DE102021107508A1 - Zuverlässige Identifikation von Bereichen (,a-Sites') in komlexen RNA-Molekülen, die zugänglich sind für Nukleinsäuren oder Komplexe von Nukleinsäuren mit Endonukleasen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:(iv) Bereitstellung einer Target-RNA;(v) esiRNA/ERNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;(vi) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder(vii) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und(viii) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern.Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Identifizierung von eNAs, die Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-Proteinen, RNase H und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren können und in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Endonukleasen, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern; sowie eNAs und Zusammensetzung enthaltend diese eNAs in der Pathogenbekämpfung.

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellung einer Target-RNA;
2. (ii) esiRNA/ERNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;
3. (iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder
4. (iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und
5. (v) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern.
• Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Identifizierung von eNAs, die Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-Proteinen, RNase H und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren können und in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Endonukleasen, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern; sowie eNAs und Zusammensetzung enthaltend diese eNAs in der Pathogenbekämpfung.
• Hintergrund der Erfindung
• Genexpression wird zu wesentlichen Anteilen auf der Ebene komplexer Ribonukleinsäuremoleküle (RNAs) reguliert, die entweder im Zuge der Transkription des zellulären Genoms (als prä-mRNAs oder mRNAs) oder im Zuge viroider oder viraler Replikation (als Viroide, virale Genome, virale mRNAs oder virale Antigenome/Replikationsintermediate) generiert werden. Die betreffenden RNAs, im Folgenden auch als,Target-RNAs' bezeichnet, sind entweder selbstreplizierend, wie im Falle von Viroiden, werden repliziert, wie im Falle viraler RNAs, zu maturen RNAs prozessiert, wie im Falle von prä-mRNAs und einigen viralen RNAs, oder sie werden translatiert, um Proteine zu generieren, wie im Falle maturer viraler, prokaryotischer oder eukaryotischer mRNAs und einiger viraler Genome. Target RNAs sind aber auch nicht-kodierende (non-coding) RNAs, die Genexpression modulieren.
• Um Einfluss auf die Genexpression zu nehmen, um diese gezielt zu modulieren und/oder ggf. zu inhibieren, sind diverse Nukleinsäure-basierte Technologien entwickelt worden. Dabei werden verschiedene Typen kurzkettiger Nukleinsäuren (NA), im Folgenden auch als ‚dirigierende NA‘ bezeichnet, über komplementäre Basenpaarung und damit sehr spezifisch an Target-RNAs assoziiert. Bei den dirigierenden NA kann es sich wiederum um Ribonukleinsäuremoleküle wie kleine (small) sRNAs (z.B. small interfering RNAs, siRNAs, oder microRNAs, miRNAs) oder auch guide (g) oder CRISPR (cr) RNAs aber auch um Desoxyribonukleinsäuren wie z.B. antisense DNA-Oligonukleotide (ASO) handeln. Die dirigierenden NA können bereits über die Bindung (,Hybridisierung‘) an die Target-RNA diese in ihrer Funktion, z.B. als Translationssubstrat, inhibieren. Meist bilden die dirigierenden NA jedoch einen Komplex mit einer Endonuklease. Diese Endonuklease liegt entweder bereits assoziiert an die dirigierende NA vor und wird dann nach Hybridisierung derselben an die Target-RNA auf dieser aktiv. Alternativ wird, nach der Assoziation der dirigierenden NA an die Target-RNA, eine Endonuklease rekrutiert. Die Funktion der Target-RNAs kann dann über die Nuklease-mediierte Katalyse einer endonukleolytischen Spaltung, inhibiert werden. Man spricht von einem ,silencing‘ der Target-RNA (1-6).
• Problemstellung. Ein Kernaspekt der Anwendung dirigierender NA, u.a. mit dem Zweck, Endonukleasen wie AGO- Proteine, RNase H oder Cas-Proteine auf eine Target-RNA zu dirigieren ist die Zugänglichkeit der Target-Sequenz an die die dirigierenden NA hybridisieren sollen. So falten sich längere RNA-Moleküle zu komplexen Sekundär- und Tertiärstrukturen, wo Segmente mit benachbarten oder weiter entfernten Segmenten interagieren. Dabei bilden sich ,stems', ,stem-loop‘, ,kissing-loop‘ und andere RNA-RNA-Interaktionen aus (7). Zudem assoziieren an die meisten RNA-Moleküle in der Zelle RNA-bindende Proteine (8). Entsprechend müssen dirigierende NA bzw. NA/Endonukleasekomplexe wie sRNA/AGO in der RNA-Interferenz (RNAi), ASO/RNase H in antisense-Verfahren oder g/crRNA/Cas in CRISPR/Cas-Verfahren mit diesen Strukturen und Proteinen konkurrieren, um an das Target assoziieren zu können (RNAi, Antisense- und CRISPR/Cas-Verfahren werden weiter unten erläutert). Je strukturierter und unzugänglicher eine Target-RNA ist, desto geringer ist entsprechend die Aktivität der NA bzw. der Nukleasen. Umgekehrt, je zugänglicher die Target-RNA ist, umso ausgeprägter der Effekt. Dieser Zusammenhang wurde für siRNA/AGO z.B. durch Gago et al (9) und für ASO z.B. durch Vickers and Crooke (10) nachgewiesen. Dabei wurde auch deutlich, dass auf mehrere Kilobasen umfassenden Target-RNAs nur sehr wenige Bereiche (sites), die im Folgenden als a-Sites (accessible sites - zugängliche Bereiche) bezeichnet werden, gut angreifbar für dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe sind (siehe auch Vorarbeiten).
• Bisherige Versuche, a-Sites in komplexen RNA-Molekülen (viralen RNA-Genomen, Viroiden, zellulären oder viralen mRNAs, non-coding RNAs etc.) zuverlässig zu detektieren, um eine möglichst hohe silencing-Effizienz zu erreichen, waren nur mäßig erfolgreich. So ist es zwar möglich, die Struktur einer RNA in einem wässrigen Milieu oder auch in der Zelle durch chemische Modifikationen zu bestimmen (11,12). Diese Ansätze sind jedoch sehr limitiert, da sie technisch aufwändig sind und RNA-Strukturen auch nur unter ganz definierten Bedingungen liefern. Ändern sich die Bedingungen - und das ist während der Aktivität einer RNA in der Zelle, allein schon aufgrund der dynamischen Interaktionen RNA-bindender Proteine, ständig der Fall - ist eine experimentelle Strukturbestimmung nicht aussagekräftig. Für kurze Bereiche können RNA-Strukturen unter Verwendung von Algorithmen wie z.B. mfold, sfold oder RNAplfold in silico prognostiziert werden. Ähnliche Ansätze sollen Bereiche aufspüren, die für dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe zugänglich sind, beispielsweise über einen ‚viral siRNA predictor‘ (http://crdd.osdd.net/servers/virsirnapred). Allerdings sind diese Programme, ebenso wie Ansätze Bibliotheken (libraries) dirigierender NA einzusetzen, nur bedingt verlässlich (13-20). Die hohe Strukturierung langkettiger Target-RNAs erklärt somit mangelnde silencing Effizienzen bei RNAi-, ASO- und CRISPR/Cas-Ansätzen.
• Die Identifizierung von a-Sites auf Target-RNAs ist somit von zentraler Bedeutung für die Verwendung von Methoden, die das Ziel haben, die Funktion(en) komplexer RNA-Moleküle z.B. während der Genexpression oder im Zuge ihrer Replikation über dirigierende NA bzw. Nukleinsäure-dirigierte Endonukleasen zu regulieren und/oder zu inhibieren. Lässt sich die Zugänglichkeit einer Target-RNA exakt und zuverlässig d.h. über fundierte experimentelle Methoden bestimmen, so erlaubt dies einerseits eine effiziente Anwendung von dirigierenden NA wie sRNAs, ASO und g/crRNAs. Zum anderen wird die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die betreffenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe unspezifisch auf anderen nicht-gewünschten RNA-Molekülen aktiv sind. Diese sog. ,off-target Effekte‘ sind bis dato ein erhebliches Problem beim Einsatz von RNAi, Antisense- und CRISPR/Cas-Verfahren; sie erfolgen z.B. über unvollständige Basenpaarung zwischen dirigierender NA und Target-RNA.
• WO 2005042705 A2 beschreibt eine Methode zur Identifizierung, zum Entwerfen und Synthetisieren einzigartiger siRNA Nukleotid-Sequenzen, welches zur Verbesserung der RNAi-Anwendung führt. Dabei erfolgt der Vergleich einer Datenbank von mRNA-Sequenzen aus der Zielspezies mit einer siRNA-Nukleotidsequenz, welche aus 18-25 Nukleotiden besteht, wobei mindestens 11 aufeinanderfolgende Nukleotide komplementär zu der mRNA-Zielsequenz sind. In einer Ausführungsform kann eine miRNA-Sequenz mit einer mRNA-Datenbank verglichen werden.
• WO 2019222036 A1 beschreibt genetisch modifizierte Proteine der AGO-Familie, welche ein verbessertes silencing erzielen. Durch spezielle Regulationen in Bezug auf die Erzeugung der AGO-Proteine wird deren Effizienz erhöht. In einer Ausführungsform bildet das mutierte AGO-Protein mit dem guide-Strang einer siRNA einen Komplex, welches zu einer Inhibition der Genexpression führt. Von einer erhöhten Affinität wird allerdings nicht gesprochen. Die vorliegende Erfindung zielt jedoch nicht auf die Erzeugung mutierter AGO-Proteine ab.
• In WO 2019001602 A1 werden Methoden für die Identifikation und Produktion von hoch effizienten siRNAs (esiRNAs/ERNAs)in zytoplasmatischen Extrakten von Nicotiana tabacum bereitgestellt. Das System erlaubt die Rekonstitution des antiviralen RNA-silencings in vitro. Im Besonderen sind in den beschriebenen Extrakten Dicer/DCL Proteine und, wahlweise, AGO-Proteine aktiv. So bereitgestellte esiRNAs/ERNAs finden Anwendung in der Regulation der Genexpression in Zielorganismen, unter anderem in der Verbesserung von Pathogenresistenz.
• Beschreibung der Erfindung
• Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs) bereitzustellen, wobei an die a-Sites dirigierende Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierten Endonukleasen binden und verlässlich (,reliable‘) die Funktion der Target-RNAs verändern.
• Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.
• Die Aufgabe der Erfindung wird insbesondere gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen, ,a-Sites', in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites dirigierende Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und verlässlich (,reliable‘) die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
1. (i) Bereitstellung einer Target-RNA;
2. (ii) esiRNA/ERNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit AGO Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;
3. (iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder
4. (iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
5. (v) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich die Funktion der Target-RNA verändern.
• Unter ,Target-RNA‘ gemäß Schritt (i) werden erfindungsgemäß komplexe Ribonukleinsäuremoleküle (RNAs) verstanden, die entweder im Zuge der Transkription eines prokaryotischen oder eukaryotischen zellulären Genoms (als prä-mRNAs oder mRNAs oder non-coding RNAs) oder im Zuge viroider oder viraler Replikation (als Viroide, virale Genome, virale mRNAs oder virale Antigenome/Replikationsintermediate) generiert werden. Die betreffenden RNAs sind entweder selbstreplizierend, wie im Falle von Viroiden, werden repliziert, wie im Falle einiger viraler RNAs, werden zu maturen RNAs prozessiert, wie im Falle von prä-mRNAs und einigen viralen RNAs, oder sie werden translatiert, um Proteine zu generieren, wie im Falle maturer viraler, prokaryotischer oder eukaryotischer mRNAs und einiger viraler Genome. Target RNAs sind aber auch non-coding RNAs, die Genexpression modulieren.
