DE102021111496A1 - Verbesserte Herstellung von natürlichen Verbindungen unter der Verwendung von Marginolactonen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Induktion mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung von mindestens einem Marginolacton sowie Verfahren zur Herstellung spezialisierter Metaboliten in einem Pilz durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung von mindestens einem Marginolacton. Vorteilhafterweise werden stille biosynthetische Gencluster im Pilz induziert oder aktiviert und ermöglichen die bequeme und effektive Synthese neuer und kommerziell relevanter Naturstoffe.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Induktion mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung von mindestens einem Marginolacton sowie Verfahren zur Herstellung spezialisierter Metaboliten in einem Pilz durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung von mindestens einem Marginolacton. Vorteilhafterweise werden stille biosynthetische Gencluster im Pilz induziert oder aktiviert und ermöglichen die bequeme und effektive Synthese neuer und kommerziell relevanter Naturstoffe.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Genome-Mining-Ansätze, bei denen häufig die an der Sekundärmetabolitproduktion beteiligten Gene identifiziert werden, haben bei vielen mikrobiellen Spezies ein beispielloses biosynthetisches Potenzial gezeigt. Diese Gene kodieren für die Enzyme, die an der Peptidbildung, Regulation, Resistenz und Synthese eines Sekundärmetaboliten beteiligt sind, und liegen physikalisch in Gruppen vor, die als biosynthetische Gencluster (BGCs) bezeichnet werden
  • Mitglieder des bakteriellen Genus Streptomyces (phylum Actinobakterien) sind am besten als wichtige bakterielle Produzenten von Antibiotika und anderen nützlichen Verbindungen bekannt, die häufig in der Humanmedizin, Tiergesundheit und Landwirtschaft verwendet werden.
  • Keller diskutiert, dass filamentöse Pilze für die Produktion einer diversen Vielzahl von Sekundärmetaboliten (SMs) bekannt sind, bei denen das für die Synthese eines SM erforderliche genetische Material typischerweise in einem biosynthetischen Gencluster (BGC) angeordnet ist. Diese Naturprodukte werden aufgrund ihrer bioaktiven Eigenschaften geschätzt, die sich aus ihren Funktionen in der Pilzbiologie ergeben, wobei unter diesen Schlüsselpositionen Schutz vor abiotischem und biotischem Stress und die Etablierung einer sicheren Nische sind. (Keller NP. Translating biosynthetic gene clusters into fungal armor and weaponry. Nat Chem Biol. 2015 Sep;11(9):671-7. doi: 10.1038/nchembio.1897. PMID: 26284674; PMCID: PMC4682562).
  • Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen der Gensequenz und der Struktur des chemischen Produkts her, was bedeutet, dass, wenn ein Stamm als eine bestimmte Verbindung produzierend entdeckt wird,, es jetzt ein einfaches Verfahren ist, den entsprechenden Gencluster zu identifizieren, der für ihre Biosynthese kodiert.
  • Jüngste dramatische Fortschritte in der Sequenzierung des gesamten Genoms ermöglichen es auch, vernünftige Vorhersagen über das biosynthetische Potenzial jedes Stammes zu treffen, was zu einem breiten Einblick in die Biogenese aller wichtigen Klassen spezialisierter Metaboliten führt und den Weg zum „Genome Mining“ für neuartige Verbindungen ebnet.
  • Das Interesse an der Entwicklung von Methoden des Biosynthese-Engineerings, zum Beispiel in Partnerschaft mit der medizinischen Chemie, ist groß, um zusätzliche chemische Vielfalt in diese Moleküle einzuführen. (siehe, zum Beispiel, Belknap, K.C., Park, C.J., Barth, B.M. et al. Genome mining of biosynthetic and chemotherapeutic gene clusters in Streptomyces bacteria. Sci Rep 10, 2003 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-58904-9; Hansson MJ, et al. Bioengineering and semisynthesis of an optimized cyclophilin inhibitor for treatment of chronic viral infection. Chem Biol. 2015 Feb 19;22(2):285-92. doi: 10.1016/j.chembiol.2014.10.023. Epub 2015 Jan 22. PMID: 25619934; PMCID: PMC4336584).
  • Rokas et al. (in: Biosynthetic gene clusters and the evolution of fungal chemodiversity, Nat. Prod. Rep. 2020, pp. 868-878, Vol. 37, 7) schlagen vor, dass pilzliche Chemodiversität von drei molekularen evolutionären Prozessen herrührt, die BGCs involvieren: funktionelle Divergenz, horizontaler Transfer und de-novo-Assemblierung.
  • Die bld-Gene sind eine wichtige Gruppe regulatorischer Gene, die den Lebenszyklus sowie die Sekundärmetabolitproduktion in Streptomyces iranensis beeinflussen. BldD ist der oberste Regulator, der in der Lage ist, Mutanten nachfolgender Regulatoren zu ergänzen, wenn dieser in ihrer Nähe angezogen wird. BldH (AdpA in Streptomyces griseus) und bldA sind regulatorische Elemente, die durch BldD ergänzt werden und die Entwicklung pleiotrop regulieren. bldA kodiert für die einzige tRNA, die in der Lage ist, das TTA-Codon (oder UUA-Codon) effektiv in Leucin zu übersetzen. Daher sind Gene, die solche Codons enthalten, auf eine ausreichende Versorgung mit bldA angewiesen, um transkribiert zu werden. Ein solches Gen ist bldH, das wiederum die bldA-Transkription aktiviert, was eine Kreuzabhängigkeit und positive Rückkopplungsschleife zwischen den beiden Genen erzeugt.
  • Das Macrolid-Antibiotikum Azalomycin F (3-[[(10E,12E,18E,20E)-15-[(E)-10-(Fiaminomethylidenamino)dec-6-en-2-yl]-5,7,9,23,25,27,31,33,34,35-decahydroxy-10,14,18,22,26,30-hexamethyl-17-oxo-16,3 7-dioxabicyclo[31.3.1]heptatriaconta-10,12,18,20-tetraen-3-yl]oxy]-3-oxopropansäue) ist ein Mitglied der natürlichen Produktfamilie der Marginolactone (Moore und Hertweck, 2002). Diese Naturstoffe zeichnen sich durch ein Makrolacton-Rückgrat und eine eine Guanidyl- oder Aminogruppe enthaltende Seitenkette aus. (Zerlin und Thiericke, 1994, Moore und Hertweck, 2002). Desertomycin A und Monazomycin sind Marginolactones die jeweils durch Streptomyces macronensis und Streptomyces mashuensis hergestellt werden (Dolak et al., 1983a, Akasaki et al., 1963), und andere Stämme wurden aus der Natur isoliert, die ebenfalls Marginolactone produzieren (siehe z. B. Tabelle 1 unten).
  • Es besteht großes Interesse an der Entwicklung von Methoden des Biosynthese-Engineerings, zum Beispiel in Partnerschaft mit der medizinischen Chemie, um zusätzliche chemische Vielfalt in Moleküle, insbesondere in der medizinischen Chemie, einzuführen. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel zur Herstellung natürlich vorkommender Verbindungen auf der Grundlage einer Synthese unter Einbeziehung biosynthetischer Gencluster bereitzustellen. Andere Aufgaben und Vorteile werden dem Fachmann beim Studium der vorliegenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung deutlich werden.
  • In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Induktion mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart, umfassend den Schritt der Kultivierung der Pilzart in einem Kulturmedium, das mindestens ein Marginolacton umfasst.
