WO2022200407A1 - Zuverlässige identifikation von bereichen (,a-sites') in komplexen rna-molekülen, die zugänglich sind für nukleinsäuren oder komplexe von nukleinsäuren mit endonukleasen - Google Patents

Zuverlässige identifikation von bereichen (,a-sites') in komplexen rna-molekülen, die zugänglich sind für nukleinsäuren oder komplexe von nukleinsäuren mit endonukleasen Download PDF

Info

Publication number
WO2022200407A1
WO2022200407A1 PCT/EP2022/057596 EP2022057596W WO2022200407A1 WO 2022200407 A1 WO2022200407 A1 WO 2022200407A1 EP 2022057596 W EP2022057596 W EP 2022057596W WO 2022200407 A1 WO2022200407 A1 WO 2022200407A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
target
ago
target rna
sites
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/057596
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sven-Erik PROF. DR. BEHRENS
Torsten DR. GURSINSKY
Selma DR. GAGO-ZACHERT
Cornelia GRUBER
Vitantonio DR. PANTALEO
Ayson GHASEMZADEH
Original Assignee
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg filed Critical Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Priority to EP22718104.7A priority Critical patent/EP4314288A1/de
Priority to CN202280037538.2A priority patent/CN117836410A/zh
Priority to CA3213865A priority patent/CA3213865A1/en
Priority to BR112023018851A priority patent/BR112023018851A2/pt
Priority to US18/552,397 priority patent/US20240175015A1/en
Publication of WO2022200407A1 publication Critical patent/WO2022200407A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting accessible regions ('a-sites') in complex RNA molecules (target RNAs), with nucleic acids or complexes of these nucleic acids and endonucleases associated therewith binding to the a-sites and the function of the target alter RNAs, characterized in that the method comprises the following steps:
  • esiRNA/fRNA screen that identifies siRNAs that, in complexes with Argonaute (AGO) proteins, can reliably induce a functional change of this target RNA;
  • the invention further relates to the use of the method for identifying eNAs that
  • Endonucleases selected from AGO proteins, RNase Fl and Cas proteins, capable of directing to the a-sites of target RNAs and in the presence or absence of these endonucleases, preferably reliably, affecting/changing the function of these RNA molecules; and eNAs and compositions containing these eNAs in pathogen control.
  • RNAs complex ribonucleic acid molecules
  • pre-mRNAs or mRNAs ribonucleic acid molecules
  • viroid or viral replication as viroids, viral genomes, viral mRNAs or viral Antigenomes/replication intermediates
  • RNAs also referred to below as 'target RNAs'
  • 'target RNAs' are either self-replicating, as in the case of viroids, are replicated, as in the case of viral RNAs, are processed to mature RNAs, as in the case of pre-mRNAs and some viral RNAs , or they are translated to generate proteins, as in the case of mature viral, prokaryotic, or eukaryotic mRNAs and some viral genomes.
  • target RNAs are also non-coding RNAs that modulate gene expression.
  • NA short-chain nucleic acids
  • the directing NA can in turn be ribonucleic acid molecules such as small sRNAs (e.g. small interfering RNAs, siRNAs, or m/croRNAs, miRNAs) or guide (g) or CRISPR (er) RNAs, but also deoxyribonucleic acids such as antisense Act DNA oligonucleotides (ASO).
  • small sRNAs e.g. small interfering RNAs, siRNAs, or m/croRNAs, miRNAs
  • guide g
  • CRISPR er RNAs
  • ASO antisense Act DNA oligonucleotides
  • the directing NA can already inhibit the function of the target RNA, for example as a translation substrate, by binding ('hybridization') to the target RNA.
  • the directing NA usually form a complex with an endonuclease. This endonuclease is either already associated to the directing NA and then becomes active on the target RNA after it has hybridized to the target RNA. Alternatively, after association of the directing NA to the target RNA, an endonuclease is recruited. The function of the target RNAs can then be inhibited via nuclease-mediated catalysis of endonucleolytic cleavage.
  • a 'silencing' of the target RNA 1-6).
  • a core aspect of the use of directing NA inter alia with the purpose of directing endonucleases such as AGO proteins, RNase H or Cas proteins to a target RNA, is the accessibility of the target sequence to which the directing NA are intended to hybridize.
  • longer RNA molecules fold into complex secondary and tertiary structures where segments interact with adjacent or more distant segments.
  • Sterns 1 stem loops, kissing loops and other RNA-RNA interactions form (7).
  • most RNA molecules in the cell associate with RNA-binding proteins (8).
  • RNA interference RNA interference
  • ASO/RNase H in antisense methods
  • g/crRNA/Cas in CRISPR/Cas methods have to compete with these structures and proteins in order to to associate to the target (RNAi, antisense and CRISPR/Cas methods are discussed below).
  • RNAi RNA interference
  • antisense and CRISPR/Cas methods are discussed below.
  • the more accessible the target RNA the more pronounced the effect. This connection was demonstrated for siRNA/AGO, for example, by Gago et al (9) and for ASO, for example, by Vickers and Crooke (10).
  • a-sites accessible sites - accessible areas
  • NA or nucleic acid/endonuclease complexes see also preliminary work.
  • RNA molecules viral RNA genomes, viroids, cellular or viral mRNAs, non-coding RNAs, etc.
  • RNA molecules viral RNA genomes, viroids, cellular or viral mRNAs, non-coding RNAs, etc.
  • chemical modifications 11:12
  • these approaches are very limited because they are technically complex and only deliver RNA structures under very defined conditions. If the conditions change - and this is constantly the case during the activity of an RNA in the cell, if only because of the dynamic interactions of RNA-binding proteins - an experimental structure determination is not meaningful.
  • RNA structures can be predicted in silico using algorithms such as mfold, sfold or RNApIfold. Similar approaches should detect areas that are accessible for directing NA or nucleic acid/endonuclease complexes, for example via a 'viral siRNA predictor' (http://crdd.osdd.net/servers/virsirnapred). However, these programs, as well as approaches to use libraries (libraries) of conducting NA, are only partially reliable (13-20). The high structuring of long-chain target RNAs thus explains the lack of silencing efficiencies in RNAi, ASO and CRISPR/Cas approaches.
  • RNAi, antisense and CRISPR/Cas methods have been a significant problem when using RNAi, antisense and CRISPR/Cas methods; they occur, for example, via incomplete base pairing between the directing NA and target RNA.
  • WO 2005042705 A2 describes a method for identifying, designing and synthesizing unique siRNA nucleotide sequences, which leads to the improvement of RNAi application.
  • a database of mRNA sequences from the target species is compared with an siRNA nucleotide sequence which consists of 18-25 nucleotides, with at least 11 consecutive nucleotides being complementary to the mRNA target sequence.
  • a miRNA sequence can be compared to an mRNA database.
  • WO 2019222036 A1 describes genetically modified proteins of the AGO family which achieve improved silencing. Special regulations relating to the production of the AGO proteins increase their efficiency.
  • the mutated AGO protein forms a complex with the guide strand of an siRNA, which leads to inhibition of gene expression. However, there is no mention of an increased affinity. However, the present invention is not directed to the generation of mutant AGO proteins.
  • WO 2019001602 A1 provides methods for the identification and production of highly efficient siRNAs (esiRNAs/ ⁇ RNAs) in cytoplasmic extracts from Nicotiana tabacum. The system allows the reconstitution of the antiviral RNA-s/ ' /enc/ngs in vitro.
  • Dicer/DCL proteins and, optionally, AGO proteins are active in the described extracts. EsiRNAs/ ⁇ RNAs provided in this way are used in the regulation of gene expression in target organisms, including in the improvement of pathogen resistance.
  • the object of the invention was to provide a method for detecting accessible regions ('a-sites') in complex RNA molecules (target RNAs), wherein nucleic acids or complexes of these nucleic acids and associated endonucleases directing to the a-sites bind and reliably ('reliably') change the function of the target RNAs.
  • the object of the invention is achieved by a method according to claim 1.
  • the object of the invention is achieved in particular by a method for detecting accessible regions, 'a-sites', in complex RNA molecules (target RNAs), with nucleic acids or complexes of these nucleic acids and associated endonucleases directing to the a-sites bind and reliably change the function of the target RNAs, characterized in that the method comprises the following steps:
  • RNAs Under 'Target RNA' according to step (i) according to the invention complex ribonucleic acid molecules (RNAs) are understood that either in the course of transcription of a prokaryotic or eukaryotic cellular genome (as pre-mRNAs or mRNAs or non-coding RNAs) or in the course of viroid or viral replication (as viroids, viral genomes, viral mRNAs or viral Antigenomes/replication intermediates) are generated.
  • RNAs of interest are either self-replicating, as in the case of viroids, are replicated, as in the case of some viral RNAs, are processed into mature RNAs, as in the case of pre-mRNAs and some viral RNAs, or are translated to generate proteins , as in the case of mature viral, prokaryotic, or eukaryotic mRNAs and some viral genomes.
  • target RNAs are also non-coding RNAs that modulate gene expression.
  • step (ii) which identifies siRNAs that can reliably induce a functional change in a target RNA in complexes with AGO proteins and part of RNA-induced silencing complexes (RISC), is known from the prior art WO 2019/001602 known.
  • a change in function is understood to mean, for example, efficient endonucleolysis or inhibition of translation of the target RNA and thus, for example, a silencing (loss of function) of this target RNA.
  • the esiRNA/fRNA screen according to step (ii) can be described as follows: A method which has been established to date and is described below aims at a reliable RNAi-based change in the function of a target RNA. It is used, for example, in combating pathogens such as plant-pathogenic viruses.
  • the largest group of plant-pathogenic viruses are (+)-strand RNA viruses, whose genome consists of one or more positively oriented (mRNA sense) RNA molecules.
  • the viral genome acts accordingly after entry into the cell as messenger RNA (mRNA), from which viral proteins are translated. Some of these proteins, along with cellular host factors, then replicate the viral RNA.
  • mRNA messenger RNA
  • RNAs double-stranded (ds) RNAs as replication products, which consist of (+) and complementary (-) RNAs.
  • mRNAs can be transcribed from the (-)RNAs, from which further viral proteins are translated.
  • the replication products can trigger an RNA interference mechanism (RNAi) in the infected plant host (see above).
  • Dicer or Dicer-like proteins from the genome, from the replication products and from the mRNAs of the virus produce a large number of small, 19-25 nt long, double-stranded siRNAs, a so-called siRNA pool ', generated; At most, this consists of all siRNAs that can theoretically be processed from these target RNAs by Dicer/DCL.
  • the siRNA/AGO complex then associates as part of a high-priority RISC to the 'cognate' viral RNAs, ie the target RNAs from which the siRNAs originally arose.
  • the association of the siRNA/AGO/RISC changes the function of the target RNAs, eg by AGO-catalyzed endonucleolysis (flydrolysis), which leads to inactivation (silencing) of the target.
  • flydrolysis AGO-catalyzed endonucleolysis
  • silencing inactivation
  • the experimental basis for the esiRNA/ ⁇ RNA screen is a cytoplasmic extract (BY2 lysate, BYL) prepared from protoplasts of suspension cells of the Nicotiana tabacum plant (24). BYL has endogenous Dicer/DCL activities and it is possible to reconstitute sRNA/AGO/RISC complexes in vitro in this extract (25-28, 9).
  • the esiRNA/ ⁇ RNA screen was initially established for 21 and 22 nt siRNAs and the two plant AGO proteins AG01 and AG02; these forms of siRNAs and AGO protein variants are known to be involved in the plant antiviral RNAi immune response.
  • Two properties served as indicators for an esiRNA/ ⁇ RNA an efficient flydrolysis induced by this RNA on the relevant target RNA by AGOL or AG02 ('slicing' or deavage') in vitro, and the ability to plants to which these siRNAs administered in various ways (e.g. via 'rub in' or transient expression) to protect against subsequent viral infection by silencing the viral RNA.
  • the esiRNA/£RNA screen consists of the following steps:
  • RNA-Seq next-generation RNA sequencing
  • RISC are reconstituted with a selected AGO and an siRNA pool generated in BYL.
