DE10211106B4 - Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Bioreaktoren - Google Patents

Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Bioreaktoren Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Hohlfaserbioreaktoren, die mit Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch und einem Nährlösungsbehälter im Kreislauf verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffzufuhr pulsierend mit ein bis sechs Pulsationen je Sekunde, erzeugt durch eine Resonanzschwingungsanordnung, erfolgt und dass Hohlfasern aus Polymeren mit erhöhter Wärmebeständigkeit und unterschiedlichen Porengrößen für Bioreaktor und Einheit für Gas-Flüssigkeitsaustausch verwendet werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Hohlfaserbioreaktoren die mit Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch und einem Nährlösungsbehälter im Kreislauf verbunden sind.
  • Die Kultivierung von Zellkulturen in Bioreaktoren und die Zufuhr von Sauerstoff bzw. Luft in diese Reaktoren ist aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Hauptproblem bekannter Verfahren war in der Vergangenheit die Schaffung aerober Bdingungen für die Entwicklung der Zellkulturen innerhalb der Reaktoren. Durch die Verwendung von Membranen und Hohlfasern konnte es teilweise gelöst werden. (vgl. z.B. DE 2940 446 A1 und WO 87/03615).
  • Bekannt ist auch, die Gaszuführung zu Bioreaktoren durch separate Reaktionseinheiten von Flüssigkeit mit dem Gas vorzunehmen.
  • In der EP 0411 658 A2 ist eine separate Einheit mit speziellen Mehrschichtenmembranen beschrieben. Auch aus der DE 4404 600 C1 ist eine separate Einheit mit Membran zur blasenfreien Begasung bekannt.
  • Ferner ist in der DE 38 18 776 C2 die Verwendung von Dialysemembranen in Verbindung mit einer Druckkammer beschrieben, wobei das Nährmedium zwangsgerührt wird.
  • Aus der DE 28 07 627 A1 ist ein Verfahren mit intermittierender Luftzufuhr und einer düsenähnlichen Vorrichtung dafür zu entnehmen, wobei kurze Luftzufuhren und längere Pausen ohne Luftzufuhr sich abwechseln.
  • Die bekannten Verfahren und Systeme zur Sauerstoffzufuhr in Zellkulturen sind bei allen erreichten Verbesserungen noch sehr aufwendig und überwiegend für spezielle Verwendungen vorgesehen.
    •
  • Aufgabe der Erfindung war es, hier Abhilfe zu schaffen und ein Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Hohlfaserbioreaktoren, die mit Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch und einem Nährlösungsbehälter im Kreislauf verbunden sind, zu entwickeln.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Patentanspruches 1.
  • Danach ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzu fuhr in Hohlfaserbioreaktoren, die mit Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch und einem Nährlösungsbehälter im Kreislauf verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffzufuhr pulsierend mit ein bis sechs Pulsationen je Sekunde, erzeugt durch eine Resonanzschwingungsanordnung erfolgt und dass Hohlfasern aus Polymeren mit erhöhter Wärmebeständigkeit und unterschiedlichen Porengrößen für Bioreaktor und Einheit für Gas-Flüssigkeitsaustausch verwendet werden.
  • Gemäß Patenansprüchen 2 und 3 werden im Bioreaktor Hohlfasern mit Porengrößen von 0,1 μm und in der Einheit für den Gas-Flüssigkeitsaustausch Hohlfasern mit Porengröße von 0,001 μm verwendet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine deutliche Verbesserung des Sauerstoffeintrags bzw. der Sauerstoffzufuhr in Bioreaktoren mit Hohlfasern.
  • Derartige Hohlfasern können aus Cellulosederivaten, Thermoplasten und Polymeren mit erhöhter Wärmebeständigkeit hergestellt werden. Sie weisen Außendurchmesser von 300 bis 500 μm und Membranstärken von 80 bis 200 μm auf. Die Porengrößen in den Hohlfasern variieren von 0,001 bis 0,1 μm.
  • Die Erfindung vermeidet mit einfachen Mitteln die Nachteile einer stoßweisen intermittierenden Sauerstoffzufuhr.
  • Sie kann vorzugsweise zur Zellkultivierung pflanzlicher und animalischer Zellen, zur Erzeugung monoklonaler Antikörper und rekombinanter Proteine verwendet werden. Andere Einsatzmöglichkeiten sind dabei nicht ausgeschlossen.