• Ein esiRNA/ERNA Screen gemäß Schritt (ii), der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit AGO Proteinen und Teil von RNA-induced silencing complexes (RISC) verlässlich eine Funktionsänderung einer Target-RNA induzieren können, ist aus dem Stand der Technik aus der WO 2019/001602 bekannt. Unter Funktionsänderung wird z.B. effiziente Endonukleolyse oder Inhibition der Translation der Target-RNA und damit z.B. ein silencing (Funktionsverlust) dieser Target-RNA verstanden.
• Der esiRNA/ERNA Screen gemäß Schritt (ii) lässt sich wie folgt beschreiben: Ein bis dato etabliertes und im Folgenden beschriebenes Verfahren zielt auf eine zuverlässige RNAi-basierte Funktionsänderung ‚einer Target-RNA. Es findet Anwendung, beispielsweise bei der Bekämpfung von Pathogenen wie pflanzenpathogenen Viren. Die größte Gruppe pflanzenpathogener Viren sind (+)-Strang RNA-Viren, deren Genom aus einem oder mehreren positiv orientierten (mRNA sense) RNA-Molekülen besteht. Das virale Genom agiert entsprechend nach Eintritt in die Zelle als messenger RNA (mRNA), von der virale Proteine translatiert werden. Einige dieser Proteine replizieren dann, gemeinsam mit zellulären Wirtsfaktoren, die virale RNA. Dabei entstehen doppelsträngige (ds) RNAs als Replikationsprodukte, die aus (+) und komplementären (-)RNAs bestehen. Von den (-)RNAs können wiederum mRNAs transkribiert werden, von denen weitere virale Proteine translatiert werden. Die Replikationsprodukte können, ebenso wie doppelsträngige Bereiche des viralen Genoms oder der viralen mRNAs, einen RNA Interferenz-Mechanismus (RNAi) des infizierten Pflanzenwirtes auslösen (siehe oben). Im Zuge dieser RNAi-Immunantwort werden durch Dicer oder Dicer-like-Proteine (Dicer/DCL) aus dem Genom, aus den Replikationsprodukten und aus den mRNAs des Virus eine Vielzahl kleiner 19-25 nt langer doppelsträngiger siRNAs, ein sog. siRNA pool‘, generiert; dieser besteht im Maximalfall aus allen theoretisch aus diesen Target-RNAs durch Dicer/DCL prozessierbaren siRNAs. Von diesen siRNAs wird ein Strang, der ,guide-Strang‘, von AGO gebunden. Geleitet durch den guide-Strang assoziiert der siRNA/AGO-Komplex dann als Teil eines RISC mit hoher Priorität an die ,kognaten‘ viralen RNAs, d.h. den Target-RNAs aus denen die siRNAs ursprünglich entstanden sind. Durch die Assoziation des siRNA/AGO/RISC wird die Funktion der Target-RNAs verändert, z.B. durch AGO-katalysierte Endonukleolyse (Hydrolyse), die zur Inaktivierung (silencing) der Targets führt. Wie in mehreren Studien festgestellt wurde (9, 21-23) ist jedoch nur ein Bruchteil der siRNAs aus einem solchen pool im RNAi-Prozess auf einer viralen Target-RNA, wie z.B. einem viralen Genom oder einer viralen mRNA, aktiv.
• Die Gründe für diese Beobachtung wurden im Folgenden adressiert: So wurde einerseits vermutet, dass nur wenige der siRNAs effizient in AGO/RISC inkorporiert werden. Andererseits wurde, wie ausgeführt, angenommen, dass nur wenige a-Sites auf komplexen RNA-Molekülen zugänglich für RNAi sind. In den Vorarbeiten wurde dann am Beispiel des (+)-Strang-RNA-Virus, Tomato bushy stunt virus (TBSV), eine mehrstufige experimentelle Methode in vitro, der sog. ‚esiRNA/ERNA screen‘ etabliert, mit dem es möglich wurde, solche siRNAs, die besonders effizient antiviral aktiv sind und im folgenden esiRNAs oder ERNAs genannt werden, aus einem viralen siRNA pool heraus zu identifizieren (Schuck J., Gursinsky T., Behrens S.-E. (2018). Methode zur gezielten Identifizierung hocheffizienter ,small interfering RNAs, ERNAs' zur Anwendung in Pflanzen und anderen Zielorganismen; WO 2019001602 A1 ).
• Die experimentelle Basis für den esiRNA/ERNA screen ist ein cytoplasmatischer Extrakt (BY2-Lysat, BYL), der aus Protoplasten von Suspensionszellen der Pflanze Nicotiana tabacum präpariert wird (24). BYL hat endogene Dicer/DCL-Aktivitäten, und es ist möglich, in diesem Extrakt sRNA/AGO/RISC-Komplexe in vitro zu rekonstituieren (25-28, 9). Der esiRNA/ERNA screen wurde initial für 21 und 22 nt siRNAs und die beiden pflanzlichen AGO-Proteine AGO1 und AGO2 etabliert; diese Formen von siRNAs und AGO-Proteinvarianten sind bekanntermaßen in die antivirale RNAi-Immunantwort der Pflanze involviert. Als Indikatoren für eine esiRNA/ERNA dienten dabei zwei Eigenschaften: Eine durch diese RNA auf der betreffenden Target-RNA induzierte effiziente Hydrolyse durch AGO1 oder AGO2 (,slicing‘ oder ,cleavage‘) in vitro, sowie die Fähigkeit, Pflanzen, denen diese siRNAs auf verschiedene Weise (z.B. über ,rub in‘ oder transiente Expression) verabreicht wurde, durch das silencing der viralen RNA gegen eine nachfolgende Virusinfektion zu schützen.
• Der esiRNA/ERNA Screen umfasst folgende Schritte:
• - Im ersten Schritt (,DCL-Assay‘) wird eine Target-RNA den in den BYL enthaltenen Dicer/DCLs ausgesetzt. Der jeweils aus der Target-RNA durch Dicer/DCL-Aktivität entstehende siRNA pool wird in seiner Gesamtheit durch next generation RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) erfasst.
• - Im zweiten Schritt (,AGO-IP‘) werden mit einem ausgewählten AGO und einem in BYL generierten siRNA pool RISC rekonstituiert. Die RISC werden über Immunopräzipitation (IP) angereichert und die AGO-gebundenen siRNAs über RNA-Seq erfasst. So werden die siRNAs eines pools erfasst, die mit hoher Affinität an das jeweils verwendete AGO binden.
• - Im dritten Schritt (,Slicer-Assay‘), der auch in medium-throughput-Format durchgeführt werden kann, werden die in Schritt zwei identifizierten siRNAs schließlich individuell mit den jeweils verwendeten AGOs darauf getestet, ob sie in der Lage sind, eine effiziente endonukleotische Hydrolyse (,slicing‘ oder ,cleavage‘) in der kognaten Target-RNA zu induzieren.
• - Im letzten Schritt werden die in vitro identifizierten esiRNAs schließlich in vivo/in planta hinsichtlich ihres Potenzials getestet, Pflanzen gegen eine Infektion mit dem Virus zu schützen.
• Es konnte gezeigt werden, dass es mit dem esiRNA/ERNA screen möglich ist, in vitro, d.h. im ,test tube‘, über ein empirisch/experimentelles System esiRNAs aus dem siRNA pool einer viralen RNA heraus zu identifizieren, die in der Lage sind, Pflanzen wirksam gegen Infektionen mit dem Virus zu schützen (9, WO 2019001602 A1 ).
• Erfindungsgemäß wurden nun weitere Erkenntnisse gewonnen, aus denen sich wichtige offene Fragen und neue Problemstellungen ergaben.
• - Es wurde nochmals verdeutlicht, dass die Effizienz einer siRNA maßgeblich von der Bindungsaffinität des guide-Stranges an das AGO-Protein abhängt. Diese Affinität wird zum einen bestimmt durch das 5'-Nukleotid der RNA; diese Tatsache war bereits bekannt: So binden z.B. siRNAs mit einem 5'Uridin präferenziell an das pflanzliche AGO1 und siRNAs mit einem 5'Adenosin präferenziell an das pflanzliche AGO2 (29, 26, 9). Darüber hinaus wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass die Affinität einer sRNA an ein AGO-Protein durch weitere, bisher unbekannte Bindungsdeterminanten in der Sequenz der sRNA bestimmt wird.
• - Die Effizienz einer siRNA hängt, wie erwartet, zudem von der Zugänglichkeit der Target-RNA ab (siehe oben): So konnten zugängliche Bereiche in der TBSV-RNA identifiziert werden (26, 9). Interessanterweise ergaben sich dabei zu einer experimentell bestimmten Sekundärstruktur des TBSV-Genoms (30) keine eindeutigen Korrelationen: So waren Bereiche der RNA, die laut Sekundärstruktur als eher zugänglich für RNAi angenommen wurden, dies de facto (d.h. in in vitro und in planta Tests) nur in sehr wenigen Fällen. Dagegen erwiesen sich andere Bereiche, die laut experimenteller Struktur nicht zugänglich sein sollten, als spaltbar durch AGO1- oder AGO2/RISC. Dieses Ergebnis bestätigte die in der Problemstellung gemachte Aussage, dass RNA-Strukturbestimmungen keine verlässlichen Auskünfte zu a-Sites einer Target-RNA geben. Mit dem esiRNA/ERNA screen Verfahren wurde somit eine Methode etabliert, die empirisch siRNAs identifiziert, die, wahrscheinlich über ihre volle Länge an derartige a-Sites hybridisieren und den endonukleolytischen oder translationsinhibierenden AGO/RISC dorthin dirigieren können.
• - Die Effizienz esiRNA-induzierter ,cleavages' der jeweiligen Target-RNAs in dem in vitro System korreliert erstaunlich exakt mit einem antiviralen Schutz, den man über Applikation ebendieser esiRNAs in der Pflanze erreichen kann (9, WO 2019001602 A1 ).
• Offene Fragen/zu lösende Probleme.
1. (a) Die erste offene Frage/das erste zu lösende Problem betrifft die Bindungsdeterminanten von sRNAs, die neben dem 5'-Nukleotid die Affinität der Bindung eines guide-Stranges an ein AGO-Protein bestimmen. Da die Affinität einer sRNA an AGO/RISC ganz wesentlich auch dessen Aktivität bestimmt (s.o.), ist die Kenntnis aller Bindungsdeterminanten von großer Bedeutung für die Ermittlung von sRNAs, die effizient und verlässlich im RNAi-Prozess agieren. Die Aufgabe war entsprechend, die Bindungsdeterminanten einer sRNA, die für eine optimale Assoziation an AGO-Proteine notwendig sind, vollständig zu definieren.