  • the RISC are enriched via immunoprecipitation (IP) and the AGO-bound siRNAs are detected via RNA-Seq.
  • IP immunoprecipitation
  • RNA-Seq RNA-Seq
  • the siRNAs identified in step two are finally tested individually with the AGOs used in each case to determine whether they are able to produce an efficient to induce endonucleotic hydrolysis ('slicing' or 'cleavage') in the cognate target RNA.
  • the esiRNAs identified in vitro are tested in vivo/in planta for their potential to protect plants against infection with the virus.
  • esiRNA/f RNA screen can be used in vitro, i.e. in the 'test tube', to identify esiRNAs from the siRNA pool of a viral RNA in an empirical/experimental system that are capable of doing so to protect plants effectively against infections with the virus (9, WO 2019001602 A1).
  • siRNAs with a 5'uridine preferentially bind to the plant AG01 and siRNAs with a 5'adenosine preferentially bind to the plant AG02 (29, 26, 9).
  • affinity of an sRNA to an AGO protein is determined by other previously unknown binding determinants in the sequence of the sRNA.
  • RNA structure determinations do not provide any reliable information about the a-sites of a target RNA.
  • the first open question/the first problem to be solved concerns the binding determinants of sRNAs, which, in addition to the 5' nucleotide, determine the affinity of the binding of a guide strand to an AGO protein. Since the affinity of an sRNA to AGO/RISC also largely determines its activity (see above), knowledge of all binding determinants is of great importance for identifying sRNAs that act efficiently and reliably in the RNAi process. Accordingly, the task was to fully define the binding determinants of an sRNA, which are necessary for optimal association with AGO proteins.
  • the task was to expand and optimize the esiRNA/fRNA screen method in such a way that it is possible to identify a-sites in complex RNA molecules of any type that are universal, i.e. for all types of directing NA or nucleic acid/ Endonuclease complexes are accessible. It should therefore be possible, even without knowing the structure of a complex RNA, to reliably identify the regions of these RNAs that can be used for a functional change or silencing of any kind.
  • Consensus sequences of siRNAs that bind to mammalian AGO proteins with high affinity were also identified.
  • the affinity of sRNAs to the relevant AGO proteins can be increased in a targeted manner and the activity of the relevant AGO/RISC in RNA-mediated silencing can be improved accordingly (Figure 2) .
  • the method of the invention includes an extended and improved step (ii), with which it is possible to adapt the sequences of identified esiRNAs / fRNAs or other sRNAs (such as miRNAs) to the determined consensus sequences whose activity in AGO / RISC, e.g. in Improving RNA-mediated silencing procedures.
  • AGO/RISC were isolated with AGO proteins from species of three different kingdoms of the Eukaryan domain, namely AGO from Plantae, AGO from Fungi and AGO Mammalia reconstituted in BYL.
  • the different AGO/RISC were reconstituted with the same, adapted sRNA (see above).
  • This sRNA was an esiRNA/fRNA which can accordingly bind to an a-site of a target RNA.
  • identical slicing/cleavage (hydrolysis) of the target RNA was observed with all AGO/RISC (FIG. 3).
  • This unexpected finding implies that sRNAs associated to a specific AGO/RISC (e.g. from plant) induce slicing/cleavage or inhibition of translation on a target RNA, do so on the same target RNA in the same way in to another AGO/RISC, ie from a completely different species (eg from a fungus) (FIG. 3).
  • This demonstrated that a-sites of complex RNA molecules are universally accessible to AGO/RISC of any nature, provided that these AGO/RISC have bound an sRNA that can hybridize to this a-site.
  • RNAs of various natures e.g. genomic RNA from viruses and mRNAs from various organisms originating from viruses, bacteria, plants, fungi, oomycetes, animals such as nematodes, arthropods and higher animals such as mammals or humans .
  • sRNA/AGO/RISC from different species act identically on the same target RNA when sRNA is incorporated with an identical or very similar binding sequence and that this is equally the case in cytoplasmic extracts from plants and humans. It was thus possible to conclude that complex RNA molecules apparently fold similarly in the cytoplasmic extracts of different cell types and that the a-sites of these RNA molecules are correspondingly formed in the same way. An a-site is thus equally accessible to AGO/RISC from a wide variety of origins, provided they have incorporated an sRNA that can hybridize to this a-site.
  • RNAi complex RNA molecules
  • Cas endonucleases
  • the a-sites should thus be universally identifiable and usable, ie not only for RNAi but also for DNA-mediated and CRISPR/Cas-mediated silencing.
  • Regions, a-sites, of a target RNA that are accessible for sRNA/AGO/RISC are correspondingly also accessible for ASO/RNase H and for g/crRNA/Cas.
  • a basic principle is thus disclosed which shows that directing NAs such as sRNAs, ASO and g/crRNAs or the nucleic acid/protein complexes sRNA/AGO/RISC, ASO/RNase H and g/crRNA/Cas derived therefrom can be accessed according to analogous principles associate a-sites of a complex target RNA and become reliably effective there.
  • the esiRNA screen method can thus be extended and used as an 'eNA screen' method (eNA stands for effective directing nucleic acid). It is now possible, e.g. via screening with sRNA/AGO/RISC, to identify areas in a complex RNA on which ASO/RNase H and g/crRNA/Cas are also active when similar or identical sequences of the ASO or g/crRNAs are used ( see application examples).
  • Viral replication in the plant can be inhibited both by siRNAs that bind to the a-sites of the viral RNA and by ASO or g/crRNAs of the same or similar sequence (see figures 4 and 6 as well as application examples).
  • the method according to the invention comprises as step (iii) a test following step (ii) with antisense DNA oligonucleotides (ASO) derived from the esiRNAs/f RNAs identified in step (ii) to determine whether these are present or can induce a functional change of the target RNA in the absence of RNase F1.
  • ASO antisense DNA oligonucleotides
  • the method according to the invention comprises as step (iv) a test following steps (ii) or (iii) with g/crRNAs derived from the esiRNAs/fRNAs or ASO identified in steps (ii) or (iii) to determine whether these are present of a Cas protein can induce a functional change of the target RNA.
  • a-sites are identified in this target RNA to which different types of targeting nucleic acids ('eNAs') bind and can reliably change the function (e.g. see above) of this target RNA either alone or through an associated endonuclease.
  • 'eNAs' targeting nucleic acids
  • RNA-mediated, DNA-mediated and CRISPR/Cas-mediated silencing are thus provided according to the invention, with which it is reliably possible to detect areas, a-sites, in complex target RNAs that are for endonuclease-directing nucleic acids such as e.g. siRNAs, miRNAs, ASO and g/crRNA are accessible.
  • the information obtained can be used to make RNA-mediated, DNA-mediated and CRISPR/Cas-mediated silencing more efficient and specific than previously possible (i.e. with a significantly reduced risk of 'off targeting') to combat pathogens and/or to modulate gene expression processes use in cells.
  • the method according to the invention contains as step (v) the identification of a-sites in the target RNA, wherein nucleic acids of different types ('eNAs') bind to the a-sites and reliably function this target either alone or through an associated endonuclease -change RNA.
  • 'eNAs' nucleic acids of different types
  • RNAs ribonucleic acids
  • DNAs deoxyribonucleic acids
  • RNA-mediated silencing also referred to as RNA interference, RNAi
  • RNAi RNA interference
  • miRNAs m/croRNAs
  • siRNAs small interfering RNAs
  • AGO Argonaute
  • RISC RNA-induced silencing complexes
  • DNA-mediated silencing mediated by various forms of antisense DNA oligonucleotides (ASO), which, inter alia, can activate the RNA-degrading enzyme RNase F1.
  • ASO antisense DNA oligonucleotides
  • RNase F1 RNA-degrading enzyme
  • CRISPR/Cas Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated
  • g/crRNAs guide/CRISPR RNAs associated to a Cas endonuclease.
  • RNAi RNA-mediated silencing
  • RNAi is a cellular mechanism that regulates gene expression post-transcriptionally in eukaryotes (32). In plants, but also in fungi, oomycetes, nematodes and insects, RNAi is also a central component of the immune system (33, 34).
  • RNAi is regulated by partially or completely double-stranded small non-coding RNAs (sRNAs), which are usually between 20 and 30 nucleotides (nt) in length.
  • sRNAs small non-coding RNAs
  • Central regulators at the post-transcriptional level are m/croRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs).
  • miRNAs are coded genomically, are transcribed in the form of precursor molecules and matured by ribonucleases, including Dicer/DCL.
  • siRNAs are processed by Dicer/DCL proteins from double-stranded (ds) RNA elements. These dsRNA elements can be structured regions from genomes or replication products of viroids or RNA viruses, but also from mRNA molecules and other forms of RNA molecules, e.g. non-coding RNAs.
  • miRNAs and siRNAs become active in RISC, the main components of which are AGO proteins. The guide strand of the sRNA is bound by AGO, while the other strand of the sRNA double strand is removed/degraded.
  • the guide strand in the sRNA/AGO/RISC complex hybridizes to regions of the target RNA.
  • these are e.g. partially or fully complementary regions on target mRNAs
  • siRNAs these are fully complementary regions on all types of target RNAs, e.g. genomic RNAs or mRNAs of pathogens from which these siRNAs were originally generated ( so-called 'cognate RNAs').
  • the target RNAs can then be inactivated, e.g.
  • RISC-associated sRNAs can thus be a target-specific inhibition (silencing) of gene expression (34-40).
  • RNAi has been used for the experimental regulation of gene expression at the (pre)mRNA level and to combat pathogens for around two decades.
  • siRNAs with a length of 21 or 22 bp are predominantly used (41); these consist of a completely complementary RNA duplex with two base overhangs at the 3' ends (35, 36).
  • RNAi is also used to combat plant-pathogenic insects, nematodes, oomycetes, fungi or plant-pathogenic plants used.
  • mRNAs of essential proteins of these pathogens are used as targets and the RNAi mechanism of the pathogens is directed against their own mRNAs.
  • RNAi-based approaches can be used to regulate cellular gene expression at the RNA level.
  • mammals in particular, however, they are also used to combat pathogens, including animal and human pathogenic viruses, some of which are already being used in clinical studies (40-43).
  • pathogens including animal and human pathogenic viruses, some of which are already being used in clinical studies (40-43).
  • siRNA-based drug 'patisiran', was approved in humans for use against polyneuropathy in hATTR (hereditary transthyretin-mediated amyloidosis).
  • 'Backbone' changes such as phosphorothioate (PS) or 'peptide nucleic acids' and sugar phosphate modifications such as morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino) influence hydrophobicity, protein association and, in turn, nuclease resistance or hybridization temperature.
  • PS phosphorothioate
  • morpholino/PMO phosphorodiamidate morpholino
  • DNA-mediated silencing This includes methods that artificially and specifically influence the metabolism and/or the expression of target RNAs by using single-stranded, 12-30 nucleotides long, chemically synthesized antisense DNA oligonucleotides (ASO). Unlike miRNAs or siRNAs, which regulate gene expression post-transcriptionally in cellular processes, chemically synthesized 12-30 nt single-stranded DNA oligonucleotides have been used from the outset for the purpose of targeted silencing of RNA molecules.
  • ASO antisense DNA oligonucleotides
  • the active enzyme is RNase H, which is present in the nucleus of mammalian cells and, to a lesser extent, in the cytoplasm.
  • the enzyme is involved in cellular DNA replication and repair; RNase H recognizes the structure of at least five bp DNA/RNA hybrids independently of the sequence (46). On these, it probably acts in a similar way to a DNase (6).
  • the 5'-phosphate/3'-hydroxyl products formed during cleavage are degraded in the cell by exonucleases, with the degradation rate in turn depending on the chemistry of the ASO (see below) but also on the type of target RNA attacked (47 ). Accordingly, ASOs intended to use the degradation mechanism must contain at least five consecutive nts that hybridize to the target, with longer complementary sequences significantly increasing the specificity.
