DE10239028B4 - A method for the identification of naturally occurring or synthetic melanin locations - Google Patents

A method for the identification of naturally occurring or synthetic melanin locations

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DE10239028B4 DE2002139028 DE10239028A DE10239028B4 DE 10239028 B4 DE10239028 B4 DE 10239028B4 DE 2002139028 DE2002139028 DE 2002139028 DE 10239028 A DE10239028 A DE 10239028A DE 10239028 B4 DE10239028 B4 DE 10239028B4
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    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten, insbesondere von Eumelanin und Pheomelanin, umfassend die Verfahrensschritte Anregung des die Melaninsorten aufweisenden Materials mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Absorption von Photonen und spektral aufgelöste Detektion des von der entnommenen oder synthetisch hergestellten Materialprobe emittierten Fluoreszenzlichts, wobei das von den in der Materialprobe vorhandenen Melaninsorten emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig zur spektralen Detektion auch zeitlich aufgelöst detektiert wird und anschließend aus der spektralen Verteilung der Fluoreszenz und aus der Fluoreszenz-Abklingfunktion die in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt werden und wobei in der zu untersuchenden Materialprobe die Fluoreszenz sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugt, die Ergebnisse verglichen und die Melanins A method for the identification of naturally occurring or synthetic melanin locations, in particular of eumelanin and pheomelanin, comprising the steps of excitation of the types of melanin-containing material with laser pulses in the femtosecond region by means of absorption of photons and spectrally resolved detection of light emitted from the extracted or synthetically prepared material sample fluorescent light wherein the fluorescent light emitted from the existing in the material sample melanin locations is detected simultaneously dissolved for spectral detection of even time and are then determined from the spectral distribution of the fluorescence and from the fluorescence decay function present in the tested material sample melanin locations, and wherein to be examined in the material sample generates fluorescence, either by means of one-photon absorption and by means of gradual two-photon absorption, the results are compared and the melanin orten bestimmt werden. locations are determined.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten. The invention relates to a method for the identification of naturally occurring or synthetic melanin locations.
  • Es ist bekannt, Fluoreszenzuntersuchungen beispielsweise in den Biowissenschaften und in der Hydrologie und Hydrogeologie zur Identifizierung eines bestimmten Stoffes auszunutzen, da die Fähigkeit des Stoffes, nach einer Lichteinstrahlung Licht zu emittieren, stoffspezifisch ist, dh jeder Stoff andere Energiebeträge aussendet. It is known to utilize fluorescence studies, for example in the life sciences and in the hydrology and geology of identifying a given substance, since the ability of the substance to emit light after light irradiation, is a substance-specific, that is, each substance emits different amounts of energy.
  • So ist zum Beispiel in J. Invest. Thus, for example, J. Invest. Dermatol. Dermatol. 116/4 (April 2001) pp. 116/4 (April 2001) pp. 629-630 beschrieben, dass das Fluoreszenzspektrum des Melanins in malignen Melanomen bei stufenweiser Zweiphotonen-Anregung charakteristische Veränderungen gegenüber gesunder Haut zeigt. 629-630 describes that the fluorescence spectrum of melanin shows characteristic changes in comparison to healthy skin in malignant melanoma with a stepwise two-photon excitation. Die spektrale Verteilung der Fluoreszenz im gesunden Hautgewebe hat bei 800 nm-Anregung ein Maximum im Bereich um 500 nm und fällt ins Langwellige stark ab, hingegen ist die Fluoreszenz des malignen Melanom-Gewebes gerade im langwelligen Bereich intensiver. The spectral distribution of fluorescence in the healthy skin tissue has at 800 nm excitation maximum in the range around 500 nm and falls into Longwave sharply, whereas the fluorescence of malignant melanoma tissue is more intense, especially in the long wavelength region. Das Emissionsmaximum liegt bei etwa 575 nm und die Intensität nimmt bis hin zu 700 nm nur wenig ab. The emission maximum is around 575 nm and the intensity increases to 700 nm from only little. Dieses Verhalten ist in This behavior is in 1 1 in erwähnter Veröffentlichung dargestellt. shown in mentioned publication. Bei dem beschriebenen Verfahren wird zunächst das zu untersuchende Gewebe mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Zweiphotonen-Absorption zur Fluoreszenz angeregt und das vom Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht spektral aufgelöst detektiert. In the described method the examined tissue with laser pulses in the femtosecond region is first excited by two-photon absorption for the fluorescence and the light emitted from the tissue fluorescence detected light spectrally resolved.