2. (b) Das zweite zu lösende Problem betrifft die Anwendbarkeit des esiRNA/ERNA screen Verfahrens. Bislang wurde das Verfahren, wie ausgeführt, experimentell/empirisch mit 21 und 22 nt siRNAs und den pflanzlichen AGO1- und AGO2/RISCangewendet. Dabei wurden esiRNAs/ERNAs identifiziert, die, entweder in pflanzlichen AGO1/RISC oder AGO2/RISCan verschiedene Stellen einer komplexen viralen RNA hybridisieren (9). Für eine breitere Anwendung war es jedoch wichtig, von einer empirischen zu einer rationalen Nutzung zu kommen. Im Vordergrund stand dabei die Hypothese, dass die in einer komplex gefalteten Target-RNA enthaltenen a-Sites möglicherweise zugänglich für jedwede Art von dirigierenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexen sind. Entsprechend war die Aufgabe, das esiRNA/ERNA screen Verfahren so zu erweitern und zu optimieren, dass es möglich ist, in komplexen RNA-Moleküle jeder Art a-Sites zu identifizieren, die universell, d.h. für alle Arten von dirigierenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe zugänglich sind. Somit sollte es möglich sein, auch ohne die Struktur einer komplexen RNAs genau zu kennen, zuverlässig die Bereiche dieser RNAs zu identifizieren, die für eine Funktionsänderung oder ein silencing jedweder Form genutzt werden können.
• Diese Aufgaben wurden erfindungsgemäß wie folgt gelöst:
1. (a) Verbesserungen der Bindungsaffinität von sRNAs an AGO. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass die Bindungsaffinität einer siRNA an ein AGO-Protein nicht, wie bisher angenommen, allein durch die Art des 5'-Nukleotids (29), sondern signifikant auch durch die übrige Sequenz der siRNA bestimmt wird. So konnten über eine statistisch relevante Anzahl von esiRNA/ERNA screen Verfahren Konsensussequenzen von guide-Strängen von sRNAs ermittelt werden, die mit hoher Affinität an ein bestimmtes AGO-Protein binden: So wurden Konsensussequenzen von siRNA guide-Strängen ermittelt, die mit hoher Affinität an pflanzliche AGO-Proteine binden. Ebenso wurden Konsensussequenzen von siRNAs ermittelt, die mit hoher Affinität an pilzliche AGO-Proteine binden. Ebenso wurden Konsensussequenzen von siRNAs ermittelt, die mit hoher Affinität an AGO-Proteine von Säugern binden. Durch gezielte Anpassung der Sequenz eines guide-Stranges an die jeweilige, erfindungsmäßige Konsensussequenz kann somit die Affinität von sRNAs an die betreffenden AGO-Proteine gezielt erhöht und entsprechend auch die Aktivität der betreffenden AGO/RISC im RNA-vermittelten silencing verbessert werden (2). Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen erweiterten und verbesserten Schritt (ii), mit dem es möglich ist, über Anpassung der Sequenzen identifizierter esiRNAs/ERNAs oder anderer sRNAs (wie z.B. miRNAs) an die ermittelten Konsensussequenzen, deren Aktivität in AGO/RISC, z.B. in RNA-vermittelten silencing Verfahren zu verbessern.
2. (b) Weiterentwicklung des esiRNA screen Verfahrens zu einem universell einsetzbaren ,eNA-screen‘ Verfahren. In den Vorarbeiten war deutlich geworden, dass die Aktivitäten von esiRNA/ERNAs auf einer Target-RNA in vitro und in vivo (d.h. im spezifischen Fall in der Pflanze) in sehr guter Übereinstimmung korrelieren (s.o.). Aus dieser Beobachtung wurde entsprechend abgeleitet, dass das Milieu in den in vitro verwendeten cytoplasmatischen Extrakten so beschaffen sein muss, dass sich komplexe RNA-Moleküle, u.a. mit den dort vorhandenen RNA-bindenden Proteinen, in ganz ähnlicher Weise wie in der intakten Zelle oder dem intakten Organismus falten. Diese Vorstellung wird durch frühere Studien gestützt, in denen gezeigt worden war, dass sich in BYL auch virale RNA-Replikation rekonstituieren lässt. Ähnlich wie beim RNAi-Prozess kann virale Replikation nur dann ablaufen, wenn sich die Faltung der viralen RNA optimal ausbilden kann (24,31). Das Postulat wurde im Folgenden bestätigt, und darauf basierend wurde das esiRNA/ERNA screen Verfahren erfindungsmäßig so weiterentwickelt, dass es nun möglich ist, a-Sites in komplexen RNA-Molekülen zu identifizieren, die für verschiedene dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe zugänglich sind (3-6).
• Erfindungsgemäß wurde dabei folgendes herausgefunden:
• - Passt man die Sequenz des guide-Strangs einer sRNA über das 5'-Nukleotid und/oder über die Konsensussequenz (s.o.) an die jeweiligen Bindungspräferenzen von AGO Proteinen verschiedener Spezies an, so agieren die resultierenden sRNA/AGO/RISC auf einer komplexen Target-RNA exakt identisch. Gezeigt wurde dies in in vitro Slicer Assays. Dabei wurden AGO/RISC mit AGO-Proteinen aus Spezies dreier verschiedener Reiche der Eukarya Domäne, nämlich AGO aus Plantae, AGO aus Fungi und AGO aus Mammalia in BYL rekonstituiert. Die verschiedenen AGO/RISC wurden dabei mit der gleichen, jeweils angepassten sRNA (siehe oben) rekonstituiert. Bei dieser sRNA handelte es sich um eine esiRNA/ERNA, die entsprechend an eine a-Site einer Target-RNAs binden kann. Bei Tests auf eben dieser Target-RNA wurde mit allen AGO/RISC ein identisches slicing/cleavage (Hydrolyse) der Target-RNA beobachtet (3). Dieser unerwartete Befund impliziert, dass sRNAs, die, assoziiert an einen bestimmten AGO/RISC (z.B. aus Pflanze) auf einer Target-RNA ein slicing/cleavage oder eine Inhibition der Translation induzieren, dies auf der gleichen Target-RNA in gleicher Weise auch in einem anderen, d.h. aus einer völlig anderen Spezies stammenden AGO/RISC (z.B. aus Pilz) tun (3). Damit wurde demonstriert, dass a-Sites komplexer RNA-Moleküle universell für AGO/RISC jedweder Natur zugänglich sind, sofern diese AGO/RISC eine sRNA gebunden haben, die an diese a-site hybridisieren kann.
• - Die oben beschriebenen Befunde wurden sowohl mit den pflanzlichen, cytoplasmatischen BYL-Extrakten als auch mit cytoplasmatischen Extrakten aus humanen Zellen (HeLa S10) erhalten.
• - Erfindungsgemäß wurde dies gezeigt für Target-RNAs verschiedener Natur, also z.B. genomische RNA aus Viren sowie mRNAs verschiedener Organismen die aus Viren, Bakterien, Pflanzen, Pilzen, Oomyceten, Tieren wie z.B. Nematoden, Arthropoden und höheren Tieren wie z.B. Säugetieren, oder dem Menschen stammt.
• Somit wurde erfindungsmäßig gezeigt, dass sRNA/AGO/RISC verschiedener Spezies, bei inkorporierter sRNA mit identischer oder sehr ähnlicher Bindesequenz auf der gleichen Target-RNA identisch agieren und dass dies gleichermaßen der Fall ist in cytoplasmatischen Extrakten aus Pflanze und Mensch. Damit konnte geschlussfolgert werden, dass sich in den cytoplasmatischen Extrakten verschiedener Zelltypen komplexe RNA-Moleküle offenbar ähnlich falten und dass a-Sites dieser RNA-Moleküle entsprechend jeweils gleichermaßen ausgebildet werden. Eine a-Site ist somit für AGO/RISC verschiedenster Herkunft gleichermaßen zugänglich, sofern diese eine sRNA inkorporiert haben, die an diese a-Site hybridisieren kann.
• Aus diesen Erkenntnissen wurde weiter postuliert, dass es analog möglich sein sollte, an die a-Sites komplexer RNA-Moleküle, die sich unter den in vitro Bedingungen offensichtlich sehr reproduzierbar bilden, auch andere Endonukleasen wie RNase H oder Cas zu dirigieren. Die a-Sites sollten damit universell, d.h. nicht nur für RNAi, sondern auch für DNA-vermitteltes und CRISPR/Cas-vermitteltes silencing identifizierbar und nutzbar gemacht werden können.
• - Dies konnte erfindungsgemäß demonstriert werden: Durch Verwendung von ASO oder g/crRNAs, die in ihrer Sequenz an zuvor identifizierte esiRNAs/ERNAs angelehnt wurden, konnten in der Tat entweder RNase H oder Cas an eine entsprechende Target-RNA geleitet und auf dieser aktiv werden (4 und 6).
• - Die oben beschriebenen Befunde wurden wiederum sowohl mit den pflanzlichen, cytoplasmatischen BYL-Extrakten als auch mit cytoplasmatischen Extrakten aus humanen Zellen (HeLa S10) erhalten (5).
• Bereiche, a-Sites, einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind entsprechend auch für ASO/RNase H sowie für g/crRNA/Cas zugänglich. Erfindungsgemäß wird somit ein Grundprinzip offenbart, das zeigt, dass dirigierende NA wie sRNAs, ASO und g/crRNAs bzw. die davon abgeleiteten Nukleinsäure/Proteinkomplexe sRNA/AGO/RISC, ASO/RNase H und g/crRNA/Cas nach analogen Prinzipien an zugängliche a-Sites einer komplexen Target-RNA assoziieren und dort zuverlässig wirksam werden.
• - Erfindungsgemäß kann das esiRNA screen Verfahren somit erweitert, als ,eNA-screen‘ Verfahren (eNA steht dabei für effektive dirigierende Nukleinsäure) eingesetzt werden. So können nun, z.B. über screening mit sRNA/AGO/RISC, Bereiche in einer komplexen RNA identifiziert werden, auf denen bei Nutzung ähnlicher oder identischer Sequenzen der ASO oder g/crRNAs auch ASO/RNase H und g/crRNA/Cas aktiv sind (siehe Anwendungsbeispiele). Dies wird insbesondere bei der Verwendung viraler Target-RNAs deutlich: So kann virale Replikation in der Pflanze sowohl durch siRNAs gehemmt werden, die an a-Sites der viralen RNA bindet, als auch durch ASO oder g/crRNAs gleicher oder angelehnter Sequenz (siehe 4 und 6 sowie Anwendungsbeispiele).
• - Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (iii) einen sich an Schritt (ii) anschließenden Test mit von den in Schritt (ii) identifizierten esiRNAs/ERNAs abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
• - Zudem umfasst das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (iv) einen an Schritte (ii) oder (iii) anschließenden Test mit von den in Schritten (ii) oder (iii) identifizierten esiRNAs/ERNAs oder ASO abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
• - Somit werden a-Sites in dieser Target-RNA identifiziert, an die dirigierende Nukleinsäuren verschiedenen Typs (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich die Funktion (z.B. s.o.) dieser Target-RNA verändern können.