  • the properties of ASO can be significantly influenced by chemical modifications. This concerns, among other things, pharmacokinetics, stability and toxic/inflammatory properties.
  • uptake in defined target cells binding affinity to target RNA and binding affinity to proteins can be modulated (45, 48, 49).
  • Conjugates such as GalNac3 or cholesterol and sugar modifications such as 2'-MOE are in use.
  • bridged nucleic acids such as LNA or cEt BNA are used.
  • base and backbone modifications are used with a similar effect as described above for siRNAs.
  • the type of chemical modification also determines whether an ASO works via steric blocking or degradation. For example, PMOs, which have already been tested in a number of antiviral approaches (50), only cause blockage of the target RNA.
  • So-called ASO gapmers where an RNase H-active region is modified at the 5' and 3' end by nuclease-resistant, chemically modified domains such as LNA or 2'-0, have proven to be particularly effective in therapeutic approaches in humans nucleotides are flanked (48).
  • chemically modified PS-ASOs can enter the cytoplasm of a target cell 'gymnotically', i.e. without an additional carrier, via the hydrophobicity of the phosphorothioate 'backbone'. Since 2016, PS/MOE-modified ASO have been used as 'nusinersen' in a first ASO-based therapy against spinal muscular atrophy. Nusinersen inhibits an aberrant splicing process (48).
  • the CRISPR/Cas system is a key component of the adaptive immune system of bacteria and archaea, specifically targeting phage infection and plasmid DNA uptake.
  • the CRISPR/Cas system is a key component of the adaptive immune system of bacteria and archaea, specifically targeting phage infection and plasmid DNA uptake.
  • catalyzed by various Cas proteins parts of genomic phage DNA or plasmids as so-called protospacers between direct repeats, i.e. identical, repetitive sequences, are integrated into the bacterial genome.
  • Pre-CRISPR RNAs pre-crRNAs
  • crRNAs CRISPR RNAs
  • crRNAs In a third step, mature crRNAs then associate either directly with the processing or other Cas proteins and form interfering complexes, which then, depending on the sequence of the crRNAs, associate with complementary DNA or RNA elements and hydrolyze them endonucleolytically.
  • Cas proteins can be used specifically on DNA or RNA molecules, e.g. at the transcriptional level (51).
  • Casl3a from Leptotrichia shahii LshCasl3a
  • Leptotrichia wadei LwaCasl3a
  • chemically modified g/crRNAs are also used to modulate the binding properties and also the stability of the RNA molecules (52-54).
  • a-sites are therefore identified in the target RNA, with nucleic acids of different types ('eNAs') binding to these a-sites and reliably ('reliable') binding either alone or through an associated endonuclease change the function of this target RNA.
  • 'Reliable' in the sense of this particularly preferred embodiment of the method according to the invention means that the eNAs at the identified a-sites always bring about a corresponding change in the function of the target RNA.
  • the eNAs of different types are preferably selected from siRNAs (e.g. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) miRNAs, antisense DNA oligonucleotides and g/crRNAs, preferably any type of the mentioned eNAs, e.g. B. naturally occurring, synthetic, recombinant or artificially produced eNAs.
  • siRNAs e.g. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs
  • the endonucleases are selected from AGO, RNase H and/or Cas proteins.
  • the particularly preferred reliable change in the function of the target RNA is mediated by RNA, DNA or CRISPR/Cas.
  • a change in the function of the target RNA is understood to mean, for example, the efficient endonucleolysis or inhibition of the translation of the target RNA and thus a silencing (loss of function) of this target RNA.
  • the (reliable) silencing of the target RNA is preferred.
  • the (reliable) silencing of the target RNA is understood, the silencing being selected from RNA, DNA or CRISPR/Cas-mediated silencing.
  • the eNAs sRNAs, antisense DNA oligonucleotides (ASO) or g/crRNAs
  • eNAs sRNAs, antisense DNA oligonucleotides (ASO) or g/crRNAs
  • ASO antisense DNA oligonucleotides
  • g/crRNAs g/crRNAs
  • the eNA is an siRNA.
  • suitable consensus sequences of the guide strand of the siRNA provided according to the invention are selected, for example, from i) UUX 1 X 2 X 3 AX 4 X 5 AX 6 A UX 7 U XgACXgXioU Xu (SEQ ID No. 1) where
  • Xi is selected from G and A;
  • X 2 is selected from C and G;
  • X 3 is selected from C and A;
  • X 4 is selected from C and G;
  • X 5 is selected from A, G and U;
  • Xe is selected from A and U;
  • X 7 is selected from C, G and A;
  • Xg is selected from U, G and A;
  • Xg is selected from U and A;
  • X 10 is selected from U and G;
  • Xu is selected from C and A; and ii) AAAX 12 X 13 AX 14 CAAX 15 AX 16 X 17 X 18 X 19 X 20 UX 21 X 22 A (SEQ ID NO: 2) wherein
  • X 12 is selected from G and U;
  • X 13 is selected from A, C and U; Xi4 is selected from G, A and C;
  • Xis is selected from C, A and G;
  • Xi 6 is selected from A and U;
  • Xi7 is selected from A, U and C;
  • Xis is selected from G, C and A;
  • Xi 9 is selected from U and C;
  • X20 is selected from C and U;
  • X21 is selected from A and U;
  • X22 is selected from U, A and C;
  • Preferred consensus sequences are the sequences UUGCCACAAAAUCUUACUUUC (SEQ ID NO: 3) and AAAGAAGCAACAAAGUCUAUA (SEQ ID NO: 4).
  • the eNA is an sRNA, i.e. any form of siRNAs (e.g. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) or any form of miRNAs and the endonuclease is an AGO protein.
  • siRNAs e.g. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs
  • AGO proteins Argonaute proteins (AGO proteins) are a family of proteins whose representatives are evolutionarily highly conserved.
  • eNAs are particularly suitable for the RNA-mediated silencing of target RNAs, such as for the silencing of RNAs that can be of cellular or pathogenic origin.
  • the eNA is any form of an antisense DNA oligonucleotide (ASO) and the endonuclease is an RNase H.
  • the ribonucleases Fl (from ribonuclease Fhybrid, synonymously RNase Fl) comprise a group of enzymes (ribonucleases ) that degrade RNA in DNA-RNA flybrids. They are divided into two groups, RNase FH I (in bacteria) or RNase FH 1 (in eukaryotes) and RNase FH 11 (in bacteria) or RNase FH2 (in eukaryotes).
  • Type Fl ribonucleases are found in almost all living things and are sequence-unspecific endonucleases that hydrolyze the phosphodiester bond of RNA in duplexes of DNA and RNA, yielding a 3'-hydroxy group and a 5'-phosphate group (6). These eNAs are particularly suitable for the DNA-mediated silencing of target RNAs, such as for the silencing of RNAs that can be of cellular or pathogenic origin.
  • the nucleic acid is any form of a CRISPR RNA or a g/crRNA derived from the CRISPR RNA and the endonuclease is a Cas protein.
  • the DNA or RNA cutting enzyme called Cas (from English CRISPR-associated 'CRISPR-associated') binds a specific RNA sequence. Before or after this RNA sequence there is another RNA sequence that can bind to a target DNA or target RNA with a complementary sequence by base pairing.
  • the g/crRNA serves as a bridge between Cas and the target DNA or target RNA to be cut.
  • the endonuclease Cas is brought into close proximity to the target, whereupon Cas hydrolyses it (51).
  • These eNAs are particularly suitable for the Cas-mediated silencing of target RNAs, e.g. for the silencing of RNAs that can be of cellular or pathogenic origin.
  • Suitable eNAs provided by the invention are selected from the sequences presented in Tables 1, 2 and 3.
  • the invention further relates to the use of the method according to the invention for identifying nucleic acids (eNAs) which direct endonucleases selected from AGO, RNase H and Cas proteins to the a-sites of target RNAs and thus, preferably reliably, the functions of this RNA Influence/change molecules, whereby the target RNAs are inactivated, for example, by endonucleolytic hydrolysis ( slicing/cleavage ) or translation inhibition, resulting in silencing of the target RNA.
  • eNAs nucleic acids
  • the eNAs are preferably selected from any type of siRNAs, any type of miRNAs, any type of antisense DNA oligonucleotides and any type of g/crRNAs. These eNAs are particularly suitable for use in the preferably reliable RNA-mediated, DNA-mediated and/or CRISPR/Cas-mediated silencing of RNAs which can be of cellular but also pathogenic origin.
  • the eNAs can be used in transgenic or transient (non-transforming) form for combating pathogens or for targeted, transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression. They are particularly suitable for use in combating pathogens in plants/crop plants, animals/crop animals and in humans, e.g. B. as virucides, bactericides, fungicides, nematicides and insecticides.
  • the invention relates to a composition comprising at least one eNA which was identified using the method according to the invention.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one eNA which was identified using the method according to the invention and optionally a carrier/adjuvant suitable for administration to plants, nematodes, insects, oomycetes, fungi, animals and humans.
  • composition is preferably a solution which can be administered in direct form, for example as a broth or as an aerosol/spray. This makes it particularly easy to prevent or treat diseases in plants/crop plants as well as in animals and also in humans.
  • the invention provides pharmaceutical or veterinary compositions for parenteral, enteral, intramuscular, mucosal or oral administration, which contain an eNA according to the invention, optionally in combination with customary carriers and/or excipients.
  • the invention relates to pharmaceutical or veterinary compositions which are suitable for the prevention and/or treatment of diseases in animals/livestock and/or in humans.
  • the pharmaceutical or veterinary composition preferably comprises at least one physiologically tolerable carrier, diluent and/or excipient.
  • the eNAs according to the present invention can be contained in a pharmaceutically acceptable carrier, e.g., in a conventional medium such as an aqueous saline medium or a buffer solution as a pharmaceutical composition for injection.
  • a pharmaceutically acceptable carrier e.g., in a conventional medium such as an aqueous saline medium or a buffer solution as a pharmaceutical composition for injection.
  • a medium may also contain conventional pharmaceutical substances such as pharmaceutically acceptable salts for adjusting osmotic pressure, buffers, preservatives and the like.
  • Preferred media include physiological saline and human serum.
  • a particularly preferred medium is PBS-buffered saline.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers are those skilled in the art, for example, from Remington's Practice of Pharmacy, 13th Edition and J. of. Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 52, No. 5, Sept-Oct., pp. 238-311.
  • the eNA according to the invention has one or more chemical modifications, it being possible for the chemical modifications to be selected from 2'-ribose modifications (2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-0-(methoxyethyl) (2'-MOE)), sugar modifications ('locked' (LNA) or unlocked (UNA)), 'backbone' changes such as phosphorothioate (PS) or 'peptide nucleic acids' and sugar phosphate modifications such as morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino).
  • 2'-ribose modifications (2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-0-(methoxyethyl) (2'-MOE)
  • sugar modifications 'locked' (LNA) or unlocked (UNA)
  • 'backbone' changes such as phosphorothioate (PS) or 'peptide nucleic acids' and sugar phosphate modifications such as morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholin
  • FIG. 1A examples of consensus sequences of siRNAs (guide strand) which were determined to be optimal for plant AGOL (left) and AG02 (right).
  • double-stranded RNAs from Tomato bushy stunt virus (TBSV) or Cucumber mosaic virus (CMV) in BYL were first processed into siRNAs by endogenous Dicer/DCLs. Total RNA was isolated from these batches and the viral siRNAs were characterized using RNA-Seq ('DCL assay').
  • RNA-Seq RNA-Seq
  • siRNAs were purified from the complexes and characterized using RNA-Seq ('AGO-IP') (9).
  • RNA-Seq 'AGO-IP'
  • siRNAs could be identified which have a high affinity for AG01 or AG02.
  • Consensus sequences for AGO1 and AG02 were derived from the sequences of the 50 21 nt siRNAs most strongly enriched in the 'AGO-IPs'. Positions at which several nucleotides allow the (almost) maximum activity are marked accordingly by letters one below the other. This was done in a similar way for AGO proteins from other organisms (e.g. fungi and humans).