  • Zwar ermöglicht dieses Verfahren die Feststellung einer eingetretenen Veränderung des untersuchten Materials, jedoch ist eine weitergehende Analyse, z. While this method allows the determination of an occurred alteration of the material under investigation, but it is further analysis, such. B. die eindeutige Bestimmung verschiedener Melaninsorten, die für die Veränderung verantwortlich sein können, nicht möglich. B. unambiguous identification of different types of melanin, which may be responsible for the change, not possible. Das generelle Problem bei der Charakterisierung von Melaninsorten besteht darin, dass die genaue Struktur unbekannt ist, z. The general problem in the characterization of types of melanin is that the exact structure is not known, for example. B. da sich Melanine nicht kristallisieren lassen und somit keine Kristall-Röntgenstrukturanalyse möglich ist. B. because melanin does not crystallize and therefore no crystal X-ray structure analysis is possible. Es sind nur bestimmte Teil-Strukturblöcke bekannt. There are known only to certain sub-structure blocks.
  • Die in In the US 5 419 323 US 5,419,323 beschriebene Lösung ermöglicht die Identifizierung verschiedener Chromophore im Gewebe. Solution described allows for the identification of different chromophores in the tissue. Die Anregung des zu untersuchenden Gewebes erfolgt mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen, das vom Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht wird sowohl spektral als auch zeitlich aufgelöst untersucht. The excitation of the tissue to be examined is carried out with radiation of different wavelengths, the fluorescent light emitted from the tissue is both spectrally resolved manner examined.
  • Ein ähnliches Verfahren ist in A similar method is described in US 6 272 376 B1 US 6,272,376 B1 beschrieben, hierbei wird mittels der zeitaufgelösten laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie der histologische Zustand von menschlichem Gewebe charakterisiert. described, in this case the histological state is characterized by human tissue by means of time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy. Auch hierbei kann die Anregung der Fluoreszenz mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen erfolgen. Also in this case the excitation of the fluorescence radiation of different wavelengths can take place.
  • Neben der bekannten Ein-Photonen-Absorption ist in Besides the well-known one-photon absorption is in DE 199 39 706 A1 DE 199 39 706 A1 ein Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie angegeben, der zur Realisierung einer stufenweisen m-Photonen-Absorption mit m ≥ 2 ein einziges fluoreszierendes Niveau und zwischen Grundniveau und dem fluoreszierenden Niveau reelle Zwischenniveaus aufweist. indicated a fluorophore for the multi-photon laser scanning microscopy, which has to implement a stepwise m-photon absorption with m ≥ 2, a single fluorescent levels and between ground level and the fluorescent level real intermediate levels.
  • Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten, insbesondere Eumelanin und Pheomelanin, anzugeben. The object of the invention is now to provide a method for identifying types of melanin, in particular eumelanin and pheomelanin indicate. Unter Melaninsorten werden natürlich vorkommende bzw. auf verschiedene Weise synthetisch hergestellte Melanine verstanden. Under melanin varieties are naturally occurring or understood in different ways melanin synthetic. Diese synthetisch hergestellten Melanine sollen auch als identisch mit natürlich vorkommenden Melaninen oder als davon abweichend charkterisiert werden können. These melanins synthetically produced should be possible charkterisiert as identical to the naturally occurring melanin or as it differently.
  • Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. The object is achieved by a method according to Claim. 1
  • Es hat sich nämlich gezeigt, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer verschiedener Melaninsorten unterschiedlich ist. It has been shown that the fluorescence lifetime of different types of melanin is different. Das Fluoreszenz-Abklingverhalten ist zwar für die Melaninsorten sehr komplex (dreifach exponentiell), aber die Fluoreszenz beispielsweise des Pheomelanins klingt deutlich schneller ab als die von Eumelanin. Although the fluorescence decay is for melanin places very complex (triple exponentially), but the fluorescence example of pheomelanin decays much faster than that of eumelanin. Damit wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten neben der bekannten Veränderung des Fluoreszenz-Spektrums auch die bisher unbekannte Tatsache der unterschiedlichen Fluoreszenz-Lebensdauern verschiedener Melaninsorten ausgenutzt, was eine selektive, sicherere und eindeutigere Identifizierung spezieller Melaninsorten ermöglicht. Thus also the hitherto unknown fact of different fluorescence lifetimes of different types of melanin is utilized in the inventive method for identifying types of melanin in addition to the known change in the fluorescence spectrum, which enables a selective, safer and clearer identification of specific types of melanin. Die sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugten Fluoreszenzspektren der Eumelaninsorten sMela, eMela, nMela sind gegeneinander verschoben, die Fluoreszenzspektren für das Pheomelanin überlagern sich in beiden Anregungsfällen jedoch annähernd. The fluorescence spectra of the Eumelaninsorten Smela, Emela, nMela produced both by means of one-photon absorption and by means of gradual two-photon absorption are shifted from each other, however, the fluorescence spectra for the Pheomelanin overlap approximately in both cases excitation. Damit kann beispielsweise eine bessere Aussage bezüglich der „Reinheit" des Pheomelanins in der untersuchten Materialprobe gemacht oder dieses Ergebnis für eine quantitative Analyse der Bestandteile Pheomelanin / Eumelanin genutzt werden. This allows, for example, made a better statement about the "purity" of pheomelanin in the tested material sample or if this result for a quantitative analysis of the constituents Pheomelanin / eumelanin be used.
