DE10217035A1

DE10217035A1 - Rekrutierungsmodule von RhoA und RhoC

Info

Publication number: DE10217035A1
Application number: DE2002117035
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Adam
Original assignee: Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2004-01-22

Abstract

Die Erfindung betrifft Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC und ihre Verwendung zur Darstellung typspezifischer Membrandomänen, zur Markierung RhoA- bzw. RhoC-typischer Zytoplasmamembrandomänen, zur Membranadressierung, zur isoformtypischen Inhibition des endogenen Proteins, ferner zur typspezifischen Inhibition von RhoA und RhoC sowie zum Transport von Fusionsproteinen an Rho-typische Membrandomänen. Medizinische Anwendungsgebiete der Erfindung liegen in einer Inhibition der Metastasierung von Melanomen und in einer Inhibition der Invasion sowie der Neo-Angiogenese bei Inflammatorischem Brustkrebs.

Description

Die Erfindung betrifft Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Darstellung typspezifischer Membrandomänen, zur Markierung RhoA- bzw. RhoC-typischer Zytoplasmamembrandomänen, zur Membranadressierung, zur isoformtypischen Inhibition des endogenen Proteins, ferner zur typspezifischen Inhibition von RhoA und RhoC sowie zum Transport von Fusionsproteinen an Rho-typische Membrandomänen. Medizinische Anwendungsgebiete der Erfindung liegen in einer Inhibition der Metastasierung von Melanomen und in einer Inhibition der Invasion sowie der Neo-Angiogenese bei Inflammatorischem Brustkrebs.

Bei Zytoskelettrearrangements während der Invasion von Shigellen in Epithelzellen spielen kleine GTP-bindende-Proteine (G-Proteine; auch GTPasen, Abkürzungsverzeichnis hinter den Beispielen) der Rho-Familie eine besondere Rolle als Mittler zwischen Signaltransduktion und Zytoskelettveränderungen. Die wichtigsten Proteine dieser Familie sind CDC42, Rac und Rho selbst, die wiederum zum Teil in verschiedenen Isoformen vorliegen. Soweit untersucht, werden sämtliche an der bakteriellen Invasion beteiligten kleinen G-Proteine auch an den Ort des Eindringens des Bakteriums rekrutiert¹. Im Rahmen von Studien zur Proteinlokalisation ist ein deutlicher Unterschied der Rekrutierungsmuster von Rho-Isoformen gefunden worden. So konnte insbesondere gezeigt werden, dass RhoA peribakteriell akkumuliert, während RhoC in die Spitzen zellulärer Protrusionen rekrutiert wird². Diesem grundsätzlichen Verteilungsmuster folgen auch andere Vertreter der Rho-Familie³. RhoA und RhoC werden posttranslational dergestalt modifiziert, dass die 3 C-terminalen Aminosäuren abgespalten werden und das dann C-terminale Zystein geranylgeranyliert wird. Weiter kommt es zur Carboxymethylierung des Zysteins. Die Geranylgeranylierung ist Voraussetzung für die Membranbindung der Proteine. Im Zytoplasma bindet der lipophile C-Terminus der Rho-Proteine an eine hydrophobe Tasche von RhoGDI (GDI=GTPase dissociation inhibitor). Nach gängiger Vorstellung bindet inaktives, Guanosindiphosphat (GDP)-gebundenes Rho im Zytoplasma an RhoGDI, wobei RhoGDI den Austausch von GDP durch GTP (Guanosin-Triphosphat) inhibiert. Die Aktivierung erfolgt dann durch GEFs (GDP/GTP exchange factors), die das G-Protein in den aktiven, GTP-gebundenen Zustand versetzen. GTPgebundenes Rho bindet schlechter an RhoGDI, wodurch der Übergang von der Bindung an RhoGDI zur Bindung an die Membran begünstigt wird⁴. Die Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC sind typisch, aber nicht spezifisch für diese Isoformen. So kann das Shigella- induzierte Rekrutierungsmuster von RhoC nicht vom Rekrutierungsmuster von RhoB unterschieden werden². Insofern stellen RhoA und RhoC Prototypen der Shigella-induzierten Proteinrekrutierung dar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC zu beschreiben und der medizinisch-biologischen Forschung sowie neuen Therapieansätzen zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass basierend auf einer Primärstrukturanalyse der Rho-Isoformen A und C (1) mittels gezieltem Austausch von Aminosäuren (site-directed mutagenesis) mutierte und mit einem Peptid-Marker (tag) versehene Rho-Proteine auf ihre Rekrutierungseigenschaft in einem Shigella-Invasionsmodell von Epithelzellen zur Verfügung gestellt wurden.

Die erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule bestehen aus den Aminosäuren 181-193 der Isoformen RhoA und RhoC. Die Aminosäuresequenzen lauten wie folgt:
Rekrutierungsmodul von RhoA: ARRGKKKSGCLVL
Rekrutierungsmodul von RhoC: VRKNKRRRGCPIL
Dabei bestimmen die jeweils ersten 9 Aminosäuren das Rekrutierungsmuster.

Die erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule bestehen aus je zwei Teilen. Die Aminosäuren 1-9 determinieren das Rekrutierungsmuster, die 4 C-terminalen Aminosäuren sind notwendig für eine posttranslationale Modifikation (Prenylierung), die eine Voraussetzung für die Membranbindung⁵ und für die Rekrutierung in dem erfindungsgemäßen System darstellt. Das vollständige Modul kann in zellulären Systemen, in zellfreien Systemen auf biochemischem Wege oder chemisch hergestellt werden. Je nach Anwendung werden die Rekrutierungsmodule als Teil eines Fusionsproteins mit beliebigem Fusionspartner in zellulären Systemen hergestellt. Hier wird der enzymatische Apparat einer Zelle zur Herstellung eines Rekrutierungsmoduls verwendet. Dabei wird mittels Transformation oder Transfektion ein Nukleinsäurekonstrukt, welches für das Rekrutierungsmodul kodiert, in die Zelle eingebracht. Die Expression des Konstrukts in der Zelle wird in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Zelle (humane Zelle, Pilzzelle etc.) durch beschriebene Regulationseinheiten des Konstrukts gesteuert (z.B.: entspr. Promotoren etc.). Für die gesamte Herstellung des Moduls werden publizierte Standardmethoden der Molekularbiologie verwendet (6).

Die Expression der Konstrukte mit den erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodulen von RhoA bzw. RhoC kann sowohl transient als auch permanent erfolgen. Zur Herstellung permanent exprimierender Zellen wird das Konstrukt in einen Vektor kloniert, der einen Selektionsmarker trägt. Die Realisierbarkeit der Herstellung stabil exprimierender Zellen wurde durch stabile Expression der erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule als EGFP-Fusionsproteine in HeLa-Zellen (erhältlich bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig; Best.-Nr.: ACC57) gezeigt, wobei EGFP-C1 (Becton Dickinson Clontech, Best.-Nr.: 6084-1) als Vektor verwendet wurde. Die Rekrutierungsmodule (Aminosäuren 181-193 von RhoA bzw. RhoC) wurden in die Restriktionsschnittstellen EcoRI und BamHI des Vektors einkloniert, HeLa-Zellen anschließend mit dem Konstrukt transfiziert und permanent exprimierende Zellen mit 0,9 mg/ml G418 (Becton Dickinson Clontech Best.-Nr.: 8056-1) selektiert.