  • FIG. 1B examples of 'slicer assays' which were carried out with a 21 nt esiRNA and with consensus-optimized 21 nt esiRNAs; left with AG01/RISC, right with AG02/RISC.
  • the 21 nt long variant of the gf698-siRNA specific for GFP mRNA was used as esiRNA (25, 26), and the sequences from FIG. 2A (upper line) as consensus-optimized siRNAs.
  • the plant AGO proteins were generated in BYL using corresponding mRNAs in v/iro translation.
  • the translation reaction was carried out in the presence of the synthetic siRNA duplexes to be tested, so that the desired siRNAs were incorporated into the AGO/RISC.
  • a radioactively labeled target RNA with the appropriate target sequence was then added and incubated.
  • the 21 nt long target sequences were each present in a segment of a GFP mRNA (in anf/sense orientation), so that the surrounding sequence was identical in all cases.
  • Total RNA was isolated from the batches and analyzed for cleavage products by means of denaturing PAGE and autoradiography. The target RNA used and the resulting cleavage products are each marked.
  • the AGO proteins were generated in BYL using corresponding mRNAs in v/iro translation.
  • the translation reaction was performed in the presence of the synthetic siRNA duplex, resulting in incorporation of the siRNA into the AGO/RISC.
  • a radioactively labeled segment of GFP mRNA was then added as target RNA and incubated.
  • Total RNA was isolated from the batches and analyzed for cleavage products by means of denaturing PAGE and autoradiography.
  • the target RNA used and the resulting cleavage products are each marked.
  • the target RNA used and the resulting cleavage products are each marked.
  • Figure 3 shows that a-sites accessible to sRNA/AGO/RISC are also accessible to ASO.
  • A) 'Slicer assays' performed in BYL with a target RNA, an esiRNA and an antisense DNA oligonucleotide (ASO) corresponding in sequence to the guide strand of the esiRNA.
  • ASO antisense DNA oligonucleotide
  • the 21 nt variant of the gf698 siRNA specific for GFP mRNA was used as the esiRNA (25, 26).
  • An in vitro translation reaction was carried out without (left) or with (right) AGO mRNA in the presence of the specified amounts of synthetic siRNA duplex or ASO.
  • a radioactively labeled segment of GFP mRNA was then added as target RNA and incubated.
  • the target RNA used and the resulting cleavage products are each marked. It can be seen that cleavage with ASO is always caused by the RNase H activities contained in the extract, i. H. independent of AGO, while siRNA-mediated cleavage occurs only in the presence of additionally generated AGO. The size of the resulting 5' cleavage product is identical.
  • the siRNAs used here were selected because of their high affinity for AG01 or AG02, determined by 'DCL assay' and 'AGO-IP' (see FIG. 2A).
  • the AGO proteins were generated in BYL using corresponding mRNAs in v/iro translation (left, middle). The translation reaction was performed in the presence of the synthetic siRNA duplexes, resulting in incorporation of the siRNA into the AGO/RISC.
  • the ASO was used under identical conditions, but without the addition of AGO mRNA (right). Then radioactively labeled genomic TBSV RNA was added as target RNA and incubated. Total RNA was isolated from the batches and analyzed for a decrease in the amount of target RNA and the appearance of cleavage products by means of a denaturing agarose gel and autoradiography. The target RNA used and the resulting cleavage products are each marked. It can be seen that on the complex TBSV RNA only the ASOs induce cleavage whose siRNA counterpart can also induce cleavage. The ASO are inactive, whose respective siRNA counterpart is also inactive. In other words, a-sites accessible to sRNA/AGO/RISC are also accessible to ASO/RNaseH. Sites that are not accessible to sRNA/AGO/RISC are also not accessible to ASO/RNase H.
  • Figure 4 shows the results of a 'slicer assay' performed with FleLa S10 cytoplasmic extract (55) with a target RNA and matching siRNA or ASO in the presence (right) and absence (left) of translated human AG02.
  • the 21 nt variant of the gf698 siRNA specific for GFP mRNA was used as the esiRNA (25, 26).
  • An in vitro translation reaction took place without (left) or with (right) AGO mRNA in the presence of synthetic siRNA duplex or ASO. Subsequently, a radioactively marked Added segment of GFP mRNA as target RNA and incubated. Total RNA was isolated from the batches and analyzed for cleavage products by means of denaturing PAGE and autoradiography.
  • RNA used and the resulting cleavage products are each marked. It can be seen that analogous endonucleolytic hydrolysis also takes place in the HeLa extract by the respective sRNA/AGO/RISC or ASO/RNase H complexes. While cleavage with ASO takes place independently of the AGO protein by the RNase H activities contained in the extract, the activity of the siRNA is significantly improved by the amount of AG02 increased by means of in vitro translation.
  • Figure 5 shows the results of a CRISPR/Cas 'cleavage' experiment performed with BYL, Casl3b and TBSV RNA compared to a 'slicer assay' with plant AGO protein.
  • the target sequence of the CRISPR-RNA 200 (crR200) used here overlaps with the target sequences of the esiRNAs 186 and 209 (siR186, siR209).
  • AGO protein and Casl3b from Prevotella sp. P5-125 were generated in BYL using corresponding mRNAs in v/iro translation.
  • the translation reactions were carried out in the presence of the synthetic siRNA duplexes or the crRNA, so that the corresponding nucleic acid/endonuclease complexes were formed.
  • a radioactively labeled region of the TBSV genomic RNA was then added as a target and incubated.
  • Total RNA was isolated from the batches and analyzed for cleavage products by means of denaturing PAGE and autoradiography.
  • the target RNA used and the resulting cleavage products are each marked. It can be seen that in the presence of Casl3b and CRISPR-RNA 200 the viral RNA is cleaved, so the a-sites recognized by the esiRNAs 186 and 209 can also be attacked by crR200/Casl3b.
  • the experimentally determined secondary RNA structure of the genome of the tomato bushy stunt virus (TBSV) (30) was used. This has segments that form functional, far-reaching RNA-RNA interactions.
  • This genomic viral RNA was used as target RNA in an in vitro 'slicer assay' with selected 21 nt siRNAs that showed high affinity to the plant AGO proteins AG01 or AG02.
  • the AGO proteins in BYL were generated by means of in vitro translation.
  • the translation reaction was carried out in the presence of the synthetic siRNA duplexes to be tested, so that the desired siRNAs were incorporated into the AGO/RISC. Then radioactively labeled TBSV genome was added as a target and incubated.
  • Example 2 Determination of consensus sequences of siRNAs improve AGO/RISC activity.
  • RNA-seq analyzes performed during the second step (AGO-IP) of esiRNA/fRNA screens of different target RNAs viral RNAs and different mRNAs
  • siRNAs derived from different AGO proteins were analyzed to be bound.
  • guide-strand consensus sequences were created for the respective AGOs: For each individual position of the sRNA, these reflect the nucleotide variant or nucleotide variants (in the case of several possibilities) for which it was determined that they each made the best contribution to an efficient Binding of the sRNA to the corresponding AGO protein makes ( Figure 1A).
  • a slicer assay was carried out in which a non-optimized siRNA was compared to a consensus-optimized siRNA.
  • the target RNA was adapted in such a way that both siRNAs can hybridize to it with the complete sequence.
  • the effect of the consensus sequence on the activity of the AGO/RISC could be determined independently of the accessibility of the target RNA. It was thus shown that the slicing of the target RNA triggered by these optimized esiRNAs/fRNAs can be increased again compared to the original esiRNA (FIG. 1B).
  • the esiRNA/fRNA screen method has thus been improved in such a way that it is no longer based exclusively on the empirical/experimental determination of efficiently effective esiRNAs and the selection of a 5′ nucleotide adapted to the respective AGO protein.
  • the binding of an esiRNA/fRNA guide strand to the AGO protein used in each case can be increased and the RNA s/Venc/ng activity of the resulting sRNA/AGO/RISC can be specifically improved.
  • Example 3 Proof that AGO/RISC complexes from different organisms, with bound esiRNAs/fRNAs of the same binding sequence, act identically on a target RNA. So far it has been shown that with an esiRNA/fRNA screen method, which is carried out in plant cytoplasmic extracts (BYL), it is possible to experimentally determine siRNAs which, as esiRNAs, are particularly efficient on a target RNA, eg the genomic RNA a plant virus, can act. The affinity to the AGO protein acting in each case was identified as an important factor for the efficiency of a siRNA on a target RNA.
  • BYL plant cytoplasmic extracts
  • the affinity for AGO is determined by the 5' nucleotide of the siRNA (29); on the other hand, as shown here according to the invention, by an optimal sequence (consensus sequence; see above).
  • the accessibility of the target RNA for AGO/RISC was assumed to be a further factor for the efficiency of an siRNA in the RN Ai.
  • a key question that arose in this context was whether regions of a target RNA that are accessible to plant AGO/RISC are similarly accessible to AGO/RISC from other organisms.
  • the AG01 and AG02 proteins from plants were expressed in BYL and analyzed in slicer assays with a Target RNA tested.
  • the siRNAs used each had the identical binding sequence (the sequence that hybridizes completely with the complementary sequence of the target RNA) and a 5' nucleotide that was adapted to the binding priority of the respective AGO: for the plant AGO1 this was 5' U, for the plant AG02 5 ⁇ , for the human AG02 5'U or 5 ⁇ and for the fungal AGO1 5'U.
  • RNA molecules are common to all AGO/RISC as long as they are directed by the same nucleic acid.
  • These can be siRNAs, but also e.g. miRNAs (28), or other types of nucleic acids (see also below).
  • Example 4 Demonstrating that regions of a target RNA that are accessible to sRNA/AGO/RISC are also accessible to ASO/RNase H.
  • Example 5 Proof that sRNA/AGO/RISC and ASO/RNase H complexes from cytoplasmic extracts of plant and human cells act identically on a target RNA when using sRNAs or ASO with an identical binding sequence.
  • esiRNA/fRNA screens were performed in FleLa S10. mRNAs of a human virus were used as target RNAs. The esiRNAs identified in vitro and (modified) ASOs derived from them were then tested in vivo, i.e. by application in a mouse model, for a protective effect against a virus infection. It was shown that mice treated with the esiRNAs and ASO identified in vitro showed significantly improved protection against viral infection compared to corresponding control animals.
  • a-sites that are accessible for AGO/RISC and also for ASO/RNase F1 can be identified in a target RNA.
  • BYL and other cytoplasmic extracts e.g. human FleLa extracts
  • correspondingly accessible areas on target RNAs can be determined in a targeted manner and these can be subjected to either sRNA- or ASO-mediated regulation, e.g. inhibition of gene expression by endonucleolytic degradation.
  • cytoplasmic extracts from cells in which it is possible to reconstitute sRNA/AGO/RISC, can be used according to the invention for the areas accessible to these complexes as well as to ASO/RNase F1, a-sites, on complex folded and with RNA -binding proteins to detect associated target RNAs.
  • Example 6 Proof that regions of a target RNA that are accessible for sRNA/AGO/RISC and ASO/RNase F1 are also accessible for CRISPR/Cas.
  • cytoplasmic extracts from cells in which it is possible to reconstitute sRNA/AGO/RISC can be used according to the invention for the areas accessible to these complexes as well as to ASO/RNase F1 and to CRISPR/Cas, a-sites , to be detected on complex folded target RNAs.
  • the target RNA can then be reliably changed in its function with RNA, DNA or CRIPR/Cas methods, e.g. inactivated by silencing.
  • C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (‚a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellung einer Target-RNA; (ii) esiRNA/ERNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können; (iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase H eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder (iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und (v) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (‚eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Identifizierung von eNAs, die Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-Proteinen, RNase H und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren können und in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Endonukleasen, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern; sowie eNAs und Zusammensetzung enthaltend diese eNAs in der Pathogenbekämpfung.