  • In einer Weiterbildung des Verfahrens wird zusätzlich auch die räumliche Verteilung der Fluoreszenz in der untersuchten Materialprobe bestimmt. In a further development of the method, the spatial distribution of the fluorescence is determined in the tested material sample addition.
  • Ferner wird ein Histogramm der Photonendichte des emittierten Fluoreszenzlichts über der Wellenlänge und der Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der untersuchten Materialprobe erstellt. Furthermore, a histogram of photon density of the emitted fluorescent light over the wavelength and the time within the fluorescence decay and the sample material under investigation is created.
  • Eine andere Weiterbildung sieht sieht vor, dass für jedes einzelne Photon des emittierten Fluoreszenzlichts die Wellenlänge und die Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der Ort innerhalb der untersuchten Materialflächen bestimmt werden und der entstehende Datenstrom on-line oder off-line analysiert wird. Another further development provides provides that are determined within the examined material surfaces for each photon of the fluorescent light emitted wavelength and time within the fluorescence decay and the place and the resulting data stream is analyzed on-line or off-line. Damit kann eine flächenmäßige Verteilung unterschiedlicher Melaninsorten ermittelt werden. In order to localize an areal distribution of different types of melanin.
  • Das Verfahren kann auch zur Ermittlung von malignem Melanom-Gewebe in entnommener Haut eingesetzt werden. The method may also be used for determination of malignant melanoma tissues of removed skin. Weist die Haut eine maligne Entartung auf, so haben sich die Bestandteile des Pigments Melanin geändert. Has the skin on malignant transformation, then the components of the pigment melanin have changed. Es kann also festgestellt werden, ob in der zu untersuchenden Materialprobe neben Eumelanin auch Pheomelanin vorhanden ist, und in welchem Verhältnis diese Substanz auch in Abhängigkeit vom Ortvorliegen. It can therefore be stated, whether pheomelanin is present in the sample material to be tested in addition to eumelanin, and how does this substance also depending on the Ortvorliegen.
  • Das Verfahren wird in der Folge anhand der Zeichnungen näher beschrieben. The method is described in more detail below with reference to the drawings.
  • Dabei zeigen show Here
  • 1 1 : Fluoreszenzspektren von gesundem Hautgewebe und malignem Melanom-Gewebe, angeregt mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption bei 800 nm; : Fluorescence spectra from healthy skin tissue and malignant melanoma tissue excited by gradual two-photon absorption at 800 nm;
  • 2 2 : Abklingverhalten der Fluoreszenz für gesundes Hautgewebe und malignes Melanom-Gewebe, angeregt mit 100 fs-Impulsen bei 800 nm; : Decay of fluorescence of healthy skin tissue and malignant melanoma tissues excited with 100 fs pulses at 800 nm;
  • 3 3 : Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für sMela; : One-photon and two-photon fluorescence spectra for Smela;
  • 4 4 : Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für eMela; : One-photon and two-photon fluorescence spectra for Emela;
  • 5 5 : Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für nMela; : One-photon and two-photon fluorescence spectra for nMela;
  • 6 6 : Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektren für pMela; : One-photon and two-photon fluorescence spectra for pMela;
  • 7 7 : eine Anordnung zur gleichzeitigen Messung der spektralen Fluoreszenz und des Fluoreszenz-Abklingverhaltens, mit welcher das Verfahren durchgeführt werden kann. An arrangement for the simultaneous measurement of the spectral fluorescence and the fluorescence decay behavior with which the method can be performed.
