DE10209788A1

DE10209788A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der relativen Syntheseleistung einzelner Zellen und/oder von Positionskoordinaten

Info

Publication number: DE10209788A1
Application number: DE2002109788
Authority: DE
Inventors: Klaus Gaertner; Christoph Giese; Christian Demmler; Uwe Marx
Original assignee: FOERDERVER INST fur MEDIZINTE
Current assignee: FOERDERVER INST fur MEDIZINTE
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-11
Also published as: AU2003227016A1; WO2003072699A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der relativen Syntheseleistung von sekretorisch gebildeten Proteinen einzelner Zellen und/oder der Positionskoordinaten dieser Zellen. Dabei soll insbesondere die Syntheseleistung von Zellen bezüglich der Bildung von monoklonalen Antikörpern, aber auch anderer Proteine berücksichtigt werden können. Aufgabengemäß soll die relative Syntheseleistung und/oder die Position solcher Zellen, die in einem Gefäß mit einer Nährlösung kultiviert werden, in kurzer Zeit bestimmt werden können. DOLLAR A Zur Lösung dieser Aufgabe sind neben den Proteine bildenden Zellen in der Nährlösung, die eine semisolide Konsistenz aufweist, auch ein für das jeweilige Protein spezifischer Fluorophor bzw. für das jeweilige Protein spezifisch bindende Substanzen, bei denen mit Licht eine Fluoreszenzanregung erreicht werden kann, enthalten. Mit einem Fluoreszenzmikroskop wird in Verbindung mit einem Videosystem und einer elektronischen Bildverarbeitung eine dreidimensionale Bestimmung der Positionskoordinaten von Regionen erhöhter Fluoreszenzlichtintensität innerhalb des Gefäßes bestimmt, wobei diese Regionen mit erhöhter Fluoreszenzlichtintensität entsprechend sekretorisch Proteine bildende Zellen enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der relativen Syntheseleistung von sekretorisch gebildeten Proteinen einzelner Zellen und/oder der Positionskoordinaten dieser Zellen. Insbesondere soll die Syntheseleistung einzelner Zellen bezüglich der Bildung von monoklonalen Antikörpern berücksichtigt werden. Es können aber auch andere sekretrorisch von Zellen gebildete Proteine, wie beispielsweise Erythropoetin (EPO), Tumor-Nekrose-Faktoren oder auch Enzyme bezüglich der Syntheseleistung einzelner Zellen für solche Proteine bestimmt und bewertet werden.
Monoklonale Antikörper haben bereits und werden auch zukünftig eine große Rolle bei der Therapierung in der Human- und Veterinärmedizin spielen.
Die Erzeugung bzw. Bildung monoklonaler Antikörper mittels einzelner Zellen bzw. Zellklonen ermöglicht es, bestimmte monoklonale Antikörper in identischer Form mit größerer Ausbeute und in kürzerer Zeit zur Verfügung zu stellen. Dabei werden solche monoklonale Antikörper bildende Zellen in Nährlösung enthaltenden Gefäßen kultiviert, wobei als Gefäße häufig an sich bekannte Mikrotiterplatten Verwendung finden.
Es hat sich dabei herausgestellt, dass die Ausbeute an monoklonalen Antikörpern, aber auch anderer Proteine, also die Syntheseleistung der einzelnen Zellen sehr unterschiedlich ist.
Da für das Klonen geeigneter Zellen üblicherweise ein Zeitraum von 4 bis 6 Wochen erforderlich ist und eine genetische Stabilität der geklonten Zellen ca. nach einem weiteren 1/2 Jahr erreicht werden kann, ist eine frühzeitig gezielte Selektion von Zellen mit erhöhter Syntheseleistung für monoklonale Antikörper oder andere Proteine wünschenswert.
Ein weiterer Aspekt, der bisher bei solchen nichtinvasiven Techniken ebenfalls nur unbefriedigend gelöst ist, besteht in der Möglichkeit einer kurzfristigen Überprüfung, ob bestimmte ausgewählte Zellen in der Lage sind, bestimmte monoklonale Antikörper oder andere Proteine bilden zu können.
