DE10207313A1

DE10207313A1 - Verfahren zur ortsspezifischen DNA-Rekombination

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Publication number: DE10207313A1
Application number: DE2002107313
Authority: DE
Original assignee: Vision 7 GmbH
Current assignee: Vision 7 GmbH
Priority date: 2002-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2003-09-11

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Verfahren und Kits zum Einbringen eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität in eukaryotische Zellen. Die Erfindung betrifft ferner Polypeptide mit Cre-Rekombinase-Aktivität sowie ein Reportersystem, welches nach Einbringen in eine entsprechende Zelle Aufschluß über eine erfolgreiche DNA-Rekombination gibt. Schließlich betrifft die Erfindung Kits zur Durchführung und zum Nachweis ortsspezifischer DNA-Rekombinationen.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verfahren und Kits zum Einbringen eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität in eukaryotische Zellen. Die Erfindung betrifft ferner Polypeptide mit Cre-Rekombinase-Aktivität sowie ein Reportersystem, welches nach Einbringen in eine entsprechende Zelle Aufschluß über eine erfolgreiche DNA-Rekombination gibt. Schließlich betrifft die Erfindung Kits zum Nachweis ortsspezifischer DNA- Rekombinationen.

Stand der Technik

Sequenz-spezifische Rekombinationen, die zu einem gerichteten Einfügen, Ausschneiden oder zu einer Inversion von Nukleinsäureabschnitten führen, können für eine Vielzahl von Anwendungen von großem Nutzen sein. In Bakterien, Bakteriophagen und Hefen wurden bereits einige ortsspezifische Rekombinasen gefunden und charakterisiert. Sie gehören zur Familie der λ-Integrasen (auch bezeichnet als "Tyrosin-Rekombinasen"), für die inzwischen über 100 Mitglieder aufgrund von Sequenzhomologien identifiziert wurden. Rekombinasen erkennen spezifische DNA-Sequenzen und katalysieren den gegenseitigen (reziproken) Austausch der DNA-Abschnitte zwischen diesen Erkennungssequenzen. Die am besten untersuchten Beispiele sind die Integrase aus dem Bakteriophagen λ, die bakteriellen Rekombinasen XerC und XerD, die Flp-Rekombinase aus Hefe sowie die zum Cre/lox-System gehörende Cre-Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1.

Die Funktion des Cre/lox-Systems im Vermehrungszyklus des Bakteriophagen P1 liegt unter anderem in der Zyklisierung des linearen Genoms und der Auflösung von dimeren Phagen-Plasmiden, um damit eine effiziente Aufteilung des Phagengenoms während der bakteriellen Zellteilung zu gewährleisten (Austin et al. (1981) Cell 25: 729-36; Abremski et al. (1983) Cell 32: 1301-11). Die Zielsequenz der Cre-Rekombinase, die sogenannte loxP-Sequenz, besteht aus 2 Rekombinase-Bindungselementen von 13 bp (Basenpaaren), die als "inverted repeats" eine zentrale Sequenz von 8 bp flankieren. Die zentrale 8 bp-Sequenz bestimmt die Orientierung der 34 bp loxP-Sequenz. Für ein Rekombinationsereignis formen vier Cre- Moleküle und zwei loxP-Sequenzen eine kreuzförmige Zwischenstruktur, die durch den reziproken Strangaustausch aufgelöst wird (Gou et al. (1997) Nature 389: 40-6).

Das Cre/lox-System ist aufgrund seiner Spezifität ein nützliches Werkzeug für viele Anwendungen in der Gentechnik (Sauer (1998), Methods 14: 381-392; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413-21). Die loxP-Sequenzen können beispielsweise in Vektoren oder in das Genom von anderen Zellen integriert werden und dort als Zielsequenz für gezielte Integrationen, Inversionen oder Exzisionen dienen. Ein DNA-Abschnitt, der von zwei loxP-Sequenzen mit gleicher Orientierung flankiert (d. h. "gefloxt") wird, wird durch die Cre-Aktivität herausgeschnitten. Die Zugabe eines Überschusses an "gefloxter" DNA zu einer Ziel-Sequenz mit einer oder zwei loxP- Stellen kann eine Integration dieser DNA an der entsprechenden Position zur Folge haben. Lox-Sequenzen in entgegengesetzter Orientierung ermöglichen dagegen die Inversion der flankierten Sequenz. Für den Rekombinationsvorgang werden außer der Cre- Rekombinase und den loxP-Sequenzen keine weiteren Faktoren benötigt (Abremski and Hoess (1984) JBC 259: 1509-14). Dies erleichtert die Anwendung des Cre/lox-Systems in den verschiedenen Zelltypen und in zellfreien Systemen.

Durch eine Cre-induzierte Inaktivierung von Genen nach abgeschlossener Entwicklung eines Organismus wird zum Beispiel die funktionelle Untersuchung von Genen, die für die Embryonalentwicklung des entsprechenden Organismus essentiell sind, ermöglicht. Auch wird die Entfernung von exogenen Sequenzen ermöglicht, wenn deren Wirkung nicht mehr erwünscht ist. So konnten zum Beispiel primäre Hepatozyten und myogene Zellen durch Expression des gefloxten SV40-Large-T-Antigens reversibel immortalisiert und somit unbegrenzt in vitro expandiert werden (Kobayashi et al. (2000) Science 287: 1258-62; Berghella et al. (1999) Hum Gene Therapy 10: 1607-17).

Durch das Ausschneiden eines DNA-Abschnittes können ebenso Gene aktiviert werden, indem sie z. B. in die Nähe eines aktiven Promotors gebracht werden (Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6). Cre- vermittelte Aktivierung von Genen kann aber auch durch Inversion von DNA-Abschnitten erreicht werden.

Eine weitere Anwendung, die zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die gezielte Integration von Transgenen (Gorman and Bullock (2000) Current opinion in Biotechnology 11: 455-60). Ferner wurden mit Hilfe des Cre/lox-Systems bereits synthetische Antikörper- Bibliotheken (Tsurushita et al. (1996) Gene 172: 59-63), gerichtete Chromosomen-Translokationen (Qin et al. (1994) PNAS 91: 1706-10) und Mosaik-Genome (Betz et al. (1996) Curr Biol 6: 1307-16) konstruiert oder humanisierte Tiermodelle durch gerichteten Genaustausch (Zou et al. (1994) Curr Biol 4: 1099-103) generiert.

Die Verwendung des Cre/lox-Systems bei der ortsgerichteten Rekombination von DNA in eukaryotischen Zellen wurde auch in der U.S.- Patentschrift 4,959,317 offenbart.

Ein bemerkenswertes Merkmal der Cre-Rekombinase ist die Fähigkeit, in den Zellkern zu gelangen und somit den Rekombinationsvorgang unabhängig von der Auflösung der Kernmembran während der Mitose einleiten zu können. Dieses ist besonders für eine Anwendung in stationären, postmitotischen Eukaryontenzellen nützlich. Zunächst wurde vermutet, daß die Cre-Rekombinase aufgrund ihrer geringen Größe von 38 Kilodalton passiv durch die Kernporen diffundiert. Einige Gruppen haben klassische Kernlokalisationssequenzen mit der Cre-Rekombinase fusioniert, um die Effizienz des Kerntransportes zu erhöhen (Gu et al. (1993) Cell 73: 1155-1164; Bergemann et al. (1995) NAR 23: 4451-56). 1999 wurde von Le et al. (NAR 27: 4703-9) jedoch gezeigt, daß das Cre-Protein endogene Kernlokalisationssignale aufweist, was ungewöhnlich ist für ein Protein, das seine Funktion in kernlosen Bakterienzellen ausübt.

Die Cre/lox-spezifische Rekombination in intakten Zellen wurde bei den bislang etablierten Anwendungen nur durch das Einbringen einer Cre-kodierenden Nukleinsäure in die Zielzellen ermöglicht. Das Cre-Gen wurde z. B. mittels Transfektion eines Expressionsvektors oder durch Infektion mit Retro- oder Adenoviren (Bergemann et al. (1995) NAR 23: 4451-56; Kanegae et al. (1995) NAR 23: 3816-3821) eingeschleust, oder es wurde durch Kreuzung mit einem Cre- transgenen Organismus mit den lox-Sequenzen zusammengeführt. Eine Kontrolle der Cre-Expression bzw. der Cre-Aktivität wurde bei diesen Ansätzen auf verschiedene Art erreicht. Das Cre-Gen kann z. B. unter die Kontrolle eines Promotors gebracht werden, der zeitlich bzw. gewebespezifisch reguliert wird (Gu et al. (1994) Science 265: 103-6).

Eine Induzierbarkeit der Cre-Aktivität kann durch die Expression von Cre-Fusionsproteinen mit sogenannten Hormon-Bindungsdomänen (HBDs) des Progesteron- oder Östrogen-Rezeptors erreicht werden (Metzger et al. (1995) PNAS 92: 6991-5; Kellendonk et al. (1996) NAR 24: 1404-11). Das Cre-HBD-Fusionsprotein wird in den Zellen konstitutiv exprimiert, es gelangt aber erst nach Zugabe des entsprechenden Steroid-Hormons in den Zellkern und kann daraufhin die Rekombination einleiten. Für die Induktion werden Hormon- Analoga benutzt, die nur mit der HBD des Fusionsproteins, aber nicht mit den endogenen Steriod-Rezeptoren interagieren. Trotzdem ist die Applikation dieser Steroide nicht unbedenklich. Ein weiterer Nachteil des Systems ist, daß einerseits die induzierte Rekombination auch bei der Applikation von hohen "Inducer"-Mengen nicht komplett ist und daß andererseits auch in Abwesenheit des Inducers eine Restaktivität der Cre-Rekombinase beobachtet werden konnte (Kellendonk et al. (1999) J Mol Biol. 285: 175-82; Schwenk et al. (1998) NAR 26: 1427-32). Diese Hintergrund-Aktivität macht sich besonders in vitro bemerkbar (Zhang et al. 1996 NAR 24: 543-8 Führmann-Benzakein et al. 2000 NAR 28: e99; Cheng et al. 2000 NAR 28: e108).