Eine Biosynthese des Rekrutierungsmoduls in kommerziell erhältlichen zellfreien Systemen (z.B.: Fa. Roche, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Best.-Nr.: 1103032) ist ebenfalls möglich.

Ebenso kommt die Synthese des prenylierten Peptids auf chemischem Wege in Frage. Dazu werden die Aminosäuren 181-190 von RhoA bzw. RhoC nach bereits publizierten Methoden zunächst synthetisiert und das C-terminale Zystein (Aminosäure 190) anschließend prenyliert⁶.

Erfindungsgemäß geht es um ein Modul zur Adressierung zweier Membrandomänen, die durch die Shigella-induzierte, isoformtypische Rekrutierung des kleinen G-Proteins Rho charakterisiert sind (RhoA-Domäne bzw. RhoC-Domäne). Dieses Modul erlaubt zum einen die isoformtypische Darstellung dieser Zytoplasmamembrandomänen, zum anderen kann eine isoformtypische Inhibition des endogenen Proteins erfolgen.

Da das Modul die komplette Information für den Rekrutierungsvorgang enthält, kann es zusätzlich dazu verwendet werden, andere Proteine an diese Membrandomänen zu schleusen (z.B.: GFP-Fusionsprotein). Daraus ergibt sich ein breites Anwendungsgebiet für diese 'Membranadressierung'.

Erfindungsgemäß ist das Rekrutierungsmodul von RhoA in einem Shigellen-Infektionsmodell beschrieben worden, was zu folgenden Ergebnissen geführt hat (RhoA und RhoC haben 193 Aminosäuren, AS) (s. Tabelle 1 sowie die 1-4):

1. Das prä-C-terminale Phosphorylierungsmotiv von RhoA, welches durch die Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert werden kann (PKA-site; Phosphorylierung von Ser188), hat keine Bedeutung für die Rekrutierung
2. Der Aktivitätszustand von RhoA hat keine Bedeutung für die Rekrutierung (dominant aktive und dominant inaktive Mutanten werden gleich rekrutiert)
3. Die C-terminale CAAX-Box (AS190-193) ist essentiell für die Rekrutierung
4. Die C-terminale CAAX-Box determiniert nicht das Rekrutierungsmuster
5. Die prä-C-terminalen Aminosäuren 181-189 determinieren das Rekrutierungsmuster von RhoA und von RhoC (Rekrutierungsmotiv
6. Der das prä-C-terminale Rekrutierungsmotiv und die CAAX-Region umfassende Cterminus von RhoA oder RhoC (Aminosäuren 181-193) reicht aus, um einem nicht-involvierten Protein (EGFP und Derivate) die entsprechende Rekrutierbarkeit zu vermitteln.
7. HeLa-Zelllinien können kreiert werden, die permanent ein Fusionsprotein bestehend aus EGFP und dem erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodul von RhoA oder RhoC exprimieren.

Während die Punkte 1-5 für das Verständnis der Physiologie der Rho-Proteine wichtig sind, bringt Punkt 6 überraschenderweise eine zusätzliche Qualität: Wenn die unterschiedlichen Membrandomänen, die durch das Verteilungsmuster von RhoA und RhoC charakterisiert sind, wichtig sind für zelluläre Funktionen, ist es von Interesse, diese Membrandomänen zu visualisieren. Darüber hinaus wird damit eine isoformtypische kompetitive Inhibition von Rho-Isoformen an der Zytoplasmamembran möglich, bei der zytoplasmatische Funktionen von anderen Rho-Isoformen nicht beeinträchtigt werden. Über unterschiedliche Funktionen von RhoA und RhoC gibt es bisher nur geringe Kenntnisse. Allerdings scheint RhoC in besonderer Weise mit der Metastasierung maligner Tumore assoziiert zu sein. So wurden in einem Metastasierungsmodell des Melanoms Transkriptionsprofile stark vs. schwach metastasierender Zellen verglichen⁷. Dabei stellte sich heraus, dass die stark metastasierenden Zellen u.a. mehr RhoC transkribieren. Zur Überprüfung der Hypothese, dass RhoC ein Metastasierungsfaktor sein könnte, wurden die schwach metastasierenden Zellen mit RhoC und RhoA transfiziert. Dabei erhielt man bei den RhoC-transfizierten Zellen eine deutlich stärkere Erhöhung der Metastasierungsrate als bei den RhoA-transfizierten Zellen. Eine kompetitive Hemmung von RhoC wäre also ein gentherapeutischer Ansatz zur Verringerung der Metastasierung des Melanoms. Eine weitere Funktion von RhoC scheint die Förderung der Invasivität sowie die Stimulierung der Angiogenese bei inflammatorischen Brustkrebszellen zu sein^8; ^8; ⁹. Aufgrund der durch den erfindungsgemäßen Ansatz möglichen Beschränkung der Inhibition auf membrangebundenes RhoC ist zu erwarten, dass die Nebenwirkungen einer solchen Strategie geringer sind als bei Inhibition aller Rho-Isoformen. Da das erfindungsgemäß beschriebene Motiv für die komplette Rekrutierung kodiert, ist auch eine Fusion des Motivs mit Enzymen möglich, die über die Membranadressierung an den gewünschten Wirkort lokalisiert werden.

Die zweite Bedeutung der erfindungsgemäßen Ergebnisse liegt darin, dass erstmals ein Marker von RhoA- bzw. RhoC-spezifischen Membrandomänen vorliegt. Solche subzellulären Marker für Endoplasmatisches Retikulum (ER), Golgi, Mitochondrien etc. werden von der Fa. Becton Dickinson Clontech (Tullastr. 4, 69126 Heidelberg) bereits kommerziell vertrieben (6907-1, 6908-1, 6903-1). Von besonderem Interesse ist daher die RhoA- bzw. RhoC-typische Markierung von Zytoplasmamembrandomänen im Vergleich zu einem globalen Zytoplasmamembranmarker (z.B.: Becton Dickinson Clontech 6918-1).

Die erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule erlauben

a) Markierung RhoA- bzw. RhoC-typischer Zytoplasmamembrandomänen
b) Typspezifische kompetitive Inhibition von RhoA oder RhoC
c) Intrazellulären Transport beliebiger enzymatischer Funktionen (Enzyme oder deren funktionelle Untereinheiten) an die RhoA- bzw. RhoC-typischen Membrandomänen zur lokalisierten Beeinflussung von Membraneigenschaften.

