CN118186001A - 一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用，涉及基因工程技术领域，其技术要点为：所述方法包括以下步骤：S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建；S2、利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系/株、有关转基因动物以及在基因治疗领域的潜在应用。本发明的方法将现有的piggyBac转座子进行改造提高其整合基因组的能力，不但整合编辑工具效率高，而且只需构建一种载体即可整合到宿主细胞的基因组在不同位点，利于一次性高效地筛选到最佳整合位点的克隆；另外，还可以通过反向PCR(reverse‑PCR)技术鉴定出插入位点。本发明的方法由改进的piggyBac转座子介导基因整合的策略具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。
Description
技术领域
本发明专利涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用。
背景技术
将外源DNA片段整合到宿主细胞的基因组中是生物技术领域的一项重要技术，在细胞株(系)改造、构建各种转基因动物和基因治疗等领域有非常重要的应用。在细胞株(系)改造领域，外源基因整合能力是获得稳定细胞株的技术保障。获取稳定细胞株的操作步骤繁琐，周期长，至少需要3个月才能完成。而且经常不能筛选到特别满意的稳定细胞株。因此，提高外源基因整合能力一直是该领域的首要考虑因素。在构建各种转基因动物领域，外源基因整合的效率直接影响转基因动物的成功与否。只有成功在动物的受精卵或胚胎期整合入宿主动物的基因组，才能获得所需要的转基因动物。在基因治疗领域，安全、有效地导入对治疗有价值的基因或失活致病基因(如突变的基因)，是基因治疗技术的关键。载体的整合能力和整合“安全性”一直是该技术的核心。除了提高载体的整合能力，整合“安全性”也是该技术必须考虑的。因为导入细胞内的DNA由于整合到基因组上的“沉默区”引起导入的目的基因被“沉默”不能表达而导致整合失败，或者整合到不该整合宿主细胞的基因组位置导致一个重要基因被破坏。
按照目的基因插入基因组内的整合方式分为随机整合和定点整合两种。(1)慢病毒等介导的基因整合方式属于随机整合。慢病毒介导的基因整合效率可高达10％，但是操作者若不注意会存在被病毒感染的风险，因此需要在特殊的实验环境下进行。另外，慢病毒介导的基因整合除了构建相应载体外，还需要包装病毒获取高滴度的病毒等，操作繁琐，容易失败。(2)归巢内切酶I-SceI、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑系统介导的基因整合方式属于定点整合。归巢内切酶I-SceI的整合效率约0.02％～2％，但是归巢内切酶在基因组上可用的切割位点比较少，只能在有限位点进行定点整合，极大限制了其应用。TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具可以提高效率达5％～20％。但是，所有定点整合的基因编辑工具均存在一个问题：定点插入的载体需要根据插入位点进行专门的载体设计与构建，意味着每进行一个新的位点定向整合就需要重新构建一次“打靶”载体，这给操作者带来不少的工作量，而且有时候某位点的整合效率特别低或整合入该位点的外源基因表达效率低。
转座子，又名转座因子是一类在基因组内可以“跳跃、移动”的遗传因子。与SleepingBeauty转座子、Tol2转座子相比，piggyBac转座子(简称PB转座子)具有更广泛的转座活性，较少地依赖于宿主因子即可实现高效转座。PB转座子的转座功能是由一个含有594个氨基酸残基的转座酶PBase介导的。该酶是在细胞质中表达成熟，而PBase介导的转座在细胞核内进行。核膜将真核细胞内的空间分隔为细胞核和细胞质2个不同的区域。核膜是不连续的，其上存在很多小孔。这些小孔结构本质上为核孔复合物(nuclearpore complex，NPC)，是细胞质和细胞核之间来回运输物质的通道。因此，PBase转座酶需要“穿越”核孔才能到达其发挥作用的部位——细胞核。核定位信号(nuclear localization signal，NLS)是蛋白质的一个结构域，能够与核转运蛋白相互作用，将蛋白通过核孔运进细胞核。第一个被确认的NLS来自病毒SV40的T抗原(SV40-NLS)。研究证实SV40-NLS具有很强的核定位能力，不少科学家尝试开发它的应用，譬如用于构建人工合成的分子生物转运工具等。