• Basierend auf den genannten Beobachtungen werden somit erfindungsgemäß experimentelle Systeme bereitgestellt, mit denen es zuverlässig möglich ist, in komplexen Target-RNAs Bereiche, a-Sites, zu detektieren, die für Endonuklease-dirigierende Nukleinsäuren wie z.B. siRNAs, miRNAs, ASO und g/crRNA zugänglich sind. Die erhaltene Information kann dahingehend genutzt werden, um RNA-vermitteltes, DNA-vermitteltes und CRISPR/Cas-vermitteltes silencing effizienter und spezifischer als bisher möglich (d.h. bei deutlich reduzierter Gefahr eines ,off targeting‘) zur Pathogenbekämpfung und/oder zur Modulation von Genexpressionsprozessen in Zellen zu nutzen.
• - Entsprechend enthält das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (v) die Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease zuverlässig die Funktion dieser Target-RNA verändern.
• Wie oben erwähnt, stehen drei wichtige Technologien zur Verfügung, in denen Nukleinsäuren, also Ribonukleinsäuren (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs) als Effektoren, d.h. dirigierende NA, für Funktionsänderungen von komplexen Target-RNAs wie z.B. für ein silencing genutzt werden:
1. (i) RNA-vermitteltes silencing (auch bezeichnet als RNA-Interferenz, RNAi), vermittelt, u.a. durch microRNAs (miRNAs) oder small interfering RNAs (siRNAs), die, assoziiert an Argonaute (AGO) Endonukleasen, in RNA-induced silencing complexes (RISC) aktiv sind.
2. (ii) DNA-vermitteltes silencing, vermittelt durch verschiedene Formen von antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO), die, unter anderem, das RNA-degradierende Enzym RNase H aktivieren können.
3. (iii) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated (Cas)-mediierte Regulation (CRISPR/Cas), die vermittelt wird über guide/CRISPR RNAs (g/crRNAs), die an eine Cas-Endonuklease assoziiert sind.
• Die drei genannten Nukleasen AGO, RNase H und Cas gehen vermutlich auf einen RNase H-ähnlichen Vorläufer zurück und agieren in ähnlicher Weise endonukeolytisch (6).
• RNA-vermitteltes silencing, RNAi. RNAi ist ein zellulärer Mechanismus, der in Eukaryonten die Genexpression post-transkriptionell reguliert (32) In Pflanzen, aber auch Pilzen, Oomyzeten, Nematoden und Insekten ist RNAi zudem eine zentrale Komponente der Immunabwehr (33, 34). RNAi wird durch teilweise oder komplett doppelsträngige small non-coding RNAs (sRNAs), die i.d.R. Längen zwischen 20 und 30 Nukleotiden (nt) aufweisen, reguliert. Zentrale Regulatoren auf post-transkriptioneller Ebene sind microRNAs (miRNAs) und small interfering RNAs (siRNAs). miRNAs sind genomisch kodiert, werden in Form von Vorläufermolekülen transkribiert und durch Ribonukleasen, u.a. Dicer/DCL, maturiert. siRNAs werden von Dicer/DCL Proteinen aus doppelsträngigen (ds) RNA-Elementen prozessiert. Diese dsRNA-Elemente können strukturierte Bereiche aus Genomen oder Replikationsprodukte von Viroiden oder RNA-Viren sein, aber auch aus mRNA-Molekülen und anderen Formen von RNA-Molekülen, z.B. non-coding RNAs, stammen. Aktiv werden miRNAs und siRNAs in RISC, deren Hauptkomponente AGO Proteine sind. Dabei wird der guide-Strang der sRNA durch AGO gebunden, während der andere Strang des sRNA-Doppelstranges entfernt/abgebaut wird. Der guide-Strang im sRNA/AGO/RISC Komplex hybridisiert an Bereiche der Target-RNA. Im Falle von miRNAs sind dies z.B. teil- oder vollkomplementäre Bereiche auf Target-mRNAs, im Falle von siRNAs sind dies vollkomplementäre Bereiche auf allen Arten von Target-RNAs, so z.B. genomischen RNAs oder mRNAs von Pathogenen, aus denen diese siRNAs ursprünglich generiert wurden (sog. ,kognate RNAs'). Die Target-RNAs können dann inaktiviert werden, z.B. durch Inhibition der Translation oder durch endonukleolytische Hydrolyse (slicing/cleavage), die durch AGO katalysiert wird, teilweise mit nachfolgendem Abbau der Spalt-(cleavage)-Produkte durch Exonukleasen. Ergebnis der Aktivität von RISC-assoziierten sRNAs kann somit eine Target-spezifische Hemmung (silencing) der Genexpression sein (34-40).
• RNAi wird seit ca. zwei Dekaden zur experimentellen Regulation der Genexpression auf (prä)mRNA-Ebene sowie zur Bekämpfung von Pathogenen eingesetzt. Dabei werden vorwiegend 21 oder 22 bp lange siRNAs verwendet (41); diese bestehen aus einem komplett komplementären RNA-Duplex mit je zwei Basen Überhängen an den 3'-Enden (35, 36). So gibt es in der Pflanze sowohl transgene, als auch nicht-transgene (,transiente‘) RNAi-Ansätze, die gegen Virusinfektionen gerichtet sind. RNAi wird zudem zur Bekämpfung pflanzenpathogener Insekten, Nematoden, Oomyceten, Pilze oder pflanzenpathogener Pflanzen verwendet. Hierbei werden z.B. mRNAs essentieller Proteine dieser Pathogene als Targets verwendet und der RNAi-Mechanismus der Pathogene gegen die eigenen mRNAs gelenkt. In praktisch allen eukaryotischen Organismen, inklusive Mammalia (Säugern), können RNAi-basierte Ansätze zur gezielten Regulation der zellulären Genexpression auf RNA-Ebene eingesetzt werden. Speziell in Säugern werden sie aber auch zur Bekämpfung von Pathogenen, u.a. tier- und humanpathogener Viren, eingesetzt, zum Teil bereits in klinischen Studien (40-43). 2018 wurde im Menschen das erste siRNA-basierte Medikament, ,patisiran‘, zum Einsatz gegen Polyneuropathie in hATTR (hereditary transthyretin-mediated amyloidosis) zugelassen.
• Im Verlauf der vergangenen Jahre wurde die Technologie erheblich verbessert. Entscheidende Triebfedern waren und sind dabei chemische Modifikationen der siRNAs: So konnten z.B. durch 2'-Ribosemodifikationen (2'-O-methyl, 2'-fluoro, 2'-O-(methoxyethyl) (2'-MOE)) Verringerungen der Immunogenität, Erhöhungen der Resistenz gegenüber Endo- und Exonukleasen sowie Erhöhungen der Schmelztemperatur des siRNA/Target-RNA-Hybrids erreicht werden. Andere Zuckermodifikationen (,locked‘ (LNA) oder unlocked, (UNA)) erhöhen oder erniedrigen die Bindungsaffinität der siRNA zur Target-RNA. ,Backbone‘-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder ,peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino) beeinflussen Hydrophobizität, Proteinassoziation und wiederum Nukleaseresistenz bzw. Hybridisierungstemperatur. Da das Einbringen von siRNAs in Zellen bzw. Zielorgane für viele Anwendungen noch schwierig ist, zielen Modifikationen und Formulierungen auch darauf, die negativ geladenen NA spezifisch zu den Zielzellen und, nach Endozytose, durch die Membran an den Wirkungsort im Cytoplasma zu bringen (42, 44).
• DNA-vermitteltes silencing. Hierunter fallen Verfahren, die über die Verwendung von einzelsträngigen, 12-30 Nukleotide langen, chemisch synthetisierten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) den Metabolismus und/oder die Expression von Target-RNAs künstlich und gezielt beeinflussen. Anders als miRNAs oder siRNAs, die in zellulären Prozessen die Genexpression post-transkriptionell regulieren, wurden chemisch synthetisierte 12-30 nt lange einzelsträngige DNA-Oligonukleotide von Anbeginn zum Zweck des gezielten silencing von RNA-Molekülen eingesetzt. Über die Hybridisierung eines ASO an die komplementäre Sequenz einer Target-RNA kann deren Funktion auf unterschiedliche Weise beeinflusst werden: So wird im steric blocking mechanismus allein über die Bindung des ASO an die Target-RNA deren Translation, die Bindung eines regulatorischen Proteins und/oder deren Replikation inhibiert. Im degradation pathway erfolgt über die Bindung des ASO an die Target-RNA die Rekrutierung des Enzyms RNase H, das das Target dann endonukleolytisch am RNA/DNA-Hybrid hydrolysiert. So kann z.B. über die Bindung von ASO an mRNAs deren Translation, bei Bindung an virale Genome deren Translation und/oder Replikation unterbunden werden (45).
• In experimentellen und therapeutischen Indikationen zielen Anwendungen von ASO überwiegend darauf, Target-RNAs durch den degradation mechanism abzubauen (45). Aktives Enzym ist dabei RNase H, das in Säugerzellen im Kern und, in geringerer Quantität, im Cytoplasma präsent ist. Das Enzym ist in die zelluläre DNA-Replikation und -Reparatur involviert; so erkennt RNase H sequenzunabhängig die Struktur von mindestens fünf bp-umfassenden DNA/RNA-Hybriden (46). Auf diesen agiert es vermutlich ähnlich wie eine DNase (6). Die bei der Spaltung entstehenden 5'-Phosphat/3'-Hydroxyl-Produkte werden in der Zelle durch Exonukleasen abgebaut, wobei die Abbaurate wiederum von der Chemie des ASO (siehe unten), aber auch der Art der angegriffenen Target-RNA abhängt (47). ASO, die den degradation mechanism nutzen sollen, müssen entsprechend mindestens fünf aufeinanderfolgende nt enthalten, die an das Target hybridisieren, wobei längere komplementäre Sequenzen die Spezifität deutlich erhöhen.
• Wie bei siRNAs können auch die Eigenschaften von ASO signifikant über chemische Modifikationen beeinflusst werden. Dies betrifft u.a. Pharmakokinetik, Stabilität und toxisch/entzündungsfördernde Eigenschaften. Zudem kann die Aufnahme in definierte Zielzellen, die Bindungsaffinität zur Target-RNA und die Bindungsaffinität zu Proteinen moduliert werden (45, 48, 49). So sind Konjugate wie z.B. GalNac3 oder Cholesterol sowie Zuckermodifikationen wie 2'-MOE in der Verwendung. Zudem werden bridged Nukleinsäuren wie LNA oder cEt BNA eingesetzt. Schließlich werden auch Basen- und backbone Modifikationen mit ähnlicher Wirkung verwendet, wie sie oben für siRNAs beschrieben sind. Die Art der chemischen Modifikation bestimmt auch, ob ein ASO über steric blocking oder degradation arbeitet. PMO, die bereits in einer Reihe von antiviralen Ansätzen getestet wurden (50), verursachen beispielsweise ausschließlich ein blockage der Target-RNA.
