Fluoreszenz-Abklingfunktion erhält, oder es wird für jedes einzelne detektierte Photon die Zeit innerhalb der Laserimpuls-Folge, der Spektralkanal und der Ort bestimmt. Der dargestellte erste Weg liefert einen komprimierten Datensatz, der alle Informationen für eine spätere Auswertung enthält; der zweite Weg liefert zwar sehr große Datenmengen, dafür kann aber eine Entscheidung über den Zustand der Materialprobe online im Datenstrom getroffen werden.

In den 3 bis 6 sind Fluoreszenzspektren für verschiedene Melaninsorten (sMela, eMela, nMela, pMela) im Vergleich dargestellt, die durch Ein-Photonen-Absorption (Anregungswellenlänge: 400 nm) und durch Zwei-Photonen-Absorption (Anregungswellenlänge: 800 nm) in der zu untersuchenden Materialprobe erzeugt wurden. So ist erkennbar, dass nur im Falle von Pheomelanin (pMela) die Spektren annähernd zusammenfallen. Damit ist eine eindeutige Bestimmung dieser Melaninsorte gegeben.

In der 7 ist nun eine Anordnung dargestellt, mit der das erfindungsgemäße Verfahren realisiert werden kann.

Ein Laser L erzeugt eine hochfrequente Folge von fs-Impulsen im nahen Infrarot. Das Licht des Lasers L wird über einen dichroitischen Spiegel S auf zwei Scan-Spiegel S_x, S_y geführt, die den Strahl in x- und y-Richtung ablenken. Die Drehachse der Scan-Spiegel S_x, S_y wird auf ein Objektiv O abgebildet, das den Laser L auf das Messobjekt M fokussiert. Durch die Bewegung der beiden Scan-Spiegel S_X, S_y wird auf dem Messobjekt M ein rechteckiges Feld abgescant. Eine zwischen dem Laser L und dem dichroitischen Spiegel S angeordnete Linse Li weitet den Strahl auf, sodass die effektive numerische Apertur der Abbildung in das Messobjekt M vergrößert und damit das Beugungsscheibchen im Fokus verkleinert wird. Um das Messobjekt M in der Fokalebene des Objektivs O zu halten und zu fixieren, wird es zweckmäßigerweise an die Rückseite einer Glasplatte GP gedrückt. Die im Fokus des Lasers L angeregte Fluoreszenz des Melanins wird durch das Objektiv O gesammelt und geht zurück über die Scan-Einheit SE und durch den dichroitischen Spiegel S. Hinter dem dichroitischen Spiegel S entsteht ein ortsfester Fokus, der in den Eingangsspalt eines Polychromators P geführt wird. Das Licht vom Polychromator P wird auf einen mehrkanaligen Photomultiplier PMT geführt. Registriert nun ein Kanal des Photomultipliers PMT ein Photon, so entsteht am betreffenden Ausgang ein Impuls von einigen ns Dauer. Die Impulse der Kanäle des Photomultipliers PMT werden einem Router R zugeführt. Dieser fasst die Impulse aller Eingangsleitungen in ein einziges Signal zusammen und erzeugt ausserdem ein digitales Signal, das angibt, in welchem Kanal ein Impuls aufgetreten ist. Dieses Signal wird als Wellenlängen-Information benutzt.

Die zusammengeführten Impulse werden von einem Constant Fraction Discriminator CFD₁ empfangen. Ein weiterer CFD₂ empfängt Referenz-Impulse vom Laser L. Eine Schaltung zur Zeitmessung (entweder ein Time-to-Amplitude Converter, TAC, mit nachgeschaltetem Ananlog-Digital-Wandler, ADC, oder ein Time-to-Digital-Converter-Schaltkreis, TDC) bestimmt die Zeitdifferenz zwischen den Photonen-Impulsen und den Referenzimpulsen vom Laser L. Die erzeugte Information ist die Zeit t des jeweiligen Photons innerhalb der Fluoreszenz-Abklingfunktion.

Die Scan-Einheit SE zur Ablenkung des Laserstrahls liefert mehrere Synchronisationssignale, d.h. einen Impuls beim Übergang auf das nächste Pixel, einen Impuls beim Anfang jeder neuen Zeile und einen Impuls am Anfang eines neuen Bildes. Eine X-Y-Schaltung XY, bestehend aus einer Kombination mehrere Zähler, erzeugt daraus die aktuelle x-y-Position innerhalb der gescannten Fläche. Die x-y-Information kann auch direkt von der Scan-Einheit SE erzeugt werden, in diesem Falle entfällt die X-Y-Schaltung XY.

In der Variante mit Histogramm-Bildung werden die Größen x, y, t und λ zur Adressierung eines Speichers SP benutzt. Der Wert des adressierten Speicherplatzes wird bei jedem Photon um eine Einheit erhöht, sodass im Speicher SP die Photonendichte über x, y, t und λ aufgebaut wird.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, bei jedem Photon die Größen x, y, t und λ in den Speicher SP einzutragen. Der Speicher SP wird dann als FIFO- (First-In-First-Out) Speicher konfiguriert. Er dient zur Pufferung der unregelmäßig eingehenden Photonendaten. Der Speicher SP wird kontinuierlich gelesen, sodass ein Datenstrom mit der Information der einzelnen Photonen entsteht.