Es ist Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten zu schaffen, mit der die Position und/oder die Syntheseleistung für monoklonale Antikörper einzelner Zellen, die in einem Gefäß mit einer Nährlösung kultiviert werden, bereits nach kurzer Zeit bestimmt werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist und mit einem Verfahren gemäß Anspruch 5 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung können mit den in den untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen erreicht werden.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der entsprechenden Verfahrensführung können sowohl die jeweiligen Positionen einzelner Zellen innerhalb eines Gefäßes, die Fähigkeit der Bildung monoklonaler Antikörper durch die Zellen, wie auch eine qualitative Bewertung der Syntheseleistung von Zellen zur Bildung von Proteinen, wie monoklonale Antikörper bestimmt, festgestellt bzw. vorgenommen werden.
Hierzu wird eine geeignete Substanz, die für die jeweiligen gebildeten monoklonalen Antikörper oder Proteine spezifisch ist, der Nährlösung im Gefäß, in dem auch die einzelnen Zellen kultiviert werden, zugegeben. Diese für das jeweilige Protein spezifische Substanz kann an die von den Zellen gebildeten Proteine binden und um die Zellen Präzipitate bilden. An diese spezifische Substanz, z. B. Immoglubin, ist ein zur Fluoreszenzanregung geeigneter Stoff kovalent gebunden. Ein Beispiel hierfür ist das sogenannte "Green Fluorescence Protein".
Die verwendete Nährlösung, in der die Zellen enthalten sind, soll eine semisolide Konsistenz aufweisen. Eine solche Konsistenz ist unter zwei Gesichtspunkten von Bedeutung. So kann die Präzipitatbildung, der sekretorisch gebildeten Proteine, um die jeweilige Zelle erreicht und insbesondere für den Fall, dass bestimmte Zellen mit erhöhter Syntheseleistung selektiert werden sollen, die Einhaltung der Positionen der jeweiligen Zellen innerhalb der im Gefäß enthaltenen Nährlösung über einen längeren Zeitraum gesichert werden.
Die semisolide Konsistenz der Nährlösung, die bis auf die bereits erwähnten proteinspezifischen Fluorophore eine an sich bekannte Zusammensetzung aufweisen kann, kann durch Zugabe geeigneter viskositätserhöhender Substanzen eingestellt werden. Bei solchen die Vitalität der Zellen nicht negativ beeinflussenden Substanzen kann es sich um biogene, prozessierte und/oder synthetische Substanzen handeln. Beispiele sind Methylzellulose, Agar oder Agarose.
Eine solche Nährlösung mit semisolider Konsistenz erreicht dann eine Viskosität, die mindestens 20-fach höher als die Viskosität von reinem Wasser ist.
Die Viskosität kann auch bevorzugt im Bereich einer 20 bis 100-fach höheren und darüber hinausgehenden liegen.
Die als ein Beispiel für solche Proteine gebildeten monoklonalen Antikörper, auch als Präzipitat bezeichnet, bilden um die jeweilige einzelne Zelle ein wolkenförmiges Gebilde, dessen räumliche Ausdehnung proportional zur Menge der bis zum entsprechenden Zeitpunkt gebildeten monoklonalen Antikörper ist.
An die gebildeten monoklonalen Antikörper lagert sich die für diese spezifische Substanz mit dem zur Fluoreszenzanregung geeignetem Stoff in konzentrierter Form an, und bilden Präzipitate, so dass bei Beleuchtung mit zur Fluoreszenzanregung geeignetem Licht in den Präzipiaten (Regionen) eine erhöhte Fluoreszenzlichtintensität und dementsprechend die monoklonalen Antikörper bildenden einzelnen Zellen lokal detektierbar sind.
Des weiteren ist nicht nur die räumliche Ausdehnung des wolkenförmigen Gebildes, um eine monoklonale Antikörper bildende Zelle ein Parameter für die Bewertung der Syntheseleistung, sondern auch die Dichte der innerhalb eines solchen wolkenförmigen Gebildes vorhandenen monoklonalen Antikörper. Dementsprechend ist auch die detektierbare Fluoreszenzintensität eine aussagekräftige Messgröße zur qualitativen Bewertung der Syntheseleistung der jeweiligen einzelnen Zellen.