综上所述，本发明旨在提供一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于解决背景技术中提出的技术问题，提供一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，所述方法包括以下步骤：
S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建：
通用载体系统包含供体载体和辅助载体，其中，供体载体：包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之间设有多克隆位点；辅助载体：包括改造后的PiggyBac转座酶编码基因EPbase，在EPbase的上游设有能提高翻译起始的元件、高效启动子，在其下游设有更加有效的终止转录的PloyA；
S2、利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系/株、转基因动物以及在基因治疗中应用：
(1)构建新型piggyBac介导的稳转细胞细胞系的载体系统，在新霉素抗性基因表达框的5端和3端分别插入PBase识别的左右臂，获得筛选载体PB(NeoR)；PB转座子的转座通过其编码的转座酶PBase实现；然后再直接通过PCR从质粒MAhelppigA3上扩增得到PB转座酶PBase，组装入pcDNA3.1载体得到由广谱表达的启动子CMV驱动的PBase表达系统；并在PBase的3端或5端分别插入高效核定位信号肽SV40-NLS；
(2)使用Lipofectamine2000将上述载体转染细胞以验证其他的效果；其中，细胞共分为4组：pcDNA3.1/PB(NeoR)；pcDNA3.1-PBase/PB(NeoR)；pcDNA3.1-5NLSPBase/PB(NeoR)和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB(NeoR)；将3种CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体分别和环形质粒形式的PB在质量比1∶2的比例下混合，分别得到pcDNA3.1-PBase/PB，pcDNA3.1-5NLSPBase/PB和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB这3种PB转座酶介导的转座系统进行细胞转染。
进一步地，所述转座系统应用于获取转基因小鼠，具体应用方法为：
高效piggyBac转座系统获取转基因小鼠：
先构建有关转基因载体-携带有目的基因的PB供体载体和由CMV启动子驱动的PB转座酶表达的辅助载体，上述载体以环形质粒形式，在质量比1：2的比例下，进行小鼠受精卵雄原核DNA显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集新生小鼠尾尖，提取DNA后，利用PCR进行鉴定，得到PB转基因阳性的转基因小鼠。
进一步地，所述转座系统应用于获取转基因斑马鱼，具体应用方法为：
高效piggyBac转座系统获取转基因斑马鱼：
(1)获取斑马鱼的载体系统：通过构建在肌肉中特异表达EGFP的标志基因来筛查转基因斑马鱼阳性，构建PB(pMylz2(EG))供体载体；并构建在斑马鱼中在合子期稳定表达的3’PBase的辅助载体；
(2)然后，将上述载体按1：2的比例溶于0.1M PH为7.5～7.6的Tris-HCl缓冲液中，然后调节浓度50ng/ul。
进一步地，将PB(pMylz2(EG))供体载体和3’PBase的辅助载体溶于Tris-HCl缓冲液后进行注射，且注射部位为：针从植物极扎入，且靠近动物极；且注射的卵的状态为单个细胞或2个细胞期的胚胎以获取转基因斑马鱼。
进一步地，所述转座系统应用于基因治疗，具体应用方法为：
(1)获取用于基因治疗领域的载体系统：将对治疗有价值的基因或失活致病基因如(突变的基因)插入S1所述的供体载体中；并构建在目的细胞/器官中特异稳定表达3’PBase的辅助载体或直接使用广谱启动子驱动的3’PBase的辅助载体；
(2)将上述载体按1：2的通过常规的转染方法导入目的细胞/器官。
本发明解决技术问题的难度及意义在于：
针对克服现有技术中目的基因插入基因组内的整合方式中的随机整合和定点整合两种整合方式的缺陷问题，本发明的方案通过将现有的PB转座子进行改造提高其整合基因组的能力，因此，本发明的技术方案不但整合编辑工具效率高，而且只需构建一种载体即可整合到宿主细胞的基因组在不同位点，利于一次性高效地筛选到最佳整合位点的克隆；另外，还可以通过反向PCR(reverse-PCR)技术鉴定出插入位点。由此可见，本发明的技术方案由PB介导基因整合的策略具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。