Mit Hilfe des Tet-Systems (Gossen and Bujard (1992) PNAS 89: 5547-51) konnte die Cre-Expression durch die Anwesenheit von Tetrazyklinen unterdrückt (St-Onge et al. (1996) NAR 24: 3875-77) oder induziert werden (Saam and Gordon (1999) JBC 274: 38071-82). Diese Methode umgeht die Applikation der bedenklichen Hormon- Analoga und benutzt statt dessen ein gut untersuchtes, nicht- toxisches Medikament für die Induktion. Das Tet-System hat aber den Nachteil, daß neben der "gefloxten" Zielsequenz und dem Cre- Gen unter dem tTA-responsiven Promotor ein weiteres Transgen nötig ist, das für das tet-Repressor-Transaktivator-Fusionsprotein (tTA) bzw. dessen reverse Form rtTA kodiert.

Die Einführung einer Cre-kodierenden Nukleinsäure birgt generell beachtliche Risiken: Zum Einen besteht die Gefahr einer Insertionsmutagenese infolge von unspezifischer Integration der exogenen DNA in das Genom der Zielzelle (Stocking et al. (1988) Cell 53: 869-79). Ein weiterer Risikofaktor ist die mit den meisten Systemen verbundene permanente bzw. für einen längeren Zeitraum anhaltende Expression der Cre-Rekombinase. So wurde kürzlich in zwei unabhängigen Arbeiten gezeigt, daß eine anhaltende Expression der Cre-Rekombinase ein verlangsamtes Wachstum und chromosomale Aberrationen in den untersuchten Zellen hervorruft (Silver and Livingston (2001) Mol Cell 8: 233-43; Loonstra et al. (2001) PNAS 98: 9209-14). Die Abhängigkeit der Cre-vermittelten Zytotoxizität von ihrer Endonukleaseaktivität läßt vermuten, daß kryptische loxP-Sequenzen, die in den Genomen von Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen gefunden wurden, bei einer hohen Expression der Rekombinase erkannt und rekombiniert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung von Verfahren zur ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen, welche das Einbringen eines Polypeptids mit Cre- Rekombinase-Aktivität in Zellen (vorzugsweise solche, die selbst nicht über ein solches Enzym verfügen) erlauben und die beschriebenen Nachteile der im Stand der Technik etablierten Verfahren, Transfer von für Cre-Rekombinase kodierenden Nukleinsäuren, nicht aufweisen.

Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, daß eine (z. B. rekombinant hergestellte) Cre-Rekombinase, die keine zusätzliche, heterologe Proteintransduktionsdomäne besitzt, bei Zugabe zum Kulturmedium intakter eukaryotischer Zellen, die weder elektrisch noch chemisch vorbehandelt wurden, von diesen aufgenommen wird und im Zellkern der Zellen einen spezifischen DNA- Rekombinantionsvorgang von DNA-Bereichen, die über entsprechende Erkennungssequenzen verfügen, zu katalysieren vermag. Die Rekombinationsrate kann dabei bereits nach einmaliger Applikation über 50% betragen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe somit durch ein in-vitro Verfahren zur ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen gelöst, bei dem man ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität, das keine heterologe Proteintransduktionsdomäne umfasst, zu einer eukaryotischen Zellkultur hinzufügt, deren Zellen (bzw. deren DNA) mindestens einen DNA-Bereich (DNA-Abschnitt) enthalten, der mindestens eine Erkennungssequenz enthält, die von dem Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität erkannt wird, und man die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA- Rekombination ermöglichen.

In der Regel können selbst lipophile Proteine mit einer molekularen Masse von mehr als 0,5 kD die Zellmembran nicht passieren.

Einige größere Proteine, wie z. B. das Homeobox-Protein Antennapedia (Antp) aus der Fruchtfliege Drosophila, die HIV-Proteine Tat und Vpr oder das Glykoprotein PreS2 aus dem Hepatitis B Virus (Ford et al. (2001) Gene Therapy 8: 1-4; Schwarze et al. (2000) Trends in Cell Biol 10: 290-5; Oess and Hildt (2000) Gene Ther 7: 750-8) sind hingegen in der Lage, durch die Plasmamembran in intakte Zellen zu gelangen. Der Mechanismus der sogenannten Proteintransduktion ist weitgehend ungeklärt. Die Aminosäuresequenzen, die die vermutlich passive Aufnahme vermitteln, konnten für Antp, Tat und PreS2 auf relativ kurze Abschnitte (11 bis 16 Aminosäuren) eingegrenzt werden. Die Transduktionsdomänen von Tat und PreS2 können relativ große Reporterproteine wie β- Galaktosidase (β-Gal, 120 kD) oder das grüne fluoreszierende Protein aus der Qualle Aequorea victoria (GFP, 27 kD) in intakte Zellen einführen (Schwarze et al. (1999) Science 285: 1569-72; Oess and Hildt (2000) Gene Ther 7: 750-8).

Nach einer vor kurzem veröffentlichten Arbeit (Jo et al. (2001) Nature Biotechnology 19: 929-33) wurde ein Cre-Fusionsprotein mit der Membran-Translokationssequenz des Kaposi-Fibroblasten- Wachstumsfaktor ("MTS" aus FGF-4) verwendet, um eine spezifische Rekombination in vitro und in vivo zu erreichen.

Umso überraschender ist die der Erfindung zugrunde liegende Erkenntnis, daß eine Cre-Rekombinase ohne heterologe Transduktionsdomäne ebenfalls in der Lage ist, die Plasmamembran der Zelle zu überwinden und in das Zellinnere zu gelangen (vgl. Beispiel 3).

Die erfindungsgemäße Verwendung eines Cre-Proteins ohne heterologe Proteintransduktionsdomäne hat gegenüber der Verwendung des Cre-MTS-Fusionsproteins von Jo et al. (loc. cit.) den Vorteil, daß weniger heterologe Peptidsequenzen, die unter Umständen die Zielzelle beeinflussen könnten, "transduziert" "werden. Die Effizienz der Rekombination bei Applikation des Cre-Proteins ohne heterologe Proteintransduktionsdomäne in serumhaltigem Medium ist ebenso hoch wie bei Applikation des von Jo et al. dargestellten Cre-MTS-Fusionsproteins in serumfreiem Medium. Somit können auch Zelltypen, die empfindlich auf Serumentzug reagieren (wie zum Beispiel murine Knochenmarkszellen), bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in serumhaltigem Medium effizient transduziert werden.

Die Verwendung einer solchen membrandurchgängigen Cre-Rekombinase eröffnet die Möglichkeit, gerichtete Rekombinationsvorgänge durchzuführen, wobei auf das Einbringen einer Cre-Rekombinase kodierenden Nukleinsäure in die Wirtszellen verzichtet werden kann, und die oben genannten Nachteile somit vermieden werden können. Das Polypeptid wird ferner in den Wirtszellen relativ schnell degradiert und nicht - wie bei Einführung einer für das Polypeptid kodierenden Nukleinsäure - über einen längeren Zeitraum permanent nachproduziert. Dadurch wird die Gefahr von zytotoxischen Effekten minimiert. Es besteht ferner nicht die Möglichkeit einer unspezifischen Integration von DNA in das Genom der verwendeten Wirtszellen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die schnellere Prozedur des Polypeptidtransfers (erfindungsgemäß weniger als 4 Stunden), wohingegen nach einem Nukleinsäuretransfer die Cre- Rekombinase erst ribosomal synthetisiert werden muß. Die spezifische DNA-Rekombination kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren somit innerhalb eines kurzen und definierten Zeitabschnittes durchgeführt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem Begriff "DNA-Rekombination" generell einen physikalischen Vorgang, der zu einem Austausch von DNA-Bereichen zwischen zwei verschiedenen DNA-Molekülen oder zwei verschiedenen Bereichen eines einzelnen DNA-Moleküls und somit zu einer Neuordnung des genetischen Ausgangsmaterials führt. Bei einer "ortsspezifischen DNA- Rekombination" handelt es sich in diesem Zusammenhang um eine DNA-Rekombination, die von einem Polypeptid mit enzymatischer Aktivität katalysiert wird, welches den zu rekombinierenden DNA- Bereich anhand definierter DNA-Sequenzabschnitte (sog. Erkennungssequenzen) erkennt und einen DNA-Strangaustausch zwischen zwei solchen Erkennungssequenzen (die aber auf unterschiedlichen DNA-Molekülen/Chromosomen lokalisiert sein können) vermittelt.

Bei den enzymatisch aktiven Polypeptiden, die einen solchen Vorgang katalysieren, kann es sich erfindungsgemäß um Polypeptide mit einer Cre-Rekombinase-Aktivität handeln, die mit den spezifischen Erkennungssequenzen interagieren, an denen sie die DNA schneiden und religieren. Als "Polypeptide mit Cre-Rekombinase- Aktivität" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polypeptide mit enzymatischer Aktivität bezeichnet, die die gleiche Reaktion zu katalysieren vermögen wie die aus der λ-Integrase-Familie der Rekombinasen stammende Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1. Die Polypeptide können dabei die Cre-Rekombinase-Aktivität als enzymatische Haupt- oder Nebenaktivität aufweisen. Die Polypeptide können darüber hinaus auch andere enzymatische und nicht- enzymatische Funktionen erfüllen. Natürlich kann es sich bei einem Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität, welches in dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden kann, auch um die Cre- Rekombinase des Bakteriophagen P1 selbst handeln. Der von dem Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität katalysierte Rekombinationsvorgang kann zu einem gerichteten Einfügen, Ausschneiden, Austausch oder zu einer Inversion des betreffenden, zu rekombinierenden DNA-Bereiches führen. Die Polypeptide mit Cre-Rekombinase- Aktivität weisen dabei keine heterologen Proteintransduktiondomänen auf.