  • Das Verfahren wird im Folgenden am Beispiel der Eigenfluoreszenz des Melanins in der menschlichen Haut beschrieben. The process is described below using the example of the self-fluorescence of the melanin in the human skin. Hierbei werden die im entnommenen Hautgewebe enthaltenen Melaninsorten beispielsweise durch schrittweise Absorption von zwei Photonen bei Bestrahlung mit Impulsen im fs-Bereich im Spektralbereich um 800 nm angeregt. Here, the types of melanin contained in the removed skin tissue are excited, for example by gradual absorption of two photons when irradiated with pulses in the femtosecond region in the spectral range around 800 nm. Diesem Anregungsverfahren liegt das spezifische spektrale Absorptionsverhalten des Melanins zugrunde, worüber im Zusammenhang mit einem Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie, insbesondere Melanin als einem Fluorophor für die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie, in This excitation method is the specific spectral absorption characteristics of melanin based on what in connection with a fluorophore for multi-photon laser-scanning microscopy, in particular melanin as a fluorophore for the two-photon laser-scanning microscopy, in DE 199 39 706 A1 DE 199 39 706 A1 berichtet wurde. was reported. Andere endogene Fluorophore oder auch körperfremde organische Stoffe (aufgenommene oder als Verunreinigung aufgetragene) werden dabei nicht angeregt. Other endogenous fluorophores or exogenous organic matter (taken or applied as an impurity) are not stimulated. Die gemessenen Fluoreszenzspektren, dh die Abhängigkeit der Intensität von der Wellenlänge, sind in The measured fluorescence spectra, that is, the dependence of the intensity of the wavelength are in 1 1 für gesundes und krankes Gewebe dargestellt und zeigen deutliche Unterschiede, wie bereits erwähnt. shown for healthy and diseased tissue and show clear differences, as already mentioned.
  • 2 2 zeigt das charakteristische Fluoreszenz-Abklingverhalten für untersuchtes gesundes Hautgewebe und malignes Melanom-Gewebe. shows the characteristic fluorescence decay for-studied healthy skin tissue and malignant melanoma tissue. Wie erkennbar ist, klingt die Fluoreszenz des malignen Melanom-Gewebes, das durch die (krankhafte) Veränderung mehr Pheomelanin enthält, schneller ab als das der gesunden Haut. As seen, the fluorescence of the sounds malignant melanoma tissue containing by (pathological) Change Pheomelanin more, faster than that of healthy skin. In In 2 2 ist auch das Quadrat der Apparatefunktion (gestrichelte Kurve) dargestellt sowie die bezüglich dieser Funktion durch globale Datenanalyse (Entfaltung) berechneten Fluoreszenzverläufe, die als duchgezogene Kurven eingezeichnet sind. also the square of the apparatus function (dotted curve) is shown as well as with respect to this function by global data analysis (unfolding) calculated fluorescence curves, which are shown as solid curves Duch. Ermittelt wurde ein dreifach exponentielles Abklingen der Fluoreszenz mit folgenden Abklingzeiten: τ 1 = (100 ± 30) ps; Was determined a three-exponential decay of the fluorescence decay times with the following: τ 1 = (100 ± 30) ps; τ 2 = (788 ± 100) ps; τ 2 = (788 ± 100) ps; τ 3 = (4,3 ± 0,3)ns. τ 3 = (4.3 ± 0.3) ns. Für gesundes Hautgewebe erhält man die Amplituden a 1 = 0,80; For healthy skin tissue is obtained, the amplitudes a 1 = 0.80; a 2 = 0,14; a 2 = 0.14; a 3 = 0,06 und für malignes Melanom-Gewebe die Amplituden a 1 = 0,95; a 3 = 0.06 and for malignant melanoma tissues, the amplitudes a 1 = 0.95; a 2 = 0,04; a 2 = 0.04; a 3 = 0,01. a 3 = 0.01.
  • Aus den Messergebnissen, die in den From the measurement results, which in the 1 1 und and 2 2 dargestellt sind, wird Folgendes deutlich: Die Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Spektren für maligne Melanome, die einen wesentlichen Anteil Pheomelanin enthalten, weisen im Vergleich zu denen der gesunden Haut eine deutliche bathochrome Verschiebung auf, die mit einer starken Verkürzung des Fluoreszenzabklingens gekoppelt ist. are shown, the following is clear: the two-photon fluorescence spectra for malignant melanoma, which contain a substantial proportion Pheomelanin exhibit compared to those of healthy skin to a significant bathochromic shift, coupled with a strong shortening of the fluorescence decay.
  • Als Detektionsverfahren zur kombinierten spektral-zeitlichen Untersuchung kann beispielsweise das Verfahren der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (beschrieben in The detection process for the combined spectral-temporal study, the method of time-correlated single photon counting, for example, (described in DD 282 518 A5 DD 282 518 A5 in Verbindung mit einem schnellen ADC-Prinzip (dargestellt in (In conjunction with a fast ADC illustrated in principle DE 43 39 784 A1 DE 43 39 784 A1 , mit mehrkanaliger Detektortechnik ( (With multi-channel detector technology DE 43 39 787 A1 DE 43 39 787 A1 ) und mit einem Scan-Verfahren (beschrieben in der Zeitschrift „Photonik", 3/2000, S. 16-19) eingesetzt werden. ) And a scan method (as described) can be employed in the journal "Photonics", 3/2000, pp 16-19.