Die erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC eignen sich also zur Darstellung einer RhoA- bzw. RhoC-typischen Membrandomäne, zur typspezifischen Inhibition von RhoA oder RhoC sowie zum Transport eines beliebigen Proteins an die typspezifische Membrandomäne.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich aus bekannten Elementen – den Proteine RhoA und RhoC – und neuen Elementen – typspezifischen Membrandomänen, typspezifische Inhibition von RhoA und RhoC, Transport von Fusionsproteinen an Rho-typische Membrandomänen sowie Membranadressierung – zusammen, die in ihrer Kombination zu den erfindungsgemäßen neuen vorteilhaften Rekrutierungsmodulen und dazu führen, dass erstmals Marker von RhoA- bzw. RhoC-spezifischen Membrandomänen vorliegen.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Rekrutierungsmodule liegt darin, dass sie sich zur

– Darstellung typspezifischer Membrandomänen
– Markierung RhoA- bzw. RhoC-typischer Zytoplasmamembrandomänen
– Herstellung von Markern von RhoA- bzw. RhoC-spezifischen Membrandomänen sowie zur
– typspezifischen Inhibition von RhoA und RhoC eignen, des weiteren zum
– Transport von Fusionsproteinen an Rho-typische Membrandomänen und
– intrazellulären Transport beliebiger enzymatischer Funktionen (Enzyme oder deren funktionelle Untereinheiten) an die RhoA- oder RhoC-typischen Membrandomänen zur lokalisierten Beeinflussung von Membraneigenschaften.

Die erfindungsgemäße Verwendung liegt des weiteren in einer Inhibition der Metastasierung von Melanomen sowie in der Inhibition einer Invasion sowie einer Neo-Angiogenese bei Inflammatorischem Brustkrebs.

Ein weiteres Anwendungsgebiet betrifft die Verwendung der Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC zur Membranadressierung, insbesondere zur Adressierung zweier Membrandomänen, die durch isoformtypische Rekrutierung des kleinen G-Proteins Rho charakterisiert sind (RhoA-Domäne, RhoC-Domäne).

Weitere Verwendungen liegen in der Eignung

– zur isoformtypischen Darstellung von Zytoplasmamembrandomänen
– zur isoformtypischen Inhibition des endogenen Proteins
– zur Schleusung anderer Proteine an Membrandomänen sowie
– zur Vermittlung der Rekrutierbarkeit nicht-involvierter Proteine.

Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sind dadurch gekennzeichnet, dass man sich

– der das Rekrutierungsmuster von RhoA und von RhoC determinierenden prä-C-terminalen Aminosäuren 181-189 als Rekrutierungsmotiv oder
– des das prä-C-terminale Rekrutierungsmotiv und die CAAX-Region umfassenden C-Terminus von RhoA oder RhoC (Aminosäuren 181-193) bedient.

Weitere Verwendungen bestehen in der Eignung zur Fusion des Motivs mit Enzymen sowie zur Fusion des Motivs mit Enzymen, die über die Membranadressierung an den gewünschten Wirkort lokalisiert werden.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele

1. Markierung RhoA-typischer Membrandomänen (4)

a) Herstellung eines Marker-Konstrukts, das die erfindungsgemäßen Rekrutierungsdeterminanten enthält, am Beispiel von RhoA

sMittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und unter Verwendung weiterer Standardmethoden der Molekularbiologie¹⁰ wird folgendes Konstrukt in dem kommerziellen Vektor pEGFP-C1 (Becton Dickinson Clontech Nr. 6084-1) hergestellt; angegeben sind die beispielhaft gegebenen Restriktionsschnittstellen EcoRI und BamHI, sowie die wesentlichen Molekülbestandteile:

A – EcoRI – B – Stop – BamHI,

wobei A: Nukleotidsequenz, die für EGFP kodiert (ist bereits in kommerziell verfügbarem Vektor enthalten), B: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoA (AS 181-193) kodiert, 'Stop': Stopp-Kodon.

b) Transfektion von HeLa-Zellen und Stimulation der isoformtypischen Akkumulation von Rho in Membrandomänen (clustering)

Die Transfektionsmethode ist beliebig; beispielhaft kann mit der Kalziumphosphat-Methode transfiziert werden² oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Transfektionsreagenzien (z.B.: DAC-30, Eurogentec Deutschland, Cäcilienstrasse 46, 50667 Köln, Nr.: TR-0030-01; Transfektion nach Herstellerangaben). Nach transienter Transfektion und Expression des Konstrukts in HeLa-Zellen erfolgt die Stimulation des Rho-clustering beispielsweise durch Infektion mit Shigella flexneri nach beschriebenen Protokollen ².

c) Optische Darstellung der RhoA-typischen Membrandomänen

Die RhoA-typischen Membrandomänen können dann entweder im nativen Präparat direkt oder nach Fixierung mit Formaldehyd² fluoreszenzoptisch dargestellt werden. Dazu wird ein Fluoreszenzmikroskop mit einem für den Marker geeigneten Filtersatz verwendet. Beispielhaft kann ein Zeiss Axiovert (Carl Zeiss Mikroskopie, Königsallee 9-21, 37081 Göttingen) als Fluoreszenz-Mikroskop mit dem Filtersatz Nr. 13 (Zeiss) eingesetzt werden. Der Fluoreszenz-Farbstoff (hier beispielhaft EGFP) wird fluoreszenzoptisch dargestellt. Da der Fluoreszenzfarbstoff Teil eines Fusionsproteins mit dem Rekrutierungsmodul von RhoA ist und die Rekrutierung dieses Moleküls nur durch das Rekrutierungsmodul von RhoA bestimmt wird (EGFP wird nicht rekrutiert), stellt der Fluoreszenzfarbstoff die isoformtypische Membrandomäne für RhoA dar. Soll ausgeschlossen werden, dass das endogene Protein durch Kompetition inhibiert wird, werden schwach exprimierende Zellen zur Analyse ausgesucht.

2. Markierung RhoC-typischer Membrandomänen (4)

a) Herstellung eines Marker-Konstrukts, das die erfindungsgemäße Rekrutierungsdeterminante von RhoC enthält

Vorgehensweise wie in 1. a) beschrieben, wobei hier allerdings das RhoC-Rekrutierungsmodul an EGFP fusioniert wird, was zu folgendem Konstrukt führt:

A – EcoRI – C – Stop – BamHI,

wobei A: Nukleotidsequenz, die für EGFP kodiert (ist bereits in kommerziell verfügbarem Vektor pEGFP-C1 enthalten), C: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoC (AS 181-193) kodiert, 'Stop': Stopp-Kodon.

Wie in 1. b) beschrieben, wobei hier das analoge RhoC-Konstrukt wie in 2. a) beschrieben zur Transfektion verwendet wird.

c) Optische Darstellung der RhoC-typischen Membrandomänen

Die Vorgehensweise ist analog zu der in 1. c) für die RhoA-typischen Membrandomänen beschriebenen Methode.

3. Darstellung von RhoA- und RhoC-typischen Membrandomänen in derselben Zelle (4)

Durch geeignete Wahl des Markersystems gelingt auch die Darstellung von RhoA- typischen und RhoC-typischen Membrandomänen in derselben Zelle.

a) Herstellung von Marker-Konstrukten, wobei die erfindungsgemäßen Rekrutierungsdeterminanten von RhoA und RhoC an unterschiedliche Fluoreszenzmarker gekoppelt werden

Als Marker werden beispielhaft die kommerziell verfügbaren GFP-Varianten ECFP und EYFP verwendet (BD-Clontech, Nr. 6076-1 und 6005-1). Dabei handelt es sich um fluoreszierende Moleküle mit Absorptions- und Emmissionsspektren, die mit geeigneten Filtersätzen voneinander zu trennen sind. Die Herstellung der Konstrukte erfolgt analog zu der Methode in 1. a), wobei folgende Konstrukte entstehen:

D – EcoRI – B – Stop – BamHI

E – EcoRI – C – Stop – BamHI,

wobei D: ECFP (in kommerziell verfügbarem Vektor enthalten), B: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoA (AS 181-193) kodiert, 'Stop': Stopp-Kodon.; E: EYFP (in kommerziell verfügbarem Vektor enthalten), C: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoC (AS 181-193) kodiert.