Als Proteintransduktionsdomänen werden im Rahmen der Erfindung kurze Aminosäuresequenzen verstanden, die den Übergang eines größeren Proteins in eine intakte eukaryotische Zelle vermitteln können. Bei diesen Aminosäuresequenzen, die lediglich aus 11-16 Aminosäuren bestehen können, kann es sich beispielsweise um die entsprechenden Transduktionsdomänen aus dem Tat-Protein, dem Homeobox-Protein Antennapedia oder dem PreS2-Protein handeln. Der Begriff "heterolog" verdeutlicht, daß der die Proteintransduktionsdomäne darstellende Aminosäurebereich nicht zur natürlichen Primärstruktur des Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität zählt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebene Aminosäuresequenzen auf oder ist ein Derivat, ein Homolog (beispielsweise mit mindestens etwa 70% Identität, vorzugsweise mindestens etwa 85% Identität, wobei ein Homologiegrad von mindestens etwa 95% besonders bevorzugt ist) oder ein Fragment (das vorzugsweise eine Länge von mindestens 304 Aminosäuren und insbesondere mindestens die Aminosäuren 37 bis 340 der SEQ ID NO: 2 aufweist) derselben. Die Bezeichnung "SEQ ID NO:" entspricht der Sequenzkennzahl "<400>" nach WIPO Standard St.25.

Unter einem "Derivat" wird dabei vorliegend ein Polypeptid gleicher Primärstruktur verstanden, welches im Vergleich mit dem jeweiligen erfindungsgemäßen Polypeptid zusätzliche Modifikationen der Peptidseitenketten aufweist. Derartige Modifikationen sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Dabei kann es sich beispielsweise um die Glykosylierung von Asparagin-, Serin- oder Threonin- Resten, um die Bildung von Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten, um die kovalente Anheftung von Fluoreszenz-Markern (z. B. Alexa 488) oder von Coenzymen wie Biotin, Liponsäure oder Pyridoxalphosphat, oder um die Phosphorylierung von Tyrosin, Serin- oder Threoninresten handeln. Ein "Homolog" bezeichnet ein Polypeptid, dessen Primärstruktur sich zu maximal etwa 30% (vorzugsweise zu maximal etwa 15%, wobei maximal etwa 5% besonders bevorzugt sind) von der Primärstruktur des jeweiligen erfindungsgemäßen Polypeptids unterscheidet. Bei einem homologen Protein können eine oder mehrere Aminosäuren der Originalsequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht sein. Ferner können eine oder mehrere Aminosäuren der Originalsequenz deletiert oder zusätzliche Aminosäuren inseriert sein. Als "aktives Fragment" wird vorliegend ein Polypeptid bezeichnet, dessen Primärstruktur mit einem Bereich der Primärstruktur des jeweiligen erfindungsgemäßen Polypeptids übereinstimmt, wobei das aktive Fragment weniger Aminosäuren umfasst als das erfindungsgemäße Polypeptid. Ein aktives Fragment eines erfindungsgemäßen Polypeptids weist die gleiche enzymatische Aktivität wie das erfindungsgemäße Polypeptid auf, d. h. es katalysiert die gleiche chemische Reaktion wie das erfindungsgemäße Polypeptid.

Bei dem Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz handelt es sich um eine rekombinante Cre-Rekombinase (nachfolgend als "wtCre" bezeichnet), die sich von dem entsprechenden Enzym aus dem Bakteriophagen P1 durch einen Aminosäureaustausch in der Position 1 (Glycin anstelle von Methionin) unterscheidet. Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Polypeptid die Plasmamembran von intakten Zellen durchqueren und in den Zellkern eindringen kann, wo es bei Vorliegen entsprechender Erkennungssequenzen der dort lokalisierten genomischen DNA der Zelle eine DNA-Rekombination katalysiert. Überraschenderweise war das Polypeptid auch ohne jegliche heterologe Domänen in der Lage, nach externer Zugabe zu einer Kultur von Maus-Fibroblasten eine loxP-spezifische DNA-Rekombination zu katalysieren (Beispiel 6). Das in SEQ ID NO: 4 angegebene und mit "nlsCre" bezeichnete Polypeptid umfasst zu Zwecken der besseren Nachweisbarkeit des Polypeptids in den Zellen zusätzlich zu der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz das Antikörperepitop 9E10 (c-myc; Aminosäuren 360-371) sowie eine am N-Terminus lokalisierte SV40- Kernlokalisationssequenz (Aminosäuren 11-17). Die Kernlokalisationssequenz soll dabei die Effizienz des Transports des Polypeptids in den Zellkern erhöhen.

Im Hinblick auf die eukaryontischen Zellen, in denen die DNA- Rekombination durchgeführt werden kann, unterliegt das erfindungsgemäße Verfahren keinen Einschränkungen. So können beispielsweise Zellkulturen von isolierten Säugetier-Zellen, wie Zellen der Maus oder des Schweins, sowie isolierte Zellen humanen Ursprungs als Zielzellen dienen. Die Zielzellen können dabei aus den verschiedensten Bereichen des Körpers stammen. Die Zellen sind erfindungsgemäß intakt und bedürfen weder einer chemischen noch physikalischen Vorbehandlung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den eukaryotischen Zellen um humane oder murine Zellen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den humanen oder murinen Zellen um Knochenmarkszellen oder Fibroblasten.

Die Kultivierungsbedingungen, die ein erfolgreiches Einbringen eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität in die eukaryotischen Zellen (in das Zellinnere) sowie eine nachfolgende DNA- Rekombination erlauben, sind abhängig von den jeweils gewählten Zellen, in denen die DNA-Rekombination durchgeführt werden soll. Sie entsprechen generell den Kultivierungsbedingungen, die der Fachmann bei einer Zellkultur der entsprechenden Zellen anwenden würde, und sind demnach im Stand der Technik ausführlichst beschrieben. Sie umfassen u. a. die Anzucht und Vermehrung der isolierten Zellen in verschiedenen herkömmlichen Medien. Als Medien kommen u. a. Dulbeccos modifiziertes Bagle's Medium (DMEM) oder Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) in Betracht. Für den Fachmann versteht es sich, daß auch andere Medien und Cytokine Verwendung finden können, um den Cre-Transfer in die Zielzellen zu erlauben. Die Medien können Antibiotika wie beispielsweise Penicillin, Streptomycin oder Kanamycin in den gebräuchlichen Konzentrationen, Cytokine (z. B. Il-3, Il-6, SCF) und andere für die Kultivierung von Zellen nützliche Zusätze, wie beispielsweise fötales Kälberserum (FCS) oder Rinder-Serumalbumin (BSA), in verschiedenen Konzentrationen enthalten.

Anzucht und Kultivierung der Zellen können jeweils in dem für die jeweiligen Zellen empfohlenen Temperaturbereich in herkömmlichen Kulturschalen durchgeführt werden. Das Einbringen des Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität in die Zellen kann erfindungsgemäß durch eine einfache Zugabe des Polypeptids zum überstand der Zellkultur erfolgen. Dabei kann das Polypeptid in einer gepufferten wässrigen Lösung vorliegen, wie z. B. in einer PBS-Lösung. Die Zellanzucht sowie die Wahl alternativer Methoden der Zugabe, die sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, liegen im Bereich des durchschnittlichen Könnens des Fachmanns. Die Effizienz der Transduktion ist in erster Linie von der eingesetzten Konzentration des Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität abhängig (siehe Beispiel 4). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Zugabe des Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität in einer Konzentration von 100 nM bis 30 µM. Nach Zugabe des Polypeptids können die Zellen vorzugsweise für einen Zeitraum von 2-12 h weiter bei den gewählten Bedingungen inkubiert werden. Anschließend kann das Kulturmedium gegen frisches Nährmedium ausgetauscht werden.

Bei den Erkennungssequenzen, die von dem Polypeptid mit Cre- Rekombinase-Aktivität erkannt werden, kann es sich vorliegend um Nukleotidsequenzabschnitte handeln, die dem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann als "loxP"-Sequenzen bekannt sind. Dabei handelt es sich um Sequenzeabschnitte von 34 bp, die aus zwei umgekehrten Sequenzwiederholungen (inverted repeats) von jeweils 13 bp bestehen (vgl. SEQ ID NO: 5; bp 1-13 und 22-34), welche ein asymetrisches Zwischenelement (spacer) von 8 bp flankieren (vgl. SEQ ID NO: 5; bp 14-21). Das Zwischenelement verleiht dem gesamten loxP- Sequenzabschnitt seine Orientierung. Je nach Lokalisation und Orientierung der loxP-Sequenzabschnitte zueinander resultiert die Rekombination in verschiedene DNA-Anordnungen; so kann der flankierte Nukleotidsequenzbereich im Zuge der Rekombination ausgeschnitten, ausgetauscht, eingefügt oder invertiert werden. Flankieren beispielsweise zwei loxP-Erkennungssequenzen mit identischer Orientierung einen bestimmten DNA-Bereich, so resultiert der durch das Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität katalysierte Rekombinationsvorgang in einem Ausschneiden (oder einem Austausch) des zwischen den loxP-Erkennungssequenzen lokalisierten ("gefloxten") DNA-Bereichs. Der Begriff "identische Orientierung" bezieht sich dabei auf eine gleiche 5' → 3' Basenabfolge der von den inverted repeats eingeschlossenen Zwischenelemente zweier loxP-Erkennungssequenzen. Alle Basen des Zwischenelementes mit Ausnahme einer Position (Position 18 in SEQ ID NO: 5) können variieren, wobei nur Rekombinationen zwischen zwei loxP-Sequenzen mit homologen Zwischenelementen effizient sind (Hoess et al. (1986) NAR 14: 2287-2300). Der zu rekombinierende DNA-Bereich kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl auf einem oder mehreren Chromosomen einer eukaryotischen Zelle, als auch auf einem oder mehreren mobilen genetischen Elementen, wie beispielsweise einem Plasmid, lokalisiert sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen identischer Orientierung mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz. Erfindungsgemäß einbezogen sind dabei Nukleotidsequenzen, die sich in Bezug auf Basenaustausche, Deletionen und Insertionen einzelner oder mehrerer Nukleotide von diesen Sequenzen unterscheiden. In jedem der "inverted repeats" müssen 8-10 Basen der 13 Basen mit loxP übereinstimmen, um eine Cre-vermittelte Rekombination zu unterstützen (Abremski et al. (1988), J. Mol. Biol. 202: 59-66; Abremski and Hoess (1985), J. Mol. Biol. 184: 211-220).