Das beschriebene Ausführungsbeispiel kann je nach Anwendung variiert werden.

So kann die gesamte Scan-Anordnung SE einschließlich des X-Y-Komplexes XY weggelassen werden. Man erhält dann eine Einzelpunkt-Messung der Intensität über t und λ.

Wird eine hochempfindlichen Messung von Zweiphotonen-Fluoreszenz-Bildern in den verschiedenen Wellenlängen-Bereichen gewünscht, so kann die Zeitmessung weggelassen werden.

Eine weitere Variante ergibt sich, wenn der Detektor durch einen einkanaligen Photomultiplier PMT ersetzt wird, wobei dann der Routen R weggelassen wird. Das Ergebnis sind Fluoreszenz-Bilder für verschiedene Zeiten nach dem Laserimpuls bzw. ein Array von Bildpunkten, die jeweils eine volle Fluoreszenz-Abklingfunktion enthalten.

Zur Erhöhung des Datendurchsatzes kann der gesamte Elektronik-Teil (Router, CFDs, Zeitmessung, Speicher) mehrfach ausgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten weist zusammenfassend die folgenden Vorteile auf:

– Das Verfahren gestattet eine eindeutige Identifizierung ausschließlich unterschiedlicher Melaninsorten.
– Die Messdaten des Verfahrens liegen in Form von Bildern vor. Bei medizinische Anwendungen finden Bilder eine weitaus höhere Akzeptanz als Einzelpunkt-Messungen.
– Jedes vom Detektor empfangene Photon wird verarbeitet, wodurch eine maximale Empfindlichkeit realisiert wird.
– Durch die hohe Empfindlichkeit in Verbindung mit einer hohen Laser-Repetitionsrate wird mit relativ geringer Impulsenergie gearbeitet. Verglichen mit niedrig repetierenden Lasern hat das Verfahren deshalb einen größeren Sicherheitsabstand zu der Intensitätsschwelle, an der gefährliche Effekte, wie Drei- und Vier-Photonenprozesse oder sogar Plasma-Erzeugung, auftreten.
– Die Zwei-Photonen-Anregung findet während des erfindungsgemäßen Verfahrens in nennenswertem Umfang nur im Fokus statt. Das erlaubt die Aufnahme von Schnittbildern in verschiedenen Tiefen der untersuchten Materialprobe.
– Die Zeitauflösung wird nur von der Laufzeitstreuung in Detektor bestimmt. Diese ist gewöhnlich etwa 10 mal kleiner als die Impulsbreite der Photonenimpulse. Die Auflösung ist deshalb 10 mal besser als beim Einsatz des gleichen Detektors im Analog-Betrieb.
– Durch Variation der Scan-Parameter kann die Anzahl der Bildpunkte beliebig verändert werden. Gleichzeitig kann die Auflösung der Zeitmessung verändert werden, indem Zeitkanäle zusammengefasst werden. Auch benachbarte Wellenlängen-Kanäle können beliebig zusammengefasst werden. Dadurch sind sowohl hochaufgelöste Bilder mit moderater Zeitauflösung als auch zeitliche Präzisionsmessungen einer geringeren Anzahl von Bildpunkten möglich.
– Durch die Aufzeichnung des vollen x-y-t-λ-Datensatzes können die Fluoreszenz-Komponenten unterschiedlicher Fluorophore anhand ihrer unterschiedlichen Spektren und Abklingzeiten gut getrennt werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten, insbesondere von Eumelanin und Pheomelanin, umfassend die Verfahrensschritte Anregung des die Melaninsorten aufweisenden Materials mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Absorption von Photonen und spektral aufgelöste Detektion des von der entnommenen oder synthetisch hergestellten Materialprobe emittierten Fluoreszenzlichts, wobei das von den in der Materialprobe vorhandenen Melaninsorten emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig zur spektralen Detektion auch zeitlich aufgelöst detektiert wird und anschließend aus der spektralen Verteilung der Fluoreszenz und aus der Fluoreszenz-Abklingfunktion die in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt werden und wobei in der zu untersuchenden Materialprobe die Fluoreszenz sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugt, die Ergebnisse verglichen und die Melaninsorten bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich die räumliche Verteilung der Fluoreszenz der in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Histogramm der Photonendichte des emittierten Fluoreszenzlichts über der Wellenlänge und der Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der untersuchten Materialfläche erstellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes einzelne Photon des emittierten Fluoreszenzlichts die Wellenlänge und die Zeit innerhalb der Fluoreszenz-Abklingfunktion und der Ort innerhalb der untersuchten Materialfläche bestimmt werden und der entstehende Datenstrom on-line oder off-line analysiert wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Ermittlung von malignem Melanom-Gewebe in entnommener Haut.