  • In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart, umfassend die Schritte von a) Induzieren von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC), der den spezialisierten Metaboliten in einer Kultur einer Pilzart gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert, und b) Isolieren des spezialisierten Metaboliten aus der Pilzspezies und/oder dem Kulturmedium davon.
  • In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe gelöst durch die Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Induzierung von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • In einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe gelöst durch die Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verfahren zum Induzieren mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung mindestens eines Marginolactons sowie Verfahren zum Herstellen spezialisierter Metaboliten in einem Pilz durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart unter Verwendung von mindestens einem Marginolacton. Vorteilhafterweise werden stille biosynthetische Gencluster im Pilz induziert oder aktiviert und ermöglichen die bequeme und effektive Synthese neuer und kommerziell relevanter natürlicher Substanzen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zum Induzieren mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart, umfassend den Schritt des Kultivierens der Pilzart in einem Kulturmedium, das mindestens ein Marginolacton umfasst.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein biosynthetischer Gencluster (BGC) als eine physisch geclusterte Gruppe von zwei oder mehr Genen in einem bestimmten Genom definiert werden, die zusammen einen Biosyntheseweg für die Produktion eines spezialisierten Metaboliten (einschließlich seiner chemischen Varianten) codieren). BGCs können gemäß der Literatur wie beispielsweise gemäß Medema et al. definiert werden (in: Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nat Chem Biol. 2015;11(9):625-631. doi:10.1038/nchembio.1890). Ein Gencluster definiert normalerweise eine Gruppe von zwei oder mehr Genen, die innerhalb der DNA eines Organismus gefunden werden und Polypeptide kodieren, die gemeinsam eine allgemeine Funktion teilen und oft innerhalb weniger tausend Basenpaare voneinander entfernt sind.
  • Es wird möglich, eine anfängliche experimentelle Charakterisierung von Hunderten solcher spezialisierter Metaboliten/Naturstoffe durchzuführen, indem Hochdurchsatzansätze verwendet werden, die durch schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie und der Aufklärung chemischer Strukturen angetrieben werden. Gleichzeitig eröffnen Einzelzellsequenzierung und Metagenomik den Zugang zu neuen und unerforschten Zweigen des Baums des Lebens und ermöglichen es Wissenschaftlern, eine bisher unentdeckte Fülle von BGCs zu erschließen. Darüber hinaus ermöglicht die synthetische Biologie die Neugestaltung von BGCs für eine effektive heterologe Expression in vor-modifizierten Wirten.
  • Stroe MC, et al. (in: Targeted induction of a silent fungal gene cluster encoding the bacteria-specific germination inhibitor fumigermin. Elife. 2020 Feb 21;9:e52541. doi: 10.7554/eLife.52541. PMID: 32083553; PMCID: PMC7034978) offenbaren einen stillen Gencluster des Pilzes Aspergillus fumigatus, der durch das Bakterium Streptomyces rapamycinicus während der Bakterien-Pilz-Interaktion aktiviert wird. Der resultierende Naturstoff ist der neuartige Pilzmetabolit Fumigermin, für dessen Biosynthese die Polyketidsynthase FgnA benötigt wird.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein biosynthetischer Gencluster (BGC), insbesondere ein stiller (nicht exprimierter oder während des Standardlebenszyklus eines Pilzes transkribierter) BGC, in einer Pilzzelle „induziert“, wenn die Expression entweder de novo erfolgt oder eine Erhöhung einer Expression von einem oder mehreren der Gene des Clusters kann bei Zugabe von mindestens einer induzierenden Substanz, wie hierin offenbart, nachgewiesen werden, d.h. die Expression in der Pilzspezies nach Zugabe von mindestens einem Marginolacton.
  • In der vorliegenden Erfindung wird die Expression basierend auf der neuen oder erhöhten Produktion eines spezialisierten Metaboliten nachgewiesen, der zuvor nicht vorhanden und/oder nachweisbar war, oder einer Reihe von spezialisierten Metaboliten, die zuvor nicht vorhanden und/oder nachweisbar waren, die identifiziert oder in einer höheren Menge identifiziert werden können. Dennoch kann die Induktion auch anhand der neu gebildeten oder erhöhten Menge an Transkriptionsprodukten (mRNAs) und/oder den jeweiligen Translationsprodukten (Proteinen) nach Induktion in der Pilzzelle und/oder dem Kulturmedium nachgewiesen werden
  • Neue Naturstoffe, die von stillen Genclustern codiert werden, können durch die konstitutive Expression von Genen induziert werden, die putative Regulatoren codieren, die in demselben Gencluster vorhanden sind. Es wurde gezeigt, dass die konstitutive Überexpression eines mutmaßlichen Signalweg-spezifischen Regulators vom großen ATP-bindenden LuxR (LAL)-Typ erfolgreich die Expression des stillen modularen PKS-Genclusters vom Typ I in Streptomyces ambofaciens induziert, was die Identifizierung einer einzigartigen Strukturklasse von Polyketiden mit vielversprechende Antitumoraktivität ermöglicht (siehe auch 6 hier für einen anderen LAL-Regulator). Diese Befunde deuten darauf hin, dass die konstitutive Expression oder Induktion dieser Signalweg-spezifischen Aktivatoren einen Ansatz zur Entdeckung neuer bioaktiver Naturstoffe darstellen könnte, da Gene, die für Proteine kodieren, die an der Biosynthese sekundärer oder spezialisierter Metaboliten beteiligt sind, oft durch Signalwegspezifische Aktivatoren kontrolliert werden.
  • Die erfindungsgemßen Verfahren können in vivo oder in vitro durchgeführt werden, z.B. in einer Bodenprobe, einer Zellkultur unter Verwendung eines Kulturmediums und dergleichen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Kultivieren“ der Pilzspezies die Vermehrung des Wachstums des Pilzes (der Pilze) in einem geeigneten Kulturmedium bei geeigneter Temperatur und unter geeigneten Bedingungen, wie sie in der Literatur zu finden sind. Ein Beispiel für ein geeignetes Medium ist Aspergillus-Minimalmedium (AMM), optional ergänzt mit Aminosäuren oder anderen Substanzen, und Kultivieren bei 28°C (siehe auch Beispiele). Bevorzugte Kulturmedien sind flüssig oder halbfest auf Platten.
  • Die vorliegende Erfindung induziert Pilz-BGCs. Im Prinzip sind alle BGCs eingeschlossen, die durch die Zugabe der Marginolactone, wie hierin beschrieben, induziert werden. Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem BGC, der an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligt ist, einem BGC, der nicht-ribosomale Peptidsynthetasen umfasst, einem BGC, der Typ-1-Polyketidsynthasen umfasst, einem BGC, der an der Synthese von Terpenen beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist. Der Fachmann wird in der Lage sein, zusätzliche BGCs in Pilzspezies leicht zu identifizieren, zum Beispiel im Hinblick auf den oben und hier zitierten Stand der Technik und in der entsprechenden Literatur.
  • Die vorliegende Erfindung induziert Pilz-BGCs unter Verwendung eines Marginolactons aus der Naturproduktfamilie der Marginolactone (Moore und Hertweck, 2002). Diese Naturstoffe sind durch ein Makrolacton-Rückgrat und eine Guanidyl- oder Aminogruppenhaltige Seitenkette gekennzeichnet (Zerlin und Thiericke, 1994, Moore und Hertweck, 2002). Die Erfinder finden heraus, dass Marginolactone allgemeine Signale bei Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Königreichen sind, im vorliegenden Fall zwischen Bakterien- und Pilzspezies. Im Allgemeinen kann daher jedes geeignete Marginolacton verwendet werden, bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus einem bakteriellen Marginolacton, wie es von einem Streptomyces-, Streptoverticillium- oder Saccharomonospora-Stamm produziert wird. Weiter bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus Desertomycin A, Desertomycin G, Monazomycin/Takacidin, Quadoctomycin, Azalomycin F oder dem Komplex oder Teilen davon, Niphimycin und Primycin A.