Die Erfindung betrifft ferner ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität, das eine der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebene Aminosäuresequenz aufweist oder ein Derivat, ein Homolog oder ein Fragment derselben ist, wobei die natürliche Cre- Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 ausgenommen ist.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität. Gegenstand ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Sequenz, bei dem man eine für die genannte Aminosäuresequenz kodierende Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegebene Sequenz, in einen Expressionsvektor ligiert, man diesen in für den Vektor geeignete Wirtszellen einbringt und man die Zellen unter zur Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen kultiviert. Gegebenenfalls schließt sich ein Isolierungs- und Reinigungschritt an. Die unter SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 dargestellten Polypeptide mit Cre-Rekombinase-Aktivität wurden z. B. rekombinant hergestellt und als Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein heterolog in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt (vgl. Beispiel 1). Die Fusionsproteine wurden jeweils in Gegenwart von Thrombin inkubiert, um den GST-Anteil von den Cre-Rekombinase-Polypeptiden abzutrennen. Die Expression der Polypeptide kann selbstverständlich auch mit Hilfe anderer etablierter Verfahren oder in anderen Organismen wie z. B. in Hefe- oder Insektenzellen erfolgen. Entsprechende Verfahren der heterologen Expression von Polypeptiden sowie geeignete Aufreinigungsstrategien der Proteine oder Fusionsproteine sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und umfassen u. a. das Baculovirus-Expressionsystem, das 6xHis-tag- Expressionssystem, das Maltose-Bindeprotein (MBP)- Expressionssystem.

Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz kodiert. Die Nukleinsäuren weisen vorzugsweise die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegebene Nukleotidsequenz auf, wobei die Degenerierung des genetischen Codes erfindungsgemäß eingeschlossen ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung isolierte Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten bzw. ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren. Hinsichtlich der Wahl der Wirtszellen unterliegt die Erfindung keinen Einschränkungen, und es sind neben bakteriellen Zellen (wie E. coli) auch Hefezellen (wie z. B. S. cerevisiae oder P. pastoris), Insektenzellen und (höhere) Euraryontenzellen, wie z. B. CHO- oder BHK-Zellen, eingeschlossen.

Daneben betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität zur Durchführung einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen, bei der man Zellen, die mindestens einen DNA-Bereich enthalten, der mindestens eine Erkennungssequenz enthält, die von dem Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität erkannt wird, in Gegenwart des Polypeptids unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA-Rekombination erlauben.

Gemäß eines weiteren Aspektes betrifft die Erfindung ferner ein Reportersystem zum Nachweis einer DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen (beispielsweise ausgelöst durch Verwendung eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität), bei dem

a) ein erstes Reportergen von zwei Erkennungssequenzen identischer Orientierung flankiert und ein zweites Reportergen stromabwärts des ersten Reportergens lokalisiert ist, wobei stromaufwärts der beiden Erkennungssequenzen ein Initiationskodon und eine Ribosomen-Bindungsstelle lokalisiert sind, die eine Translation des ersten Reportergens ermöglichen, die durch ein Stopkodon zwischen den beiden Erkennungssequenzen beendet wird, und im Bereich zwischen den beiden Reportergenen kein funktionstüchtiges Initiationskodon lokalisiert ist; und
b) durch eine ortsspezifische DNA-Rekombination das zweite Reportergen in eine Position zu dem Initiationskodon gebracht wird, die eine Translation des zweiten Reportergens ermöglicht; und
c) die Genprodukte der beiden Reportergene voneinander zu unterscheiden sind.

Das Reportersystem erlaubt eine schnelle und quantitative Detektion einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in einer eukaryotischen Zelle. Es eröffnet die Möglichkeit, umgehend zu überprüfen, ob unter gegebenen Versuchsbedingungen bei der Transduktion eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität eine ausreichend hohe Transduktionseffizienz erzielt wurde. Das Reportersystem erlaubt somit eine begleitende Qualitätskontrolle der Cre- Proteinpräparation und der Transduktionsbedingungen (Medium- Zusammensetzung, Zeit der Inkubation, Temperatur etc.).

Bei den Erkennungssequenzen, die von einem Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität erkannt werden, kann es sich beispielsweise um loxP- (vgl SEQ ID NO: 5), um frt-Erkennungssequenzen oder um deren homologe, von Polypeptiden mit Cre- oder Flp-Rekombinase- Aktivität erkannten Sequenzen handeln. Die Erkennungssequenzen des Reportersystems weisen eine identische Orientierung zueinander auf, was eine Exzision des von ihnen flankierten ("gefloxten") DNA-Bereiches bewirkt. Durch die Exzision wird das erste Reportergen aus dem Genkonstrukt entfernt, wobei das zweite Reportergen in eine Position zu dem Initiationskodon und der Ribosomenbindungsstelle gebracht wird, die eine Translation (des Genprodukts) des zweiten Reportergens erlaubt, d. h. das Initiationskodon und das zweite Reportergen sollten nach der DNA- Rekombination in einem Leserahmen vorliegen. Da ortsspezifische DNA-Rekombinationen basengenau verlaufen, läßt sich eine genaue Vorhersage des zu erwartenden Rekombinationsproduktes treffen. Dem Fachmann ist es somit bei Konstruktion des Reportersystems möglich, die Basenabfolge diesbezüglich auszuwählen und die Funktionstüchtigkeit des Systems zu gewährleisten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Erkennungssequenzen loxP-Erkennungssequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz. Erfindungsgemäß eingeschlossen sind Erkennungssequenzen, die sich von den o. g. Sequenzen herleiten und sich durch einzeln ausgetauschte Nukleotide von diesen unterscheiden. Die Polypeptide mit Rekombinase- Aktivität, die sich in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Reportersystem verwenden lassen, können neben den Polypeptiden mit Cre-Rekombinase-Aktivität auch Polypeptide umfassen, die die enzymatische Aktivität einer anderen Rekombinase, wie beispielsweise die der lambda-Integrase Flp, aufweisen. Nukleotidsequenzen, die in eukaryotischen Zellen als Initiationskodon, Stopkodon oder Ribosomenbindungsstelle genutzt werden können, zählen zum Standardwissen des Fachmanns und können einschlägigen Lehrbüchern entnommen werden.

Als Reportergene werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Gene bezeichnet, die für Proteine kodieren, die einen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis ihrer Expression ermöglichen. Derartige Reportergene sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben und umfassen u. a. die für die β-Galaktosidase, die Luciferase oder die Chloramphenicol-Acetyltransferase kodierenden Gene. Die Durchführung des Nachweises der erfolgten Rekombination kann den Aufschluss der Zellen und/oder die Zugabe zusätzlicher Substanzen erfordern, deren biochemische Umsetzung durch das Genprodukt eines Reportergens erfassbar ist. Die Expression der β- Galaktosidase läßt sich beispielsweise sowohl colorimetrisch (mittels einer Anfärbung der Zellen) durch Umsetzung des Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG) oder X-Gal, fluorometrisch durch Umsetzung einer 4-Methylumbelliferyl-β- galactopyranosid-Verbindung oder durch Chemilumineszenz anhand der Umsetzung eines 1,2-Dioxetan-Galactopyranosid-Derivates nachweisen. Ferner können Gene Anwendung finden, die den Zellen eine Resistenz gegenüber zytotoxischen oder anderen Substanzen, die das Wachstum hemmen oder inhibieren, vermitteln. Der Nachweis der Expression dieser Gene erfolgt dabei durch Kultivierung der Zellen unter entsprechend selektiven Bedingungen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert mindestens eines der Reportergene für ein fluoreszierendes Protein. Die Messung der von lumineszenten Proteinen verursachten Lichtemissionen eignet sich insbesondere für in-vivo Messungen, da die Zellen nicht aufgeschlossen werden müssen und somit einem direkten Nachweis zugänglich sind. Aus diesem Grunde ist die Messung einer Fluoreszenz mit weniger zeitlichem und materiellem Aufwand verbunden. Aliquots der jeweiligen Zellkultur lassen sich während des Kulturwachstums mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes oder durchflußcytometrisch auf eine Emission von Licht hin untersuchen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das fluoreszierende Protein eine der in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 angegebenen Aminosäuresequenzen auf oder ist ein Derivat, ein Homolog oder ein aktives Fragment derselben. Dabei handelt es sich um das rot-fluoreszierende DsRed1- Protein aus Discosoma sp. bzw. um das enhanced green fluorescent protein (eGFP), einer Variante des GFP aus Aequorea victoria.

Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Reportersystem die in SEQ ID NO: 8 angegebene Nukleotidsequenz auf. Dieses Reporterkonstrukt (SFr) wurde generiert, in dem das für ein rotes fluoreszierendes Protein kodierende DsRed1-Gen von loxP-Sequenzen mit gleicher Orientierung flankiert wurde. Stromabwärts der zweiten loxP-Sequenz befindet sich der offene Leserahmen eines eGFP-Gens, welches für das "enhanced green fluorescent protein" kodiert und ein deletiertes ATG-Startkodon aufweist. Eine Ribosomenbindungsstelle und ein potentielles ATG-Initiationskodon im Leseraster des DsRed- Gens sind vor der ersten loxP-Sequenz lokalisiert. Die Übergänge sind so konstruiert, daß eine loxP-spezifische Rekombination zur Exzision des DsRed-Genes führt und gleichzeitig das eGFP-Gen in den richtigen Leserahmen zum ATG-Initiationskodon rückt (vgl. Fig. 2). Die Detektion einer Cre-spezifischen Rekombination kann fluoreszenzmikroskopisch oder durchflußcytometrisch erfolgen. Die Durchflußcytometrie erlaubt eine genaue Bestimmung der Rekombinationsrate, ohne daß die Zellen zuvor behandelt werden müssen.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen unter Verwendung eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität, bei dem man das erfindungsgemäße Reportersystem und ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität in eine eukaryotische Zelle einbringt und die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA- Rekombination ermöglichen, und im folgenden den Rekombinationsvorgang anhand des vom zweiten Reportergen kodierten Genprodukts nachweist (d. h., beispielsweise durch eine Änderung oder das Aufteten einer Fluoreszenz, wenn wenigstens ein Reportergen für ein fluoreszierendes Protein kodiert).