  • Selbstverständlich kann das Verfahren in Abhängigkeit von der gewünschten Aussage vereinfacht werden. Of course, the process can be simplified, depending on the desired information. So kann auf das Scan-Verfahren verzichtet werden. So can be dispensed with the scanning process. Die Aufzeichnung des Fluoreszenzspektrums kann auf wenige (bis herab zu zwei) Spektralkanäle reduziert werden. The recording of the fluorescence spectrum can be reduced to a few (down to two) spectral channels.
  • Die Auswertung der gewonnenen Messdaten kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen. The evaluation of the measurement data obtained can be done in two different ways. Entweder wird ein Histogramm der Photonendichte über der Wellenlänge, der Zeit und der gescanten Fläche erzeugt, hierbei entsteht ein Datensatz, der für jeden Punkt der untersuchten Fläche für jeden Spektralkanal eine volle Fluoreszenz-Abklingfunktion erhält, oder es wird für jedes einzelne detektierte Photon die Zeit innerhalb der Laserimpuls-Folge, der Spektralkanal und der Ort bestimmt. Either a histogram of photon density to the wavelength, time, and the scanned surface is generated, this creates a data set that receives a full fluorescence decay function for each point of the studied area for each spectral channel, or there is for each detected photon, the time determined within the laser pulse sequence, the spectral channel and location. Der dargestellte erste Weg liefert einen komprimierten Datensatz, der alle Informationen für eine spätere Auswertung enthält; The illustrated first way provides a compressed data set that contains all the information for later analysis; der zweite Weg liefert zwar sehr große Datenmengen, dafür kann aber eine Entscheidung über den Zustand der Materialprobe online im Datenstrom getroffen werden. Although the second way gives very large amounts of data, but can be made online in the data stream a decision on the status of the material sample.
  • In den In the 3 3 bis to 6 6 sind Fluoreszenzspektren für verschiedene Melaninsorten (sMela, eMela, nMela, pMela) im Vergleich dargestellt, die durch Ein-Photonen-Absorption (Anregungswellenlänge: 400 nm) und durch Zwei-Photonen-Absorption (Anregungswellenlänge: 800 nm) in der zu untersuchenden Materialprobe erzeugt wurden. are fluorescence spectra for different types of melanin (Smela, Emela, nMela, pMela) shown in the comparison, by one-photon absorption (excitation wavelength: 400 nm) and by two-photon absorption (excitation wavelength: 800 nm) generated in the to be tested material sample were. So ist erkennbar, dass nur im Falle von Pheomelanin (pMela) die Spektren annähernd zusammenfallen. Thus it is seen that only in the case of pheomelanin (pMela) coincide approximately spectra. Damit ist eine eindeutige Bestimmung dieser Melaninsorte gegeben. Thus an unambiguous determination of melanin places is given.
  • In der In the 7 7 ist nun eine Anordnung dargestellt, mit der das erfindungsgemäße Verfahren realisiert werden kann. is shown now an arrangement with which the inventive method can be realized.