Die Transfektion erfolgt wie in 1. b) beschrieben, wobei jedoch eine Mischung aus beiden in a) beschriebenen Konstrukten verwendet wird (Doppeltransfektionen mit Kalziumphosphattechnik wie beschrieben in ³; Doppeltransfektionen bei Verwendung von DAC-30 (Eurogentec) nach Herstellerangaben).

c) Optische Darstellung RhoA- und RhoC-typischer Membrandomänen in derselben Zelle

Die Darstellung erfolgt im Prinzip wie in 1. c) angegeben, wobei allerdings andere Fluoreszenzfilter zur Anwendung kommen: Sollen die beiden Membrandomänen nacheinander betrachtet werden, kann für ECFP der Filtersatz F31-044 und für EYFP der Filtersatz F41-028 (AHF Analysentechnik AG, Kohlplattenweg 18, 72005 Tübingen) verwendet werden.

4. Simultane Darstellung von RhoA- und RhoC-typischen Membrandomänen

Die gleichzeitige Darstellung von RhoA- und RhoC-typischen Membrandomänen erfolgt wie in 3. beschrieben; allerdings wird für die optische Darstellung der Filtersatz F51-017 (AHF Analysentechnik) verwendet.

5. Darstellung der Lagebeziehung von RhoA- bzw. RhoC-typischen Membrandomänen zu anderen Strukturen der Zelle oder zu Surrogatmarkern (2, 3)

Durch geeignete Wahl von Markern können die isoformtypischen Membrandomänen in räumlichem Bezug zu anderen Faktoren dargestellt werden. Beispielhaft wird hier die Darstellung der Lagebeziehung zwischen Rho-Domänen, Bakterien und F-Aktin in fixierten Zellen beschrieben. Die Zahl der hintereinander oder simultan darstellbaren Faktoren ist lediglich durch die Zahl voneinander unterscheidbarer und für die darzustellenden Faktoren verwendbarer Marker limitiert. EGFP-Marker eigenen sich auch zur Darstellung von Rho-Membrandomänen in nativen, nicht-fixierten Zellen (vgl. 1. c)); zur parallelen Markierung anderer Zellbestandteile in lebenden Zellen muss jeweils ein zellgängiger Marker für diesen Zellbestandteil eingesetzt ¹¹ oder der Marker auf anderem Wege (z.B. Koimport mit Träger-Molekülen: 5-23731 oder 5-23734, Molecular Probes, für Import von markierten Phosphoinositiden) in die Zelle gebracht werden.

a) Herstellung von EGFP-Fusionsproteinen mit den Rekrutierungsmodulen von RhoA bzw. RhoC

Die Herstellung der Konstrukte erfolgt wie in 1. a) und 2. a) beschrieben.

Die Transfektion und Stimulaiton der Epithelzellen erfolgt wie in 1. b) bzw. 2. b) beschrieben.

c) Optische Darstellung der Lagebeziehung zwischen isoformtypischen Membrandomänen von RhoA oder RhoC, Bakterien und F-Aktin

c1) Zweidimensionale Darstellung

Hierfür kann konventionelle Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Die Präparate werden zunächst fixiert und permeabilisiert ³, anschließend werden Bakterien mit spezifischen Antikörpern und blau-markierten Sekundärantikörpern ³ sowie F-Aktin mit einem rot fluoreszierenden Farbstoff nach Herstellerangaben (A-12381, Molecular Probes Europe BV, PoortGebouw, Rijnsburgerweg 10, 2333 AA Leiden, Niederlande) angefärbt. Damit kommen die RhoA- oder RhoC-typische Membrandomäne grün (EGFP), Bakterien blau und F-Aktin rot fluoreszenzoptisch zur Darstellung, wobei hierfür beispielhaft ein Axiovert (Zeiss) Fluoreszenzmikroskop mit den Filtersätzen Nr. 01/Zeiss (Best.-Nr.: 488001-0000) für Bakterien, Nr. 13/Zeiss (Best.-Nr.: 488013-0000) für EGFP und Nr. 00/Zeiss (Best.-Nr.: 488000-0000) für die F-Aktin-Markierung verwendet wird.

c2) Dreidimensionale Darstellung

Nach Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der Zellen wie in c1) beschrieben kommt ein spezielles mikroskopisches Verfahren für die 3D-Darstellung zur Anwendung: Dabei werden Bildstapel mit definierten Abständen der Fokusebenen mit einer Digitalkamera aufgenommen und anschließend mit einem Dekonvolutionsprogramm bearbeitet ³. Das Verfahren erlaubt eine 3D-Darstellung der Lagebeziehung zwischen den jeweils grün gefärbten isoformtypischen Rho-Domänen und rot angefärbtem F-Aktin.

Alternativ kann auch ein Laser Scanning-Mikroskop verwendet werden (verschiedene kommerzielle Anbieter; z.B.: Zeiss, LSM 510 Meta).

6. Simultane Darstellung von Rho-typischen Membrandomänen und anderen Zellbestandteilen oder Surrogatmarkern

Hierfür eignen sich die Verfahren, die in 5. beschrieben wurden, wobei allerdings Doppelbandpass-Filtersätze (bei Darstellung von 2 Faktoren) oder Trippelbandpass-Filtersätze (bei Darstellung von 3 Faktoren) zur optischen Darstellung der verschiedenen Faktoren verwendet werden. Zur Darstellung von EGFP-markierten Rho-Membrandomänen, blau markierten Bakterien und rot gefärbtem F-Aktin wie in 5. beschrieben, kann z.B. der Trippelbandpass-Filtersatz Nr. 40/Zeiss (Best.-Nr.: 488040-0000) eingesetzt werden.