Dabei kann das erfindungsgemäße Reportersystem auch dazu verwendet werden, Rekombinationsvorgänge nachzuweisen, bei denen das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität nach den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren in die Zelle eingebracht wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität durch Transfektion oder durch virale Infektion mit einem Vektor, der eine für das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierende Nukleinsäure enthält, in die Zelle eingebracht, wobei man die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität ermöglichen. Die Expression kann dabei unter der Kontrolle einer konstitutiven oder induzierbaren Promotorstruktur stehen. Eine induzierbaren Promotorstruktur bezeichnet eine Promotorstruktur, bei der die Zugabe bestimmter Substanzen eine Änderung der Transkriptionsrate der zu kontrollierenden Nukleotidsequenz (wie z. B. eines Gens) zur Folge hat. Weiterhin kann eine Cre-Variante (zum Beispiel eine Fusion mit einer Hormon- Bindungsdomäne), die erst durch Zugabe einer Substanz (zum Beispiel ein Steroid-Hormon) "aktiviert" wird, konstitutiv exprimiert werden. Vorzugsweise erfolgt erst bei Zugabe dieser induzierenden Substanzen überhaupt eine ortsspezifische Rekombination. Das Reportersystem erleichtert die Kontrolle der Induzierbarkeit eines solchen Systems. (Induzierbare Promotorstrukturen, die im Rahmen des Verfahrens Anwendung finden können, sind dem Fachmann hinreichend bekannt.)

Das Reportersystem eignet sich darüber hinaus selbstverständlich auch dazu, Rekombinationsvorgänge nachzuweisen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren der ortsspezifischen DNA-Rekombination initiiert wurden, und bei denen das Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität zum Kulturüberstand der eukaryotischen Zellkultur gegeben wurde. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid ein Polypeptid mit Cre- Rekombinase-Aktivität, das die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist oder ein Derivat, ein Homolog oder ein aktives Fragment derselben.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des beschriebenen Reportersystems zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA- Rekombination in eukaryotischen Zellen.

Im Rahmen einer in vivo-Anwendung wird ein Polypeptid mit Cre- Rekombinase-Aktivität (ohne heterologe PTD, z. B. nach SEQ ID No. 2 oder 4) beispielsweise in Mäuse injiziert, die entweder transgene Cre-Erkennungssequenzen tragen, mit rekombinanten Viren infiziert wurden oder ein Transplantat (z. B. Knochenmark) mit solchen Sequenzen erhalten haben. Die Injektion kann dabei direkt in das entsprechende Organ oder in die Blutbahn erfolgen und kann, je nach Position der Erkennungssequenzen, in einer partiellen Inaktivierung oder Aktivierung von Genen, oder auch zum Beispiel in einer chromosomalen Translokation resultieren. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Verwendung eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität (s. o.) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Durchführung einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen in vivo. Demgemäß ist Erfindungsgegenstand auch ein das erfindungsgemäße Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität (s. o.) enthaltendes pharmazeutisches Präparat, das gegebenenfalls zusätzlich pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und Trägerstoffe enthält.

Darüber hinaus schließt die Erfindung Wirtszellen, die das erfindungsgemäße Reportersystem enthalten, sowie Wirtszellen, die das erfindungsgemäße Reportersystem und das erfindungsgemäße Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität enthalten, ein. Hinsichtlich der Wahl der Wirtszellen unterliegt die Erfindung keinen Einschränkungen, und es sind neben bakteriellen Zellen (wie E. coli) auch Insektenzellen und (höhere) Euraryontenzellen, wie z. B. murine und humane Zellinien CHO- oder BHK-Zellen, eingeschlossen.

Die Erfindung betrifft auch Kits zur Durchführung einer ortsspezifischen Rekombination.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung eines Verfahrens zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA- Rekombination in eukaryotischen Zellen unter Verwendung eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität. Die Kits können neben dem erfindungsgemäßen Reportersystem u. a. einen geeigneten Transformationsvektor und verschiedene Reagenzien enthalten, die beim Einbringen des Reportersystems in die Zellen nützlich sind.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher beschrieben.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 (A) schematische Darstellung der Polypeptide nlsCre, PTD-nlsCre, TLM-nlsCre und wtCre nach ihrer Aufreinigung als GST- Fusionsprotein und Abspaltung des GST-Anteils mit Thrombin. Die einzige Abweichung des rekombinanten wtCre-Proteins zur nativen Cre-Aminosäuresequenz (Accession No. P06956) ist ein Glycin anstelle von Methionin an Position Nr. 1. Das modifizierte Protein nlsCre weist gegenüber wtCre einen Aminosäureaustausch (Threonin anstelle von Alanin) an Position 207, die zusätzliche SV40- Kernlokalisationssequenz ("NLS", Aminosäuren 11-17 in SEQ ID NO: 4) am N-Terminus und ein 9E10 (c-myc)-Epitop ("myc-tag", Aminosäuren 360-371 in SEQ ID NO: 4) am C-Terminus auf. Demgegenüber enthalten die Proteine TLM-nlsCre und PTD-nlsCre zusätzlich die bekannten Proteintransduktionsdomänen PreS2-TLM aus HBV bzw. Tat- PTD aus HIV-1. (B) SDS-PAGE zum Nachweis von nlsCre, TLM-nlsCre, PTD-nlsCre und wtCre. Die Cre-Proteine wurden als GST- Fusionsproteine in E. coli exprimiert, affinitätsgereinigt und mit Thrombin vom GST-Anteil freigespalten. Die Proteinpräparationen wurden mittels SDS-PAGE in einem 12,5%igen Gel aufgetrennt, und die Proteine wurden anschließend durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht.

Fig. 2 Reportersystem zur Detektion von Cre-Rekombinase- Aktivität. In dem retroviralen Reporterkonstrukt SFr (SEQ ID NO: 8) ist das DsRed1-Gen (kodiert für ein rotes fluoreszierendes Protein) von loxP-Sequenzen mit gleicher Orientierung flankiert. Distal der zweiten loxP-Sequenz befindet sich der offene Leserahmen des eGFP-Gens (kodiert für das "enhanced green fluorescent protein"), in dem das ATG-Startkodon deletiert wurde. Eine Kozak- Konsensussequenz und ein potentielles ATG-Initiationskodon im Leseraster des DsRed-Gens sind vor der ersten loxP-Sequenz lokalisiert. Die Übergänge sind so konstruiert, daß eine lox- spezifische Rekombination zur Exzision des DsRed-Genes führt und gleichzeitig das eGFP-Gen in den richtigen Leserahmen zum ATG- Initiationskodon rückt. Zellen, die mit diesem Reporterkonstrukt stabil transduziert sind, zeigen eine rote Fluoreszenz. Nach Cre/lox-spezifischer Rekombination wird eGFP anstelle des DsRed1- Gens exprimiert, und die Zellen zeigen eine grüne Fluoreszenz.

Fig. 3 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von klonalen Reporterzellen, die 2 Tage zuvor in Medium mit 800 nM rekombinantem, gereinigtem nlsCre-Protein kultiviert wurden. Unter allen behandelten Reporterzell-Klonen konnten Zellen mit deutlicher grüner Fluoreszenz detektiert werden (hier gezeigt für Klon 12 und 15), die in unbehandelten Zellpopulationen nicht beobachtet wurden. Die nicht-homogene Lokalisation des DsRed1-Proteins in den Zellen ist vermutlich auf dessen Tendenz zur Aggregation zurückzuführen (Clontech-Produktinformation).

Fig. 4 Nachweis der lox-spezifischen Rekombination auf chromosomaler DNA-Ebene. (A) Positionen der Primer für eine PCR auf dem Reporterkonstrukt SFr. Eine präzise, Cre-vermittelte Exzision des DsRed1-Gens führt zu einer Vorlage, die um 735 bp verkürzt ist. (B) Genomische DNA aus unbehandelten (-) oder mit rekombinantem nlsCre-Protein inkubierten (+) Reporterzellen (Klone 12 und 15) wurde als "Template" mit den PCR-Primern p1 und p2 eingesetzt. Neben dem erwarteten PCR-Produkt von 1099 bp für die nicht- rekombinierte Vorlage konnte in den (+)-Proben das nach spezifischer Rekombination erwartete Produkt von 364 bp detektiert werden. Die Identität der sichtbaren Banden wurde durch Sequenzanalyse überprüft.

Fig. 5 Abhängigkeit der Rekombinationsrate von der Konzentration des nlsCre-Proteins im Medium. (A) Reporterzellen wurden für 6 Stunden in Medium (MEM mit 10% FCS) mit unterschiedlichen Konzentrationen an nlsCre inkubiert und 48 Stunden später mittels Durchflußzytometrie auf eGFP- und DsRed1-Expression analysiert (zur Auswertung siehe auch Abschnitt B). Der Anteil eGFP- positiver Zellen ist in Abhängigkeit von der nlsCre-Konzentration im Medium dargestellt. Unter diesen Bedingungen wurde durch die Zugabe von 5 µM nlsCre eine Rekombinationsrate von über 50% erreicht. (B) Reporterzellen wurden für 6 Stunden mit 2,5 µM nlsCre in serumfreien Medium (MEM ohne FCS) inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durchflußzytometrisch analysiert und die DsRed1-Expression gegen die eGFP-Expression mit Hilfe der "Cellquest"-Software (Becton Dickinson) geplottet und ausgewertet. Während in unbehandelten Zellen (mock) keine eGFP-Expression detektiert werden konnte, waren > 50% der nlsCre-behandelten Zellen eGFP-positiv.

Fig. 6 Cre/lox-spezifische Rekombination in murinen Knochenmarkzellen nach Zugabe von nlsCre-Protein zum Medium. Schematische Darstellung des endogen "gefloxten" C/EBPα Lokus vor und nach lox-spezifischer Rekombination. Durch die erste PCR mit den Primern p3 und p4 konnte der C/EBPα^fl/fl-Lokus in der genomischen DNA der Knochenmarkzellen nachgewiesen werden. Mit der zweiten PCR (Primer p5 und p6) konnte nur in der genomischen DNA von nlsCre- oder PTD-nlsCre-behandelten Knochenmarkzellen das spezifische 400 bp-Produkt detektiert werden, das nach der Exzision von C/EBPα entsteht. Die 400 bp-Produkte wurden durch Sequenzanalyse verifiziert.