Da die einzelnen Zellen innerhalb der Nährlösung in einem Gefäß räumlich beliebig verteilt sind, ist insbesondere für die Selektion bestimmter einzelner Zellen, die eine erhöhte Syntheseleistung aufweisen, die Kenntnis der jeweiligen Position einer solchen Zelle innerhalb des Gefäßes erforderlich.
Für die Bestimmung der Positionskoordinaten der einzelnen Zellen in dreidimensionaler Form kann aus diesem Grund ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem Videosystem, z. B. einer Digitalkamera und einer elektronischen Bildverarbeitung eingesetzt werden. Dabei kann durch entsprechende Manipulation eines solchen Mikroskops eine zweidimensionale Bildaufnahme mit einer ortsaufgelösten Erfassung der Fluoreszenzintensität in verschiedenen Ebenen durchgeführt werden.
Diese Ebenen sind bevorzugt orthogonal zur optischen Achse eines solchen Mikroskops und parallel zueinander ausgerichtet. Die konfokale zweidimensionale Bildaufnahme erfolgt weiter in vorgebbaren Abständen der einzelnen Ebenen zueinander, so dass die Bildaufnahme quasi schichtweise durchgeführt wird. Die einzelnen Ebenen sollten in möglichst gleichen Abständen ausgewählt werden, wobei der Abstand jeweils benachbarter Ebenen möglichst nicht kleiner als 20 µm und nicht größer als 70 µm, bevorzugt bei ca. 50 µm liegen sollte.
Durch die Mikroskopbeleuchtung kann eine Fluoreszenzanregung erreicht werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, eine weitere Lichtquelle allein oder zusätzlich einzusetzen, die ein begrenztes Wellenlängenspektrum abstrahlt, wobei zumindest die Fluoreszenzanregungswellenlänge des jeweilig verwendeten zur Fluoreszenzanregung geeigneten Stoffes im Wellenlängenspektrum einer solchen Lichtquelle enthalten ist.
Durch die elektronische Bildaufnahme, bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung können, wie bereits vorab angedeutet, Regionen erhöhter Fluoreszenzlichtintensität, innerhalb eines wolkenförmigen Gebildes, das um eine Proteine, wie z. B. monoklonale Antikörper bildende Zelle ausgebildet ist, innerhalb der einzelnen Ebenen detektiert werden.
Hierzu ist es zweckmäßig, mindestens einen Schwellwert für eine zu berücksichtigende Fluoreszenzintensität, der innerhalb einer solchen Region erreicht werden soll, vorzugeben.
Mit den so innerhalb einer Ebene zweidimensional detektierten Koordinaten solcher Regionen und unter Kenntnis der Lage der jeweiligen Ebene können die Positionskoordinaten in dreidimensionaler Form bestimmt werden.
Diese Kenntnis ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn, wie bereits angedeutet, eine Selektion bestimmter ausgewählter Zellen durchgeführt werden soll. Hierzu kann ein elektronisch gesteuerter Mikromanipulator eingesetzt werden, der mit Hilfe von entsprechend bestimmten Positionskoordinaten in Bezug zu einer entsprechend ausgewählten Zelle in das Gefäß eingeführt und die entsprechende Zelle aus dem Gefäß aufnehmen kann.
Es kann außerdem sinnvoll sein, bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mindestens ein optisches Filter einzusetzen. Ein solches Filter sollte dann zwischen Gefäß und Digitalkamera angeordnet werden und zumindest für den Wellenlängenbereich bzw. eine Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes transparent sein und möglichst andere Wellenlängen zu sperren, um zum einen Streulichteinflüsse zu reduzieren und zum anderen die Auswertung mittels einer elektronischen Bildverarbeitung vereinfachen zu können.
Zumindest wenn auf solche optische Filter verzichtet wird, sollte mittels der elektronischen Bildverarbeitung eine Grauwertbildung durchgeführt werden.