• Als besonders wirksam in Therapieansätzen im Menschen haben sich sog. ASO gapmers erwiesen, wo ein RNase H-aktiver Bereich jeweils am 5'- und 3'-Ende durch Nuklease-resistente, chemisch modifizierte Domänen wie z.B. LNA oder 2'-O-modifizierte Nukleotide flankiert werden (48). Chemisch modifizierte PS-ASOs können nach Endozytose ,gymnotisch‘, d.h. auch ohne zusätzlichen Trägerstoff über die Hydrophobizität des Phosphorothioat ,backbone‘ durch die Membran in das Cytoplasma einer Zielzelle gelangen. Seit 2016 werden PS/MOE-modifizierte ASO als ,nusinersen‘ in einer ersten ASObasierten Therapie gegen spinale Muskelatrophie eingesetzt. Nusinersen inhibiert dabei einen aberranten Spleißprozess (48).
• CRISPR/Cas-vermitteltes silencing. Das CRISPR/Cas-System ist eine zentrale Komponente des adaptiven Immunsystems von Bakterien und Archaeen, das insbesondere gegen Infektionen von Phagen und die Aufnahme von Plasmid-DNA gerichtet ist. So werden, katalysiert durch verschiedene Cas-Proteine,Teile von genomischer Phagen-DNA oder Plasmiden als sog. Protospacer zwischen direct repeats, also identische, sich wiederholende Sequenzen, in das Bakteriengenom integriert. Von diesem DNA-Abschnitt aus werden pre-CRISPR-RNAs (pre-crRNAs) transkribiert und diese durch weitere Cas-Proteine zu CRISPR-RNAs (crRNAs) prozessiert; bei verschiedenen Mikrobenarten existieren hier drei sehr unterschiedliche Mechanismen der Prozessierung. Mature crRNAs assoziieren dann in einem dritten Schritt entweder direkt mit den prozessierenden oder anderen Cas-Proteinen und bilden interfering complexes, die dann, in Abhängigkeit der Sequenz der crRNAs, an komplementäre DNA- oder RNA-Elemente assoziieren und diese endonukleolytisch hydrolysieren können. Über gezielte Konstruktionen von crRNAs in Form sog. guide RNAs (g/crRNAs), lassen sich Cas-Proteine gezielt auf DNA- oder RNA-Molekülen einsetzen, z.B. zum Zwecke endonukleolytischer Hydrolysen, um so gezielt die Genexpression auf transkriptioneller wie auch auf post-transkriptioneller Ebene zu beeinflussen (51). Für das silencing von RNA-Molekülen wurden so beispielsweise Cas13a aus Leptotrichia shahii (LshCas13a) oder Leptotrichia wadei (LwaCas13a) eruiert. Ähnlich wie bei siRNAs und ASO werden auch g/crRNAs chemisch modifiziert eingesetzt, um die Bindungseigenschaften und auch die Stabilität der RNA-Moleküle zu modulieren (52-54).
• Es ist ein besonderer Vorteil der Erfindung, dass es nunmehr möglich ist, a-Sites in unterschiedlichen komplexen Target-RNAs zu identifizieren, wobei an diese a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich (,reliable‘) die Funktion dieser Target-RNA verändern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden deshalb a-Sites in der Target-RNA identifiziert, wobei an diese a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich (,reliable‘) die Funktion dieser Target-RNA verändern. ,Verlässlich‘ im Sinne dieser besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet, dass die eNAs an den identifizierten a-Sites stets eine entsprechende Funktionsänderung der Target-RNA bewirken.
• Die eNAs verschiedenen Typus sind vorzugsweise ausgewählt aus siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) miRNAs, antisense DNA-Oligonukleotiden und g/crRNAs, vorzugsweise jedwede Art der genannten eNAs, wie z. B. natürlich vorkommende, synthetische, rekombinante oder artifiziell erzeugte eNAs.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Endonukleasen ausgewählt aus AGO-, RNase H und/oder Cas-Proteinen. Damit im Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass die, besonders bevorzugt verlässliche Veränderung der Funktion der Target-RNA durch RNA, DNA oder CRISPR/Cas vermittelt wird.
• Wie oben erwähnt, wird unter Funktionsänderung der Target-RNA z.B. die effiziente Endonukleolyse oder Inhibition der Translation der Target-RNA und damit ein silencing (Funktionsverlust) dieser Target-RNA verstanden. Bevorzugt ist erfindungsgemäß das (verlässliche) silencing der Target-RNA. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das (verlässliche) silencing der Target-RNA verstanden, wobei das silencing ausgewählt ist aus RNA, DNA oder CRISPR/Cas-vermitteltem silencing.
• Besonders bevorzugt ist es, wenn die in den Schritten (ii), (iii) und/oder (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten eNAs (sRNAs, antisense DNA-Oligonukleotide (ASO) bzw. g/crRNAs) eine Konsensussequenz aufweisen. Dies hat den Vorteil, dass die entsprechende Endonuklease effektiver arbeitet, z.B. indem die Konsensussequenz die Affinität der eNA an diese Endonuklease erhöht.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die eNA eine siRNA. Beispiele für geeignete Konsensussequenzen des guide-Strangs der siRNA, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, sind ausgewählt, z.B., aus
1. i) UUX₁X₂X₃AX₄X₅AX₆AUX₇UX₈ACX₉X₁₀UX₁₁ (SEQ ID Nr. 1) wobei
   • X₁ ausgewählt ist aus G und A;
   • X₂ ausgewählt ist aus C und G;
   • X₃ ausgewählt ist aus C und A;
   • X₄ ausgewählt ist aus C und G;
   • X₅ ausgewählt ist aus A, G und U;
   • X₆ ausgewählt ist aus A und U;
   • X₇ ausgewählt ist aus C, G und A;
   • X₈ ausgewählt ist aus U, G und A;
   • X₉ ausgewählt ist aus U und A;
   • X₁₀ ausgewählt ist aus U und G; und
   • X₁₁ ausgewählt ist aus C und A;
   und
2. ii) AAAX₁₂X₁₃AX₁₄CAAX₁₅AX₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X_2OUX₂₁X₂₂A (SEQ ID Nr.: 2) wobei
   • X₁₂ ausgewählt ist aus G und U;
   • X₁₃ ausgewählt ist aus A, C und U;
   • X₁₄ ausgewählt ist aus G, A und C;
   • X₁₅ ausgewählt ist aus C, A und G;
   • X₁₆ ausgewählt ist aus A und U;
   • X₁₇ ausgewählt ist aus A, U und C;
   • X₁₈ ausgewählt ist aus G, C und A;
   • X₁₉ ausgewählt ist aus U und C;
   • X₂₀ ausgewählt ist aus C und U;
   • X₂₁ ausgewählt ist aus A und U; und
   • X₂₂ ausgewählt ist aus U, A und C;
• Bevorzugte Konsensussequenzen sind die Sequenzen UUGCCACAAAAUCUUACUUUC (SEQ ID Nr.: 3) und AAAGAAGCAACAAAGUCUAUA (SEQ ID Nr: 4).
  In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die eNA eine sRNA, d.h. jedwede Form von siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) oder jedwede Form von miRNAs und die Endonuklease ist ein AGO-Protein. Argonaute Proteine (AGO-Proteinen) sind eine Familie von Proteinen, deren Vertreter evolutionär stark konserviert sind. Sie kommen in fast allen Organismen vor, wo sie eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Regulation der Genexpression spielen. Vertreter der AGO-Familie sind am transkriptionellen gene-silencing (TGS) und am posttranskriptionellen gene-silencing (PTGS) beteiligt (37). Die eNAs eignen sich besonders für das RNA-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
• In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die eNA jedwede Form eines antisense DNA-Oligonukleotids (ASO) und die Endonuklease ist eine RNase H. Die Ribonukleasen H (von Ribonuklease Hybrid, synonym RNase H) umfassen eine Gruppe von Enzymen (Ribonukleasen), die RNA in DNA-RNA-Hybriden abbauen. Sie werden in zwei Gruppen unterteilt, RNase HI (in Bakterien) bzw. RNase H1 (in Eukaryoten) und RNase HII (in Bakterien) bzw. RNase H2 (in Eukaryoten). Ribonukleasen des Typs H kommen in fast allen Lebewesen vor und sind sequenzunspezifische Endonukleasen, welche die Phosphodiester-Bindung von RNA in Doppelsträngen von DNA und RNA hydrolysieren, wodurch eine 3'-Hydroxygruppe und eine 5'-Phosphatgruppe entstehen (6). Diese eNAs eignen sich besonders für das DNA-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
• In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleinsäure jedwede Form einer CRISPR RNA oder eine von der CRISPR RNA abgeleitete g/crRNA und die Endonuklease ist ein Cas-Protein. Das DNA- oder RNA-schneidende Enzym namens Cas (von englisch CRISPR-associated ,CRISPR-assoziiert‘) bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Vor oder nach dieser RNA-Sequenz befindet sich eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine Target-DNA oder Target-RNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die g/crRNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden Target-DNA oder Target-RNA. Durch die Verkettung des Enzyms Cas, der g/crRNA und der Target-DNA oder Target-RNA wird die Endonuklease Cas in die räumliche Nähe des Targets gebracht, woraufhin Cas dieses hydrolysiert (51). Diese eNAs eignen sich besonders für das Cas-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
• Beispiele für geeignete eNAs, die von der Erfindung bereitgestellt werden, sind ausgewählt aus den in Tabellen 1, 2 und 3 dargestellten Sequenzen. Tabelle 1: Beispiele für als eNAs geeignete siRNAs

  siRNA	Sequenz guide-Strang (5'-3')	SEQ ID.	Sequenz passenger-Strang (5'-3')	SEQ ID.