Fig. 7 spezifische Rekombination nach Zugabe von nicht- modifizierter Cre-Rekombinase. Reporterzellen wurden mit 1 µM des wtCre-Proteins für 3 Stunden inkubiert. Nach zwei Tagen konnten im Fluoreszenzmikroskop ca. 1,5% eGFP-exprimierende Zellen detektiert werden.

Beispiele

Klonierungen, Annealing von Oligonukleotiden, Phosphorylierung von DNA-Fragmenten und die Präparation von chromosomaler DNA wurden nach Standardprotokollen (Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology John Wiley & Sons. New York, USA) durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden mit Taq-Polymerase (Qiagen) oder Platinum PfxI-Polymerase (Gibco BRL) nach Empfehlungen der entsprechenden Firma durchgeführt. Der Mung bean-Nuklease Verdau wurde nach Empfehlung der Firma Promega durchgeführt.

Beispiel 1 Darstellung von rekombinanter, gereinigter Cre- Rekombinase Beispiel 1a Konstruktion von Vektoren für die Expression von Cre-Rekombinase

Als Expressionsvektor für die Produktion von GST-Cre- Fusionsproteinen in E. coli wurde pGEX-2T(KT) verwendet (SEQ ID NO: 9), ein modifizierter pGEX-2T-Vektor mit der Multiklonierungsregion aus pEG(KT) (Mitchell et al. (1993) Yeast 9: 715-723). Für die Klonierung von pGEX-nlsCre wurde pGEX-2T(KT) mit XhoI linearisiert, die Überhänge mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und anschließend mit NcoI geschnitten. Ein modifiziertes Cre-Gen (Bergemann et al. (1995) NAR 23: 4451-6) wurde aus R815 (Prassolov et al. (2001) Exp Hematol. 29: 756-65) mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und XbaI isoliert, wobei der XbaI-Überhang ebenfalls mit Hilfe des Klenow-Fragmentes geglättet wurde. Das Cre- kodierende DNA-Fragment wurde anschließend mit pGEX-2T(KT) ligiert.

Für die Konstruktion von pGEX-TLM-nlsCre wurden die Oligonukleotide TLM+ (SEQ ID NO: 10; 5'-GATCCCCGCTGTCTTCCATTTTCTCCCGTATC- GGCGATCCGGGTGGCGGTTC-3') und TLM- (SEQ ID NO: 11; 5'- CATGGAACCGCCACCCGGATCGCCGATACGGGAGAAAATGGAAGACAGCGGG-3'), für pGEX-PTD-nlsCre die Oligonukleotide PTD+ (SEQ ID NO: 12; 5'- GATCCTATGGCCGTAAAAAGCGCCGTCAGCGCCGCCGTCC-3') und PTD- (SEQ ID NO: 13; 5'-CATGGGACGGCGGCGCTGACGGCGCTTTTTACGGCCATAG-3') hybridisiert und phosphoryliert. Die entstandenen 52 bp bzw. 40 bp-Fragmente wurden jeweils in das BamHI/NcoI-linearisierte Plasmid pGEX- nlsCre insertiert.

Die eingeführten DNA-Fragmente kodieren für Aminosäuresequenzen aus dem PreS2-Glycoprotein von HBV bzw. aus dem tat-Protein von HIV-1. Für beide Sequenzen wurde gezeigt, daß sie die Aufnahme von rekombinanten Reporterproteinen in Zellen vermitteln können (Oess and Hildt 2000 Gene Therapy 7: 750-8; Schwarze et al. 1999 Science 285: 1569-72). Das modifizierte Cre-Gen aus R815 kodiert für die Cre-Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 mit einem Aminosäureaustausch (Threonin anstelle von Alanin) an Position 207, die zusätzlich die SV40-Kernlokalisationssequenz (Aminosäuren 11-17 in SEQ ID NO: 4) am N-Terminus und ein 9E10 (c-myc)-Epitop (Aminosäuren 360-371 in SEQ ID NO: 4) am C-Terminus enthält. Die modifizierte Cre-Rekombinase wird im Folgenden als "nlsCre" bezeichnet.

Für die Herstellung einer Cre-Rekombinase ohne C- und N-terminale Modifikationen wurde zunächst eine PCR mit pGEX-nlsCre als Vorlage und den Oligonukleotide Cre-N (SEQ ID NO: 14; 5'- GAAGAGGAAGGGATCCAATTTACTGACCG-3') und Cre-C (SEQ ID NO: 15; 5'- CAGAAATAAGCTTTTGTTCCTAATCGCCATC-3') unter Verwendung der PfxI- Polymerase (Gibco Life Technologies) durchgeführt. Das entstandene 1060 bp-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII geschnitten, und die entstandenen 683 bp (BamHI- HindIII) und 355 bp (BamHI)-Fragmente wurden nacheinander in den BamHI-HindIII-geöffneten Vektor pGEX-2T(KT) insertiert.

Des weiteren wurde der Basenaustausch, der zu der A207T-Mutation in nlsCre führt, unter Verwendung der Oligonukleotide 207+ (SEQ ID NO: 16; 5'-GGTTAGCACCGCAGGTGTAG-3') und 207- (SEQ ID NO: 17; 5'-CTACACCTGCGGTGCTAACC-3') mittels der "overlap extension- Methode" (Ho et al. (1989) Gene 77: 51-59) korrigiert. Das gesamte wtCre-Gen (SEQ ID NO: 1) in dem so entstandenen Vektor pGEX-wtCre wurde durch Sequenzanalyse verifiziert.

Nach der in Beispiel 1b beschriebenen Expression, Aufreinigung und dem Thrombin-Verdau des GST-wtCre-Fusionsproteins wird das "wtCre"-Protein (SEQ ID NO: 2) dargestellt, das sich von der beschriebenen, "natürlichen" Cre-Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 (Accession NO: P06956) nur an Position 1 (Glycin statt Methionin) unterscheidet.

Beispiel 1b Expression und Affinitätsreinigung der Cre- Fusionsoroteine

Transformanden des E. coli-Expressionsstammes BL21- CodonPlus(DE3)-RP (Stratagene) mit den Expressionsplasmiden pGEX- nlsCre, pGEX-TLM-nlsCre, pGEX-PTD-nlsCre und pGEX-wtCre wurden in 1 l LB (+ 100 mg/l Ampicillin und 50 mg/l Chloramphenicol) bis zu einer OD₆₀₀ von 0.7 kultiviert und 8 Stunden bei 25 Grad mit 0.5 mM IPTG induziert. Der Aufschluß der Zellen erfolgte in 40 ml PBS, 0.5% Triton-X-100, 0.5 mM Pefabloc (Roche Diagnostics GmbH) durch Ultraschall. Nach Zentrifugation bei 4000 × g wurde der überstand mit 500 µl Glutathion-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia) 3 h bei 4°C im Drehrad inkubiert. Die Sepharose wurde 3 × 10 min im Drehrad mit 40 ml PBS, pH 7.0 gewaschen. Die Identität der GST-Cre-Fusionsproteine wurde immunologisch mit dem monoklonalen anti-myc-Antikörper (9E10) überprüft. Zur Abspaltung der Cre- Proteine vom GST-Anteil wurde die Sepharose mit 10 units Thrombin (Amersham Pharmacia) in 1 ml PBS/100 mM Na₂HPO₄ 16 Stunden bei 25 Grad im Drehrad behandelt.

Die durch Thrombin-Verdau freigesetzten Cre-Proteine zeigten im SDS-Gel ein Laufverhalten, welches den erwarteten Molmassen entspricht (Fig. 1, A und B). NlsCre, TLM-nlsCre, PTD-nlsCre und wtCre wurden in einer Konzentration von 100 bis 500 ng/µl (2-12 µM) erhalten.

Beispiel 2 Darstellung eines Reportersystems zur Detektion von Cre-Aktivität Beispiel 2a Konstruktion des retroviralen Reporterkonstruktes SFr (Fig. 2)

Die Konstruktion des Reporterkonstruktes SFr (= SFβ91-loxP-DsRed1- loxP-eGFP-wPRE, SEQ ID NO: 8) verlief über mehrere Zwischenschritte. Alle Plasmid-Amplifizierungen wurden in RecA- defizienten E. coli-Stämmen (DHSα oder DH10B von Gibco BRL) bei einer Wachstumstemperatur von 28°C durchgeführt.