Description

Zuverlässige Identifikation von Bereichen (, a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen, die zugänglich sind für Nukleinsäuren oder Komplexe von Nukleinsäuren mit Endonukleasen.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(i) Bereitstellung einer Target-RNA;
(ii) esiRNA/fRNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;
(iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase Fl eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder
(iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und
(v) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Identifizierung von eNAs, die
Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-Proteinen, RNase Fl und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren können und in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Endonukleasen, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern; sowie eNAs und Zusammensetzung enthaltend diese eNAs in der Pathogenbekämpfung.
Flintergrund der Erfindung
Genexpression wird zu wesentlichen Anteilen auf der Ebene komplexer Ribonukleinsäuremoleküle (RNAs) reguliert, die entweder im Zuge der Transkription des zellulären Genoms (als prä-mRNAs oder mRNAs) oder im Zuge viroider oder viraler Replikation (als Viroide, virale Genome, virale mRNAs oder virale Antigenome/Replikationsintermediate) generiert werden. Die betreffenden RNAs, im Folgenden auch als , Target-RNAs' bezeichnet, sind entweder selbstreplizierend, wie im Falle von Viroiden, werden repliziert, wie im Falle viraler RNAs, zu maturen RNAs prozessiert, wie im Falle von prä-mRNAs und einigen viralen RNAs, oder sie werden translatiert, um Proteine zu generieren, wie im Falle maturer viraler, prokaryotischer oder eukaryotischer mRNAs und einiger viraler Genome. Target RNAs sind aber auch nicht-kodierende (non-coding) RNAs, die Genexpression modulieren.
Um Einfluss auf die Genexpression zu nehmen, um diese gezielt zu modulieren und/oder ggf. zu inhibieren, sind diverse Nukleinsäure-basierte Technologien entwickelt worden. Dabei werden verschiedene Typen kurzkettiger Nukleinsäuren (NA), im Folgenden auch als dirigierende NA' bezeichnet, über komplementäre Basenpaarung und damit sehr spezifisch an Target-RNAs assoziiert. Bei den dirigierenden NA kann es sich wiederum um Ribonukleinsäuremoleküle wie kleine (small) sRNAs (z.B. small interfering RNAs, siRNAs, oder m/croRNAs, miRNAs) oder auch guide (g) oder CRISPR (er) RNAs aber auch um Desoxyribonukleinsäuren wie z.B. antisense DNA-Oligonukleotide (ASO) handeln. Die dirigierenden NA können bereits über die Bindung (, Hybridisierung') an die Target-RNA diese in ihrer Funktion, z.B. als Translationssubstrat, inhibieren. Meist bilden die dirigierenden NA jedoch einen Komplex mit einer Endonuklease. Diese Endonuklease liegt entweder bereits assoziiert an die dirigierende NA vor und wird dann nach Hybridisierung derselben an die Target-RNA auf dieser aktiv. Alternativ wird, nach der Assoziation der dirigierenden NA an die Target-RNA, eine Endonuklease rekrutiert. Die Funktion der Target-RNAs kann dann über die Nuklease-mediierte Katalyse einer endonukleolytischen Spaltung, inhibiert werden. Man spricht von einem ,silencing' der Target-RNA (1- 6).
Problemstellung. Ein Kernaspekt der Anwendung dirigierender NA, u.a. mit dem Zweck, Endonukleasen wie AGO- Proteine, RNase H oder Cas-Proteine auf eine Target-RNA zu dirigieren ist die Zugänglichkeit der Target-Sequenz an die die dirigierenden NA hybridisieren sollen. So falten sich längere RNA-Moleküle zu komplexen Sekundär- und Tertiärstrukturen, wo Segmente mit benachbarten oder weiter entfernten Segmenten interagieren. Dabei bilden sich , Sterns1, ,stem-loop‘, ,kissing-loop' und andere RNA-RNA-Interaktionen aus (7). Zudem assoziieren an die meisten RNA- Moleküle in der Zelle RNA-bindende Proteine (8). Entsprechend müssen dirigierende NA bzw. NA/Endonukleasekomplexe wie sRNA/AGO in der RNA-Interferenz (RNAi), ASO/RNase H in antisense- Verfahren oder g/crRNA/Cas in CRISPR/Cas-Verfahren mit diesen Strukturen und Proteinen konkurrieren, um an das Target assoziieren zu können (RNAi, Antisense- und CRISPR/Cas-Verfahren werden weiter unten erläutert). Je strukturierter und unzugänglicher eine Target-RNA ist, desto geringer ist entsprechend die Aktivität der NA bzw. der Nukleasen. Umgekehrt, je zugänglicher die Target-RNA ist, umso ausgeprägter der Effekt. Dieser Zusammenhang wurde für siRNA/AGO z.B. durch Gago et al (9) und für ASO z.B. durch Vickers and Crooke (10) nachgewiesen. Dabei wurde auch deutlich, dass auf mehrere Kilobasen umfassenden Target-RNAs nur sehr wenige Bereiche (sites), die im Folgenden als a-Sites (accessible sites - zugängliche Bereiche) bezeichnet werden, gut angreifbar für dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe sind (siehe auch Vorarbeiten).
Bisherige Versuche, a-Sites in komplexen RNA-Molekülen (viralen RNA-Genomen, Viroiden, zellulären oder viralen mRNAs, non-coding RNAs etc.) zuverlässig zu detektieren, um eine möglichst hohe s/Venc/ng-Effizienz zu erreichen, waren nur mäßig erfolgreich. So ist es zwar möglich, die Struktur einer RNA in einem wässrigen Milieu oder auch in der Zelle durch chemische Modifikationen zu bestimmen (11,12). Diese Ansätze sind jedoch sehr limitiert, da sie technisch aufwändig sind und RNA-Strukturen auch nur unter ganz definierten Bedingungen liefern. Ändern sich die Bedingungen - und das ist während der Aktivität einer RNA in der Zelle, allein schon aufgrund der dynamischen Interaktionen RNA-bindender Proteine, ständig der Fall - ist eine experimentelle Strukturbestimmung nicht aussagekräftig. Für kurze Bereiche können RNA-Strukturen unter Verwendung von Algorithmen wie z.B. mfold, sfold oder RNApIfold in silico prognostiziert werden. Ähnliche Ansätze sollen Bereiche aufspüren, die für dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe zugänglich sind, beispielsweise über einen , viral siRNA predictor' (http://crdd.osdd.net/servers/virsirnapred). Allerdings sind diese Programme, ebenso wie Ansätze Bibliotheken (libraries) dirigierender NA einzusetzen, nur bedingt verlässlich (13-20). Die hohe Strukturierung langkettiger Target-RNAs erklärt somit mangelnde silencing Effizienzen bei RNAi-, ASO- und CRISPR/Cas-Ansätzen.
Die Identifizierung von a-Sites auf Target-RNAs ist somit von zentraler Bedeutung für die Verwendung von Methoden, die das Ziel haben, die Funktion(en) komplexer RNA-Moleküle z.B. während der Genexpression oder im Zuge ihrer Replikation über dirigierende NA bzw. Nukleinsäure-dirigierte Endonukleasen zu regulieren und/oder zu inhibieren. Lässt sich die Zugänglichkeit einer Target-RNA exakt und zuverlässig d.h. über fundierte experimentelle Methoden bestimmen, so erlaubt dies einerseits eine effiziente Anwendung von dirigierenden NA wie sRNAs, ASO und g/crRNAs. Zum anderen wird die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die betreffenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe unspezifisch auf anderen nicht-gewünschten RNA-Molekülen aktiv sind. Diese sog. ,off-target Effekte' sind bis dato ein erhebliches Problem beim Einsatz von RNAi, Antisense- und CRISPR/Cas-Verfahren; sie erfolgen z.B. über unvollständige Basenpaarung zwischen dirigierender NA und Target-RNA.
WO 2005042705 A2 beschreibt eine Methode zur Identifizierung, zum Entwerfen und Synthetisieren einzigartiger siRNA Nukleotid-Sequenzen, welches zur Verbesserung der RNAi-Anwendung führt. Dabei erfolgt der Vergleich einer Datenbank von mRNA-Sequenzen aus der Zielspezies mit einer siRNA- Nukleotidsequenz, welche aus 18-25 Nukleotiden besteht, wobei mindestens 11 aufeinanderfolgende Nukleotide komplementär zu der mRNA-Zielsequenz sind. In einer Ausführungsform kann eine miRNA- Sequenz mit einer mRNA-Datenbank verglichen werden.
WO 2019222036 Al beschreibt genetisch modifizierte Proteine der AGO-Familie, welche ein verbessertes silencing erzielen. Durch spezielle Regulationen in Bezug auf die Erzeugung der AGO- Proteine wird deren Effizienz erhöht. In einer Ausführungsform bildet das mutierte AGO-Protein mit dem guide-Strang einer siRNA einen Komplex, welches zu einer Inhibition der Genexpression führt. Von einer erhöhten Affinität wird allerdings nicht gesprochen. Die vorliegende Erfindung zielt jedoch nicht auf die Erzeugung mutierter AGO-Proteine ab. In WO 2019001602 Al werden Methoden für die Identifikation und Produktion von hoch effizienten siRNAs (esiRNAs/£RNAs)in zytoplasmatischen Extrakten von Nicotiana tabacum bereitgestellt. Das System erlaubt die Rekonstitution des antiviralen RNA-s/'/enc/ngs in vitro. Im Besonderen sind in den beschriebenen Extrakten Dicer/DCL Proteine und, wahlweise, AGO-Proteine aktiv. So bereitgestellte esiRNAs/£RNAs finden Anwendung in der Regulation der Genexpression in Zielorganismen, unter anderem in der Verbesserung von Pathogenresistenz.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a- Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs) bereitzustellen, wobei an die a-Sites dirigierende Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierten Endonukleasen binden und verlässlich (,reliable') die Funktion der Target-RNAs verändern.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.
Die Aufgabe der Erfindung wird insbesondere gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen, , a-Sites', in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites dirigierende Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierte Endonukleasen binden und verlässlich (,reliable') die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(i) Bereitstellung einer Target-RNA;
(ii) esiRNA/£RNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit AGO Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;
(iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase Fl eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder
(iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
(v) Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich die Funktion der Target-RNA verändern.
Unter , Target-RNA' gemäß Schritt (i) werden erfindungsgemäß komplexe Ribonukleinsäuremoleküle (RNAs) verstanden, die entweder im Zuge der Transkription eines prokaryotischen oder eukaryotischen zellulären Genoms (als prä-mRNAs oder mRNAs oder non-coding RNAs) oder im Zuge viroider oder viraler Replikation (als Viroide, virale Genome, virale mRNAs oder virale Antigenome/Replikationsintermediate) generiert werden. Die betreffenden RNAs sind entweder selbstreplizierend, wie im Falle von Viroiden, werden repliziert, wie im Falle einiger viraler RNAs, werden zu maturen RNAs prozessiert, wie im Falle von prä-mRNAs und einigen viralen RNAs, oder sie werden translatiert, um Proteine zu generieren, wie im Falle maturer viraler, prokaryotischer oder eukaryotischer mRNAs und einiger viraler Genome. Target RNAs sind aber auch non-coding RNAs, die Genexpression modulieren.
Ein esiRNA/fRNA Screen gemäß Schritt (ii), der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit AGO Proteinen und Teil von RNA-induced silencing complexes (RISC) verlässlich eine Funktionsänderung einer Target-RNA induzieren können, ist aus dem Stand der Technik aus der WO 2019/001602 bekannt. Unter Funktionsänderung wird z.B. effiziente Endonukleolyse oder Inhibition der Translation der Target-RNA und damit z.B. ein silencing (Funktionsverlust) dieser Target-RNA verstanden.