  siR GFP	UAGUUCAUCCAUGCCAUGUGU	5	ACAUGGCAUGGAUGAACUAUA	6
  siR179	UGAUGGUCUCCAUGUCGCUUG	7	AGCGACAUGGAGACCAUCAAG	8
  siR186	AUUCUCUUGAUGGUCUCCAUG	9	UGGAGACCAUCAAGAGAAUGA	10
  siR209	AAAUCUCUUUCUUAGGCCAAA	11	UGGCCUAAGAAAGAGAUUUUU	12
  siR1470	AUAUGCAGACUCUCCACGGCU	13	CCGUGGAGAGUCUGCAUAUCA	14
  siR1575	UUUCGAGGCUGAAUCACCCGA	15	GGGUGAUUCAGCCUCGAAACC	16
  siR1717	UUUAGCCCGGAAAAUUGCACC	17	UGCAAUUUUCCGGGCUAAAUG	18
  siR3243	AUUCGCCAACUCAACUCUAUC	19	UAGAGUUGAGUUGGCGAAUUA	20
  siR3516	AGAUGCUGUGACAAGAGCGCC	21	CGCUCUUGUCACAGCAUCUGG	22
  siR3701	AAAAACGCACUGUCUGUACCU	23	GUACAGACAGUGCGUUUUUCA	24
  siR3722	UUAGAGACAGUACAAUUUAUG	25	UAAAUUGUACUGUCUCUAACC	26
  siR3758	AUACCGGUAGAUGUGAAUGUC	27	CAUUCACAUCUACCGGUAUCA	28
  siR3939	UUCACUGUUAGCUUGUUCCCU	29	GGAACAAGCUAACAGUGAACG	30
  siR4044	AUUCGAAUUCGUCUCAUCGUU	31	CGAUGAGACGAAUUCGAAUCA	32
  siR4418	AAGAGUCUGUCUUACUCGCCU	33	GCGAGUAAGACAGACUCUUCA	34

  Tabelle 2: Beispiele für als eNAs geeignete antisense DNA-Oligonukleotide (ASO)

  ASO	Sequenz (5'-3')	SEQ ID
  ASO GFP	TAGTTCATCCATGCCATGTGT	35
  ASO 179	TGATGGTCTCCATGTCGCTTG	36
  ASO209	AAATCTCTTTCTTAGGCCAAA	37
  ASO3243	ATTCGCCAACTCAACTCTATC	38
  ASO3701	AAAAACGCACTGTCTGTACCT	39
  ASO3722	TTAGAGACAGTACAATTTATG	40
  ASO3939	TTCACTGTTAGCTTGTTCCCT	41
  ASO209 MOE	[2'-O-MOE-rA][2'-O-MOErA]ATCTCTTTCTTAGGCCA[2'-O-MOE-rA][2'-O-MOE-rA]	42
  ASO209 LNA	[LNA-A]AATCTCTTTCTTAGGCCAA[L NA-A]	43
  ASO209 PTO	A*A*A*T*C*T*C*T*T*T*C*T* T*A*G*G*C*C*A*A*A	44

  Tabelle 3: Beispiele für eine als eNA geeignete CRISPR-RNA

  CRISPR-RNA	Sequenz (5'-3')	SEQ ID
  crR200		45

  
  nicht unterstrichen: ,Spacer‘-Sequenz (Erkennung der Target-RNA)
  unterstrichen: direct repeat‘ (Bindung durch Cas13b-Protein)
• Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Nukleinsäuren (eNAs), die Endonukleasen ausgewählt aus AGO-, RNase H und Cas-Proteinen an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren und damit, vorzugsweise verlässlich, die Funktionen dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern, wobei die Target-RNAs beispielsweise durch endonukleolytische Hydrolyse (slicing/cleavage) oder Translationsinhibition inaktiviert werden und es somit zu einem silencing der Target-RNA kommt.
• Wie oben erwähnt, sind die eNAs vorzugsweise ausgewählt aus jedweder Art von siRNAs, jedweder Art von miRNAs, jedweder Art von antisense DNA-Oligonukleotiden und jedweder Art von g/crRNAs. Diese eNAs eignen sich besonders zur Verwendung beim, vorzugsweise verlässlichen, RNA-vermittelten, DNA-vermittelten und/oder CRISPR/Cas-vermittelten silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
• Die eNAs können in transgener oder transienter (non-transforming) Form zur Pathogenbekämpfung oder zur gezielten, transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulation der Genexpression eingesetzt werden. Sie eignen sich besonders zur Verwendung in der Pathogenbekämpfung in Pflanzen/Nutzpflanzen, Tieren/Nutztieren und im Menschen, z. B. als Viruzide, Bakterizide, Fungizide, Nematizide und Insektizide.
• In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine eNA, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde.
• In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine eNA, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde und fakultativ ein(e) Trägersubstanz/Hilfsstoff, die/der zur Verabreichung in/auf Pflanzen, in Nematoden, Insekten, Oomyceten, Pilzen, Tieren und im Menschen geeignet ist.
• Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Lösung, die in direkter Form z.B. als Nährlösung oder als Aerosol/Spray, verabreicht werden kann. Damit lassen sich besonders einfach Erkrankungen an Pflanzen/Nutzpflanzen sowie in Tieren und auch im Menschen vorbeugen oder behandeln.
• In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzungen für die parenterale, enterale, intramuskuläre, mukosale oder orale Verabreichung bereit, die eine eNA gemäß der Erfindung, optional in Kombination mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzungen, die für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen in Tieren/Nutztieren und/oder im Menschen geeignet sind.
• Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzung wenigstens einen physiologisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, und/oder Hilfsstoff. Die eNAs gemäß der vorliegenden Erfindung können in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, z.B. in einem herkömmlichen Medium, wie einem wässrigen Salzmedium oder einer Pufferlösung als pharmazeutische Zusammensetzung zur Injektion enthalten sein. Ein solches Medium kann auch herkömmliche pharmazeutische Stoffe enthalten, wie zum Beispiel pharmazeutisch verträgliche Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsmittel und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören physiologische Kochsalzlösung und Humanserum. Ein besonders bevorzugtes Medium ist PBS-gepufferte Kochsalzlösung.
• Weitere geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann beispielsweise aus Remington's Practice of Pharmacy, 13. Ausgabe und J. of. Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 52, Nr. 5, Sept-Okt., S. 238-311, bekannt.
• Die eNA gemäß der Erfindung weist in einer bevorzugten Ausführungsform eine oder mehrere chemische Modifikationen auf, wobei die chemischen Modifikationen ausgewählt sein können aus 2'-Ribosemodifikationen (2'-O-methyl, 2'-fluoro, 2'-O-(methoxyethyl) (2'-MOE)), Zuckermodifikationen (,locked‘ (LNA) oder unlocked, (UNA)), ,Backbone‘-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder ,peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino). Hierdurch werden die Stabilität und oder Lebensdauer/Halbwertszeit der eNAs bei der Anwendung, z.B. in der Pathogenbekämpfung erhöht.
• Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 5 Figuren und 6 Ausführungsbeispielen näher erläutert.
• Es zeigen:
• 1A Beispiele von Konsensussequenzen von siRNAs (guide-Strang), die als optimal für das pflanzliche AGO1 (links) bzw. AGO2 (rechts) ermittelt wurden. Zur Bestimmung der Konsensussequenzen wurden zunächst doppelsträngige RNAs von Tomato bushy stunt virus (TBSV) oder Cucumber mosaic virus (CMV) in BYL durch endogene Dicer/DCLs zu siRNAs prozessiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und die viralen siRNAs mittels RNA-Seq charakterisiert (,DCL-Assay‘). In weiteren Ansätzen wurde parallel zur siRNA-Generierung entweder AGO1- oder AGO2-Protein mit N-terminalem FLAG-tag durch in vitro-Translation entsprechender mRNAs produziert. Anschließend wurden die mit viralen siRNAs beladenen AGO/RISC durch eine Immunopräzipitation mit Hilfe eines Anti-FLAG-Antikörpers isoliert, die siRNAs aus den Komplexen gereinigt und mittels RNA-Seq charakterisiert (,AGO-IP‘) (9). Durch Vergleich der relativen Häufigkeiten, mit der individuelle siRNAs jeweils in ,DCL-Assay‘ und AGO-IP‘ detektiert wurden, konnten siRNAs identifiziert werden, die eine hohe Affinität zu AGO1 oder AGO2 aufweisen. Aus den Sequenzen der 50 am stärksten in den ,AGO-IPs' angereicherten 21 nt siRNAs wurden Konsensussequenzen für AGO1 und AGO2 abgeleitet. Positionen, an denen mehrere Nukleotide die (nahezu) maximale Aktivität ermöglichen, sind entsprechend durch untereinanderstehende Buchstaben gekennzeichnet. In ähnlicher Form wurde dies für AGO-Proteine aus anderen Organismen (z.B. Pilz und Mensch durchgeführt).
• 1B Beispiele von ,Slicer-Assays', die mit einer 21 nt esiRNA und mit Konsensus-optimierten 21 nt esiRNAs durchgeführt wurden; links mit AGO1/RISC, rechts mit AGO2/RISC. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26), als Konsensus-optimierte siRNAs die Sequenzen aus 2A (obere Zeile). Die pflanzlichen AGO-Proteine wurden in BYL mittels in vitro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der zu testenden, synthetischen siRNA-Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der gewünschten siRNAs in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde eine radioaktiv markierte Target-RNA mit der entsprechend passenden Target-Sequenz zugegeben und inkubiert. Die 21 nt langen Target-Sequenzen lagen jeweils in einem Segment einer GFP-mRNA (in antisense-Orientierung) vor, sodass die umgebende Sequenz in allen Fällen identisch war. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert.
• 2 Ergebnisse von ,Slicer-Assays' in BYL, die mit einer esiRNA sowie mit AGO/RISC-Komplexen aus Mensch, Pflanze (Nicotiana benthamiana) und Pilz (Colletotrichum graminicola) durchgeführt wurden. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Die verwendete esiRNA enthält am 5'-Ende ein Uridin (5'U), sodass alle drei AGO-Proteine mit dieser siRNA agieren konnten. Zudem wurde die esiRNA mit einem 5'-Adenosin mit dem pflanzlichen AGO2/RISCgetestet. Die AGO-Proteine wurden in BYL mittels in vitro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart des synthetischen siRNA-Duplexes durchgeführt, sodass es zum Einbau der siRNA in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt eine praktisch vollständige Übereinstimmung des Reaktionsmusters - es entstehen die jeweiligen Spaltprodukte in praktisch analogen Quantitäten. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert.
• 3 dass a-Sites, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, auch für ASO zugänglich sind.
  • A) ,Slicer-Assays' durchgeführt in BYL mit einer Target-RNA, einer esiRNA und einem in der Sequenz mit dem guide-Strang der esiRNA entsprechenden antisense DNA-Oligonukleotid (ASO). Links: in Abwesenheit von translatiertem AGO-Protein; Rechts: in Anwesenheit von translatiertem pflanzlichem AGO-Protein. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Eine in vitro-Translationsreaktion erfolgte ohne (links) bzw. mit (rechts) AGO-mRNA jeweils in Gegenwart der angegebenen Mengen an synthetischem siRNA-Duplex oder ASO. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass eine Spaltung mit ASO stets durch die im Extrakt enthaltenen RNase H-Aktivitäten, d. h. unabhängig von AGO, erfolgt, während die siRNA-vermittelte Spaltung nur bei Anwesenheit von zusätzlich generiertem AGO erfolgt. Die Größe des jeweils entstehenden 5'-Spaltproduktes ist identisch.
  • B) Slicer-Assays in BYL, durchgeführt mit genomischer TBSV-RNA als Target und verschiedenen siRNAs, assoziiert an pflanzliches AGO1 (links) oder AGO2 (Mitte). Rechts - analoger Assay mit ausgewählten ASO, welche die entsprechende Sequenz wie die guide-Stränge entsprechender siRNAs aufweisen. Die hier verwendeten siRNAs wurden aufgrund ihrer hohen Affinität zu AGO1 bzw. AGO2, ermittelt durch ,DCL-Assay‘ und ,AGO-IP‘ (siehe 2A) ausgewählt. Die AGO-Proteine wurden in BYL mittels in vitro-Translation entsprechender mRNAs generiert (links, Mitte). Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der synthetischen siRNA-Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der siRNA in den AGO/RISC kam. Der Einsatz der ASO erfolgte unter identischen Bedingungen, allerdings ohne Zugabe von AGO-mRNA (rechts). Anschließend wurde radioaktiv markierte, genomische TBSV-RNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierendem Agarosegel und Autoradiographie auf eine Abnahme der Menge an Target-RNA und das Auftreten von Spaltprodukten analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass auf der komplexen TBSV-RNA nur die ASO eine Spaltung induzieren, deren siRNA-Pendant ebenfalls eine Spaltung erzeugen kann. Die ASO sind inaktiv, deren jeweiliges siRNA-Pendant ebenfalls inaktiv ist. Mit anderen Worten: a-Sites, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind auch für ASO/RNase H zugänglich. Sites, die nicht für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind auch nicht für ASO/RNase H zugänglich.