1. Die loxP-Sequenz vor dem DsRed-Gen (loxP1) wurde durch Hybridisierung der Oligonukleotide loxP1+ (SEQ ID NO: 18; 5'- GGCCGCATGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATC-3') und loxP1- (SEQ ID NO: 19; 5'-CATGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCATGC-3'), die loxP-Sequenz nach dem DsRed-Gen (loxP2) durch Hybridisierung der Oligonukleotide loxP2+ (SEQ ID NO: 20; 5'- GATCTTAGTCGACGCGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCAGGCCTGCAC- 3') und loxP2- (SEQ ID NO: 21; 5'-GTGCAGGCCTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTCGACTAA-3') erhalten. Die loxP- Fragmente wurden anschließend mit Polynukleotidkinase (MBI- Fermentas) phosphoryliert.
2. Für die Konstruktion von pDsRed1-loxP2 wurde pDsRed1-C1 (Clontech) mit XmaI geschnitten, die Überhänge mit Hilfe des Klenow- Fragmentes geglättet, anschließend mit BglII verdaut und das loxP2-Fragment in den so vorbereiteten Vektor insertiert.
3. pKS-loxP1-DsRed1(Cterm)-loxP2 entstand durch eine 3-Fragmente- Ligation des loxP1-Fragmentes und des 326 bp NcoI-BamHI- Fragmentes aus pDsRed1-loxP2 mit dem Not1-BamHI-geöffneten Vektor pBlueskript(KS+) (Stratagene). Durch nachfolgende Insertion des 423 bp-NcoI-Fragmentes aus pDsRed1-C1 in den NcoI-geschnittenen pKS-loxP1-DsRed1(Cterm)-loxP2 in der richtigen Orientierung wurde das Zwischenkonstrukt pKS-loxP1-DsRed1-loxP2 erhalten.
4. Die loxP1-DsRed1-loxP2-Sequenz wurde mittels NotI/XmaI-Verdau aus pKS isoliert, und die Überhänge wurden mit Mung Bean-Nuklease (Promega) geglättet. pSFβ91-eGFP(tag) (Wahlers et al. (2001) Gene Ther 8: 477-86, Schambach et al. (2000) Mol. Ther. 2: 435-45) wurde mit NcoI linearisiert, die Überhänge mit Mung Bean-Nuklease geglättet, und das loxP1-DsRed1-loxP2-Fragment wurde insertiert. Nach Überprüfung der Orientierung und der Übergänge mittels Sequenzanalyse konnte pSFβ91-loxP-DsRed1-loxP-eGFP mit einem "in frame"-Übergang zwischen loxP2 und dem eGFP-Gen isoliert werden. Der "in frame"-Übergang gewährleistet die Translation von eGFP nach Cre-vermittelter Excision durch die korrekte Positionierung zum ATG-Startkodon vor loxP1.
5. Zur Erhöhung der Expression des retroviralen Reporterkonstruktes in den Zielzellen wurde das HindIII-Fragment mit wPRE (woodchuck HBV posttranscriptional regulatory element, Zufferey et al. (1999) J Virol. 73: 2886-92) aus pKS-γwPRE isoliert (Schambach et al. (2000) Mol Ther. 2: 435-45) und in die HindIII-Stelle von SFβ91-loxP-DsRed1-loxP-eGFP insertiert. Die richtige Orientierung wurde durch Restriktionsverdau überprüft.

Beispiel 2b Klonierung von Maus-Fibroblasten nach Transduktion mit SFr

Die Verpackungszellinie Phoenix-gp (http: / / www.stanford.edu/group/nolan/) wurde mit dem Reporterkonstrukt SFr sowie mit Expressionsplasmiden für MoMuLV-gag/pol (das Expressionsplasmid für gag/pol, pSVgag/pol, enthält das gagpol-Gen aus MoMuLV unter der Kontrolle des SV40-Promotors) und für das ecotrophe Hüllprotein von MoMuLV (Morita et al. (2000) Gene Ther. 7: 1063-66) transfiziert. Die Maus-Fibroblasten-Zellinie SC-1 wurde mit den virus- haltigen Überständen infiziert. Nach drei Tagen konnten SC-1 Zellen, in denen das Reporterkonstrukt stabil integriert war, durch ihre rote Fluoreszenz mikroskopisch und durchflußytometrisch nachgewiesen werden. Mittels Einzelzellablagen konnten 5 SC-1 Klone (Klon 3, Klon 8, Klon 10, Klon 12 und Klon 15) isoliert werden, die eine stabile Expression von DsRed1 zeigen. Bei keinem dieser Klone konnte in dem Beobachtungszeitraum (Wochen bis Monate) eine spontane Rekombination beobachtet werden, die sich in der Expression von eGFP manifestierte.

Zur Verpackung des Reporterkonstruktes SFr in ecotrophe Viren wurden Phoenix-gp Verpackungszellen in Dulbeccos' modifizierten Eagle's Medium (DMEM) mit 2 mM Glutamin und 10% Fötalem Kälberserum (FCS, Sigma) kultiviert. Die Transfektion von 10⁷ Phoenix-gp mit 10 µg Expressionsplasmid für MoMuLV gagpol, 5 µg SFr und 3 µg Expressionsplasmid für MoMuLV-env wurde nach der Ca₃(PO₄)₂- Methode (Ausrubel et al. (1994), s. o.) durchgeführt. Für die Transfektion und die Ernte der Überstände nach 44 Stunden wurde DMEM/FCS mit 20 mM HEPES, pH 7,5 verwendet. Zur Infektion wurden 50 µl des virushaltigen Überstandes in 500 µl DMEM/FCS/HEPES + 4 µg/ml Protaminsulfat auf 10⁵ SC-1 Zellen (ATCC NO CRL-1404) gegeben und 90 min bei 20°C und 800 × g zentrifugiert.

Die Kultivierung der SC-1 Reporterzellen erfolgte in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM, Sigma) mit 2 mM Glutamin und 10% FCS bei 37°C im Brutschrank.

Beispiel 3 loxP-spezifische Rekombination nach Zugabe von gereinigter Cre-Rekombinase ohne heterologe Transduktionsdomäne

Um zu untersuchen, ob extern zugegebenes Cre-Protein eine lox- spezifische Excision in den Reporterzellen auslösen kann, wurden verschiedene SFr-transduzierte SC-1-Klone (jeweils 10⁵ Zellen pro Zellkultur-Schale mit 1,5 cm Durchmesser) mit affinitätsgereinigtem nlsCre, PTD-nlsCre oder TLM-nlsCre (Endkonzentration 0,8-1 mm in MEM mit den in Beispiel 2 genannten Supplementen und 50 U/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin) für 3-4 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach 48 Stunden wurde der Anteil der eGFP-positiven Zellen durchflußzytometrisch mit Hilfe des FACScaliber (Becton Dickinson) bestimmt. Überraschenderweise war der Anteil eGFP- positiver Zellen nach Zugabe des nlsCre-Proteins ohne heterologe Proteintransduktionsdomäne mindestens so hoch wie nach Zugabe von PTD-nlsCre und TLM-nlsCre (Tabelle 1). (n = Anzahl der Experimente; Schwankungsbereich des Anteils eGFP-positiver Zellen). Tabelle 1

Nach Zugabe von 0,8 µM nlsCre-Protein zu verschiedenen klonalen Reporterzellen (Klon 3, 8, 10, 12 und 15) konnten bei mikroskopischer Betrachtung in allen Ansätzen bereits nach 24 h einige Zellen mit einer schwachen grünen Fluoreszenz detektiert werden, die nach 48 Stunden deutlicher wurde (siehe Fig. 3). Die eGFP- positiven Zellen zeigten dabei keine oder eine deutlich verringerte rote Fluoreszenz im Vergleich zu den umgebenden Zellen. Der Anteil der eGFP-positiven Zellen lag nach durchflußzytometrischer Analyse zwischen 2 und 4%. Unter den Kontrollzellen konnten dagegen keine eGFP-positiven Zellen detektiert werden.

Zum Nachweis der Cre-spezifischen Rekombination auf DNA-Ebene wurde chromosomale DNA aus den nlsCre-behandelten Mischpopulationen der Klone 12 (4% eGFP-positiv) und 15 (2.5% eGFP positiv) isoliert. Die chromosomale DNA wurde als Vorlage für eine Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt, bei der der (+) Primer p1 (SEQ ID NO: 22; 5'-ACGCCGAAACCGCGCCGCGCGTC-3') 173 bp vor der ersten loxP-Sequenz und (-) Primer p2 (SEQ ID NO: 23; 5'- GCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3') 154 bp nach der zweiten lox- Sequenz anbindet (vgl. Fig. 4A). Die Mischpopulationen zeigen in der ersten PCR neben dem 1099 bp-Produkt, das aus der Vorlage des nicht-rekombinierten Reporterkonstruktes zu erwarten ist, ein weiteres Produkt von 364 bp, das der Länge des erwarteten Produktes aus der rekombinierten Vorlage (d. h. nach Exzision des DsRed1-Gens) entspricht. Das 364 bp-Produkt fehlt, wenn genomische DNA aus den unbehandelten Reporterzellen als Vorlage eingesetzt wurde (Fig. 4B). Die Sequenzanalyse der aus dem Gel isolierten PCR-Produkte bestätigte die präzise, Cre/lox-spezifische Rekombination.

Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß das nlsCre-Protein ohne heterologe Proteintransduktionddomäne nach externer Zugabe in den Zellkern der Reporterzellen gelangt und dort eine spezifische Rekombination einleitet.

Beispiel 4 Effiziente loxP-spezifische Rekombination durch nlsCre

Um die Effizienz der Rekombination durch nlsCre zu erhöhen, wurden zunächst höhere Konzentrationen des gereinigten Proteins eingesetzt, und die Inkubation wurde verlängert.

Hierzu wurden Reporterzellen mit 1,0, 1,5, 2,5 und 5,0 mm nlsCre- Konzentrationen in MEM (mit 2 mM Glutamin, 10% FCS, 50 U/ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin) für 6 Stunden bei 37°C inkubiert, und das Medium wurde gegen frisches MEM ausgetauscht. Nach zwei Tagen wurde der Anteil eGFP-positiver Zellen durchflußzytometrisch mit einem FACScaliber bestimmt.

Wie erwartet, steigt die Rekombinationseffizienz mit steigender nlsCre-Konzentration. Die Inkubation mit 5 µM nlsCre führte zu einer Rekombinationsrate von über 50% (Fig. 5A). Wurde die Inkubation mit nlsCre in serumfreiem Medium (MEM mit 2 mM Glutamin und 50 U/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin) durchgeführt, konnte bereits nach Zugabe von 2,5 µM nlsCre eine Rekombinationsrate von über 50% gemessen werden (Fig. 5B). Eine Verringerung der Rekombinationseffizienz in Anwesenheit von Serum (hier 40% versus 53% nach Zugabe von 2,5 µM nlsCre) kann möglicherweise auf eine Aggregation des rekombinanten Proteins mit Serumproteinen zurückzuführen sein.