Der esiRNA/fRNA Screen gemäß Schritt (ii) lässt sich wie folgt beschreiben: Ein bis dato etabliertes und im Folgenden beschriebenes Verfahren zielt auf eine zuverlässige RNAi-basierte Funktionsänderung einer Target-RNA. Es findet Anwendung, beispielsweise bei der Bekämpfung von Pathogenen wie pflanzenpathogenen Viren. Die größte Gruppe pflanzenpathogener Viren sind (+)-Strang RNA-Viren, deren Genom aus einem oder mehreren positiv orientierten (mRNA sense) RNA-Molekülen besteht. Das virale Genom agiert entsprechend nach Eintritt in die Zelle als messenger RNA (mRNA), von der virale Proteine translatiert werden. Einige dieser Proteine replizieren dann, gemeinsam mit zellulären Wirtsfaktoren, die virale RNA. Dabei entstehen doppelsträngige (ds) RNAs als Replikationsprodukte, die aus (+) und komplementären (-)RNAs bestehen. Von den (-)RNAs können wiederum mRNAs transkribiert werden, von denen weitere virale Proteine translatiert werden. Die Replikationsprodukte können, ebenso wie doppelsträngige Bereiche des viralen Genoms oder der viralen mRNAs, einen RNA Interferenz-Mechanismus (RNAi) des infizierten Pflanzenwirtes auslösen (siehe oben). Im Zuge dieser RNAi-lmmunantwort werden durch Dicer oder Dicer-like-Proteine (Dicer/DCL) aus dem Genom, aus den Replikationsprodukten und aus den mRNAs des Virus eine Vielzahl kleiner 19-25 nt langer doppelsträngiger siRNAs, ein sog. ,siRNA pool', generiert; dieser besteht im Maximalfall aus allen theoretisch aus diesen Target-RNAs durch Dicer/DCL prozessierbaren siRNAs. Von diesen siRNAs wird ein Strang, der ,guide-Strang', von AGO gebunden. Geleitet durch den guide-Strang assoziiert der siRNA/AGO-Komplex dann als Teil eines RISC mit hoher Priorität an die ,kognaten' viralen RNAs, d.h. den Target-RNAs aus denen die siRNAs ursprünglich entstanden sind. Durch die Assoziation des siRNA/AGO/RISC wird die Funktion der Target-RNAs verändert, z.B. durch AGO-katalysierte Endonukleolyse (Flydrolyse), die zur Inaktivierung (silencing) der Targets führt. Wie in mehreren Studien festgestellt wurde (9, 21-23) ist jedoch nur ein Bruchteil der siRNAs aus einem solchen pool im RNAi-Prozess auf einer viralen Target-RNA, wie z.B. einem viralen Genom oder einer viralen mRNA, aktiv.
Die Gründe für diese Beobachtung wurden im Folgenden adressiert: So wurde einerseits vermutet, dass nur wenige der siRNAs effizient in AGO/RISC inkorporiert werden. Andererseits wurde, wie ausgeführt, angenommen, dass nur wenige a-Sites auf komplexen RNA-Molekülen zugänglich für RNAi sind. In den Vorarbeiten wurde dann am Beispiel des (+)-Strang-RNA-Virus, Tomato bushy stunt virus (TBSV), eine mehrstufige experimentelle Methode in vitro, der sog. ,esiRNA/£RNA screen' etabliert, mit dem es möglich wurde, solche siRNAs, die besonders effizient antiviral aktiv sind und im folgenden esiRNAs oder £RNAs genannt werden, aus einem viralen siRNA pool heraus zu identifizieren (Schuck J., Gursinsky T., Behrens S.-E. (2018). Methode zur gezielten Identifizierung hocheffizienter , small interfering RNAs, £RNAs' zur Anwendung in Pflanzen und anderen Zielorganismen; WO 2019001602 Al).
Die experimentelle Basis für den esiRNA/£RNA screen ist ein cytoplasmatischer Extrakt (BY2-Lysat, BYL), der aus Protoplasten von Suspensionszellen der Pflanze Nicotiana tabacum präpariert wird (24). BYL hat endogene Dicer/DCL-Aktivitäten, und es ist möglich, in diesem Extrakt sRNA/AGO/RISC- Komplexe in vitro zu rekonstituieren (25-28, 9). Der esiRNA/£RNA screen wurde initial für 21 und 22 nt siRNAs und die beiden pflanzlichen AGO-Proteine AGOl und AG02 etabliert; diese Formen von siRNAs und AGO-Proteinvarianten sind bekanntermaßen in die antivirale RNAi-lmmunantwort der Pflanze involviert. Als Indikatoren für eine esiRNA/£RNA dienten dabei zwei Eigenschaften: Eine durch diese RNA auf der betreffenden Target-RNA induzierte effiziente Flydrolyse durch AGOl oder AG02 (,slicing‘ oder deavage') in vitro, sowie die Fähigkeit, Pflanzen, denen diese siRNAs auf verschiedene Weise (z.B. über ,rub in' oder transiente Expression) verabreicht wurde, durch das silencing der viralen RNA gegen eine nachfolgende Virusinfektion zu schützen.
Der esiRNA/£RNA Screen umfasst folgende Schritte:
Im ersten Schritt (,DCL-Assay') wird eine Target-RNA den in den BYL enthaltenen Dicer/DCLs ausgesetzt. Der jeweils aus der Target-RNA durch Dicer/DCL-Aktivität entstehende siRNA pool wird in seiner Gesamtheit durch next generation RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) erfasst.
Im zweiten Schritt (,AGO-IP') werden mit einem ausgewählten AGO und einem in BYL generierten siRNA pool RISC rekonstituiert. Die RISC werden über Immunopräzipitation (IP) angereichert und die AGO-gebundenen siRNAs über RNA-Seq erfasst. So werden die siRNAs eines pools erfasst, die mit hoher Affinität an das jeweils verwendete AGO binden.
Im dritten Schritt (,Slicer-Assay'), der auch in medium-throughput-Format durchgeführt werden kann, werden die in Schritt zwei identifizierten siRNAs schließlich individuell mit den jeweils verwendeten AGOs darauf getestet, ob sie in der Lage sind, eine effiziente endonukleotische Hydrolyse ( ,slicing' oder ,cleavage ') in der kognaten Target-RNA zu induzieren.
Im letzten Schritt werden die in vitro identifizierten esiRNAs schließlich in vivo/in planta hinsichtlich ihres Potenzials getestet, Pflanzen gegen eine Infektion mit dem Virus zu schützen.
Es konnte gezeigt werden, dass es mit dem esiRNA/f RNA screen möglich ist, in vitro, d.h. im ,test tube', über ein empirisch/experimentelles System esiRNAs aus dem siRNA pool einer viralen RNA heraus zu identifizieren, die in der Lage sind, Pflanzen wirksam gegen Infektionen mit dem Virus zu schützen (9, WO 2019001602 Al).
Erfindungsgemäß wurden nun weitere Erkenntnisse gewonnen, aus denen sich wichtige offene Fragen und neue Problemstellungen ergaben.
Es wurde nochmals verdeutlicht, dass die Effizienz einer siRNA maßgeblich von der Bindungsaffinität des guide-Stranges an das AGO-Protein abhängt. Diese Affinität wird zum einen bestimmt durch das 5'-Nukleotid der RNA; diese Tatsache war bereits bekannt: So binden z.B. siRNAs mit einem 5'Uridin präferenziell an das pflanzliche AGOl und siRNAs mit einem 5'Adenosin präferenziell an das pflanzliche AG02 (29, 26, 9). Darüber hinaus wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass die Affinität einer sRNA an ein AGO-Protein durch weitere, bisher unbekannte Bindungsdeterminanten in der Sequenz der sRNA bestimmt wird.
Die Effizienz einer siRNA hängt, wie erwartet, zudem von der Zugänglichkeit der Target-RNA ab (siehe oben): So konnten zugängliche Bereiche in der TBSV-RNA identifiziert werden (26, 9). Interessanterweise ergaben sich dabei zu einer experimentell bestimmten Sekundärstruktur des TBSV-Genoms (30) keine eindeutigen Korrelationen: So waren Bereiche der RNA, die laut Sekundärstruktur als eher zugänglich für RNAi angenommen wurden, dies de facto (d.h. in in vitro und in planta Tests) nur in sehr wenigen Fällen. Dagegen erwiesen sich andere Bereiche, die laut experimenteller Struktur nicht zugänglich sein sollten, als spaltbar durch AGOl- oder AG02/RISC . Dieses Ergebnis bestätigte die in der Problemstellung gemachte Aussage, dass RNA-Strukturbestimmungen keine verlässlichen Auskünfte zu a-Sites einer Target-RNA geben. Mit dem esiRNA/f RNA screen Verfahren wurde somit eine Methode etabliert, die empirisch siRNAs identifiziert, die, wahrscheinlich über ihre volle Länge an derartige a-Sites hybridisieren und den endonukleolytischen oder translationsinhibierenden AGO/RISC dorthin dirigieren können.
Die Effizienz esiRNA-induzierter ,cleavages' der jeweiligen Target-RNAs in dem in vitro System korreliert erstaunlich exakt mit einem antiviralen Schutz, den man über Applikation ebendieser esiRNAs in der Pflanze erreichen kann (9, WO 2019001602 Al). Offene Fragen/zu lösende Probleme.
(a) Die erste offene Frage/das erste zu lösende Problem betrifft die Bindungsdeterminanten von sRNAs, die neben dem 5'-Nukleotid die Affinität der Bindung eines guide-Stranges an ein AGO-Protein bestimmen. Da die Affinität einer sRNA an AGO/RISC ganz wesentlich auch dessen Aktivität bestimmt (s.o.), ist die Kenntnis aller Bindungsdeterminanten von großer Bedeutung für die Ermittlung von sRNAs, die effizient und verlässlich im RNAi- Prozess agieren. Die Aufgabe war entsprechend, die Bindungsdeterminanten einer sRNA, die für eine optimale Assoziation an AGO-Proteine notwendig sind, vollständig zu definieren.
(b) Das zweite zu lösende Problem betrifft die Anwendbarkeit des esiRNA/fRNA screen Verfahrens. Bislang wurde das Verfahren, wie ausgeführt, experimentell/empirisch mit 21 und 22 nt siRNAs und den pflanzlichen AGOl- und AG02/RISC angewendet. Dabei wurden esiRNAs/f RNAs identifiziert, die, entweder in pflanzlichen AGOl/RISC oder AG02/RISC an verschiedene Stellen einer komplexen viralen RNA hybridisieren (Figur 9). Für eine breitere Anwendung war es jedoch wichtig, von einer empirischen zu einer rationalen Nutzung zu kommen. Im Vordergrund stand dabei die Flypothese, dass die in einer komplex gefalteten Target-RNA enthaltenen a-Sites möglicherweise zugänglich für jedwede Art von dirigierenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexen sind. Entsprechend war die Aufgabe, das esiRNA/fRNA screen Verfahren so zu erweitern und zu optimieren, dass es möglich ist, in komplexen RNA-Moleküle jeder Art a-Sites zu identifizieren, die universell, d.h. für alle Arten von dirigierenden NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe zugänglich sind. Somit sollte es möglich sein, auch ohne die Struktur einer komplexen RNAs genau zu kennen, zuverlässig die Bereiche dieser RNAs zu identifizieren, die für eine Funktionsänderung oder ein silencing jedweder Form genutzt werden können.
Diese Aufgaben wurden erfindungsgemäß wie folgt gelöst:
(a) Verbesserungen der Bindungsaffinität von sRNAs an AGO. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass die Bindungsaffinität einer siRNA an ein AGO-Protein nicht, wie bisher angenommen, allein durch die Art des 5'-Nukleotids (29), sondern signifikant auch durch die übrige Sequenz der siRNA bestimmt wird. So konnten über eine statistisch relevante Anzahl von esiRNA/fRNA screen Verfahren Konsensussequenzen von guide-Strängen von sRNAs ermittelt werden, die mit hoher Affinität an ein bestimmtes AGO-Protein binden: So wurden Konsensussequenzen von siRNA guide-Strängen ermittelt, die mit hoher Affinität an pflanzliche AGO-Proteine binden. Ebenso wurden Konsensussequenzen von siRNAs ermittelt, die mit hoher Affinität an pilzliche AGO-Proteine binden. Ebenso wurden Konsensussequenzen von siRNAs ermittelt, die mit hoher Affinität an AGO-Proteine von Säugern binden. Durch gezielte Anpassung der Sequenz eines guide-Stranges an die jeweilige, erfindungsmäßige Konsensussequenz kann somit die Affinität von sRNAs an die betreffenden AGO-Proteine gezielt erhöht und entsprechend auch die Aktivität der betreffenden AGO/RISC im RNA-vermittelten silencing verbessert werden (Figur 2).
Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen erweiterten und verbesserten Schritt (ii), mit dem es möglich ist, über Anpassung der Sequenzen identifizierter esiRNAs/fRNAs oder anderer sRNAs (wie z.B. miRNAs) an die ermittelten Konsensussequenzen, deren Aktivität in AGO/RISC, z.B. in RNA-vermittelten silencing Verfahren zu verbessern.
(b) Weiterentwicklung des esiRNA screen Verfahrens zu einem universell einsetzbaren ,eNA- screen' Verfahren. In den Vorarbeiten war deutlich geworden, dass die Aktivitäten von esiRNA/fRNAs auf einer Target-RNA in vitro und in vivo (d.h. im spezifischen Fall in der Pflanze) in sehr guter Übereinstimmung korrelieren (s.o.). Aus dieser Beobachtung wurde entsprechend abgeleitet, dass das Milieu in den in vitro verwendeten cytoplasmatischen Extrakten so beschaffen sein muss, dass sich komplexe RNA-Moleküle, u.a. mit den dort vorhandenen RNA-bindenden Proteinen, in ganz ähnlicher Weise wie in der intakten Zelle oder dem intakten Organismus falten. Diese Vorstellung wird durch frühere Studien gestützt, in denen gezeigt worden war, dass sich in BYL auch virale RNA-Replikation rekonstituieren lässt. Ähnlich wie beim RNAi-Prozess kann virale Replikation nur dann ablaufen, wenn sich die Faltung der viralen RNA optimal ausbilden kann (24,31).
Das Postulat wurde im Folgenden bestätigt, und darauf basierend wurde das esiRNA/fRNA screen Verfahren erfindungsmäßig so weiterentwickelt, dass es nun möglich ist, a-Sites in komplexen RNA-Molekülen zu identifizieren, die für verschiedene dirigierende NA bzw. Nukleinsäure/Endonukleasekomplexe zugänglich sind (Figuren 3-6).
Erfindungsgemäß wurde dabei folgendes herausgefunden:
Passt man die Sequenz des guide-Strangs einer sRNA über das 5'-Nukleotid und/oder über die Konsensussequenz (s.o.) an die jeweiligen Bindungspräferenzen von AGO Proteinen verschiedener Spezies an, so agieren die resultierenden sRNA/AGO/RISC auf einer komplexen Target-RNA exakt identisch. Gezeigt wurde dies in in vitro Slicer Assays. Dabei wurden AGO/RISC mit AGO-Proteinen aus Spezies dreier verschiedener Reiche der Eukarya Domäne, nämlich AGO aus Plantae, AGO aus Fungi und AGO aus Mammalia in BYL rekonstituiert. Die verschiedenen AGO/RISC wurden dabei mit der gleichen, jeweils angepassten sRNA (siehe oben) rekonstituiert. Bei dieser sRNA handelte es sich um eine esiRNA/fRNA, die entsprechend an eine a-Site einer Target- RNAs binden kann. Bei Tests auf eben dieser Target-RNA wurde mit allen AGO/RISC ein identisches slicing/cleavage (Hydrolyse) der Target-RNA beobachtet (Figur 3). Dieser unerwartete Befund impliziert, dass sRNAs, die, assoziiert an einen bestimmten AGO/RISC (z.B. aus Pflanze) auf einer Target-RNA ein slicing/cleavage oder eine Inhibition der Translation induzieren, dies auf der gleichen Target-RNA in gleicher Weise auch in einem anderen, d.h. aus einer völlig anderen Spezies stammenden AGO/RISC (z.B. aus Pilz) tun (Figur 3). Damit wurde demonstriert, dass a-Sites komplexer RNA-Moleküle universell für AGO/RISC jedweder Natur zugänglich sind, sofern diese AGO/RISC eine sRNA gebunden haben, die an diese a-site hybridisieren kann.
Die oben beschriebenen Befunde wurden sowohl mit den pflanzlichen, cytoplasmatischen BYL-Extrakten als auch mit cytoplasmatischen Extrakten aus humanen Zellen (HeLa S10) erhalten.
Erfindungsgemäß wurde dies gezeigt für Target-RNAs verschiedener Natur, also z.B. genomische RNA aus Viren sowie mRNAs verschiedener Organismen die aus Viren, Bakterien, Pflanzen, Pilzen, Oomyceten, Tieren wie z.B. Nematoden, Arthropoden und höheren Tieren wie z.B. Säugetieren, oder dem Menschen stammt.
Somit wurde erfindungsmäßig gezeigt, dass sRNA/AGO/RISC verschiedener Spezies, bei inkorporierter sRNA mit identischer oder sehr ähnlicher Bindesequenz auf der gleichen Target- RNA identisch agieren und dass dies gleichermaßen der Fall ist in cytoplasmatischen Extrakten aus Pflanze und Mensch. Damit konnte geschlussfolgert werden, dass sich in den cytoplasmatischen Extrakten verschiedener Zelltypen komplexe RNA-Moleküle offenbar ähnlich falten und dass a-Sites dieser RNA-Moleküle entsprechend jeweils gleichermaßen ausgebildet werden. Eine a-Site ist somit für AGO/RISC verschiedenster Herkunft gleichermaßen zugänglich, sofern diese eine sRNA inkorporiert haben, die an diese a-Site hybridisieren kann.
Aus diesen Erkenntnissen wurde weiter postuliert, dass es analog möglich sein sollte, an die a- Sites komplexer RNA-Moleküle, die sich unter den in vitro Bedingungen offensichtlich sehr reproduzierbar bilden, auch andere Endonukleasen wie RNase H oder Cas zu dirigieren. Die a- Sites sollten damit universell, d.h. nicht nur für RNAi, sondern auch für DNA-vermitteltes und CRISPR/Cas-vermitteltes silencing identifizierbar und nutzbar gemacht werden können.
Dies konnte erfindungsgemäß demonstriert werden: Durch Verwendung von ASO oder g/crRNAs, die in ihrer Sequenz an zuvor identifizierte esiRNAs/fRNAs angelehnt wurden, konnten in der Tat entweder RNase H oder Cas an eine entsprechende Target- RNA geleitet und auf dieser aktiv werden (Figuren 4 und 6).
Die oben beschriebenen Befunde wurden wiederum sowohl mit den pflanzlichen, cytoplasmatischen BYL-Extrakten als auch mit cytoplasmatischen Extrakten aus humanen Zellen (FleLa S10) erhalten (Figur 5).
Bereiche, a-Sites, einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind entsprechend auch für ASO/RNase H sowie für g/crRNA/Cas zugänglich. Erfindungsgemäß wird somit ein Grundprinzip offenbart, das zeigt, dass dirigierende NA wie sRNAs, ASO und g/crRNAs bzw. die davon abgeleiteten Nukleinsäure/Proteinkomplexe sRNA/AGO/RISC, ASO/RNase H und g/crRNA/Cas nach analogen Prinzipien an zugängliche a-Sites einer komplexen Target-RNA assoziieren und dort zuverlässig wirksam werden.
Erfindungsgemäß kann das esiRNA screen Verfahren somit erweitert, als ,eNA-screen' Verfahren (eNA steht dabei für effektive dirigierende Nukleinsäure) eingesetzt werden. So können nun, z.B. über screening mit sRNA/AGO/RISC, Bereiche in einer komplexen RNA identifiziert werden, auf denen bei Nutzung ähnlicher oder identischer Sequenzen der ASO oder g/crRNAs auch ASO/RNase H und g/crRNA/Cas aktiv sind (siehe Anwendungsbeispiele). Dies wird insbesondere bei der Verwendung viraler Target-RNAs deutlich: So kann virale Replikation in der Pflanze sowohl durch siRNAs gehemmt werden, die an a-Sites der viralen RNA bindet, als auch durch ASO oder g/crRNAs gleicher oder angelehnter Sequenz (siehe Figuren 4 und 6 sowie Anwendungsbeispiele).
Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (iii) einen sich an Schritt (ii) anschließenden Test mit von den in Schritt (ii) identifizierten esiRNAs/f RNAs abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase Fl eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
Zudem umfasst das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (iv) einen an Schritte (ii) oder (iii) anschließenden Test mit von den in Schritten (ii) oder (iii) identifizierten esiRNAs/fRNAs oder ASO abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können.
Somit werden a-Sites in dieser Target-RNA identifiziert, an die dirigierende Nukleinsäuren verschiedenen Typs (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich die Funktion (z.B. s.o.) dieser Target-RNA verändern können.
Basierend auf den genannten Beobachtungen werden somit erfindungsgemäß experimentelle Systeme bereitgestellt, mit denen es zuverlässig möglich ist, in komplexen Target-RNAs Bereiche, a- Sites, zu detektieren, die für Endonuklease-dirigierende Nukleinsäuren wie z.B. siRNAs, miRNAs, ASO und g/crRNA zugänglich sind. Die erhaltene Information kann dahingehend genutzt werden, um RNA- vermitteltes, DNA-vermitteltes und CRISPR/Cas-vermitteltes silencing effizienter und spezifischer als bisher möglich (d.h. bei deutlich reduzierter Gefahr eines ,off targeting') zur Pathogenbekämpfung und/oder zur Modulation von Genexpressionsprozessen in Zellen zu nutzen.
Entsprechend enthält das erfindungsgemäße Verfahren als Schritt (v) die Identifizierung von a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease zuverlässig die Funktion dieser Target-RNA verändern.
Wie oben erwähnt, stehen drei wichtige Technologien zur Verfügung, in denen Nukleinsäuren, also Ribonukleinsäuren (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs) als Effektoren, d.h. dirigierende NA, für Funktionsänderungen von komplexen Target-RNAs wie z.B. für ein silencing genutzt werden:
(i) RNA-vermitteltes silencing (auch bezeichnet als RNA-Interferenz, RNAi), vermittelt, u.a. durch m/croRNAs (miRNAs) oder small interfering RNAs (siRNAs), die, assoziiert an Argonaute (AGO) Endonukleasen, in RNA-induced silencing complexes (RISC) aktiv sind.
(ii) DNA-vermitteltes silencing, vermittelt durch verschiedene Formen von antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO), die, unter anderem, das RNA-degradierende Enzym RNase Fl aktivieren können. (iii) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated (Cas)- mediierte Regulation (CRISPR/Cas), die vermittelt wird über guide/CRISPR RNAs (g/crRNAs), die an eine Cas-Endonuklease assoziiert sind.
Die drei genannten Nukleasen AGO, RNase H und Cas gehen vermutlich auf einen RNase H-ähnlichen Vorläufer zurück und agieren in ähnlicher Weise endonukeolytisch (6).