  • Der Pilz, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jeder Pilz sein, der kultiviert werden kann und BGCs umfasst, die durch ein geeignetes Marginolacton induziert werden können. Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Pilz ausgewählt ist aus einem einzelligen Pilz, einem filamentösen Pilz, einer Hyphe, Hefe, Schimmel, einem Candida-Stamm, einem Saccharomyces-Stamm, einem Debaryomyces-Stamm, einem Stamm von Zygosaccharomyces, ein Stamm von Aspergillus, A. nidulans und A. fumigatus. Andere geeignete Pilzarten sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann die Quelle des Marginolactons in der Kultur jede geeignete Quelle sein. Beispielsweise kann, wie hierin beschrieben, die gereinigte Verbindung auf Kulturen von A. nidulans und A. fumigatus angewendet werden, oder es kann eine Co-Kultur des jeweiligen Pilzes mit S. iranensis, S. rapamycinicus, Streptomyces mashuensis und Streptomyces macronensis durchgeführt werden. Somit ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wobei das mindestens eine Marginolacton dem Medium als eine (einzelne oder gereinigte oder im Wesentlichen gereinigte) Verbindung als Teil eines Bakterienzellextrakts von Bakterien, die das mindestens eine Marginolacton produzieren, zugesetzt wird (im Extrakt oder Lysat enthalten) und/oder dem Medium durch Co-Kultivierung mit Bakterien zugeführt wird, die mindestens eines der Marginolactone produzieren.
  • Noch ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart, umfassend die Schritte a) Induzieren der Synthese mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC), der den spezialisierten Metaboliten synthetisiert, in einer Kultur einer Pilzart gemäß der vorliegenden Erfindung, und b) Isolieren besagten spezialisierten Metaboliten aus der Pilzart und/oder dem Kulturmedium davon.
  • In diesem Zusammenhang gelten für Schritt a) wie erwähnt dieselben oder im Wesentlichen dieselben Anforderungen und/oder Bedingungen wie oben erwähnt. Wie erwähnt wird die Expression in der vorliegenden Erfindung basierend auf der neuen oder erhöhten Produktion eines spezialisierten Metaboliten nachgewiesen, der zuvor nicht vorhanden und/oder nachweisbar war, oder einem Set von spezialisierten Metaboliten, die zuvor nicht vorhanden und/oder nachweisbar waren, die identifiziert oder in einer höheren Menge nachweisbar sind. Dabei ist die Produktion eines zuvor nicht vorhandenen und/oder nachweisbaren spezialisierten Metaboliten oder einer Reihe von zuvor nicht vorhandenen und/oder nachweisbaren spezialisierten Metaboliten das Ziel, und nach der Induktion wird/werden der oder die spezialisierten Metaboliten geeigneterweise aus der Pilzart und/oder dem Kulturmedium davon isoliert. Isolieren oder Reinigen bedeutet, dass der Metabolit von mindestens einer wesentlichen nicht erwünschten Anzahl unerwünschter Nebenprodukte und Kontaminanten getrennt wird. Verfahren zum Isolieren der Metaboliten hängen hauptsächlich von dem Metaboliten selbst und der Art der durchgeführten Kultur ab. Ein Beispiel ist die präparative HPLC (siehe Beispiele), weitere geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt, insbesondere beim Upscaling der Produktion.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden. In einer Batch wird vom Anfang bis zum Ende des Prozesses keine zusätzliche Fütterung verwendet; in einem Fed-Batch kann die Fütterung mit Substrat und Supplements die Dauer einer Kultur für höhere Zelldichten verlängern oder den Stoffwechsel umstellen, um den gewünschten Metaboliten zu produzieren; und in der kontinuierlichen Kultur hält entweder die Zuführrate einer wachstumsbegrenzenden Substanz die Zelldichte konstant (ein Chemostat) oder die Zelldichte bestimmt die Zuführrate des Substrats (Turbidostat). Eine weitere, sehr produktive Möglichkeit bietet die Zellretention (Perfusion). Die Zuführrate entspricht der Abfuhrrate des Ernteguts. Durch die ausgewogene Art der Fütterung kann ein stabiler Zustand erreicht werden, der Tage bis Monate andauern kann.
  • Die vorliegende Erfindung induziert Pilz-BGCs zur Produktion gewünschter Metaboliten. Im Prinzip sind alle BGCs eingeschlossen, die durch die Zugabe der Marginolactone, wie hierin beschrieben, induziert werden. Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem BGC, der an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligt ist, einem BGC, der nicht-ribosomale Peptidsynthetasen umfasst, einem BGC, der Typ-1-Polyketidsynthasen umfasst, einem BGC, der an der Synthese von Terpenen beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist. Der Fachmann wird in der Lage sein, zusätzliche BGCs in Pilzspezies leicht zu identifizieren, zum Beispiel im Hinblick auf den oben und hier zitierten Stand der Technik und in der entsprechenden Literatur.
  • Bevorzugt ist ferner ein BGC, der an der Synthese von F-9775A oder F-9775B beteiligt ist, Cathepsin-K-Inhibitoren, die aus einem Chromatin-Remodeling-deletierten Stamm von Aspergillus nidulans stammen. Es wurde festgestellt, dass ein Polyketid-Synthase-Gen für ihre Bildung und für das einfachere, archetypische Polyketid Orsellinsäure verantwortlich ist. Beide Verbindungen F-9775A und B wurden als Medikament gegen Osteoporose getestet (Sato, S., Morishita, T., Hosoya, T. & Ishikawa, Y. Novel pentacyclic compounds, F-9775A and F-9775B, their manufacture with Paecilomyces carneus, and their use for treatment of osteoporosis. Japanisches Patent JP11001480 (1999)).
  • Noch ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung mindestens eines Marginolactons zum Induzieren mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie hierin offenbart.
  • Noch ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung mindestens eines Marginolactons zur Herstellung mindestens eines spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie hierin offenbart.
  • Zusammenfassend identifizierten die Erfinder bakterielle Marginolactone von Streptomyceten als die Hauptinduktoren der Naturstoffbiosynthese der Pilze A. nidulans und A. fumigatus. Zusätzlich identifizierten sie drei phylogenetisch entfernte Streptomyceten, um kryptische Naturstoff-Gencluster in Pilzen zu induzieren, basierend auf ihrem genetischen Repertoire, was die breite Anwendbarkeit des Konzepts der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Gegenstände.
    • Gegenstand 1. Verfahren zur Induktion mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart, umfassend den Schritt der Kultivierung der Pilzart in einem Kulturmedium, das mindestens ein Marginolacton umfasst.
    • Gegenstand 2. Verfahren nach Gegenstand 1, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligten BGC, einem BGC umfassend nicht-ribosomale Peptidsynthetasen, einem BGC umfassend Typ 1 Polyketidsynthasen, einem an der Synthese von Terpenen beteiligten BGC, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist
    • Gegenstand 3. Verfahren nach Gegenstand 1 oder 2, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus einem bakteriellen Marginolacton, wie von einem Stamm von Streptomyces, Streptoverticillium oder Saccharomonospora hergestellt.
    • Gegenstand 4. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus Desertomycin A, Desertomycin G, Monazomycin/Takacidin, Quadoctomycin, Azalomycin F oder der Komplex oder Teile davon, Niphimycin und Primycin A.