Beispiel 5 Extern zugegebenes nlsCre-Protein kann eine loxP- spezifische Exzision in murinen Knochenmarkzellen einleiten

Knochenmarkzellen aus einem C57Bl/6-Mausstamm, in dem das endogene C/EBP-Gen mit loxP-Sequenzen flankiert ist (Zhang et al. (2001) Blood 98: 792a-793a, siehe Fig. 6) wurden zunächst durch Ausspülen von Ober- und Unterschenkelknochen präpariert. Aliquots von 2 × 10⁶ Zellen wurden 7 Stunden bei 37°C in 500 µl einer 1 : 1 Mischung aus 2 × DMDM (mit zweifach konzentrierten Zytokinen (siehe unten), 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin) und PBS (mock) bzw. PBS mit gereinigtem, rekombinantem nlsCre-Protein inkubiert. Die Endkonzentrationen betrugen 1,5 µM nlsCre bzw. 1,5 µM PTD-nlsCre. Die Zellen wurden abzentrifugiert, und das Medium wurde gegen IMDM (mit 20% FCS, 0,1% Rinder-Serumalbumin, 2 mM Glutamin, 5 ng/ml humanes IL-6; 10 ng/ml murines IL-3 und 50 ng/ml murines SCF; alle rekombinanten Wachstumsfaktoren von R&D Systems) ausgewechselt. Nach einer Woche Kultivierung der Zellen bei 37°C im Brutschrank wurde genomische DNA der drei Ansätze präpariert und als Vorlage für zwei verschiedene Polymerase- Kettenreaktionen (PCRs) eingesetzt.

Die erste PCR unter Verwendung der Oligonukleotide p3 (SEQ ID NO: 24, 5'-TGGCCTGGAGACGCAATGA-3') und p4 (SEQ ID NO: 25; 5'- CGCAGAGATTGTGCGTCTTT-3') dient zum Nachweis des nicht rekombinierten Allels C/EBPα^fl/fl, das als Vorlage ein 269 bp-Fragment als PCR-Produkt ergibt. Dieses Produkt konnte in allen Ansätzen, die genomische DNA des C/EBPα^fl/fl-Mausstammes enthielt, aber nicht in der Negativkontrolle ohne DNA-Vorlage nachgewiesen werden (Fig.6). Für die zweite PCR wurden die Oligonukleotide p5 (SEQ ID NO: 26; 5'-GCCTGGTAAGCCTAGCAATCCT-3') und p6 (SEQ ID NO: 27; 5'- TGGAAACTTGGGTTGGGTGT-3') eingesetzt, die ein 400 bp-Fragment mit der rekombinierten Vorlage (d. h. nach Exzision des C/EBPα-Gens) und theoretisch ein 6,6 kb Fragment mit der nicht-rekombinierten Vorlage ergeben. Während das 6,6 kb-Fragment unter den gewählten Bedingungen (Standard-Ansatz mit Qiagen-Taq-Polymerase; 30 sec Denaturierung, 45 sec Annealing bei 60°C und 45 sec Verlängerungsphase pro Zyklus) nicht entstand, wurde ein 400 bp-Produkt nur in den Ansätzen detektiert, deren Vorlage aus Zellen stammte, die mit rekombinantem nlsCre oder PTD-nlsCre inkubiert worden waren (Fig. 6). Die Sequenzierung der 400 bp-PCR-Produkte bestätigte die korrekte Exzision von C/EBP.

Dieses Beispiel zeigt, daß sich der direkte Transfer des rekombinanten, gereinigten Cre-Proteins nicht nur für eine spezifische Rekombination des Reporterkonstruktes SFr in der Maus- Fibroblastenzellinie SC-1 eignet, sondern prinzipiell auch für die Rekombination einer anderen Vorlage (hier das "gefloxte" C/EBPα-Gen) in primären Zellen (hier Maus-Knochenmark) eingesetzt werden kann.

Beispiel 6

LoxP-spezifische Rekombination nach Transduktion von unmodifiziertem Cre-Protein

Die in Beispiel 3 und 4 dargelegten Untersuchungen zeigen eine Cre-spezifische Rekombination in klonalen Reporterzellen, denen rekombinantes, gereinigtes Cre-Protein über das Kulturmedium zugeführt wurde. Die prinzipielle Eigenschaft der Cre-Rekombinase, in intakte Zellen zu gelangen, ist dabei unabhängig von den bekannten Proteintransduktionsdomänen Tat-PTD oder PreS2-TLM. Um zu untersuchen, ob die "künstlich angefügten" Aminosäuresequenzen (die SV40-NLS am N-terminus oder das 9E10-Epitop am C-terminus) des hier verwendeten, modifizierten nlsCre-Proteins diese Eigenschaft vermitteln, sollte ein Cre-Protein ohne Modifikationen getestet werden.

Reporterzellen wurden mit 1 µM des wtCre-Proteins (siehe Beispiel 1) für 3 Stunden inkubiert. Nach zwei Tagen konnten im Fluoreszenzmikroskop eGFP-positive Zellen detektiert werden (Fig. 7). Die durchschnittliche Rekombinationsrate liegt bei ca. 1,5% (n = 7; 0,6-2,5%).

Da die Transduktion des Cre-Proteins offensichtlich unabhängig von heterologen Aminosäuresequenzen ist, hat die Cre-Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 wahrscheinlich eine endogene Proteintransduktionsdomäne. Die etwas höhere Rekombinationseffizienz von nlsCre unter gleichen Bedingungen (siehe Tabelle 1) kann auf die Beschleunigung des Kerntransportes durch die SV40-NLS zurückgeführt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. In-vitro Verfahren zur ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen, bei dem man

a) ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität, das keine heterologe Proteintransduktionsdomäne umfasst, zu einer eukaryotischen Zellkultur hinzufügt, deren Zellen mindestens einen DNA-Bereich enthalten, der mindestens eine Erkennungssequenzen enthält, die von dem Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität erkannt wird, und man

b) die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA- Rekombination ermöglichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität eine der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist oder ein Derivat, ein Homologes oder ein aktives Fragment derselben ist.

3. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotischen Zellen humane oder murine Zellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die humanen oder murinen Zellen Knochenmarkszellen oder Fibroblasten sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität zum Kulturüberstand der eukaryotischen Zellkultur gibt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität in einer Konzentration von 100 nM bis 30 µM zugibt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz sind.

8. Verwendung eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität, das keine heterologe Transduktionsdomäne enthält, zur Durchführung einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen, bei der man Zellen, die mindestens einen DNA-Bereich enthalten, der mindestens eine Erkennungssequenz enthält, die von dem Polypeptid mit Cre- Rekombinase-Aktivität erkannt wird, in Gegenwart des Polypeptids unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA- Rekombination erlauben.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz sind.

10. Verwendung eines Polypeptids mit Cre-Rekombinase-Aktivität, das keine heterologe Transduktionsdomäne enthält, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Durchführung einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen in vivo.

11. Polypeptid mit Cre-Rekombinase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist oder ein Derivat, ein Homologes oder ein aktives Fragment derselben, mit Ausnahme der natürlichen Cre-Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1.

12. Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenzen aufweist.

13. Isolierte Zelle, die ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität nach Anspruch 11 enthält.

14. Isolierte Zelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 12 enthält.

15. Zelle nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine bakterielle Zelle oder eine eukaryontische Zelle ist.

16. Zelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine E. coli-Zelle, eine Hefezelle oder eine Insektenzelle ist.

17. Reportersystem zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA- Rekombination in eukaryotischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportersystem ein DNA-Konstrukt ist, bei dem

a) ein erstes Reportergen, das von zwei Rekombinase- Erkennungssequenzen in einer Weise flankiert ist, die in Gegenwart eines Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität eine Exzision des besagten ersten Reportergens zur Folge hat, und

b) ein zweites Reportergen stromabwärts des ersten Reportergens lokalisiert ist, wobei stromaufwärts der beiden Erkennungssequenzen ein Initiationskodon und eine Ribosomen-Bindungsstelle lokalisiert sind, die eine Translation des ersten Reportergens ermöglichen, die durch ein Stopkodon zwischen den beiden Erkennungssequenzen beendet wird, und im Bereich zwischen den beiden Reportergenen kein funktionstüchtiges Initiationskodon lokalisiert ist; und

c) durch eine ortsspezifische DNA-Rekombination das zweite Reportergen in eine Position zu dem Initiationskodon gebracht wird, die eine Translation des zweiten Reportergens ermöglicht; und

d) die Genprodukte der beiden Reportergene voneinander zu unterscheiden sind.

18. Reportersystem nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz sind.

19. Reportersystem nach den Ansprüchen 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Reportergene für ein fluoreszierendes Protein kodiert.

20. Reportersystem nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszierende Protein die in SEQ ID NO: 6 oder die in SEQ ID NO: 7 angegebene Sequenz aufweist.

21. Reportersystem nach den Ansprüchen 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportersystem die in SEQ ID NO: 8 angegebene Sequenz aufweist.

22. Verfahren zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA- Rekombination in eukaryotischen Zellen unter Verwendung eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität, bei dem man

a) ein Reportersystem nach den Ansprüchen 17 bis 21 und ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität in eine eukaryotische Zelle einbringt und die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die eine DNA-Rekombination ermöglichen; und man

b) einen erfolgten Rekombinationsvorgang anhand des vom zweiten Reportergen kodierten Genprodukts nachweist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität durch Transfektion oder virale Infektion mit einem Vektor in die Zellen einbringt, der eine für das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei man die Zellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des Polypeptids ermöglichen.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität in die Zellen einbringt, indem man das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität zum Kulturüberstand der eukaryotischen Zellkultur gibt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität ein Polypeptid nach Anspruch 11 ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenzen loxP-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz sind.

27. Verwendung eines Reportersystems gemäß den Ansprüchen 17 bis 21 zum Nachweis einer ortsspezifischen DNA- Rekombination in eukaryotischen Zellen.

28. Isolierte Wirtszelle, die ein Reportersystem nach den Ansprüchen 17 bis 21 enthält.

29. Wirtszelle nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle zusätzlich ein Polypeptid mit Cre-Rekombinase- Aktivität nach Anspuch 11 enthält.

30. Zelle nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß es eine bakterielle Zelle oder eine eukaryontische Zelle ist.

31. Zelle nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es eine E. coli-Zelle, eine murine oder humane Zelle ist.

32. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Cre- Rekombinase-Aktivität nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor ligiert, man diesen in Wirtszellen einbringt und man die Zellen unter zur Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen kultiviert.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegebene Sequenz aufweist.

34. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 7.

35. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 22 bis 26.

36. Pharmazeutisches Präparat zur Durchführung einer ortsspezifischen DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen.

37. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zusätzlich pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.