Neben der Grauwertbildung kann aber auch allein oder zusätzlich eine Bildkorrektur durchgeführt werden (vgl. Fig. 1).
Insbesondere für die Auswahl und Selektion einzelner Zellen mit erhöhter Syntheseleistung sollten bestimmte Kriterien aufgestellt und berücksichtigt werden. Dabei können verschiedene Eingangsparameter x_i berücksichtigt werden.
So sollten neben der bereits erwähnten Fluoreszenzintensität auch die Fläche und/oder der Durchmesser der in den einzelnen Ebenen detektierten Regionen bestimmt werden. Vorteilhaft kann der Mittelwert der detektierten Fluoreszenzintensität für einzelne Regionen berücksichtigt werden.
Zusätzlich können als Eingangsparameter auch der Umfang und/oder die Konturform der Regionen bestimmt werden. Eine Bestimmung der Konturform ist immer dann erforderlich bzw. sinnvoll, wenn die detektierte Region eine von einer rotationssymmetrischen Form abweichende Kontur aufweist.
Insbesondere für den Fall, dass ausgewählte Zellen aus dem Gefäß selektiv entfernt werden sollen, ist es günstig auch die Abstände der einzelnen Regionen, in denen Zellen angeordnet sind, zueinander zu bestimmen, wobei diese Abstandsbestimmung möglichst auch in dreidimensionaler Form durchgeführt werden sollte. Dadurch kann vermieden werden, dass in unerwünschter Form zwei oder mehrere Zellen aus dem Gefäß aufgenommen werden, wobei dann auch Zellen mit relativ geringer Syntheseleistung selektiert werden würden.
Unter Berücksichtigung der Annahme, dass innerhalb einer entsprechend detektierten Region eine Proteine, z. B. monoklonale Antikörper bildende Zelle angeordnet ist, kann deren Position innerhalb der entsprechend detektierten Region durch Berechnung eines Fluoreszenzintensitätsschwerpunktes bzw. des Flächenschwerpunktes dieser Region mit erhöhter Genauigkeit bestimmt werden.
Mit einer elektronischen Datenverarbeitungsanlage kann unter Berücksichtigung von mindestens zwei der vorab bezeichneten Eingangsparameter, wobei die detektierte Fluoreszenzintensität in Verbindung mit der Fläche und/oder dem Durchmesser der jeweiligen Region zu bevorzugen sind, eine Einteilung in die Syntheseleistung, z. B. für monoklonale Antikörper, einzelner Zellen berücksichtigende Klassen vorgenommen werden.
Eine solche Klasseneinteilung für bestimmte Subpopulationen kann beispielsweise in "Schwachproduzenten", "mittlere Produzenten", "Hochproduzenten" und "Superproduzenten" erfolgen. Es besteht dann nach einer solchen Klassifizierung die Möglichkeit, lediglich in die Klasse "Superproduzenten" fallende Zellen für die weitere Kultivierung zu selektieren.
Die Klassifizierung kann sowohl in scharfer Form mit Messwerten von Eingangsparametern, als auch in unscharfer Form nach dem linguistischen Modellansatz sowie einer Kombination scharfer mit unscharfer Form durchgeführt werden, wobei die linguistischen Eingangsparameter x_i mit entsprechenden linguistischen Termen µ_i,j definiert werden können.
Solche linguistischen Terme können für die jeweils detektierte Fläche einer Region "klein", "mittel" oder "groß", für die Fluoreszenzintensität "sehr schwach", "schwach", "mittel", "stark" oder "sehr stark" sein. Für einen zu berücksichtigenden Durchmesserbereich als Eingangsparameter können ebenfalls entsprechende linguistische Terme, wie bei der Fläche definiert werden.
Für die Bestimmung des Abstandes zum nächsten Nachbarproduzenten als linguistischer Eingangsparameter können die entsprechenden linguistischen Terme "kurz", "mittel" oder "lang" sein.
Mögliche linguistische Terme für einen Bereichsumfang können wieder analog wie für die Fläche bzw. den Durchmesser definiert werden.