  • Durch die Anwendung der Erfindung konnte der Sauerstoffeintrag in die Flüssigkeiten der Zellkulturen, wie der Nährlösung, wesentlich erhöht werden.
    •
  • Weitere Ziele, Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung ergeben sich aus nachfolgenden Beispielen in Verbindung mit der Zeichnung gem. 1.
  • Es zeigt
  • 1: eine schematische Darstellung einer möglichen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
  • Beispiel 1
  • Eine in 1 dargestellte mögliche Anordnung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Patentanspruch 1 besteht aus einem Liquid/Solid-Bioreaktor 1 mit Hohlfasern einer Porengröße von 0,1 μm und einer separaten Einheit für den Gas-Flüssigkeitsaustausch 2 mit Hohlfasern einer Porengröße von 0,001 μm. Der Hohlfaserbioreaktor und die separate Einheit sind über einen Nährlösungskreislauf 8 und einem Nährlösungsbehälter 9 miteinander verbunden. Der Bioreaktor 1 enthält Zellkulturen, hier CHO-Zellen, und die separate Einheit dient zum Gasaustausch von Sauerstoff und Kohlendioxid. Die separate Einheit ist über ein Kopplungssystem 3 zur Dosierung von gereinigter Frischluft und/oder von Sauerstoff und einer an sich bekannten Resonanzschwingungsanordnung 4 verbunden. Diese Resonanzschwingungsanordnung erzeugt ein bis sechs Pulsationen je Sekunde, vorzugsweise ein bis zwei Pulsationen je Sekunde. Die erzeugten Pulsationen werden über eine Flüssigkeitssäule 6 und ein Gaspolster 7 als oszillierende Eigenfrequenz in die Einheit für den Gas-Flüssigkeitsaustausch weitergeleitet. Die Dimensionierung von Flüssigkeitssäule und Gaspolster sind abgestimmt mit dem gesamten Kreislauf.
  • Ein Vergleich einer Versuchsanordnung mit normaler Sauerstoffzufuhr und mit einer Anordnung gemäß Patentanspruch 1, bei einer Pulsation je Sekunde, zur Ermittlung des Sauerstoffübergangskoeffizienten, kurz KLA-Wert genannt, ergab folgendes. Die Sauerstofftransferrate OTR (oxigen-transfer-rate) aus der Gasphase in die Flüssigkeitsphase wird durch den Volumen bezogenen Stoff-Übergangskoeffizient für Sauerstoff, den KLA-Wert beschrieben. In diesem Koeffizient sind KL der Filmdiffusionskoeffizient in Meter je Stunde und A die spezifische Phasengrenzfläsche der Gasblasen in m2/m3. Die Bestimmung des KLA-Wertes erfolgt mit der dynamischen Methode. Dazu wurde das System mit Stickstoff begast, um den Sauerstoff zu entfernen. Diese Begasung erfolgte solange, bis ein Nullpunkt gefunden werden konnte. Anschließend wurde mit Luft begast und die Zunahme des Sauerstoffs elektrochemisch mittels einer Sauerstoff Elektrode gemessen und aufgezeichnet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00030001
  • Beispiel 2 (nachgereicht)
  • Analog Beispiel 1 wurde der Sauerstoffübergang bei einer Protoplasmenkultur der Gattung „Nikotiana tabakum" ermittelt.
  • Zu Vergleichszwecken wurde ebenfalls mit einer Pulsation je Sekunde gearbeitet.
  • Die ermittelten Ergebnisse zum KLA-Wert sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2
    Figure 00040001
    • 1
    Liquid/Solid-Bioreaktor
    2
    Einheit für Gas-Flüssigkeitsaustausch
    3
    Kopplungssystem
    4
    Resonanzschwingungsanordnung
    5
    sterile Schnittstelle
    6
    Flüssigkeitssäule
    7
    Gaspolster
    8
    Nährlösungskreislauf
    9
    Nährlösungsbehälter

Claims (3)

  1. Verfahren zur Verbesserung der Sauerstoffzufuhr für Zellkulturen in Hohlfaserbioreaktoren, die mit Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch und einem Nährlösungsbehälter im Kreislauf verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffzufuhr pulsierend mit ein bis sechs Pulsationen je Sekunde, erzeugt durch eine Resonanzschwingungsanordnung, erfolgt und dass Hohlfasern aus Polymeren mit erhöhter Wärmebeständigkeit und unterschiedlichen Porengrößen für Bioreaktor und Einheit für Gas-Flüssigkeitsaustausch verwendet werden.
  2. Verfahren gem. Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hohlfaserbioreaktoren Hohlfasern mit Porengröße von 0,1 μm verwendet werden.
  3. Verfahren gem. Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in den Einheiten für den Gas-Flüssigkeitsaustausch Hohlfasern mit Porengrößen von 0,001 μm verwendet werden.
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