综上所述，与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
1、通过本发明的方法，利用构建的高效piggyBac转座系统在不同细胞系测试，其介导的克隆形成能力能够提高9-40倍；转基因小鼠的阳性率达50％，转基因斑马鱼的阳性率也很高，且基因表达十分稳定；
2、通过本发明的方法构建的PiggyBac系统介导基因组整合方法，其具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。
附图说明
图1是本发明中高效piggyBac转座系统的通用载体系统(A：供体载体；B：辅助载体，启动子一般为组成性表达的高效真核启动子，Kozak序列具有显著提高真核细胞的翻译效率的能力，在piggyBac转座酶的3’端插入核定位信号)；
图2是本发明中PB转座子介导的用于测试构建稳定转染细胞株的系统(A：载体PB(NeoR)；B：由广谱表达的启动子CMV驱动的PBase表达系统；TC：终止密码子；BGHpA：牛生长激素poly(A)信号)；
图3是本发明中在不同细胞系中比较PB转座子介导的克隆形成能力(A：转染293细胞进行克隆形成的比较；B：转染HeLa细胞进行克隆形成的比较)；
图4是本发明中PB转座子介导的用于测试转基因小鼠效率的系统；
图5是本发明中荧光显微镜下观察PB转座子介导的基因小鼠获得的情况；
图6是本发明中PB转座子介导的用于测试转基因斑马鱼效率的系统；
图7是本发明中荧光显微镜下观察PB转座子介导的基因斑马鱼获得的情况。
图8是本发明中利用Reverse PCR技术鉴定高效piggyBac转座系统介导的基因组整合位点的方法。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
实施例：
本发明提供的实施方案如上述发明内容所述，提供了一种由改进的由piggyBac转座子介导的基因整合方法，包括其构建方法及其应用。
本发明实施方案的具体实施为：
(1)高效piggyBac转座系统的构建(通用载体系统)
该通用载体系统包含两种载体(如图1所示)，即：供体载体和辅助载体。
1)供体载体：包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末端序列3’TR,在5’TR和3’TR之间设有多克隆位点。
2)辅助载体：包括改造后的PiggyBac转座酶编码基因EPbase，在EPbase的上游设有能提高翻译起始的元件、高效启动子，在其下游设有更加有效的终止转录的PloyA。
(2)利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系(株)
首先，需要构建新型piggyBac介导的稳转细胞系的载体系统。为了验证其效果，本申请发明人构建了如图2所示的载体系统。本载体系统用于筛选稳转细胞株的抗性基因为NeoR，因此，在新霉素抗性基因表达框的5端和3端分别插入PBase识别的左右臂，获得筛选载体PB(NeoR)(如图2中的A所示)。PB转座子的转座是通过其编码的转座酶PBase来实现的。然后再直接通过PCR从质粒MAhelppigA3上扩增得到PB转座酶PBase，组装入pcDNA3.1载体得到由广谱表达的启动子CMV驱动的PBase表达系统(如图2中的B所示)。在PBase的3端或5端分别插入高效核定位信号肽SV40-NLS(如图2中的B所示)。
然后，使用Lipofectamine2000将上述载体转染细胞以验证其效果。细胞共分为4组：pcDNA3.1/PB﹙NeoR﹚；pcDNA3.1-PBase/PB(NeoR)；pcDNA3.1-5NLSPBase/PB(NeoR)和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB(NeoR)。3种CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体分别和环形质粒形式的PB(NeoR)在质量比1：2的比例下混合，分别得到pcDNA3.1-PBase/PB(NeoR)，pcDNA3.1-5NLSPBase/PB(NeoR)和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB(NeoR)3种PB转座酶介导的转座系统进行细胞转染。细胞转染3天后，将上述转染完毕的细胞用胰酶消化转移到10cm细胞培养皿中，然后加入G418至终浓度为300g/mL。