7. Verwendung stabil exprimierender Zellen zur Markierung Rho-typischer Membrandomänen

Mit den in 1. a) beschriebenen Konstrukte können auch stabil exprimierende Zellen hergestellt werden. Dazu werden beispielhaft HeLa-Zellen mit den in 1. b) beschriebenen Konstrukten transfiziert. Durch Selektion mit 0,9 mg/ml G418 können Zellen hergestellt werden, die das jeweilige Konstrukt permanent exprimieren. Bei Bedarf können einzelne Zellklone durch Reklonieren mittels 'limited dilution' hergestellt werden. Dabei werden die Zellen bei einer Zellpassage nach dem Trypsinieren in einer Zählkammer gezählt und so stark verdünnt, dass bei der Subkultur in 96-Loch-Zellkulturschalen statistisch nur 0,1 Zellen pro Loch beimpft werden. Dieses Verfahren kann bei Bedarf wiederholt werden. Damit erzielt man Zellklone, die direkt im Fluoreszenzmikroskop auf Expression des Konstrukts untersucht werden können. Diese Zellen oder Zellklone können nun beliebig stimuliert und als Testsystem für die Markierung isoformtypischer Membrandomänen von Rho verwendet werden. Beispielhaft kann durch Infektion mit Shigella stimuliert werden, wie in 1. b) beschrieben. Der Vorteil stabil exprimierender Systeme besteht u.a. darin, dass die Markersysteme nicht mehr für jeden Stimulations-assays selbst hergestellt werden müssen. Damit geht eine erhebliche Einsparung an Zeit und Kosten einher. Mit den in 1. a) und 1. b) beschriebenen Konstrukten stabil transfizierte HeLa-Zellen können zur Verfügung gestellt werden.

8. Transport beliebiger Proteine an die isoformtypischen Membrandomänen von Rho (4)

So wie in 1. und 2. das Markermolekül EGFP als Fusionsprotein mit dem Rekrutierungsmodul von RhoA bzw. RhoC nach Stimulation wie RhoA oder RhoC selbst rekrutiert wird, sollten beliebige andere Proteine nach Fusion mit einem Rho-Rekrutierungsmodul ebenfalls an die isoformtypischen Membrandomänen von Rho rekrutieren.

8.1. Lokalisierter Einsatz von Inhibitoren

RhoGAP sind Aktivatoren der intrinsischen GTPase-Aktivität von Rho-Proteinen. Es ist gezeigt worden, dass das RhoGAP-Modul von dem Klasse IX-Myosin Myr5 in-vitro zwar RhoA, RhoB und RhoC ähnlich inhibiert; allerdings kolokalisiert Myr5 nach Stimulation mit RhoC, nicht aber mit RhoA ³. Damit kommt das RhoGAP-Modul von Myr5 in-vivo als Inhibitor von RhoC, nicht aber als Inhibitor von RhoA in Betracht, obwohl biochemisch (in-vitro) eine Interaktion von Myr5 und RhoA möglich ist. Damit wird in-vivo die Spezifität der Interaktion von Myr5 mit Rho Isoformen auch durch das Rekrutierungsverhalten mitbestimmt. Dieser physiologische Feinregulierungsmechansimus biochemisch möglicher Interaktionen zwischen Molekülen durch Steuerung der Rekrutierungseigenschaften (Interaktion setzt Kolokalisation voraus) kann nun mit den erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodulen von RhoA und RhoC gezielt eingesetzt werden. Beispielhaft kann das RhoGAP-Modul von Myr5 mit dem RhoA-Rekrutierungsmodul als Fusionsprotein exprimiert und damit – im Gegensatz zu dem kompletten Protein – auch in-vivo als Inhibitor von RhoA eingesetzt werden.

Die Herstellung des Konstrukts erfolgt in Analogie zu den EGFP-Fusionsproteinen wie beschrieben in 1. a) und 2. a). Die RhoGAP-Domäne umfasst die Nukleotide 4987-5571 von Myr5 wie beschrieben ^12;13. Das RhoGAP-Modul von Myr5 (Nukleotide 4987-5571 ³) wird mittels molekularbiogischer Standardmethoden beispielhaft mit dem Rekrutierungsmodul von RhoA fusioniert:

EcoRI – A – BamHI – B – Stop – SmaI, wobei

A: Nukleotide 4987-5571 von myr5; sie kodieren für das RhoGAP-Modul von Myr5
B: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoA (AS 181-193) kodiert,
'Stop': Stopp-Kodon.

Das Konstrukt wird beispielhaft in pCI-neo (Promega GmbH, High-Tech-Park, Schildkrötenstr. 15, 68199 Mannheim, Best.-Nr.: E 1841) kloniert. Transfektion und Expression erfolgen wie in 1. b) angegeben. Nach Stimulation wird das RhoGAP an die RhoA-typische Membrandomäne rekrutiert und kann so RhoA lokal antagonisieren. Durch die Fusion mit dem RhoA-Rekrutierungsmodul erhält das RhoGAP-Modul von Myr5 eine Eigenschaft, die das Holoprotein nicht hat, da das Fusionsprotein im Gegensatz zum Holoprotein nicht wie RhoC ³, sondern wie RhoA rekrutiert werden sollte. Als Variante kann analog auch folgendes Konstrukt in pEGFP-C1 (BD Clontech) hergestellt werden:

C – EcoRI – A – BamHI – B – Stop – XbaI, wobei

C: EGFP, bereits in Vektor enthalten A: Nukleotide 4987-5571 von myr5; sie kodieren für das RhoGAP-Modul von Myr5
B: Nukleotidsequenz, die für das Rekrutierungsmodul von RhoA (AS 181-193) kodiert,
'Stop': Stopp-Kodon. Durch die zusätzliche Fusion von EGFP kann die Relokalisation dieses Konstrukts leicht fluoreszenzoptisch verfolgt werden (vgl. 1. c)). Dieses Prinzip kann auf beliebige Protein- oder Peptid-Inhibitoren übertragen werden. Durch die lokale Akkumulation in den Rho-typischen Membrandomänen ist zu erwarten, dass solche Inhibitoren wie am hier beschriebenen Beispiel neue Eigenschaften erhalten, aber auch unerwünschte Eigenschaften verlieren. Sollte beispielhaft eine Inhibition von RhoC oder eines anderen Moleküls, das mit der RhoC-typischen Membrandomäne kolokalisiert, zu einer unerwünschten Wirkung einer Inhibition führen, kann mit dem erfindungsgemäßen System Aktivität durch Fusion mit dem RhoA-Rekrutierungsmodul gezielt auf die RhoA-typische Membrandomäne lokalisiert werden.

8.2. Konzentration beliebiger enzymatischer Aktivitäten an den isoformtypischen Membrandomänen von RhoA bzw. RhoC

In Analogie zum Transport des in 8.1. beschriebenen RhoGAP-Moduls von Myr5 an die RhoA-typische Membrandomäne können beliebige enzymatische Aktivitäten (Module) durch Fusion mit den erfindungsgemäßen Rho-Rekrutierungsmodulen an die Rho-Membrandomänen transloziert werden. Auf diese Weise sollten Membraneigenschaften und membrannahe Prozesse lokal zu beeinflussen sein. Beispielhaft wird ein PhospholipaseD-Konstrukt mit dem Rekrutierungsmodul von RhoA oder RhoC fusioniert. Phospholipase D (PLD) spielt eine wichtige, die Funktion von Rho ergänzende, Rolle bei kortikalen Rearrangements des Zytoskeletts. So sind verschiedene zu Zytoskelettveränderungen führende Signale Rho-vermittelt, während andere Signale eine Aktivierung der PLD unabhängig von Rho bewirken ¹ ⁴. Durch die Translokation von PLD an die RhoA-Membrandomäne als Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäßen RhoA-Rekrutierungsmodul kann eine simultane Aktivierung beider Signalsysteme des Zytoskeletts an der RhoA-Membrandomäne erfolgen. Die Herstellung des Konstrukts erfolgt im Prinzip wie in 8.1. dargestellt, wobei jedoch PLD an die Stelle des RhoGAP von Myr5 kloniert wird. Nach Transfektion und Expression in Epithelzellen (vgl. 1. b)) ist deshalb das Fusionsprotein zur Verstärkung RhoA-abhängiger Zytoskelettveränderungen einsetzbar.