  • C) Pflanzenprotektionsexperimente mit esiRNA 209 (siR209) und dem entsprechenden ASO-Pendant (ASO209) sowie Kontrollen mit unspezifischen (GFP) siRNAs bzw. ASO und mit zuvor als nicht effizient (siehe 4B) erkannten ASO. Die siRNAs bzw. ASO wurden zusammen mit genomischer TBSV-RNA auf die Oberfläche zweier Blätter von Nicotiana benthamiana-Pflanzen aufgerieben (rub-in). Anschließend wurden die Pflanzen drei Wochen lang hinsichtlich des Auftretens von Symptomen einer TBSV-Infektion beobachtet. (dpi - days post infection).
  • D) Pflanzenprotektionsexperimente mit chemisch modifizierten und nicht modifizierten ASO 209 sowie Kontrolle mit nicht modifiziertem, unspezifischen (GFP) ASO. Das Experiment wurde wie unter C) beschrieben durchgeführt. (MOE - 2'-O-(methoxyethyl); LNA - Locked Nucleic Acid; PTO - Phosphorothioat; dpi - days post infection).
• 4 die Ergebnisse eines ,Slicer-Assays' durchgeführt mit zytoplasmatischem HeLa S10-Extrakt (55) mit einer Target-RNA und dazu passender siRNA oder ASO in Gegenwart (rechts) und in Abwesenheit (links) von translatiertem humanen AGO2. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Eine in vitro-Translationsreaktion erfolgte ohne (links) bzw. mit (rechts) AGO-mRNA jeweils in Gegenwart von synthetischem siRNA-Duplex oder ASO. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass auch in HeLa-Extrakt analoge endonukleolytische Hydrolysen durch die jeweiligen sRNA/AGO/RISC- bzw. ASO/RNase H-Komplexe erfolgen. Während eine Spaltung mit ASO unabhängig von AGO-Protein durch die im Extrakt enthaltenen RNase H-Aktivitäten erfolgt, wird die Aktivität der siRNA durch die mittels in vitro-Translation erhöhte AGO2-Menge deutlich verbessert.
• 5 die Ergebnisse eines CRISPR/Cas ,cleavage‘-Experiments, durchgeführt mit BYL, Cas13b und TBSV-RNA im Vergleich zu einem ,Slicer-Assay‘ mit pflanzlichem AGO-Protein. Die Target-Sequenz der hier verwendeten CRISPR-RNA 200 (crR200) überlappt mit den Target-Sequenzen der esiRNAs 186 und 209 (siR186, siR209). AGO-Protein sowie Cas13b aus Prevotella sp. P5-125 wurden in BYL mittels in vitro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktionen wurden in Gegenwart der synthetischen siRNA-Duplexe bzw. der crRNA durchgeführt, sodass es zur Ausbildung der entsprechenden Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe kam. Anschließend wurde ein radioaktiv markierter Bereich der genomischen TBSV-RNA als Target zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass in Gegenwart von Cas13b und CRISPR-RNA 200 eine Spaltung der viralen RNA erfolgt, die durch die esiRNAs 186 bzw. 209 erkannten a-Sites sind also auch durch crR200/Cas13b angreifbar.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel 1: Slicer-Assay
• Benutzt wurde die experimentell bestimmte RNA-Sekundärstruktur des Genoms des Tomato bushy stunt virus (TBSV) (30). Diese weist Segmente, die funktionale, weitreichende RNA-RNA-Wechselwirkungen ausbilden, auf. Diese genomische virale RNA wurde als Target-RNA in einem in vitro ,Slicer-Assay‘ mit ausgewählten 21 nt siRNAs, die eine hohe Affinität zu den pflanzlichen AGO-Proteinen AGO1 oder AGO2 zeigten, eingesetzt. Dazu wurde die AGO-Proteine in BYL mittels in vitro-Translation generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der zu testenden, synthetischen siRNA-Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der gewünschten siRNAs in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde radioaktiv markiertes TBSV-Genom als Target zugegeben und inkubiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender Agarose-Gelelektrophorese und Autoradiographie auf slicing/cleavage-Produkte analysiert. Die Position des 5'-Nukleotids der getesteten siRNAs (bzw. das 3'-Ende der Target-Sequenz) wurde ermittelt. Die 21 nt stromaufwärts davon entsprechen der Target-Sequenz, in deren Mitte erfolgt die endonukleolytische Spaltung durch den RISC. Für siRNAs, die eine Hydrolyse der Target-RNA induzieren konnten, wurden entsprechende Spaltfragmente detektiert. siRNAs, die nicht oder kaum zu einer Hydrolyse der Target-RNA führten, konnten ebenfalls bestimmt werden (9). Anhand der Strukturanalyse war prognostiziert worden, dass solche Regionen, die hier größtenteils einzelsträngig vorliegen, zugänglich für RNAi sind und solche, die im Wesentlichen doppelsträngig vorliegen, nicht zugänglich sind. Es konnte keine klare Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des ,Slicer-Assays' und der prognostizierten Sekundärstruktur festgestellt werden (9).
• Beispiel 2: Ermittlung von Konsensus-Sequenzen von siRNAs verbessern AGO/RISC Aktivität. In RNA-seq Analysen, die während des zweiten Schrittes (AGO-IP) von esiRNA/ERNA screens verschiedener Target-RNAs (virale RNAs und verschiedene mRNAs) durchgeführt wurden, wurde eine statistisch relevante Anzahl von siRNAs analysiert, die von verschiedenen AGO-Proteinen gebunden werden. Aus diesen Analysen wurden für die jeweiligen AGOs guide-Strang-Konsensussequenzen erstellt: Diese geben für jede einzelne Position der sRNA jeweils die Nukleotidvariante bzw. Nukleotidvarianten (bei mehreren Möglichkeiten) wieder, für die ermittelt wurde, dass sie jeweils den besten Beitrag zu einer effizienten Bindung der sRNA an das entsprechende AGO-Protein leistet ( 1A). Um den Effekt der ermittelten Konsensussequenzen zu ermitteln wurde ein Slicer-Assay durchgeführt, in der eine nicht-optimierte siRNA im Vergleich zu einer Konsensus-optimierten siRNA getestet wurde. Die Target-RNA wurde dabei so angepasst, dass beide siRNAs jeweils mit der kompletten Sequenz an diese hybridisieren können. Auf diese Weise ließ sich der Effekt der Konsensussequenz auf die Aktivität des AGO/RISC unabhängig von der Zugänglichkeit der Target-RNA feststellen. Es wurde so gezeigt, dass sich das durch diese so optimierten esiRNAs/ERNAs ausgelöste slicing der Target-RNA im Vergleich zu der ursprünglichen esiRNA nochmals erhöhen lässt (1B). Das esiRNA/ERNA screen Verfahren wurde somit dahingehend verbessert, dass es nun nicht mehr ausschließlich auf der empirisch/experimentellen Ermittlung effizient wirksamer esiRNAs und Auswahl eines an das jeweilige AGO-Protein angepassten 5'-Nukleotides beruht. Durch Anpassung an die Konsensussequenz kann die Bindung eines esiRNA/ERNA guide-Stranges an das jeweils verwendete AGO-Protein erhöht und damit die RNA silencing-Aktivität des resultierenden sRNA/AGO/RISC gezielt verbessert werden.
• Beispiel 3: Nachweis, dass AGO/RISC-Komplexe aus unterschiedlichen Organismen, bei gebundenen esiRNAs/ERNAs gleicher Bindesequenz, identisch auf einer Target-RNA agieren.
• Bislang wurde gezeigt, dass es mit einem esiRNA/ERNA screen Verfahren, das in pflanzlichen cytoplasmatischen Extrakten (BYL) durchgeführt wird, möglich ist, experimentell siRNAs zu ermitteln, die, als esiRNAs, besonders effizient auf einer Target-RNA, z.B. der genomischen RNA eines Pflanzenvirus, agieren können. Als wichtiger Faktor für die Effizienz einer siRNA auf einer Target-RNA wurde dabei die Affinität an das jeweils agierende AGO-Protein ermittelt. Die Affinität zu AGO wird zum einen durch das 5'-Nukleotid der siRNA bestimmt (29); zum anderen, wie hier erfindungsgemäß gezeigt, durch eine optimale Sequenz (Konsensussequenz; s.o.). Als weiterer Faktor für die Effizienz einer siRNA im RNAi wurde, wie ausgeführt, die Zugänglichkeit der Target-RNA für AGO/RISC vermutet. Eine zentrale Frage, die sich in diesem Zusammenhang stellte, war, ob Bereiche einer Target-RNA, die für pflanzliche AGO/RISC zugänglich sind, dies in ähnlicher Weise auch für AGO/RISC aus anderen Organismen sind. Um dies zu testen wurden die AGO1- und AGO2-Proteine aus Pflanze (Nicotiana benthamiana), das AGO2-Protein aus Mammalia (Homo sapiens) und das AGO1-Protein aus Fungi (Colletotrichum graminicola) in BYL exprimiert und in Slicer-Assays mit einer Target-RNA getestet. Die verwendeten siRNAs hatten jeweils die identische Bindesequenz (die Sequenz, die vollständig mit der komplementären Sequenz der Target-RNA hybridisiert) und ein 5'-Nukleotid, das jeweils an die Bindepriorität des jeweiligen AGO angepasst war: Für das pflanzliche AGO1 war dies 5'U, für das pflanzliche AGO2 5'A, für das humane AGO2 5'U oder 5'A und für das pilzliche AGO1 5'U. Aus den durchgeführten Slicer-Assays ließen sich zwei wesentliche Erkenntnisse ableiten: (i) Alle eingesetzten AGO-Proteine bilden in den BYL funktionelle RISC und (ii) alle AGO/RISC zeigen eine direkt vergleichbare slicing/cleavage-Aktivität (2). Damit wurde deutlich, dass AGO/RISC aus Spezies dreier verschiedener Reiche (Plantae, Fungi und Animalia der Eukarya-Domäne), wenn sie mit sRNAs gleicher Bindesequenz beladen werden, in sehr vergleichbarer Weise auf der entsprechenden Target-RNA aktiv sind.
• Dieser Befund ist neu und unerwartet, denn es wird gezeigt, dass die Zugänglichkeit eines Target-RNA-Moleküls allgemein für alle AGO/RISC gegeben ist, solange diese durch die gleiche Nukleinsäure dirigiert werden. Dies können siRNAs, aber z.B. auch miRNAs (28), oder andere Arten von Nukleinsäuren (siehe auch unten) sein.
• Beispiel 4: Nachweis, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, auch zugänglich sind für ASO/RNase H.
• Die Tatsache, dass Bereiche einer Target-RNA, die für einen sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, in gleicher Weise für einen sRNA/AGO/RISC aus einem anderen organismischen Reich zugänglich sind, deutete darauf, dass sich mit sRNA/AGO/RISC generell zugängliche Bereiche, a-Sites, einer komplexen Target-RNA detektieren lassen. Dies führte wiederum zu der Hypothese, dass diese a-Sites dann auch für andere Nukleinsäure/Nuklease-Komplexe wie beispielsweise ASO/RNase H zugänglich sein sollten.