    • Gegenstand 5. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei der Pilz ausgewählt ist aus einem einzelligen Pilz, einem filamentösen Pilz, einer Hyphe, Hefe, Schimmel, einem Stamm von Candida, einem Stamm von Saccharomyces, einem Stamm von Debaryomyces, einem Stamm von Zygosaccharomyces, einem Stamm von Aspergillus, A. nidulans und A. fumigatus.
    • Gegenstand 6. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei das mindestens eine Marginolacton dem Medium als Verbindung als Teil eines bakteriellen Zellextrakts von Bakterien zugesetzt wird, die mindestens ein Marginolacton produzieren, und/oder es wird diesem Medium durch Kokultur mit Bakterien, die mindestens ein Marginolacton produzieren, zugesetzt.
    • Gegenstand 7. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart, umfassend die Schritte von a) Induzieren von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC), der den spezialisierten Metaboliten in einer Kultur einer Pilzart nach einem der Gegenstände 1 bis 6, synthetisiert, und b) Isolieren des spezialisierten Metaboliten aus der Pilzspezies und/oder dem Kulturmedium davon.
    • Gegenstand 8. Verfahren nach Gegenstand 7, wobei das Verfahren als Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlicher Prozess durchgeführt wird.
    • Gegenstand 9. Verfahren nach Gegenstand 7 oder 8, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligten BGC, einem BGC umfassend nicht-ribosomale Peptidsynthetasen, einem BGC umfassend Typ 1 Polyketidsynthasen, einem an der Synthese von Terpenen beteiligten BGC, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist.
    • Gegenstand 10. Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Induzierung von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 6.
    • Gegenstand 11. Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren nach einem der Gegenstände 7 bis 9.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen weiter beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hierin zitierten Referenzen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
    • 1 zeigt den Einfluss der bld-Gene auf die Induktion des Orsellinsäure BGC in A. nidulans. a. Schematische Darstellung der regulatorischen Kaskade von bld-Genen. Der Hauptregulator BldD reguliert die verbleibenden bld-Gene und verhindert, dass die Zellen in ihrem Lebenszyklus fortschreiten. BldH/AdpA kann die Expression weiterer bld- und whi-Gene induzieren, was letztendlich zur Bildung von Luftmyzel und Sporulation führt. bldA ermöglicht die effiziente Translation von Genen, die TTA-Codons enthalten, und reguliert damit sowohl die Sporulation als auch die Sekundärmetabolitproduktion. b. Einfluss deletierter S. iranensis bld-Gene auf die Induktion der Orsellinsäureproduktion in A. nidulans. Die Deletion von bldD, bldA oder bldH von S. iranensis führt zu der Unfähigkeit, die Expression des ors-Gen-Clusters in A. nidulans zu induzieren. Die Unfähigkeit, Orsellinsäure zu produzieren, führt zu einer Unfähigkeit, Lecanorinsäure sowie F-9775 A/B zu produzieren.
    • 2 zeigt die Induktion der Orsellinsäureproduktion durch AzlR (SIRAN1137)-Mutanten. Die Deletion von azlR macht S. iranensis unfähig, die Produktion der ors-Verbindungen in A. nidulans zu induzieren. Durch die Komplementierung der Deletion wird die induktive Fähigkeit teilweise wiederhergestellt.
    • 3 zeigt die Azalomycin F-Produktion verschiedener S. iranesis-Mutanten. a. Die Deletion von azlR macht es S. iranensis unmöglich, Azalomycin F zu produzieren. b. Die Bld-Mutanten, die den ors-Gencluster in A. nidulans nicht induzieren können, produzieren kein Azalomycin F.
    • 4 zeigt die Induktion von BGCs in A. nidulans und A. fumigatus durch Co-Kultivierung mit Mutanten, denen die Azalomycin-Produktion mangelt. a. LC-MS-Profil extrahierter Ionenchromatogramme der Orsellinsäure (m/z = 167 [M-H]-). Die Deletion der biosynthetischen Kerngene des azl-Genclusters macht es den erzeugten Mutanten unmöglich, die Produktion von Orsellinsäure in A. niduans zu induzieren. b. Eine fehlerhafte Azalomycin F-Produktion führt dazu, dass S. iranensis die Produktion von Fumigermin in A. fumigatus nicht induzieren kann. c. S. iranensis-Mutanten, die in der Azalomycin F-Produktion defekt sind, induzieren nicht die Produktion von Fumicyclinen A, B oder C in A. fumigatus.
    • 5 zeigt, dass die Zugabe von Marginolactonen stille BGCs in A. nidulans und A. fumigatus aktivieren kann. a. Die Zugabe von 40 µg/ml Azalomycin F oder 30 µg/ml Desertomycin A induziert die Produktion von Orsellinsäure in A. nidulans. b. Die Zugabe von Azalomycin F induziert die Produktion von Fumigermin in A. fumigatus. c. Die Marginolacton-produzierenden Stämme S. macronensis und S. mashuensis sind auch in der Lage, die Produktion von Orsellinsäure in A. nidulans zu induzieren. d. Die Zugabe von Azalomycin F induziert die Produktion von Fumicyclinen A, B und C in A. fumigatus.
    • 6 ist die grafische Zusammenfassung der Regulation von bakteriellem Azalomycin F und der Regulation der Pilzinduktion des ors-Genclusters. Bei S. iranensis beginnt die Regulation des Azalomycin F BGC mit BldD. Dieses Protein reguliert die Expression von bldA und bldH als Dimer mit c-di-GMP. bldA kodiert für die einzige tRNA, die das UUA-Codon in Leucin übersetzt. AzlR (SIRAN1137) ist ein Transkriptionsregulator vom LAL-Typ, der ein solches UUA-Codon trägt und das Azalomycin F BGC positiv reguliert. Azalomycin F in Kombination mit weiteren Effektoren aktiviert den SAGA/ADA-Komplex und/oder basR in A. nidulans. Die Acetyltransferase GcnE des SAGA/ADA-Komplexes acetyliert die Aminosäuren Lysin K9 und K14 des Histons H3, die zum ors-Gencluster gehören. BasR aktiviert die Transkription des ors-Genclusters.