  • Ein Laser L erzeugt eine hochfrequente Folge von fs-Impulsen im nahen Infrarot. A laser L generates a high frequency sequence of fs pulses in the near infrared. Das Licht des Lasers L wird über einen dichroitischen Spiegel S auf zwei Scan-Spiegel S x , S y geführt, die den Strahl in x- und y-Richtung ablenken. The laser light L is fed via a dichroic mirror S to two scanning mirror S x, S y, which deflect the beam in x- and y-direction. Die Drehachse der Scan-Spiegel S x , S y wird auf ein Objektiv O abgebildet, das den Laser L auf das Messobjekt M fokussiert. The axis of rotation of the scanning mirror S x, S y is mapped onto an objective O, which focuses the laser L to the measuring object M. Durch die Bewegung der beiden Scan-Spiegel S X , S y wird auf dem Messobjekt M ein rechteckiges Feld abgescant. By the movement of the scanning mirror S X, S Y, a rectangular box is abgescant on the measuring object M. Eine zwischen dem Laser L und dem dichroitischen Spiegel S angeordnete Linse Li weitet den Strahl auf, sodass die effektive numerische Apertur der Abbildung in das Messobjekt M vergrößert und damit das Beugungsscheibchen im Fokus verkleinert wird. Means disposed between the laser L and the dichroic mirror S Li lens widens the beam, so that the effective numerical aperture of the imaging increased in the test object M, and therefore the Airy disk is reduced in focus. Um das Messobjekt M in der Fokalebene des Objektivs O zu halten und zu fixieren, wird es zweckmäßigerweise an die Rückseite einer Glasplatte GP gedrückt. In order to keep the object to be measured M in the focal plane of the lens O and fix, it is advantageously pressed against the back of a glass plate GP. Die im Fokus des Lasers L angeregte Fluoreszenz des Melanins wird durch das Objektiv O gesammelt und geht zurück über die Scan-Einheit SE und durch den dichroitischen Spiegel S. Hinter dem dichroitischen Spiegel S entsteht ein ortsfester Fokus, der in den Eingangsspalt eines Polychromators P geführt wird. The excited in the focus of the laser L fluorescence of melanin is collected by the lens O and goes back through the scan unit SE and through the dichroic mirror S. Behind the dichroic mirror S produces a fixed focus, which is guided in the entrance slit of a polychromator P becomes. Das Licht vom Polychromator P wird auf einen mehrkanaligen Photomultiplier PMT geführt. The light from the polychromator P is guided onto a multi-channel photomultiplier PMT. Registriert nun ein Kanal des Photomultipliers PMT ein Photon, so entsteht am betreffenden Ausgang ein Impuls von einigen ns Dauer. now registers a channel of the photomultiplier PMT, a photon, a pulse of a few ns duration produced at the corresponding output. Die Impulse der Kanäle des Photomultipliers PMT werden einem Router R zugeführt. The pulses of the channels of the photomultiplier PMT are supplied to a router R. Dieser fasst die Impulse aller Eingangsleitungen in ein einziges Signal zusammen und erzeugt ausserdem ein digitales Signal, das angibt, in welchem Kanal ein Impuls aufgetreten ist. This summarizes the pulses of all input lines into a single signal together and also generates a digital signal indicative of the channel in which a pulse has occurred. Dieses Signal wird als Wellenlängen-Information benutzt. This signal is used as a wavelength information.
  • Die zusammengeführten Impulse werden von einem Constant Fraction Discriminator CFD 1 empfangen. The combined pulses are received by a constant fraction discriminator CFD. 1 Ein weiterer CFD 2 empfängt Referenz-Impulse vom Laser L. Eine Schaltung zur Zeitmessung (entweder ein Time-to-Amplitude Converter, TAC, mit nachgeschaltetem Ananlog-Digital-Wandler, ADC, oder ein Time-to-Digital-Converter-Schaltkreis, TDC) bestimmt die Zeitdifferenz zwischen den Photonen-Impulsen und den Referenzimpulsen vom Laser L. Die erzeugte Information ist die Zeit t des jeweiligen Photons innerhalb der Fluoreszenz-Abklingfunktion. Another CFD 2 receives the reference pulses from the laser L. A circuit for measuring time (either a time-to-amplitude converter, TAC, with a downstream Ananlog-digital converter, ADC, or a time-to-digital converter circuit, TDC) determines the time difference between the photon pulses and the reference pulses from the laser L. the generated information is the time t of the respective photon within the fluorescence decay function.
  • Die Scan-Einheit SE zur Ablenkung des Laserstrahls liefert mehrere Synchronisationssignale, dh einen Impuls beim Übergang auf das nächste Pixel, einen Impuls beim Anfang jeder neuen Zeile und einen Impuls am Anfang eines neuen Bildes. The scanning unit SE for deflecting the laser beam provides a plurality of synchronization signals, that is, a pulse at the transition to the next pixel, a pulse at the start of each new line, and a pulse at the beginning of a new image. Eine XY-Schaltung XY, bestehend aus einer Kombination mehrere Zähler, erzeugt daraus die aktuelle xy-Position innerhalb der gescannten Fläche. from an XY XY circuit consisting of a combination of a plurality of counter produces the current XY position within the scanned area. Die xy-Information kann auch direkt von der Scan-Einheit SE erzeugt werden, in diesem Falle entfällt die XY-Schaltung XY. The xy information may also be created directly from the scan unit SE, in this case, eliminates the XY-XY circuit.
  • In der Variante mit Histogramm-Bildung werden die Größen x, y, t und λ zur Adressierung eines Speichers SP benutzt. In the variant with histogram formation of the variables x, y, t and λ used for addressing a memory SP. Der Wert des adressierten Speicherplatzes wird bei jedem Photon um eine Einheit erhöht, sodass im Speicher SP die Photonendichte über x, y, t und λ aufgebaut wird. The value of the addressed memory location is incremented at each photon by one unit, so that in the memory SP, the photon density across x, y, t and λ is established.