上述有关结果如图3所示。结果表明PB转座子介导的克隆形成与对照组比存在极为显著的差异，其介导的克隆形成能力是野生型的6.7-30倍，表明piggyBac转座子可以显著提高基因组插入的效率(如图3所示)。再通过分析发现与野生型PBase相比，5NLSPBase和3NLSPBase均能提高基因组插入的效率，3NLSPBase提高得更多，达1.3-1.6倍(如图3所示)。
而且更为重要的是，为了明确通过piggyBac转座子获取的细胞株遗传稳定性，选取分别选取5个PBase介导的293稳转株和选取3个PBase介导的HeLa稳转株分别连续传代8代及以上。结果表明由piggyBac介导构建的293或HeLa稳定细胞株能够长期稳定表达目的基因。
(3)高效piggyBac转座系统获取转基因小鼠
同上先构建有关转基因载体，如图4所示。将CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体和PB﹙polyA(EG)﹚以环形质粒形式，在质量比1：2的比例下，进行小鼠受精卵雄原核DNA显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集新生小鼠尾尖，提取DNA后，利用PCR进行鉴定，得到了PB﹙EG)﹚转基因阳性的转基因小鼠(如图5所示)。通过荧光显微镜可以清晰地观察到EGFP阳性的小鼠(如图5所示)，并进一步通过PCR技术鉴定上述小鼠的基因型。结果表明该批次小鼠转基因阳性率达50％以上，说明piggyBac介导的转基因小鼠技术效率很高。
(4)高效piggyBac转座系统获取转基因斑马鱼
获取斑马鱼的载体如图6所示：通过构建在肌肉中特异表达EGFP的标志基因来筛查转基因斑马鱼阳性，构建了PB﹙pMylz2(EG)﹚供体载体；然后，构建在斑马鱼中在合子期稳定表达的3’PBase的辅助载体。将上述载体按1：2的比例溶在0.1MPH为7.5～7.6的Tris-HCl缓冲液中，然后调节浓度50ng/ul。注射部位是：针从植物极扎入，尽量靠近动物极。卵的状态为单个细胞或2个细胞期的胚胎。
由于pMylz2启动子大概在斑马鱼三天的时候就可以明显地观察到，然后我们通过在荧光显微镜下筛查阳性斑马鱼(如图7中的B所示)。而且成斑马鱼长到2个月还能够稳定地观察到EGFP阳性(如图7中的C所示)，说明该转基因基因表达十分稳定。
(5)Reverse PCR技术鉴定高效piggyBac转座系统介导的基因组整合
将所获得的双阳性雄鼠和野生型雌鼠进行交配繁殖，新生小鼠在长波紫外光或者蓝光下观察，表体发光的小鼠即表示转座子插入到某基因中，图8是一个例子，利用ReversePCR检测到该转基因小鼠的插入位点。
上述实施方案与现有技术对比：
按照目的基因插入基因组内的整合方式分为随机整合和定点整合两种：
(1)归巢内切酶I-SceI、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑系统介导的基因整合方式属于定点整合。归巢内切酶I-SceI的整合效率约0.02％～2％，但是归巢内切酶在基因组上可用的切割位点比较少，只能在有限位点进行定点整合，极大限制了其应用。TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具可以提高效率达5％～20％。但是，所有定点整合的基因编辑工具均存在一个问题：定点插入的载体需要根据插入位点进行专门的载体设计与构建，意味着每进行一个新的位点定向整合就需要重新构建一次“打靶”载体，这给操作者带来不少的工作量，而且有时候某位点的整合效率特别低或整合入该位点的外源基因表达效率低。
(2)转座子、慢病毒等介导的基因整合方式属于随机整合。慢病毒介导的基因整合效率可高达10％，但是操作者若不注意会存在被病毒感染的风险，因此需要在特殊的实验环境下进行。另外，慢病毒介导的基因整合除了构建相应载体外，还需要包装病毒获取高滴度的病毒等，操作繁琐，容易失败。目前已经鉴定到的转座子有很多种类，但是能够在真核生物中高效、随机整合的转座子很少。与Sleeping Beauty转座子、Tol2转座子相比，piggyBac转座子(简称PB转座子)具有更广泛的转座活性，较少地依赖于宿主因子即可实现高效转座。
因此，通过本发明的上述实施例方案中的PiggyBac转座子介导的基因整合编辑工具更效率高，而且只需构建一种载体即可；并且还可以通过反向PCR(reversePCR)技术鉴定出插入位点。由此可见，PB介导基因整合技术具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、高效piggyBac转座系统的构建，即通用载体系统的构建：