  • Beispiele
  • Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung werden AzlR und SIRAN1137 synonym verwendet, wobei AzlR bevorzugt wird. Tabelle 1: Weltweite Isolierung von Marginolacton-produzierenden Actinomyceten und ihre phylogenetische Diversität zeigen eine ubiquitäre Verteilung dieser Verbindungsklasse im Boden
    Verbindung Hersteller Ort der Isolierung Quelle
    Desertomycin A Streptomyces flavofungini Wüstensand, Afrika (Uri et al., 1958)
    Streptomyces spectabilis BT352 Südfrankreich (Benallaoua et al., 1990)
    Streptomyces macronensis Belize (Dolak et al., 1983a, Dolak et al., 1983b)
    Streptomycin nobilis JCM4274 (isoliert als Streptomyces sp. 725) Hesbaye, Belgien (Hashimoto et al., 2020, Baldacci et al., 1965)
    Streptomyces alboflavus SC11 Streptomyces baldacii subsp. netropsis (Streptomyces sp. DSM5990) Westliche Sichan Hochebene, China Indien (Fan et al., 2012) (Grabley et al., 1993, Zeeck et al., 1991)
    Desertomycin G Streptomyces althioticus MSM3 Oberfläche von Seetang Ulva sp., kantabrianische See (Braña et al., 2019)
    Monazomycin/Takacidin Streptoverticillium griseoverticillatum Iwate Präfektur, Japan (Shinobu und Shimada, 1962)
    Streptomyces mashuensis Mashusee, Japan (Sawazaki et al., 1955)
    Quadoctomycin Streptomyces sp. MM168-141F8 Shinagawa-ku, Tokio, Japan (Sawa et al., 2018)
    Azalomycin F Streptomyces iranensis Teheran, Iran (Hamedi et al., 2010)
    Streptomyces rapamycinicus Osterinseln (Kumar und Goodfellow ,2008)
    Streptomyces malaysiensis MJM1968 Imsil, Südkorea (Cheng et al., 2010)
    Streptomyces sp. 211726 Mangrovenbaum Rhizosphäre, Wenchang, China (Yuan et al., 2013)
    Streptomyces violaceusniger Tü4113 Streptomyces sp. M56 Streptomyces melanosporofaciens DSM40318 Otway Nationalpark, Australien Termitenhügel, Südafrika Weizenfeld nahe Pescara, Italien (Höltzl et al., 1998) (Kim et al., 2014) (Arcamone et al., 1959)
    Niphimycin Streptomyces endus DSM 40187 Streptomyces sp. IMB7-145 Cache Flusstal Valley, Illinois, USA Marine Sediment vor der Küste von Dalian, China (Gottlieb et al., 1951) (Wu et al., 2013)
    Primycin A Saccharomonospora azurea NA-128 Saccharomonospora galeriensis (basonym Streptomyces primycini; basonym Micromonospora galeriensis) Sichuan, Guangyuan, China Intestinaler Trakt und Faeces von Wachsmotten (Runmao, 1987) (Vályi-Nagy et al., 1954, Úri und Actor, 1979, Wagman, 1980, Szabó et al., 2007)
    Tabelle 2. Transskriptomanalyse der Genexpression in der S. iranensis ΔazlR-Mutante im Vergleich zum S. iranensis Wildtyp. Die gezeigten Gene gehören möglicherweise zu dem BGC, der für die Produktion von Azalomycin F verantwortlich ist und zeigen eine stark verringerte Expression, wenn azlR deletiert ist.
    Gen Streptomyces iranensis (HM35T) ID DSM41954 in Genname Mögliche Proteins Rolle des Fache-Veränderung in S. iranensis ΔSIRAN1137 verglichen mit Wildtyp
    SIRAN_RS04265 azlE Typ I Polyketidsynthase -58.7
    SIRAN_RS04255 azlG Typ I Polyketidsynthase -55.4
    SIRAN_RS04250 azlH Typ I Polyketidsynthase -65.2
    SIRAN_RS04245 azlA Typ I Polyketidsynthase -66.5
    SIRAN_RS04240 azl4 4-Guanidinbutanoat:CoA Ligase -38.8
    SIRAN_RS04235 azl5 4-Guanidinbutyryl- CoA:ACP Acyltransferase -39.3
  • Materialen und Methoden
  • Mikroorganismen, Plasmide, Medien und Kultivierung
  • Alle Mikrobenstämme wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet sind in Tabelle 1 aufgelistet. Verwendete Plasmide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 1: Mikroorganismen, deren Genotyp und Referenz.
    Organismus Relevanter Genotyp Referenz
    Streptomyces iranensis DSM41954 (HM35T) Wildtyp Stamm Hamedi et al. (2010)
    Streptomyces Δazl4Δazl5 iranensis SIRAN1022&SIRAN1023::aae(3)IV, oriT (Krespach et al., 2020)
    Streptomyces ΔazlH iranensis SIRAN1025::aae(3)IV, oriT (Krespach et al., 2020)
    Streptomyces ΔbldD iranensis SIRAN2101::aac(3)IV, oriT vorliegende Anmeldung
    Streptomyces ΔbldA iranensis SIRANXXXX: :aac(3)IV, oriT vorliegende Anmeldung
    Streptomyces ΔbldH iranensis SIRANXXXX::aac(3)IV, oriT vorliegende Anmeldung
    Streptomyces AazIR iranensis SIRAN1137::aac(3)IV, oriT vorliegende Anmeldung
    Streptomyces AazlRc iranensis SIRAN1137::aac(3)IV, attB::pSET152_kan_SIRAN1137, oriT vorliegende Anmeldung
    Streptomyces macronensis UC 8271 (NRRL12566) Wildtyp Stamm Dolak et al. (1983)
    Streptomyces mashuensis DSM40896 Wildtyp Stamm Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, DE
    Streptomyces melanosporofaciens DSM40318 Wildtyp Stamm (Arcamone et al., 1959)
    Streptomyces sp. M56 Streptomyces violaceusniger Tü4113 Wildtyp Stamm Wildtyp Stamm (Kim et al., 2014) (Höltzl et al., 1998)
    Saccharomonospora azurea Wildtyp Stamm Salazar O, Morón R, Genilloud O. Int J Syst Evol Microbiol. 2000 Nov;50 Pt 6:2043-2055
    Aspergillus nidulans RMS011 Aspergillus fumigatus ATCC 46645 pabaAl, yA2; ΔargB::trpCΔB; veAl, trpC801 Wildtyp Stamm, MAT-1 Stringer et al. (1991) (Hearn und Mackenzie, 1980)
    Escherichia coli α-Select deoR, recAl, endAl, relAl, hsdR17(r - k , m + k ), supE44, gyrA96, thi-1, Fγ - Bioline, London, UK
    Escherichia coli BW25113 lacl q , rrnB T14 , ΔlacZ WJ16 , hsdR514, ΔaraBA-, D AH33 , ΔrhaBAD LD78 Datsenko und Wanner (2000)
    Escherichia coli ET12567 F - , dam-13::Tn9, dcm-6, hsdR, zij-202 ::Tn10, recF143, galK2, GalT22, ara-14, acY1, xyl-5, leuB6, thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78, mtl-1, glnV44 MacNeil et al. (1992)
    Table 2: Plasmide wie in dieser Untersuchung verwendet, deren relevante Eigenschaften und Referenzen.
    Plasmide Eigenschaften Referenz
    pIJ790 λ-RED (gam, bet, exo), cat, araC, rep 10 1ts (Gust et al., 2003)
    pUZ8002 RK2 Derivat mit defektivem oriT (aph) (Paget et al., 1999)
    pKOSi kan r, pSG5 Replicon, oriT (Netzker et al., 2016)
    pK0Si_SIRAN2101 kan, RSF ori, pSG5, SIRAN2101 vorliegende Anmeldung
    pKOSi_ΔSIRAN2101 kan, RSF ori, pSG5, SIRAN2101::aac(3)IV, oriT vorliegende Anmeldung
    pSET152_kan lacZa, oripUCl9, oriT RP4, int-attP, j C31, kan r (Bierman et al., 1992)
  • Kultivierung von Streptomyces spp.