9. Kompetition der erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule mit endogenen Rho-Isoformens

Da gezeigt wurde, dass die erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodule die vollständige Information für den Transport an die RhoA- oder RhoC-typischen Membrandomänen beinhalten, sollten die im Überschuss vorhandenen Rho-Rekrutierungsmodule mit den endogenen Rho-Proteinen um die Rekrutierung kompetieren. Deshalb sollten die Rho-Rekrutierungsmodule für eine kompetitive, isoformtypische Inhibition endogener Rho-Proteine einsetzbar sein. Während das Rekrutierungsmuster von RhoA bisher nur bei dieser Isoform beobachtet wurde, ist bisher kein Lokalisationsunterschied zwischen RhoB und RhoC beschrieben. Deshalb sollte das Rekrutierungsmodul von RhoC auch RhoB und möglicherweise noch andere Isoformen kompetitiv inhibieren. Damit stehen isoformtypische Inhibitoren für Rho-Isoformen zur Verfügung. Dabei können zwei prinzipielle Anwendungen unterschieden werden: a) Verwendung der erfindungsgemäßen Aminosäuren 181-189 (nicht prenyliert) zur isoformtypischen Inhibition des endogenen Proteins an der jeweiligen Rho-Membrandomäne. b) Verwendung der erfindungsgemäßen Aminosäuren 181-190, wobei AS 190 (Zystein) geranylgeranyliert ist. Letztere Konstrukte können in zellulären Systemen dadurch erzielt werden, dass die AS 181-193 kloniert und exprimiert werden, wobei die Geranylgeranylierung sowie die Abspaltung der 3 C-terminalen Aminosäuren enzymatisch in der Zelle erfolgen. Außerdem sind sowohl die nicht-modifizierten Peptide wie auch die geranylgeranylierten Peptide chemisch synthetisierbar.

9.1. RhoA-typische Inhibition

RhoA kann inhibiert werden durch

9.1.1. Überexpression des kompletten RhoA-Rekrutierungsmoduls (AS181-193) nach Transfektion wie in 1. beschrieben

Für die kompetitive Inhibition des endogenen Proteins muss das erfindungsgemäße RhoA-Rekrutierungsmodul stark exprimiert werden. Das Expressionsniveau kann durch die bei der Transfektion eingesetzte DNA-Menge, durch Verwendung unterschiedlich starker, auch regulierbarer (induzierbarer) Promotoren, variiert werden. In Abhängigkeit vom Expressionsniveau des RhoA-Rekrutierungsmoduls kann die Rekrutierung von endogenem RhoA inhibiert werden.

9.1.2. Überexpression der Aminosäuren 181-189 von RhoA als Fusionsprotein

Herstellung des Konstrukts wie in 1. beschrieben mit der Abweichung, dass hier nur die für die Aminosäuren 181-189 kodierenden Nukleotide kloniert werden. Dieses Fusionsprotein kompetiert mit dem endogenen Protein um die Bindung an die Membrandomäne. Im Unterschied zu 9.1.1. kompetiert dieses Konstrukt aber nicht mit der Bindung des endogenen Proteins an RhoGDI.

9.1.2. ein synthetisches Peptid, das die Aminosäuren 181-189 von RhoA umfasst

Dieses Peptid kann beispielhaft synthetisch hergestellt werden (z.B. kommerziell: Fa. Eurogentec) und zur Kompetition mit dem endogenen Protein entweder in Zellen mikroinjiziert ¹⁵ oder über kommerziell verfügbare Techniken in Zellen eingebracht werden (Bioporter, Best.-Nr.: 14-01-16500; BioCarta Europe GmbH, Borsteler Chausee 53, Hamburg 22453, Germany). Dieses erfindungsgemäße Peptid sollte lediglich mit der isoformtypischen Bindung des endogenen Rho-Proteins an die Membrandomäne, nicht aber mit der Bindung von Rho an RhoGDI kompetieren.

9.1.3. ein synthetisches, am C-terminalen Zystein geranylgeranyliertes Peptid, das die Aminosäuren 181-190 von RhoA umfasst

Dieses modifizierte Peptid besteht aus den AS 181-190 von RhoA, wobei das C-terminale Zystein (AS190) geranylgeranyliert ist. Die Herstellung erfolgt wie beschrieben in ⁶ oder in ¹⁶. Für die Einschleusung des modifizierten Peptids in Zellen wird ein auf liposomaler Basis beruhendes kommerzielles System verwendet (Bioporter, Best.-Nr.: 14-01-16500; BioCarta Europe GmbH, Borsteler Chausee 53, Hamburg 22453, Germany). Das erfindungsgemäße Peptid kompetiert mit endogenem RhoA um die Bindung an die isoformtypische RhoA-Membrandomäne. Zusätzlich kann die Geranylgeranyl-Gruppe zusammen mit dem erfindungsgemäßen Peptid um die Bindung von RhoA an RhoGDI kompetieren ^6;17;18

10. Medizinische Anwendungen der erfindungsgemäßen Rho-Rekrutierungsmodule

Die Inhibition von Ras-artigen kleinen G-Proteinen ist seit langem ein Ziel pharmakologischer Forschung, da Ras selbst ein gut etabliertes Tumorprotein ist. Da die Funktion der kleinen GTPasen von ihrer Prenylierung abhängt, wird versucht, über eine Inhibition der Prenylierung die endogenen Proteine zu inaktivieren. Dazu werden die prenylierenden Enzyme inhibiert. Kleine G-Proteine werden entweder von Farnesyltransferase farnesyliert oder von Geranylgeranyltransferase I oder II geranylgeranyliert. RhoA, B, C und G werden von der Geranylgeranyltransferase I geranylgeranyliert ¹⁹, RhoB kann zusätzlich vom selben Enzym farnesyliert werden ²⁰. Deshalb werden durch Inhibitoren der Prenyltransferasen entsprechend der Spezifität der Enzyme und der Inhibitoren jeweils große Gruppen kleiner G-Proteine inhibiert. So ist es mit diesem Ansatz insbesondere nicht möglich, RhoA oder RhoC präferentiell zu inhibieren. Demgegenüber erlaubt ein auf den erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodulen von RhoA und RhoC basierender Ansatz eine Inhibition von Rho-Proteinen durch Interferenz mit der isoformtypischen Membranbindung der endogenen Proteine. Wegen der erfindungsgemäßen isoformtypischen Spezifität der verwendeten Rekrutierungsmodule von RhoA oder RhoC wird eine isoformtypische Inhibition ermöglicht. Eine isoformtypische Inhibition von Rho-Proteinen ist von Interesse, weil Rho-Isoformen biologisch unterschiedliche Bedeutung haben. So konnte gezeigt werden, dass RhoC, aber nicht RhoA, für die Metastasierung des Melanoms wichtig ist. Da wir den einzigen Unterschied zwischen RhoC und RhoA zeigen (differentielle Rekrutierung an die Zytoplasmamembran), sollte eine selektive Inhibition von RhoC-typischer Membranbindung die Metastasierung von Melanomen inhibieren. RhoC spielt auch eine wichtige Rolle bei der aggressivsten Form des Brustkrebses, dem inflammatorischen Brustkrebs. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Produktion angiogenetischer Faktoren RhoC-abhängig ist ^8;9. Die selektive Inhibition RhoC-typischer Membranbindung endogener Rho Proteine durch Kompetition mit den erfindungsgemäßen Rekrutierungsmodul von RhoC stellt deshalb einen rationalen Ansatz zur Therapie dieses Karzinoms dar. Die Applikation des Rekrutierungsmoduls am Patienten kann in Form einer Gentherapie mit Fusionsproteinen geschehen oder durch Verabreichung der Peptide, entweder in nicht-geranylgeranylierter Form bestehend aus den AS 181-189 von RhoC oder in geranylgeranylierter Form bestehend aus den AS 181-190, wobei das C-terminale Zystein modifiziert ist.