• In dazu durchgeführten Studien wurde zunächst deutlich, dass BYL auch eine RNase H Aktivität enthalten. So konnte erstmals demonstriert werden, dass bei Supplementierung von BYL mit einem einzelsträngigen ASO, das zu einem bestimmten Bereich einer Target-RNA komplementär ist, diese Target-RNA, ASO-dirigiert, in definierte Fragmente hydrolysiert wird. Diese endonukleolytische Hydrolyse konnte somit unabhängig von der Anwesenheit eines rekonstituierten AGO/RISC beobachtet werden, und sie generiert 3'-Spaltprodukte, die von denen eines AGO/RISC differieren (3A). Bisher erhaltene Daten, die hier nicht im Detail dargelegt werden, deuten darauf, dass in BYL sowohl RNase H1-als auch RNase H2-Aktivitäten messbar sind (C. Gruber, nicht publizierte Daten).
• Zur Prüfung unserer Hypothese wurden ASO synthetisiert, die in ihrer Bindesequenz exakt zuvor mit pflanzlichen AGO/RISC identifizierten esiRNAs/ERNAs entsprachen. In einer Serie von Experimenten konnte dann erfindungsgemäß gezeigt werden, dass Bereiche, die zuvor als zugänglich für siRNA/AGO/RISC-mediierte Endonukleolyse charakterisiert wurden, dies in analoger Weise für ASO/RNase H-mediierte Endonukleolyse sind. So wird eine virale Target-RNA, die durch einen esiRNAvermittelten AGO/RISC endonukleolytisch gespalten wird, an gleicher Stelle durch ASO-mediierte RNase H-Aktivität endonukleolytisch gespalten. Dagegen sind ASO, deren Sequenz inaktiven siRNAs entspricht, nicht auf dieser Target-RNA aktiv (3B). In nachfolgenden Studien in vivo konnte demonstriert werden, dass ASO, ähnlich wie siRNAs, in der Lage sind, virale Infektionen in Pflanze zu verhindern. Wie erwartet, wirken nur solche ASO antiviral, die in ihrer Sequenz esiRNAs entsprechen und somit an komplementäre a-Sites in den Target-RNAs binden können. Dagegen war kein antiviraler Effekt mit ASO zu beobachten, die siRNAs entsprachen, die zu anderen, offenbar nicht zugänglichen Bereichen der verwendeten Target-RNA komplementär sind (3C). Wie hier gezeigt können in diesen Experimenten auch MOE-, LNA- und PS(PTO)-modifizierte ASO als antivirale Substanzen eingesetzt werden (3D).
• Beispiel 5: Nachweis, dass sRNA/AGO/RISC- und ASO/RNase H-Komplexe aus cytoplasmatischen Extrakten pflanzlicher und humaner Zellen, bei Verwendung von sRNAs oder ASO identischer Bindesequenz, identisch auf einer Target-RNA agieren.
• Die nächste Frage, die sich stellte, war, ob sich analoge Ergebnisse auch in cytoplasmatischen Extrakten erhalten lassen, die nicht, wie BYL, aus pflanzlichen Zellen gewonnen werden. Um dies zu überprüfen, bot es sich an, S10 Extrakte aus humanen HeLa-Zellen unter ähnlichen Bedingungen wie BYL zu testen. In HeLa S10-Extrakten kann AGO/RISC-Aktivität unter sehr ähnlichen Bedingungen in vitro rekonstituiert werden (56); zudem enthalten diese Extrakte RNase H-Aktivität (55). Entsprechend der Aufgabe wurden in HeLa S10 Slicer-Aassays mit dem humanen AGO2-Protein, einer Target-RNA, einer passenden esiRNA und einem davon abgeleiteten ASO durchgeführt (4). Dabei wurde deutlich, dass hier, analog zu der Situation in BYL, die Target-RNA von beiden endonukleolytischen Aktivitäten wiederum in sehr ähnlicher Weise gespalten wird, d.h. es entstand jeweils das gleiche 5'-Spaltprodukt. Im Gegensatz zu BYL konnte in HeLa S10 AGO/RISC-Aktivität auch ohne zusätzlich exprimiertes (in vitro translatiertes) AGO rekonstituiert werden; bei zusätzlich exprimiertem AGO2, ließ sich die Aktivität aber steigern (4). Damit wurde folgendes deutlich: In cytoplasmatischen Extrakten völlig verschiedener Zelltypen erfolgt die Faltung einer komplexen Target-RNA offenbar in sehr ähnlicher Weise. Die Faltung erfolgt vermutlich über RNA-RNA- und auch RNA-Protein-Interaktionen mit in den Extrakten enthaltenen RNA-bindenden Proteinen.
• Es wurden esiRNA/ERNA screens in HeLa S10 durchgeführt. Als Target-RNAs wurden mRNAs eines humanen Virus eingesetzt. Die dabei in vitro identifizierten esiRNAs und davon abgeleiteten (modifizierte) ASO wurden anschließend in vivo, d.h. durch Applikation im Mausmodell auf eine protektive Wirkung gegen eine Virusinfektion getestet. Es wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit den in vitro identifizierten esiRNAs und ASO behandelt wurden, im Vergleich zu entsprechenden Kontrolltieren einen deutlich verbesserten Schutz gegen die Virusinfektion aufwiesen.
• Durch ein screening mit sRNA/AGO/RISC können in einer Target-RNA a-Sites identifiziert werden, die zugänglich für AGO/RISC und auch für ASO/RNase H sind. Mit BYL und anderen cytoplasmatischen Extrakten, also z.B. humanen HeLa-Extrakten, können entsprechend zugängliche Bereiche auf Target-RNAs gezielt ermittelt werden und diese entweder sRNA- oder auch ASO-mediierter Regulation, z.B. Inhibition der Genexpression durch endonukleolytischen Abbau, zugeführt werden.
  Damit können cytoplasmatische Extrakte von Zellen, in denen es möglich ist, sRNA/AGO/RISC zu rekonstituieren, erfindungsgemäß dazu eingesetzt werden, die für diese Komplexe als auch für ASO/RNase H zugänglichen Bereiche, a-Sites, auf komplex gefalteten und mit RNA-bindenden Proteinen assoziierten Target-RNAs zu detektieren.
• Beispiel 6: Nachweis, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC und ASO/RNase H zugänglich sind, auch für CRISPR/Cas zugänglich sind.
• Dem oben beschriebenen Grundprinzip folgend wurde nachkommend postuliert, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, dies auch für g/crRNA-dirigierte Cas-Proteine sind. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde das Cas13b-Protein aus Prevotella sp. (P5-125) gemeinsam mit crRNAs individueller Wahl als endonukleolytische Komplexe in BYL oder HeLa S10 rekonstituiert. Die crRNAs waren dabei so konzipiert (5), dass sie mit Bereichen einer Target-RNA überlappten, für die zuvor gezeigt werden konnte, dass sie für esiRNA/AGO/RISC zugänglich sind. In einem entsprechenden endonukleolytischen Assay konnte gezeigt werden, dass mit diesen g/crRNAs eine durch Cas13b katalysierte spezifische Hydrolyse der Target-RNA an ähnlichen Stellen wie mit den entsprechenden esiRNA/AGO/RISC erfolgen kann. D.h. mit rekonstituierten sRNA/AGO/RISC und rekonstituierten g/crRNA/Cas13b Komplexen, in denen die verwendeten s- und g/crRNAs an jeweils homologe Bereiche auf der Target-RNA hybridisieren, wurden jeweils Abbauprodukte generiert ( 5).
• Damit können cytoplasmatische Extrakte von Zellen, in denen es möglich ist, sRNA/AGO/RISC zu rekonstituieren, erfindungsgemäß dazu eingesetzt werden, die für diese Komplexe als auch für ASO/RNase H, als auch für CRISPR/Cas zugänglichen Bereiche, a-Sites, auf komplex gefalteten Target-RNAs zu detektieren. Die Target-RNA kann dann verlässlich mit RNA, DNA oder CRIPR/Cas Verfahren in ihrer Funktion verändert, z.B. durch silencing inaktiviert werden.
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• Zitierte Patentliteratur
• WO 2005042705 A2 [0008]
• WO 2019222036 A1 [0009]
• WO 2019001602 A1 [0010, 0017, 0020, 0021]
• WO 2019/001602 [0015]

Claims (20)

1. Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierten Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellung einer Target-RNA; (ii) esiRNA/eRNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können; (iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder (iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und (v) Identifizierung der a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsänderung der Target-RNA eine effiziente Endonukleolyse oder eine Inhibition der Translation der Target-RNA und damit z.B. ein silencing (Funktionsverlust) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-RNA eine RNA ist, die aus Viren, Bakterien, Pflanzen, Pilzen, Tieren oder dem Menschen stammt.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs ausgewählt sind aus jedweder Art von siRNAs (siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) und/oder jedweder Art von miRNAs und/oder jedweder Art von antisense DNA-Oligonukleotiden und/oder jedweder Art von g/crRNAs, vorzugsweise jedwede Art der genannten eNAs, wie z. B. natürlich vorkommende, synthetische, rekombinante oder artifiziell erzeugte eNAs.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Endonuklease ausgewählt ist aus Argonaute (AGO)-, RNase H und/oder Cas-Proteinen.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Funktion der Target-RNA ausgewählt ist aus RNA-, DNA- oder CRISPR/Cas-vermitteltem silencing.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Funktion der Target-RNA verlässlich ist, d.h. stets erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs eine Konsensussequenz aufweisen, die die Affinität zu der Endonuklease erhöht.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) oder jedwede Art von miRNAs sind und die Endonuklease ein AGO-Protein ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) sind und die Endonuklease eine RNase H ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von g/crRNAs sind und die Endonuklease ein Cas-Protein ist.
12. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche zur Identifizierung von eNAs, die Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-, RNase H und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren und damit, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zum, vorzugsweise verlässlichen, RNA-vermittelten, DNA-vermittelten und/oder CRISPR/Cas-vermittelten silencing.
14. Verwendung der nach einem Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 identifizierten eNAs zur Pathogenbekämpfung in Pflanzen/Nutzpflanzen, Tieren/Nutztieren und/oder im Menschen, z. B. als Viruzide, Bakterizide, Fungizide, Nematizide und Insektizide.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs in transgener oder transienter (non-transforming) Form zur Pathogenbekämpfung oder zur gezielten, posttranskriptionellen Regulation der Genexpression eingesetzt werden.
16. Zusammensetzung umfassend mindestens eine eNA, die mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 identifiziert wurde.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine Lösung oder ein Aerosol/Spray ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung ist.
19. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung zur parenteralen, enteralen, intramuskulären, mukosalen oder oralen Verabreichung oder zur Verabreichung als Aerosol geeignet ist.
20. Verfahren, Verwendung oder Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die eNA eine oder mehrere chemische Modifikationen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die chemischen Modifikationen ausgewählt sind aus z.B. 2'-Ribosemodifikationen (2'-O-methyl, 2'-fluoro, 2'-O-(methoxyethyl) (2'-MOE)), Zuckermodifikationen (,locked‘ (LNA) oder unlocked, (UNA)), ,Backbone‘-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder ,peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino).

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