  • Streptomyces iranensis DSM41954 (HM35T) Wildtyp- und Deletionsmutanten wurden in TSB-Medium bei 28 °C und 180 U/min in einem Erlenmeyerkolben mit Wattestopfen gezüchtet, um einen ausreichenden Gasaustausch zu ermöglichen. Typischerweise wurden 5 × 108 Sporen in 50 ml Medium inokuliert, um eine Kultur zu erhalten, die bis zu einer hohen Dichte gezüchtet wurde. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf Hafermehl-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Streptomyces mashuensis DSM40896 wurde durch Inokulation von 2,5 × 107 Sporen in 50 ml GYM-Medium (4 g/1 Glucose, 4 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 Malzextrakt, pH 7,2) und Inkubation bei 28 °C und 180 U/min über Nacht gezüchtet. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf Hafermehl-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Streptomyces melanosporofaciens DSM40318 wurde durch Inokulation von 2,5 × 107 Sporen in 50 ml TSBY-Medium (Xu et al. 2017) und Inkubation bei 28 °C und 180 U/min über Nacht gezüchtet. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf Hafermehl-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Streptomyces sp. M56 wurde durch Inokulation von 2,5 × 107 Sporen in 50 ml TSBY-Medium und Inkubation bei 28 °C bei 180 U/min über Nacht gezüchtet. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf Hafermehl-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Streptomyces violaceusniger Tü4113 wurde durch Inokulation von 2,5 × 107 Sporen in 50 ml GYM-Medium und Inkubation bei 28 °C bei 180 U/min für 72 Stunden gezüchtet. Die Kultur wurde dann in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert. Das Medium wurde verworfen und das Pellet mit 5 ml TSB-Medium gewaschen, um restliches GYM-Medium zu entfernen. Das Pellet wurde dann in 50 ml TSB-Medium resuspendiert und weitere 72 Stunden bei 28°C und 180 U/min inkubiert. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf Hafermehl-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Saccharomonospora azurea wurde durch Inokulation von 2,5 × 107 Sporen in 50 ml TSBY-Medium und Inkubation bei 28 °C bei 180 U/min über Nacht gezüchtet. Sporen wurden durch Ausplattieren von 200 µL einer Flüssigkultur auf MS-Agar und Inkubation für 14 Tage bei 28°C erzeugt.
  • Kultivierung von Aspergillus spp.
  • Aspergillus nidulans RMS011 wurde in 50 ml AMM (Brakhage und Van den Brulle, 1995), ergänzt mit 5 mM Arginin, 1 ml/1 Spurenelementen, 0,3 mM FeSO4 und 0,0003 % (w/v) p-Aminobenzoesäure (PABA) kultiviert. Nach Inokulation von 4 × 108 Sporen wurden die Kulturen bei 37 °C mit 200 U/min inkubiert. Sporen wurden von Kolonien erhalten, die auf AMM-Agarplatten bei 37 °C für 3 Tage gewachsen waren, ergänzt wie für AMM beschrieben.
  • Aspergillus fumigatus ATCC 46645 wurde in 50 ml AMM kultiviert (Brakhage und Van den Brulle, 1995). Nach der Inokulation von 108 Sporen wurden die Kulturen bei 37 °C mit 200 U/min inkubiert. Sporen wurden von Kolonien erhalten, die 3 Tage lang bei 37 °C auf AMM-Agarplatten gezüchtet wurden.
  • Kokultivierung von Aspergillus spp. mit Streptomyces spp.
  • Streptomyces spp. wurden wie oben beschrieben kultiviert. Mycelien von A. fumigatus oder A. nidulans Übernachtkulturen (~16 h alt) in AMM wurden mit Miracloth (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) vom Medium getrennt und in frisches AMM (im Fall von A. nidulans ergänzt mit 5 mM Arginin, 1 mL/L Spurenelemente, 0,3 mM FeSO4 und 0,0003 % (w/v) PABA) platziert. Entweder 1/20 Vol. der Streptomycetenkultur (Schroeckh et al., 2009) oder 20 - 40 µg/ml gereinigtes Marginolacton (Desertomycin A, Monazomycin A und Azalomycin F, Primycin A1) wurden zugegeben und bei 37 °C bei 200 U7min weiter inkubiert. Desertomycin A und Monazomycin wurden von Santa Cruz Biotechnology (Dallas, USA) bezogen. Proben für die LC-MS-Analyse wurden nach 12 h (für A. fumigatus) oder 24 h (für A. nidulans) der Kokultivierung entnommen und wie unten beschrieben extrahiert.
  • Erzeugung von Streptomyces iranensis Mutanten
  • Gen-Deletionen in S. iranensis wurden wie von Netzker et al. (2016) beschrieben erzeugt. Verwendete Oligonukleotidsequenzen sind in Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3: Namen der Oligonukleotide, deren Sequenz und Funktion.
    Name Sequenz (5' - 3'). Kleine Buchstaben zeigen Erkennungssequenzen von verwendeten Restriktionsenzymen an. Fette Buchstaben markieren homologe Sequenzen für die Rekombination. Funktion/Aufgabe. FW: Vorwärts Primer. RV: Reverser Primer.
    OMK_116 GCT TCA aag ctt CAT GGT CAC TTG CTC TCC TC (SEQ ID NO: 1) Klonierung von SIRAN2101 und HindIII Erkennungssequenz. FW
    OMK_117 CAT TGT tct aga GGC GAT TTC CTC ACC ATC TC (SEQ ID NO: 2) Klonierung von SIRAN2101 und XbaI Erkennungssequenz. RV
    OMK_118 CAC AGC CGC ACG TCG ATA CAG CGT CCG GGG AGC TTT ATG ATT CGG GGG ATC CGT CGA CC (SEQ ID NO: 3) Amplifikation der Resistenzkassette und Insertion von homologen flankierenden Regionen von SIRAN2101. FW
    OMK_119 CGG CAC GTT TCT GCT GGT GAA CAG GGA AAG GGG GAC TCA TGT AGG CTG GAG CTG CTT (SEQ ID NO: 4) Amplifikation der Resistenzkassette und Insertion von homologen flankierenden Regionen von SIRAN2101. RV
    OMK_148 CCT TGG CGG AAA AGT TGA TC (SEQ ID NO: 5) PCR für Southern blot Sonde für SIRAN2101. FW
    OMK_149 CAA ATC CGA CCG TCC TTT AAG (SEQ ID NO: 6) PCR für Southern blot Sonde für SIRAN21010. RV
  • Extraktion und Nachweis von Naturprodukten
  • Zur pilzlichen Naturstoffextraktion wurde das Kulturmedium mit einem ULTRA-TURRAX (IKA-Werke, Staufen, Deutschland) homogenisiert. Homogenisierte Kulturen wurden zweimal mit insgesamt 100 ml Ethylacetat extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Für die LC-MS-Analyse wurden die getrockneten Extrakte in 1 ml Methanol gelöst und auf ein Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS-System geladen, bestehend aus einem UltiMate 3000 binären Schnelltrenn-LC mit Photodioden-Array-Detektor (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) und einem linearen Ionenfallen-Massenspektrometer LTQ XL (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland), ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionenquelle.
  • Die Extrakte (Injektionsvolumen 10 µl) wurden auf einer 150 mm × 4,6 mm Accucore Reversed-Phase (RP)-MS-Säule mit einer Partikelgröße von 2,6 µm (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) bei einer Flussrate von 1 ml/min analysiert, mit folgendem Gradienten über 21 min: anfänglich 0,1 % (v/v) HCOOH-MeCN/0,1 % (v/v) HCOOH-H2O 0/100, das in 15 min auf 80/20 erhöht wurde und dann auf 100/0 in 2 min, 2 min auf 100/0 gehalten und in 2 min auf 0/100 umgekehrt. Die Identifizierung von Desertomycin A und Monazomycin wurde durch Vergleich mit authentischen Referenzen erreicht, die von Santa Cruz Biotechnology (Dallas, USA) erworben wurden.