Bei dem Eingangsparameter Konturform können linguistische Terme, wie "kreisförmig", "mittel" oder "elliptisch" definiert werden.
In dieser Form kann eine Fuzzifizierung und Umwandlung in entsprechend geeignete unscharfe Mengen durchgeführt werden, um gegebenenfalls nachfolgend Entscheidungsmuster in Form von unscharfen Regeln aus den ermittelten Bilddaten extrahieren zu können.
Unter Berücksichtigung der verschiedenen Eingangsparameter x_i und der durch Fuzzyfizierung der linguistischen Eingangsvariablen in geeignete unscharfe Mengen erzeugten unscharfen Terme µ_i,j kann die linguistische Ausgangsvariable y "Syntheseleistung" durch die bereits erwähnte unscharfe Klassifikation als linguistische Ausgangstermbeschreibung ν_k (unscharfe Ausgangsbeschreibung) und/oder nach Defuzzyfizierung als scharfer Ausgangswert k (konkrete Klasse) bestimmt werden.
Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.
Dabei zeigen:
Fig. 1 in schematischer Form den Ablauf der Erfassung, Verarbeitung von zweidimensional aufgenommenen Bildern sowie zur Einteilung von Antikörper bildenden Zellen in verschiedene Klassen und
Fig. 2 den Ablauf zur Ermittlung von Positionskoordinaten von Zellen mit erhöhter Syntheseleistung und deren gezielter Selektion.
Beispielsweise können identische Antikörper mit einer gezielten und gewünschten Struktur aus Myelomzellen, die mit B-Lymphozyten verschmolzen sind, gewonnen werden. Diese Hybridzellen (Hybridom-Zellen) entwickeln auf dem Wege der klonalen Proliferation Zellfamilien (Klone), die genetisch identisch sind und damit absolut strukturgleiche monoklonale Antikörper mit einer einheitlichen Antigenspezifizität produzieren.
Der von solchen Zellen, auch als Präzipitat bezeichnete hochmolekulare Antikörper-Antigen-Komplex bildet um jede Zelle, die zur Antikörperbildung in der Lage ist, ein wolkenförmiges Gebilde. Ein in der Nährlösung enthaltender steriler Fluorophor lagert sich an den Proteinen an und nach Bestrahlung mit entsprechend geeignetem Licht, wird Fluoreszenz angeregt.
Nach Ablauf einer vorgegebenen Zeit bzw. auch nach Ablauf von bestimmten Zeiten kann intervallweise eine Überprüfung vorgenommen werden, ob von den Zellen tatsächlich monoklonale Antikörper gebildet werden, die Syntheseleistung einzelner Zellen qualitativ bewertet und/oder für solche Zellen dreidimensionale Positionskoordinaten ermittelt werden.
Hierzu werden in den einzelnen Ebenen innerhalb des Gefäßes zweidimensionale Bilder erfasst und mittels einer elektronischen Bildverarbeitung, wie sie beispielsweise unter der Handelsbezeichnung "analySIS" von der Firma Soft Imaging System, DE als geeignete Software kommerziell erhältlich ist, weiter verarbeitet, wie dies in der schematischen Darstellung nach Fig. 1 im oberen Bereich ersichtlich ist. Im folgenden wird dann eine Auswahl, die die Syntheseleistung einzelner Zellen berücksichtigt, durchgeführt.
Mit Fig. 2 soll schematisch die Vorgehensweise für eine differenzierte Selektion von sogenannten Hochproduzenten HP_n verdeutlicht werden.
Dabei entspricht z- der jeweiligen Ebene in der ein zweidimensionales Bild erfasst und ausgewertet werden kann. Mit a ist der Abstand der einzelnen Ebenen voneinander, in denen zweidimensionale Bilder aufgenommen und berücksichtigt werden, bezeichnet.
Wird nunmehr in einer bestimmten Ebene ein solcher "Hochproduzent" ermittelt, können dessen dreidimensionale Positionskoordinaten x, y, z sowie der Präzipitatdurchmesser für eine Selektion einer solchen Zelle mit der entsprechend hoher Syntheseleistung genutzt werden.