  • Eine andere Möglichkeit besteht darin, bei jedem Photon die Größen x, y, t und λ in den Speicher SP einzutragen. Another possibility is for each photon, the variables x, y, t and λ entered in the memory SP. Der Speicher SP wird dann als FIFO- (First-In-First-Out) Speicher konfiguriert. The memory SP is then configured as a FIFO (First-In-First-Out) memory. Er dient zur Pufferung der unregelmäßig eingehenden Photonendaten. It is used to buffer the irregular incoming photon data. Der Speicher SP wird kontinuierlich gelesen, sodass ein Datenstrom mit der Information der einzelnen Photonen entsteht. The memory SP is read continuously, so that a data stream with the information of the individual photons produced.
  • Das beschriebene Ausführungsbeispiel kann je nach Anwendung variiert werden. The embodiment described can be varied depending on the application.
  • So kann die gesamte Scan-Anordnung SE einschließlich des XY-Komplexes XY weggelassen werden. Thus, the entire scan assembly SE including the XY-XY complex may be omitted. Man erhält dann eine Einzelpunkt-Messung der Intensität über t und λ. One then obtains a single point measurement of the intensity over t and λ.
  • Wird eine hochempfindlichen Messung von Zweiphotonen-Fluoreszenz-Bildern in den verschiedenen Wellenlängen-Bereichen gewünscht, so kann die Zeitmessung weggelassen werden. Is a highly sensitive measurement of two-photon fluorescence images in different wavelength ranges is desired, the time measurement can be omitted.
  • Eine weitere Variante ergibt sich, wenn der Detektor durch einen einkanaligen Photomultiplier PMT ersetzt wird, wobei dann der Routen R weggelassen wird. A further variant is obtained when the detector is replaced by a single-channel photomultiplier PMT, and then the routes R is omitted. Das Ergebnis sind Fluoreszenz-Bilder für verschiedene Zeiten nach dem Laserimpuls bzw. ein Array von Bildpunkten, die jeweils eine volle Fluoreszenz-Abklingfunktion enthalten. This results in fluorescence images for different times after the laser pulse, or an array of pixels, each containing a full fluorescence decay.
  • Zur Erhöhung des Datendurchsatzes kann der gesamte Elektronik-Teil (Router, CFDs, Zeitmessung, Speicher) mehrfach ausgeführt werden. To increase the data throughput of the entire electronics part (router, CFDs, timing, memory) can be executed multiple times.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Melaninsorten weist zusammenfassend die folgenden Vorteile auf: The inventive method for identification of types of melanin collectively has the following advantages:
    • – Das Verfahren gestattet eine eindeutige Identifizierung ausschließlich unterschiedlicher Melaninsorten. - The method permits a clear identification of different types of melanin exclusively.
    • – Die Messdaten des Verfahrens liegen in Form von Bildern vor. - The measurement data of the process are in the form of images. Bei medizinische Anwendungen finden Bilder eine weitaus höhere Akzeptanz als Einzelpunkt-Messungen. In medical applications find pictures a much higher acceptance as a single-point measurements.
    • – Jedes vom Detektor empfangene Photon wird verarbeitet, wodurch eine maximale Empfindlichkeit realisiert wird. - Each received by the detector photon thereby maximum sensitivity is realized is processed.
    • – Durch die hohe Empfindlichkeit in Verbindung mit einer hohen Laser-Repetitionsrate wird mit relativ geringer Impulsenergie gearbeitet. - Due to the high sensitivity in connection with a high repetition rate laser operating with a relatively low pulse energy. Verglichen mit niedrig repetierenden Lasern hat das Verfahren deshalb einen größeren Sicherheitsabstand zu der Intensitätsschwelle, an der gefährliche Effekte, wie Drei- und Vier-Photonenprozesse oder sogar Plasma-Erzeugung, auftreten. Compared with low repetitive lasers therefore the method has a greater distance to the intensity threshold at which harmful effects, such as three- and four-photon processes or even plasma generation occur.
    • – Die Zwei-Photonen-Anregung findet während des erfindungsgemäßen Verfahrens in nennenswertem Umfang nur im Fokus statt. - The two-photon excitation occurs only in focus during the novel process to a significant extent. Das erlaubt die Aufnahme von Schnittbildern in verschiedenen Tiefen der untersuchten Materialprobe. This allows the inclusion of cross sections at different depths of the studied sample.