Tabelle 1 Charakterisierung verschiedener Rho-Mutanten hinsichtlich ihres Rekrutierungsverhaltens
Legende zu den Figuren
1: Primärstrukturvergleich zwischen RhoA und RhoC
Beide Proteine bestehen aus 193 Aminosäuren. Während sich die beiden Rho-Isoformen im Bereich der Aminosäuren 1-180 lediglich an 8 Positionen unterscheiden, variieren im Bereich der Aminosäuren 181-188 sechs von acht Aminosäuren. Auffällig ist weiterhin der relativ hohe Anteil basischer Aminosäuren bei beiden Isoformen in diesem Bereich (AS 181-188): RhoA: 62,5 %; RhoC: 75 %.
2: Differentielle, Shigella-induzierte Rekrutierung von Rho-Isoformen
2-1 und 2-2: Charakteristische Rekrutierungsmuster von Rho-Isoformen nach Infektion von HeLa-Zellen mit invasiven Shigellen (Stamm SC301, ²¹): Grün: F-Aktin; rot: Peptid-markiertes RhoA (2-1) oder RhoC (2-2). 2-1): RhoA akkumuliert peribakteriell um eindringende Bakterien herum, woraus sich ein ovales Rekrutierungsmuster ergibt (s. Pfeile). 2-2): Akkumulation von RhoC in Shigella-induzierten zellulären Protrusionen (s. Pfeile). Die Markierung der Zellausläufer durch RhoC ergibt ein blütenartiges Rekrutierungsmuster. Vgl. 22 2-3 und 2-4: Keine Rekrutierung von RhoA (2-3) oder RhoC (2-4) bei Inkubation von HeLa-Zellen mit nicht-invasiven Shigellen (Stamm SC300, ²¹): Grün: F-Aktin, rot: Peptid-markiertes RhoA (2-3) oder RhoC (2-4). Im nicht-stimulierten Zustand (Inkubation mit nicht-invasiven Bakterien) erfolgt keine isoformtypische Rekrutierung von RhoA oder RhoC.
3: Die Aminosäuren 181-189 von RhoA bzw. RhoC bestimmen das Rekrutierungsmuster
Doppeltransfektion von HeLa-Zellen mit den für die entsprechenden Fusionsproteine kodierenden Konstrukten und Infektion mit invasiven Shigellen.
3-1, 3-2, 3-3: RhoCAC (s. Tab. 1) wird rekrutiert wie RhoA: Shigella-induzierte peribakterielle Akkumulation des Konstrukts (s. Pfeile in 3-1). Konversion des Rekrutierungsmusters durch Austausch der Aminosäuren 181, 183, 184, 186-188 von RhoC durch die entsprechenden Analoga von RhoA (vgl. 1). Rot: RhoCAC; blau: Bakterien; grün: F-Aktin. 3-1: Überlagerungsbild (rot-grün-blau); 3-2: roter Kanal; 3-3: blauer Kanal.
3-4, 3-5, 3-6: RhoACA (s. Tab. 1) wird rekrutiert wie RhoC: Shigella-induzierte Akkumulation des Konstrukts in zellulären Protrusionen (s. Pfeile in 3-4). Konversion des Rekrutierungsmusters durch Austausch der Aminosäuren 181, 183, 184, 186-188 von RhoA durch die entsprechenden Analoga von RhoC. Rot: RhoACA; grün: F-Aktin. 3-4: overlay (rot-grün); 3-5: roter Kanal; 3-6: grüner Kanal.
Alle Längenmarker in 3: 5 μm.
4: Markierung von RhoA- bzw. RhoC-typischen Membrandomänen durch die Aminosäuren 181-193 von RhoA bzw. RhoC und Rekrutierung beliebiger Proteine ohne funktionellen Bezug (GFP-Derivate)
Differentielle Rekrutierung von GFP-Derivaten durch die Rekrutierungsmodule von RhoA und RhoC in derselben Zelle nach Doppeltransfektion von HeLa-Zellen mit den für die entsprechenden Fusionsproteine kodierenden Konstrukten und Infektion mit invasiven Shigellen.
4-1, 4-2, 4-3, 4-4: ECFP allein (Kontrolle, grün) kolokalisiert nicht mit RhoA. Rot: Peptid-markiertes RhoA akkumuliert peribakteriell (s. Pfeil in 4-1); grün: EGFP; blau: Bakterien. 4-1: overlay, 4-2: Bakterien, 4-3: RhoA, 4-4: EGFP. Keine Kolokalisation von EGFP (4-4) mit RhoA (4-3).
4-5, 4-6, 4-7, 4-8: EGFP allein (Kontrolle, grün) kolokalisiert nicht mit RhoC. Rot: Peptid-markiertes RhoC akkumuliert in zellulären Protrusionen (s. Pfeile in 4-5); grün: EGFP; blau: Bakterien. 4-5: overlay, 4-6: Bakterien, 4-7: RhoC, 4-8: EGFP. Keine Kolokalisation von EGFP (4-8) mit RhoC (4-7).
4-9, 4-10, 4-11, 4-12: Als Fusionsprotein mit den AS 181-193 von RhoA bzw. RhoC werden die EGFP-Derivate ECFP und EYFP wie RhoA bzw. Rhoc rekrutiert. Rot: Fusionsprotein bestehend aus EYFP und den Aminosäuren 181-193 von RhoC; grün: Fusionsprotein bestehend aus ECFP und den Aminosäuren 181-193 von RhoA; blau: Bakterien. Isoformtypische Rekrutierung der GFP-Derivate entsprechend der Herkunft der fusionierten Rekrutierungsmodule: EYFP mit dem Rekrutierungsmodul von RhoC akkumuliert in zellulären Protrusionen (4-9, 4-12, s. geschlossene Pfeile in 4-9 und 4-12), während das Rekrutierungsmodul von RhoA als C-terminale Fusion dem GFP-Derivat ECFP zu einer peribakteriellen Rekrutierung verhilft (4-9, 4-11; s. offene Pfeile in 4-9, 4-10, 4-11).
Alle Längenmarker in 4: 5 μm.