Claims

1. Vorrichtung zur Bestimmung der relativen Syntheseleistung von Zellen und/oder der Positionskoordinaten dieser Zellen, wobei die sekretorisch Proteine bildenden Zellen in einer Nährlösung in einem Gefäß enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nährlösung mit semisolider Konsistenz ein für das jeweilige Protein spezifischer Fluorophor enthalten ist und ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem Videosystem und einer elektronischen Bildverarbeitung zur dreidimensionalen Bestimmung der Positionskoordinaten von Regionen erhöhter Fluoreszenzlichtintensität innerhalb des Gefäßes vorhanden sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein elektronisch gesteuerter Mikromanipulator zur selektiven Aufnahme einzelner Zellen aus dem Gefäß, unter Berücksichtigung der bestimmten Positionskoordinaten vorhanden ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung eine mindestens zwanzigfach höhere Viskosität als reines Wasser aufweist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nährlösung zur Einstellung der semisoliden Konsistenz viskositätserhöhende Substanzen enthalten sind.

5. Verfahren zur Bestimmung der relativen Syntheseleistung von Zellen und/oder der Positionskoordinaten, bei dem die sekretorisch Proteine bildenden Zellen in einer Nährlösung mit semisolider Konsistenz in einem Gefäß enthalten sind, in die Nährlösung ein für das jeweilige Protein spezifisch bindende Substanzen eingebracht und mit Licht eine Fluoreszenzanregung erreicht wird; außerdem eine zweidimensionale Bildaufnahme mit einer ortsaufgelösten Erfassung der Fluoreszenzlichtintensität in verschiedenen parallel zueinander ausgerichteten und in vorgebbaren Abständen zueinander angeordneten Ebenen, zur Bestimmung dreidimensionaler Positionskoordinaten von Regionen erhöhter Fluoreszenzintensität innerhalb des Gefäßes ausgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass lediglich die Positionskoordinaten für Regionen, die einen vorgebbaren Schwellwert einer Fluoreszenzintensität übersteigen, berücksichtigt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzintensität innerhalb der Regionen ortsaufgelöst bestimmt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Eingangsparameter neben der Fluoreszenzintensität auch die Fläche und/oder der Durchmesser der einzelnen Regionen innerhalb einer Ebene bestimmt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Eingangsparameter der Umfang und/oder die Konturform der Regionen bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass für eine Selektion als Eingangsparameter die Abstände einzelner Regionen zueinander bestimmt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzintensitätsschwerpunkt oder der Flächenschwerpunkt einer fluoreszierenden Region bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die Regionen unter Berücksichtigung zumindest der Eingangsparameter Fluoreszenzintensität, Fläche und/oder Durchmesser der einzelnen Bereiche, eine Einteilung, in Klassen vorgenommen wird und dabei verschiedene Syntheseleistung von Zellen den Klassen zugeordnet sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einteilung mittels vorgebbarer linguistischer Terme für die ausgewählten Eingangs- und/oder Ausgangsparameter vorgenommen wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einteilung und Auswahl bestimmter Bereiche mit Zellen, deren Syntheseleistung vorgebbare Parameter erfüllen, mittels scharfer und/oder unscharfer Klassifikation durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der bestimmten Positionskoordinaten innerhalb ausgewählter Regionen angeordnete Zellen, mittels eines elektronisch gesteuerten Mikromanipulators aus dem Gefäß aufgenommen werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der relativen Syntheseleistung der Zellen nach einem oder mehreren vorgebbaren Zeitabstand/-abständen durchgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mittels einer elektronischen Bildverarbeitung eine Bildkorrektur und/oder eine Grauwertbildung durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zweidimensionale Bildaufnahme in Ebenen, deren Abstand jeweils im Bereich von 20 bis 70 µm liegen, durchgeführt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung an monoklonale Antikörper bildenden Zellen durchgeführt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die semisolide Konsistenz der Nährlösung durch Zugabe viskositätserhöhender Substanzen auf eine mindestens zwanzigfach höhere Viskosität als reines Wasser eingestellt wird.