    • – Die Zeitauflösung wird nur von der Laufzeitstreuung in Detektor bestimmt. - The time resolution is determined only by the delay spread in the detector. Diese ist gewöhnlich etwa 10 mal kleiner als die Impulsbreite der Photonenimpulse. This is usually about 10 times smaller than the pulse width of photon pulses. Die Auflösung ist deshalb 10 mal besser als beim Einsatz des gleichen Detektors im Analog-Betrieb. The resolution is therefore 10 times better than when using the same detector in analog mode.
    • – Durch Variation der Scan-Parameter kann die Anzahl der Bildpunkte beliebig verändert werden. - By varying the scan parameters, the number of pixels can be changed. Gleichzeitig kann die Auflösung der Zeitmessung verändert werden, indem Zeitkanäle zusammengefasst werden. At the same time, the resolution of the timing can be changed by time channels are combined. Auch benachbarte Wellenlängen-Kanäle können beliebig zusammengefasst werden. Also adjacent wavelength channels can be combined arbitrarily. Dadurch sind sowohl hochaufgelöste Bilder mit moderater Zeitauflösung als auch zeitliche Präzisionsmessungen einer geringeren Anzahl von Bildpunkten möglich. This produce high-resolution images with moderate time resolution and temporal precision measurements of a smaller number of pixels are possible.
    • – Durch die Aufzeichnung des vollen xyt-λ-Datensatzes können die Fluoreszenz-Komponenten unterschiedlicher Fluorophore anhand ihrer unterschiedlichen Spektren und Abklingzeiten gut getrennt werden. - By recording the full xyt λ record the fluorescence components of different fluorophores can be well separated by their different spectra and decay times.

Claims (5)

  1. Verfahren zur Identifizierung von natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Melaninsorten, insbesondere von Eumelanin und Pheomelanin, umfassend die Verfahrensschritte Anregung des die Melaninsorten aufweisenden Materials mit Laserimpulsen im fs-Bereich mittels Absorption von Photonen und spektral aufgelöste Detektion des von der entnommenen oder synthetisch hergestellten Materialprobe emittierten Fluoreszenzlichts, wobei das von den in der Materialprobe vorhandenen Melaninsorten emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig zur spektralen Detektion auch zeitlich aufgelöst detektiert wird und anschließend aus der spektralen Verteilung der Fluoreszenz und aus der Fluoreszenz-Abklingfunktion die in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt werden und wobei in der zu untersuchenden Materialprobe die Fluoreszenz sowohl mittels Ein-Photonen-Absorption als auch mittels stufenweiser Zwei-Photonen-Absorption erzeugt, die Ergebnisse verglichen und die Melanins A method for the identification of naturally occurring or synthetic melanin locations, in particular of eumelanin and pheomelanin, comprising the steps of excitation of the types of melanin-containing material with laser pulses in the femtosecond region by means of absorption of photons and spectrally resolved detection of light emitted from the extracted or synthetically prepared material sample fluorescent light wherein the fluorescent light emitted from the existing in the material sample melanin locations is detected simultaneously dissolved for spectral detection of even time and are then determined from the spectral distribution of the fluorescence and from the fluorescence decay function present in the tested material sample melanin locations, and wherein to be examined in the material sample generates fluorescence, either by means of one-photon absorption and by means of gradual two-photon absorption, the results are compared and the melanin orten bestimmt werden. locations are determined.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich die räumliche Verteilung der Fluoreszenz der in der untersuchten Materialprobe vorhandenen Melaninsorten bestimmt wird. The method of claim 1, wherein in addition, the spatial distribution of the fluorescence present in the tested material sample melanin locations is determined.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Histogramm der Photonendichte des emittierten Fluoreszenzlichts über der Wellenlänge und der Zeit innerhalb des Fluoreszenz-Abklingens und der untersuchten Materialfläche erstellt wird. The method of claim 1, wherein a histogram of photon density of the emitted fluorescent light over the wavelength and time is created within the fluorescence decay and the examined material surface.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes einzelne Photon des emittierten Fluoreszenzlichts die Wellenlänge und die Zeit innerhalb der Fluoreszenz-Abklingfunktion und der Ort innerhalb der untersuchten Materialfläche bestimmt werden und der entstehende Datenstrom on-line oder off-line analysiert wird. A method according to claim 1, characterized in that the wavelength and the time within the fluorescence decay function and the location to be determined within the examined material surface for each photon of the fluorescent light emitted and the resulting data stream is analyzed on-line or off-line.
  5. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Ermittlung von malignem Melanom-Gewebe in entnommener Haut. Use of the method according to any one of claims 1 to 4 for detecting malignant melanoma tissue of removed skin.
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