AS: Aminosäure(n)
CAAX: C-terminale Aminosäuresequenz von Rho-artigen Proteinen: Zystein – aliphatische Aminosäure – aliphatische Aminosäure – beliebige Aminosäure (Leucin im Falle von Rho)
ECFP: enhanced cyan fluorescent protein (Becton Dickinson Clontech 6076-1)
EGFP: enhanced green fluorescent protein (Becton Dickinson Clontech 6084-1)
ER: Endoplasmatisches Retikulum
EYFP: enhanced yellow fluorescent protein (Becton Dickinson Clontech 6007-1)
G: Golgi-Apparat
GDI: GTPase dissociation inhibitor
GDP: Guanosin-Diphosphat
GEF: GDP/GTP exchange factors
GFP: Green Fluorescent Protein
GTP: Guanosin-Triphosphat
PKA: Proteinkinase A

Literaturverzeichnis

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC.
Rekrutierungsmodule nach Anspruch 1, bestehend aus den Aminosäuren 181-193 der Isoformen RhoA und RhoC.
Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 1 und 2, bestehend aus den Aminosäuresequenzen 3.1. ARRGKKKSGCLVL für das Rekrutierungsmodul von RhoA 3.2. VRKNKRRRGCPIL für das Rekrutierungsmodul von RhoC.
Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweils ersten 9 Aminosäuren das Rekrutierungsmuster bestimmen.
Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 1 bis 4, bestehend aus aus je zwei Teilen, einerseits den
1. das Rekrutierungsmuster determinierenden Aminosäuren 1-9, zum anderen 5.2. zur Prenylierung notwendigen vier C-terminalen Aminosäuren.
Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 1 bis 5 als Teil eines Fusionsproteins mit beliebigem Fusionspartner in zellulären Systemen, herstellbar mit Hilfe des enzymatischen Apparates einer Zelle, indem mittels Transformation oder Transfektion ein Nukleinsäurekonstrukt, welches für das Rekrutierungsmodul kodiert, in die Zelle eingebracht wird und die Expression des Konstrukts in der Zelle in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Zelle – humane Zelle, Pilzzelle – durch beschriebene Regulationseinheiten/entsprechende Promotoren des Konstrukts gesteuert wird.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie in zellulären Systemen hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Teil eines beliebigen Fusionsproteins in zellulären Systemen hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 7 und 8 in Gestalt einer Biosynthese in zellulären Systemen, dadurch gekennzeichnet, dass der enzymatische Apparat einer Zelle so verwendet wird, dass mittels Transformation oder Transfektion ein Nukleinsäurekonstrukt gebildet und in die Zelle eingebracht wird, welches für das Rekrutierungsmodul kodiert und die Expression des Konstrukts in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Zelle – humane Zelle oder Pilzzelle – durch Regulationseinheiten des Konstrukts (entsprechende Promotoren) gesteuert wird.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 9 in einem transformierbaren Bakterium (z. B.: E. coli) hergestellt wird, nach DNA-Präparation die für das Konstrukt kodierende DNA als Matrize für eine reverse Transkription in-vitro verwendet wird und die dabei entstehende mRNA anschließend in an sich bekannter Weise als Vorlage für eine in-vitro-Translation zur Herstellung des Konstrukts dient.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Konstrukte sowohl transient als auch permanent erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die permanente Expression der Konstrukte zur Herstellung permanent exprimierender Zellen führt, wobei das Konstrukt in einen Vektor kloniert wird, der einen Selektionsmarker trägt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass stabile Expression der Rekrutierungsmodule als EGFP-Fusionsproteine in HeLa-Zellen erfolgt, wobei EGFP-C1 als Vektor verwendet wird, die Rekrutierungsmodule (Aminosäuren 181-193 von RhoA oder RhoC) in die Restriktionsschnittstellen EcoRI und BamHI des Vektors einkloniert und die HeLa-Zellen anschließend mit dem Konstrukt transfiziert und permanent stabil exprimierende Zellen selektiert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die stabil exprimierenden Zellen zur Markierung Rho-typischer Membrandomänen eingesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung der Rekrutierungsmodule nach den Ansprüchen 6 bis 10 auf chemischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren 181-190 von RhoA und/ oder RhoC in an sich bekannter Weise synthetisiert werden und das C-terminale Zystein (Aminosäure 190) anschließend prenyliert wird.
Verwendung der Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Darstellung typspezifischer Membrandomänen.
Verwendung nach Anspruch 16 zur Markierung RhoA- bzw. RhoC-typischer Zytoplasmamembrandomänen.
Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung von Markern von RhoA- bzw. RhoC-spezifischen Membrandomänen.
Verwendung nach den Ansprüchen 16 bis 19 zur RhoA- bzw. RhoC-typischen Markierung von Zytoplasmamembrandomänen.
Verwendung nach Anspruch 16 zur typspezifischen Inhibition von RhoA und RhoC.
Verwendung nach Anspruch 16 zum Transport von Fusionsproteinen an Rho-typische Membrandomänen.
Verwendung nach Anspruch 21 zum intrazellulären Transport beliebiger enzymatischer Funktionen (Enzyme oder deren funktionelle Untereinheiten) an die RhoA- oder RhoC-typischen Membrandomänen zur lokalisierten Beeinflussung von Membraneigenschaften.
Verwendung nach Anspruch 16 zur Inhibition der Metastasierung von Melanomen.
Verwendung nach Anspruch 16 zur Inhibition einer Invasion sowie einer Neo-Angiogenese bei Inflammatorischem Brustkrebs.
Verwendung der Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Membranadressierung.
Verwendung nach Anspruch 25 zur Adressierung zweier Membrandomänen, die durch isoformtypische Rekrutierung des kleinen G-Proteins Rho charakterisiert sind (RhoA-Domäne, RhoC-Domäne).
Verwendung nach Anspruch 25 und 26 zur isoformtypischen Darstellung von Zytoplasmamembrandomänen.
Verwendung nach Anspruch 25 und 26 zur isoformtypischen Inhibition des endogenen Proteins.
Verwendung nach Anspruch 25 zur Schleusung anderer Proteine an Membrandomänen.
Verwendung der Rekrutierungsmodule der Proteine RhoA und RhoC nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Vermittlung der Rekrutierbarkeit nicht-involvierter Proteine.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass man sich der das Rekrutierungsmuster von RhoA und von RhoC determinierenden prä-C-terminalen Aminosäuren 181-189 als Rekrutierungsmotiv bedient.
Verwendung nach Anspruch 30 und 31, dadurch gekennzeichnet, dass man sich des das prä-C-terminale Rekrutierungsmotiv und die CAAX-Region umfassenden C-Terminus von RhoA oder RhoC (Aminosäuren 181-193) bedient.
Verwendung nach Anspruch 31 zur Fusion des Motivs mit Enzymen.
Verwendung nach Anspruch 33 zur Fusion des Motivs mit Enzymen, die über die Membranadressierung an den gewünschten Wirkort lokalisiert werden.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass stabil exprimierende Zellen nach Anspruch 12 zur Markierung Rho-typischer Membrandomänen eingesetzt werden.