  • Herstellung und Reinigung von Azalomycin F aus S. iranensis
  • Um Proben des Azalomycin-F-Komplexes aus S. iranensis zu erhalten, wurden 50 mL TSBY mit 5 × 108 Sporen inokuliert und die Bakterien 4 Tage bei 28 °C und 180 U/min inkubiert. Die gesamte Kultur wurde zentrifugiert, um die Biomasse vom Kulturüberstand zu trennen. Nach Gefriertrocknung der Biomasse wurde der Inhalt des Pellets zweimal mit 50 ml Methanol bei 60 °C extrahiert. Beide Extraktionslösungen wurden vereinigt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft und in 2 ml 75 % (v/v) wässrigem Methanol (MeOH(aq)) gelöst. Der Extrakt wurde anschließend auf eine N-Vinylpyrrolidon-Divinylbenzol-Copolymerharz-SPE-Säule (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) geladen, mit 50 % (v/v) MeOH (aq) gewaschen und mit 70 % (v/v) MeOH eluiert (aq), um gereinigten Azalomycin-F-Komplex zu erhalten.
  • Ergebnisse
  • Pleiotrope Transkriptionsregulatoren der bld-Familie sind an der bakteriellen Induktion des pilzlichen ors-Genclusters beteiligt
  • Um den chemischen Auslöser pilzbiosynthetischer Gencluster durch S. iranensis zu identifizieren, verfolgten die Erfinder einen Top-down-Ansatz, beginnend mit charakterisierten pleiotropen Regulatoren und anschließender Beschränkung auf spezifischere Regulatoren. BldD ist ein gut untersuchter pleiotroper Regulator von Genen, die am komplexen Entwicklungszyklus von Streptomyceten sowie an der Biosynthese von Naturstoffen beteiligt sind (Elliot et al., 1998, Elliot et al., 2001, Elliot et al., 2003). Die Experimente der Erfinder zeigten, dass die Deletion von bldD in S. iranensis zu einer Mutante führte, die nicht in der Lage war, den ors-Gencluster in A. nidulans zu induzieren. Die gemeinsame Kultivierung der Deletionsmutante mit A. nidulans und die anschließende LC-MS-Analyse zeigten keine Pilzproduktion der vom ors-Gencluster abgeleiteten Verbindungen Orselinsäure, Lecanorsäure und F-9775A und B (1B). Dies weist darauf hin, dass von BldD kontrollierte Gene an der Regulation des gesuchten bakteriellen Auslösers beteiligt sind.
  • BldH ist ein pleiotroper Entwicklungsregulator, dessen Transkription von BldD kontrolliert wird (Den Hengst et al., 2010). Die Erfinder haben dieses Gen in S. iranensis deletiert. Die Deletionsmutante zeigte den erwarteten kahlen Phänotyp und konnte den ors-Gencluster in A. nidulans nicht induzieren, was auf eine Rolle von BldH bei der Regulierung dieser Wechselwirkung hindeutet (1B).
  • Nach der regulatorischen Kaskade von Genen, die von BldD und BldH kontrolliert werden, analysierten die Erfinder als nächstes bldA. bldA codiert die einzige tRNA in den meisten Streptomyceten, die das TTA-Codon effektiv in Leucin übersetzen kann (Leskiw et al., 1993, Takano et al., 2003). Die Deletion von bldA in S. iranensis führte zu einem Mutantenstamm, der den zuvor erwähnten bldA Phänotyp zeigte. In einer Kokultur von S. iranensis ΔbldA und A. nidulans stellten wir fest, dass die bldA-Deletionsmutante die Biosynthese der typischen ors-Genclusterprodukte nicht induziert (1B). Daher müssen Gene, die das TTA-Codon enthalten, an der Regulation des bakteriellen Auslösers beteiligt sein.
  • Zusammengenommen identifizierten die Erfinder somit drei pleiotrope Hauptregulatoren der Bakterienreich-übergreifenden Interaktion von S. iranensis mit A. nidulans. Der Einfluss von bldA auf die Translation von Genen, die möglicherweise an der Produktion des chemischen Auslösers beteiligt sind, ermöglichte ein Screening von Genen, die das TTA-Codon für Leucin verwenden.
  • Daher haben die Erfinder das Genom von S. iranensis auf Gene gescreent, die drei Kriterien erfüllen. Erstens müssen sie mindestens ein TTA-Codon enthalten. Zweitens sollten sie mutmaßliche Transkriptionsregulatoren codieren und drittens sollten diese Gene Homologe in Streptomyces rapamycinicus und Streptomyces violaceusniger haben. Diese Streptomyceten sind eng mit S. iranensis verwandt und induzieren auch das ors-Gencluster in A. nidulans (Schroeckh et al., 2009, Nouioui et al., 2018)). Insgesamt identifizierten die Erfinder 12 Gene, die diese Kriterien erfüllten, diese Gene wurden in S. iranensis deletiert, und die Mutanten wurden mit A. nidulans co-kultiviert (2).
  • Nur die Deletionsmutante von SIRAN1137 (azlR) induzierte keine Biosynthese der ors-Gencluster-codierten Produkte. Die bioinformatische Analyse zeigt, dass azlR einen mutmaßlichen Transkriptionsregulator der LuxR-Familie kodiert, der aus 918 Aminosäuren besteht und eine N-terminale ATP-Bindungsdomäne sowie eine C-terminale Helix-Turn-Helix-Domäne enthält (Horn et al., 2014). Daher gehört es zur atypischen LAL-Unterfamilie (große ATP-Bindungsregulatoren der LuxR-Familie (Horn et al., 2014, De Schrijver und De Mot, 1999). Diese Gruppe von Transkriptionsregulatoren ist häufig an der Regulation der Polyketidsynthese beteiligt (Romero-Rodriguez et al., 2015). S. iranensis ΔazlR wies keinen bld Phänotyp auf und wird daher nicht als zur bld Familie gehörig angesehen. Um zu verifizieren, dass die Unfähigkeit, den ors-Gencluster des Pilzes zu induzieren, durch die Deletion von SIRAN1137 verursacht wird komplementierten die Erfinder die Mutante, indem sie eine Kopie des Wildtyp-SIRAN1137-Gens über das integrative Plasmid pSET152 in die φC31-Anheftungsstelle einführten (Bierman et al., 1992).Die Komplementationsmutante wurde mit A. nidulans co-kultiviert, und die Analyse des Extrakts ergab, dass die Produktion der vom ors-Gencluster abgeleiteten Verbindungen im Wesentlichen wiederhergestellt wurde (2).
  • Zusammenfassend wurde eine Strategie angewendet, bei der gut charakterisierte pleiotrope Regulatoren der bld-Familie verwendet wurden, um einen spezifischeren Regulator des bakteriellen Auslösers zu finden, der die Biosynthese der aus dem ors-Gencluster stammenden Naturstoffe induziert. Dies führte zur Identifizierung des Transkriptionsregulators AzlR aus der Familie der Nicht-Glatzen.
  • AzlR reguliert die Produktion von Azalomycin F in S. iranensis
  • Um durch AzlR regulierte Gene zu identifizieren, isolierten die Erfinder mRNA der Deletionsmutante und führten eine Transkriptomanalyse durch. Dabei zeigte sich eine starke Herunterregulierung essentieller Gene des Azalomycin F BGC in S. iranensis AazIR im Vergleich zum Wildtyp (Tabelle 2). Dementsprechend wurde in den Kulturen von S. iranensis AazIR kein Azalomycin F nachgewiesen (3). Als nächstes wurden Kulturen von S. iranensis ΔbldD, S. iranensis ΔbldH und S. iranensis ΔbldA auf Azalomycin F-Produktion getestet. Erwartungsgemäß wurde in diesen Kulturen kein Azalomycin F nachgewiesen (3). Die komplementierte Mutante von ΔazlR, S. iranensis ΔazIRC, zeigte jedoch eine Azalomycin F-Produktion (3). Folglich wurden Mutanten, denen Gene des Azalomycin F BGC fehlen, auf ihre Fähigkeit getestet, den ors-Gencluster des Pilzes zu induzieren. azlH codiert ein Modul der Azalomycin-F-PKS. azl4 und azl5 codieren Enzyme, die für die Aktivierung und das Laden der von Arginin abgeleiteten Vorstufe 4-Guanidinobuttersäure auf die PKS essentiell sind (Xu et al., 2017, Hong et al., 2013). Die Deletion dieser Gene führt zu Mutanten, die kein Azalomycin F produzieren können (Krespach et al., 2020). Die gemeinsame Kultivierung von S. iranensis ΔazlH und S. iranensis Δazl4Δazl5 mit A. nidulans führte nicht zur Pilzproduktion von Orsellinsäure und ihren Derivaten (4A).