通用载体系统包含供体载体和辅助载体，其中，供体载体：包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之间设有多克隆位点；辅助载体：包括改造后的PiggyBac转座酶编码基因EPbase，在EPbase的上游设有能提高翻译起始的元件、高效启动子，在其下游设有更加有效的终止转录的PloyA；
S2、利用高效piggyBac转座系统建立稳转细胞系/株、转基因动物以及将其在基因治疗中应用：
(1)构建新型piggyBac介导的稳转细胞系的载体系统，将目的基因连同筛选标记基因(譬如新霉素抗性基因表达框)插入S1所示的的供体载体的多克隆位点，获得构建稳转细胞株的供体载体PB(目的基因)；然后再直接通过PCR从质粒MAhelppigA3上扩增得到PB转座酶PBase，组装入pcDNA3.1载体得到由广谱表达的启动子CMV驱动的PBase表达系统；并在PBase的3端或5端分别插入高效核定位信号肽SV40-NLS；
(2)使用Lipofectamine2000将上述载体转染细胞以验证其效果；其中，细胞共分为4组：pcDNA3.1/PB(目的基因)；pcDNA3.1-PBase/PB(目的基因)；pcDNA3.1-5NLSPBase/PB(目的基因)和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB(目的基因)；将3种CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体分别和环形质粒形式的PB(目的基因)供体载体在质量比1∶2的比例下混合，分别得到pcDNA3.1-PBase/PB(目的基因)，pcDNA3.1-5NLSPBase/PB(目的基因)和pcDNA3.1-3NLSPBase/PB(目的基因)这3种PB转座酶介导的转座系统进行细胞转染。
2.根据权利要求1所述的一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，所述转座系统应用于获取转基因小鼠，具体应用方法为：
高效piggyBac转座系统获取转基因小鼠：
先构建有关用于转基因小鼠构建的piggyBac载体系统：携带有目的基因的供体载体PB，譬如可以全身发绿色荧光的PB(EG)供体载体和CMV启动子驱动的改进型PB转座酶的辅助载体；然后将上述PB(EG)供体载体和辅助载体以环形质粒形式，在质量比2：1的比例下，进行小鼠受精卵雄原核DNA显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集新生小鼠尾尖，提取DNA后，利用PCR进行鉴定，得到PB(EG)转基因阳性的转基因小鼠。
3.根据权利要求1所述的一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，所述转座系统应用于获取转基因斑马鱼，具体应用方法为：
高效piggyBac转座系统获取转基因斑马鱼：
(1)获取转基因斑马鱼的载体系统：通过构建在肌肉中特异表达EGFP的标志基因来筛查转基因斑马鱼阳性，构建PB(pMylz2(EG))供体载体；并构建在斑马鱼中在合子期稳定表达的3’PBase的辅助载体；(2)然后，将上述载体按1：2的比例溶于0.1M PH为7.5～7.6的Tris-HCl缓冲液中，然后调节浓度50ng/ul。
4.根据权利要求3所述的一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，将PB(pMylz2(EG))供体载体和3’PBase的辅助载体溶于Tris-HCl缓冲液后进行注射，且注射部位为：针从植物极扎入，且靠近动物极；且注射的卵的状态为单个细胞或2个细胞期的胚胎，获得转基因斑马鱼。
5.根据权利要求1所述的一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法，其特征在于，所述转座系统应用于基因治疗，具体应用方法为：
(1)获取用于基因治疗的载体系统：获得对治疗有价值的基因或失活致病基因插入S1所述的供体载体；构建在目的细胞/器官中特异稳定表达3’PBase的辅助载体或直接使用广谱启动子驱动的3’PBase的辅助载体；
(2)将上述载体按1：2的通过常规的转染方法导入目的细胞/器官。
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