  • Unter Verwendung dieser Informationen testeten die Erfinder, ob S. iranensis Azalomycin F-defiziente Mutanten ebenfalls keine natürlichen Produkt-BGCs in A. fumigatus induzieren würden. Erwartungsgemäß konnten alle getesteten Mutanten keine Pilzproduktion der Fumicycline sowie von Fumigermin induzieren (4B). Dies weist darauf hin, dass Azalomycin F bei diesen Wechselwirkungen zwischen den bakteriellen Königreichen eine wesentliche Rolle spielt.
  • Bakterielle Marginolactone lösen die Induktion von Pilz-Naturstoff-BGCs aus
  • Um die Rolle von Azalomycin F als Auslöser von S. iranensis für die Induktion von Pilz-BGCs zu verifizieren, wurde die gereinigte Verbindung auf Kulturen von A. nidulans und A. fumigatus angewendet. Wie in 5A gezeigt, produzierte A. nidulans Orselinsäure und ihre Derivate nach Zugabe von Azalomycin F. BasR ist ein pleiotroper Regulator der Streptomyces-induzierten Naturstoffbiosynthese in A. nidulans (Fischer et al., 2018). Die Deletion von basR führt zu Pilzstämmen, die keine Biosynthese von Orsellinsäure, Lecanorsäure und F-9775A/B in Gegenwart von S. rapamycinicus zeigen. Die Erfinder fragten, ob die Induktion des ors-Genclusters durch Azalomycin F dem gleichen regulatorischen Weg folgt wie eine Co-Kultivierung des Pilzes mit S. iranensis und S. rapamycinicus. Daher wandten die Erfinder Azalomycin F auf die A. nidulans ΔbasR-Mutante an. Wie in 5A gezeigt, wurde nach Zugabe von Azalomycin F zum Pilz keine der typischen ors-Gencluster-Verbindungen nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Pilz-Signaltransduktion nach Azalomycin-F-Applikation durch BasR vermittelt wird. Die Regulation der Biosynthese von Azalomycin F als bakterielles Signal sowie die Verarbeitung des Moleküls durch Pilze ist in 6 zusammengefasst.
  • A. fumigatus codiert kein basR-Homolog (Fischer et al., 2018). Bei Zugabe von S. iranensis sowie Azalomycin F wurden jedoch sowohl die Fumicycline als auch Fumigermin produziert (5B und 5D). Somit kann Azalomycin F als chemischer Auslöser der pilzlichen Naturstoff-BGC-Induktion angesehen werden, obwohl sich die pilzliche Signaltransduktion zwischen A. nidulans und A. fumigatus unterscheidet.
  • Azalomycin F ist ein Mitglied der Margolacton-Naturstofffamilie (Moore und Hertweck, 2002). Diese Naturstoffe sind durch ein Makrolacton-Rückgrat und eine Guanidyl- oder Aminogruppe enthaltende Seitenkette gekennzeichnet (Zerlin und Thiericke, 1994, Moore und Hertweck, 2002). Die Erfinder finden heraus, dass Marginolactone allgemeine Signale bei Wechselwirkungen zwischen Königreichen sind. Desertomycin A und Monazomycin sind Marginolaktone, die von Streptomyces macronensis bzw. Streptomyces mashuensis produziert werden (Dolak et al., 1983a, Akasaki et al., 1963). Um dies zu verifizieren, wurden beide Streptomyceten mit A. nidulans co-kultiviert. Sowohl S. macronensis als auch S. mashuensis induzierten den ors-Gencluster (5C). Zusätzlich wurden kommerzielles Desertomycin A und Monazomycin zu einer Kultur von A. nidulans gegeben. Beide Verbindungen induzierten die Bildung von Orselinsäure und ihren Derivaten sowie die Produktion der Fumicycline und Fumigermin in A. fumigatus (5A, B und 5D).
  • Referenzen wie zitiert
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  • Zitierte Patentliteratur
    • JP 11001480 [0034]

Claims (11)

  1. Verfahren zur Induktion mindestens eines biosynthetischen Genclusters (BGC) in einer Pilzart, umfassend den Schritt der Kultivierung der Pilzart in einem Kulturmedium, das mindestens ein Marginolacton umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligten BGC, einem BGC umfassend nicht-ribosomale Peptidsynthetasen, einem BGC umfassend Typ 1 Polyketidsynthasen, einem an der Synthese von Terpenen beteiligten BGC, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von F-9775A oder F-9775B beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus einem bakteriellen Marginolacton, wie von einem Stamm von Streptomyces, Streptoverticillium oder Saccharomonospora hergestellt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mindestens eine Marginolacton ausgewählt ist aus Desertomycin A, Desertomycin G, Monazomycin/Takacidin, Quadoctomycin, Azalomycin F oder der Komplex oder Teile davon, Niphimycin und Primycin A.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Pilz ausgewählt ist aus einem einzelligen Pilz, einem filamentösen Pilz, einer Hyphe, Hefe, Schimmel, einem Stamm von Candida, einem Stamm von Saccharomyces, einem Stamm von Debaryomyces, einem Stamm von Zygosaccharomyces, einem Stamm von Aspergillus, A. nidulans und A. fumigatus.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das mindestens eine Marginolacton dem Medium als Verbindung als Teil eines bakteriellen Zellextrakts von Bakterien zugesetzt wird, die mindestens ein Marginolacton produzieren, und/oder es wird diesem Medium durch Kokultur mit Bakterien, die mindestens ein Marginolacton produzieren, zugesetzt.
  7. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart, umfassend die Schritte von a) Induzieren von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC), der den spezialisierten Metaboliten in einer Kultur einer Pilzart nach einem der Ansprüche 1 bis 6 synthetisiert, und b) Isolieren des spezialisierten Metaboliten aus der Pilzspezies und/oder dem Kulturmedium davon.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren als Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlicher Prozess durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der BGC ausgewählt ist aus einem stillen BGC, einem an der Synthese mindestens eines spezialisierten Metaboliten beteiligten BGC, einem BGC umfassend nicht-ribosomale Peptidsynthetasen, einem BGC umfassend Typ 1 Polyketidsynthasen, einem an der Synthese von Terpenen beteiligten BGC, einem BGC, der an der Synthese von Lantipeptiden beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Orsellinsäure oder Derivaten davon beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von F-9775A oder F-9775B beteiligt ist, einem BGC, der an der Synthese von Fumicyclinen beteiligt ist, und einem BGC, der an der Synthese von Fumigermin beteiligt ist.
  10. Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Induzierung von mindestens einem biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  11. Verwendung von mindestens einem Marginolacton zur Herstellung von mindestens einem spezialisierten Metaboliten durch einen biosynthetischen Gencluster (BGC) in einer Pilzart nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
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