RNA-vermitteltes silencing, RNAi. RNAi ist ein zellulärer Mechanismus, der in Eukaryonten die Genexpression post-transkriptionell reguliert (32) In Pflanzen, aber auch Pilzen, Oomyzeten, Nematoden und Insekten ist RNAi zudem eine zentrale Komponente der Immunabwehr (33, 34). RNAi wird durch teilweise oder komplett doppelsträngige small non-coding RNAs (sRNAs), die i.d.R. Längen zwischen 20 und 30 Nukleotiden (nt) aufweisen, reguliert. Zentrale Regulatoren auf post- transkriptioneller Ebene sind m/croRNAs (miRNAs) und small interfering RNAs (siRNAs). miRNAs sind genomisch kodiert, werden in Form von Vorläufermolekülen transkribiert und durch Ribonukleasen, u.a. Dicer/DCL, maturiert. siRNAs werden von Dicer/DCL Proteinen aus doppelsträngigen (ds) RNA- Elementen prozessiert. Diese dsRNA-Elemente können strukturierte Bereiche aus Genomen oder Replikationsprodukte von Viroiden oder RNA-Viren sein, aber auch aus mRNA-Molekülen und anderen Formen von RNA-Molekülen, z.B. non-coding RNAs, stammen. Aktiv werden miRNAs und siRNAs in RISC, deren Flauptkomponente AGO Proteine sind. Dabei wird der guide-Strang der sRNA durch AGO gebunden, während der andere Strang des sRNA-Doppelstranges entfernt/abgebaut wird. Der guide- Strang im sRNA/AGO/RISC Komplex hybridisiert an Bereiche der Target-RNA. Im Falle von miRNAs sind dies z.B. teil- oder vollkomplementäre Bereiche auf Target-mRNAs, im Falle von siRNAs sind dies vollkomplementäre Bereiche auf allen Arten von Target-RNAs, so z.B. genomischen RNAs oder mRNAs von Pathogenen, aus denen diese siRNAs ursprünglich generiert wurden (sog. ,kognate RNAs'). Die Target-RNAs können dann inaktiviert werden, z.B. durch Inhibition der Translation oder durch endonukleolytische Flydrolyse ( slicing/cleavage ), die durch AGO katalysiert wird, teilweise mit nachfolgendem Abbau der Spalt-(c/eavage)-Produkte durch Exonukleasen. Ergebnis der Aktivität von RISC-assoziierten sRNAs kann somit eine Target-spezifische Hemmung (silencing) der Genexpression sein (34-40).
RNAi wird seit ca. zwei Dekaden zur experimentellen Regulation der Genexpression auf (prä)mRNA- Ebene sowie zur Bekämpfung von Pathogenen eingesetzt. Dabei werden vorwiegend 21 oder 22 bp lange siRNAs verwendet (41); diese bestehen aus einem komplett komplementären RNA-Duplex mit je zwei Basen Überhängen an den 3'-Enden (35, 36). So gibt es in der Pflanze sowohl transgene, als auch nicht-transgene (, transiente') RNAi-Ansätze, die gegen Virusinfektionen gerichtet sind. RNAi wird zudem zur Bekämpfung pflanzenpathogener Insekten, Nematoden, Oomyceten, Pilze oder pflanzenpathogener Pflanzen verwendet. Hierbei werden z.B. mRNAs essentieller Proteine dieser Pathogene als Targets verwendet und der RNAi-Mechanismus der Pathogene gegen die eigenen mRNAs gelenkt. In praktisch allen eukaryotischen Organismen, inklusive Mammalia (Säugern), können RNAi-basierte Ansätze zur gezielten Regulation der zellulären Genexpression auf RNA-Ebene eingesetzt werden. Speziell in Säugern werden sie aber auch zur Bekämpfung von Pathogenen, u.a. tier- und humanpathogener Viren, eingesetzt, zum Teil bereits in klinischen Studien (40-43). 2018 wurde im Menschen das erste siRNA-basierte Medikament, ,patisiran', zum Einsatz gegen Polyneuropathie in hATTR (hereditary transthyretin-mediated amyloidosis) zugelassen.
Im Verlauf der vergangenen Jahre wurde die Technologie erheblich verbessert. Entscheidende Triebfedern waren und sind dabei chemische Modifikationen der siRNAs: So konnten z.B. durch 2'- Ribosemodifikationen (2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-0-(methoxyethyl) (2'-MOE)) Verringerungen der Immunogenität, Erhöhungen der Resistenz gegenüber Endo- und Exonukleasen sowie Erhöhungen der Schmelztemperatur des siRNA/Target-RNA-Hybrids erreicht werden. Andere Zuckermodifikationen (,locked' (LNA) oder unlocked, (UNA)) erhöhen oder erniedrigen die Bindungsaffinität der siRNA zur Target-RNA. ,Backbone'-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder , peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino) beeinflussen Hydrophobizität, Proteinassoziation und wiederum Nukleaseresistenz bzw. Hybridisierungstemperatur. Da das Einbringen von siRNAs in Zellen bzw. Zielorgane für viele Anwendungen noch schwierig ist, zielen Modifikationen und Formulierungen auch darauf, die negativ geladenen NA spezifisch zu den Zielzellen und, nach Endozytose, durch die Membran an den Wirkungsort im Cytoplasma zu bringen (42, 44).
DNA-vermitteltes silencing. Hierunter fallen Verfahren, die über die Verwendung von einzelsträngigen, 12-30 Nukleotide langen, chemisch synthetisierten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) den Metabolismus und/oder die Expression von Target-RNAs künstlich und gezielt beeinflussen. Anders als miRNAs oder siRNAs, die in zellulären Prozessen die Genexpression post-transkriptionell regulieren, wurden chemisch synthetisierte 12-30 nt lange einzelsträngige DNA-Oligonukleotide von Anbeginn zum Zweck des gezielten silencing von RNA-Molekülen eingesetzt. Über die Hybridisierung eines ASO an die komplementäre Sequenz einer Target-RNA kann deren Funktion auf unterschiedliche Weise beeinflusst werden: So wird im steric blocking mechanismus allein über die Bindung des ASO an die Target-RNA deren Translation, die Bindung eines regulatorischen Proteins und/oder deren Replikation inhibiert. Im degradation pathway erfolgt über die Bindung des ASO an die Target-RNA die Rekrutierung des Enzyms RNase H, das das Target dann endonukleolytisch am RNA/DNA-Hybrid hydrolysiert. So kann z.B. über die Bindung von ASO an mRNAs deren Translation, bei Bindung an virale Genome deren Translation und/oder Replikation unterbunden werden (45). In experimentellen und therapeutischen Indikationen zielen Anwendungen von ASO überwiegend darauf, Target-RNAs durch den degradation mechanism abzubauen (45). Aktives Enzym ist dabei RNase H, das in Säugerzellen im Kern und, in geringerer Quantität, im Cytoplasma präsent ist. Das Enzym ist in die zelluläre DNA-Replikation und -Reparatur involviert; so erkennt RNase H sequenzunabhängig die Struktur von mindestens fünf bp-umfassenden DNA/RNA-Hybriden (46). Auf diesen agiert es vermutlich ähnlich wie eine DNase (6). Die bei der Spaltung entstehenden 5'-Phosphat/3'-Hydroxyl- Produkte werden in der Zelle durch Exonukleasen abgebaut, wobei die Abbaurate wiederum von der Chemie des ASO (siehe unten), aber auch der Art der angegriffenen Target-RNA abhängt (47). ASO, die den degradation mechanism nutzen sollen, müssen entsprechend mindestens fünf aufeinanderfolgende nt enthalten, die an das Target hybridisieren, wobei längere komplementäre Sequenzen die Spezifität deutlich erhöhen.
Wie bei siRNAs können auch die Eigenschaften von ASO signifikant über chemische Modifikationen beeinflusst werden. Dies betrifft u.a. Pharmakokinetik, Stabilität und toxisch/entzündungsfördernde Eigenschaften. Zudem kann die Aufnahme in definierte Zielzellen, die Bindungsaffinität zur Target-RNA und die Bindungsaffinität zu Proteinen moduliert werden (45, 48, 49). So sind Konjugate wie z.B. GalNac3 oder Cholesterol sowie Zuckermodifikationen wie 2'-MOE in der Verwendung. Zudem werden bridged Nukleinsäuren wie LNA oder cEt BNA eingesetzt. Schließlich werden auch Basen- und backbone Modifikationen mit ähnlicher Wirkung verwendet, wie sie oben für siRNAs beschrieben sind. Die Art der chemischen Modifikation bestimmt auch, ob ein ASO über steric blocking oder degradation arbeitet. PMO, die bereits in einer Reihe von antiviralen Ansätzen getestet wurden (50), verursachen beispielsweise ausschließlich ein blockage der Target-RNA.
Als besonders wirksam in Therapieansätzen im Menschen haben sich sog. ASO gapmers erwiesen, wo ein RNase H-aktiver Bereich jeweils am 5'- und 3'-Ende durch Nuklease-resistente, chemisch modifizierte Domänen wie z.B. LNA oder 2'-0-modifizierte Nukleotide flankiert werden (48). Chemisch modifizierte PS-ASOs können nach Endozytose ,gymnotisch', d.h. auch ohne zusätzlichen Trägerstoff über die Hydrophobizität des Phosphorothioat , backbone' durch die Membran in das Cytoplasma einer Zielzelle gelangen. Seit 2016 werden PS/MOE-modifizierte ASO als ,nusinersen' in einer ersten ASO- basierten Therapie gegen spinale Muskelatrophie eingesetzt. Nusinersen inhibiert dabei einen aberranten Spleißprozess (48).
CRISPR/Cas-vermitteltes silencing. Das CRISPR/Cas-System ist eine zentrale Komponente des adaptiven Immunsystems von Bakterien und Archaeen, das insbesondere gegen Infektionen von Phagen und die Aufnahme von Plasmid-DNA gerichtet ist. So werden, katalysiert durch verschiedene Cas-Proteine, Teile von genomischer Phagen-DNA oder Plasmiden als sog. Protospacer zwischen direct repeats, also identische, sich wiederholende Sequenzen, in das Bakteriengenom integriert. Von diesem DNA-Abschnitt aus werden pre-CRISPR-RNAs (pre-crRNAs) transkribiert und diese durch weitere Cas- Proteine zu CRISPR-RNAs (crRNAs) prozessiert; bei verschiedenen Mikrobenarten existieren hier drei sehr unterschiedliche Mechanismen der Prozessierung. Mature crRNAs assoziieren dann in einem dritten Schritt entweder direkt mit den prozessierenden oder anderen Cas-Proteinen und bilden interfering complexes, die dann, in Abhängigkeit der Sequenz der crRNAs, an komplementäre DNA- oder RNA-Elemente assoziieren und diese endonukleolytisch hydrolysieren können. Über gezielte Konstruktionen von crRNAs in Form sog. guide RNAs (g/crRNAs), lassen sich Cas-Proteine gezielt auf DNA- oder RNA-Molekülen einsetzen, z.B. zum Zwecke endonukleolytischer Hydrolysen, um so gezielt die Genexpression auf transkriptioneller wie auch auf post-transkriptioneller Ebene zu beeinflussen (51). Für das silencing von RNA-Molekülen wurden so beispielsweise Casl3a aus Leptotrichia shahii (LshCasl3a) oder Leptotrichia wadei (LwaCasl3a) eruiert. Ähnlich wie bei siRNAs und ASO werden auch g/crRNAs chemisch modifiziert eingesetzt, um die Bindungseigenschaften und auch die Stabilität der RNA-Moleküle zu modulieren (52-54).
Es ist ein besonderer Vorteil der Erfindung, dass es nunmehr möglich ist, a-Sites in unterschiedlichen komplexen Target-RNAs zu identifizieren, wobei an diese a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich (,reliable') die Funktion dieser Target-RNA verändern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden deshalb a-Sites in der Target-RNA identifiziert, wobei an diese a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease verlässlich (,reliable') die Funktion dieser Target-RNA verändern. , Verlässlich' im Sinne dieser besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet, dass die eNAs an den identifizierten a-Sites stets eine entsprechende Funktionsänderung der Target-RNA bewirken.
Die eNAs verschiedenen Typus sind vorzugsweise ausgewählt aus siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) miRNAs, antisense DNA-Oligonukleotiden und g/crRNAs, vorzugsweise jedwede Art der genannten eNAs, wie z. B. natürlich vorkommende, synthetische, rekombinante oder artifiziell erzeugte eNAs.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Endonukleasen ausgewählt aus AGO-, RNase H und/oder Cas-Proteinen. Damit im Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass die, besonders bevorzugt verlässliche Veränderung der Funktion der Target-RNA durch RNA, DNA oder CRISPR/Cas vermittelt wird. Wie oben erwähnt, wird unter Funktionsänderung der Target-RNA z.B. die effiziente Endonukleolyse oder Inhibition der Translation der Target-RNA und damit ein silencing (Funktionsverlust) dieser Target-RNA verstanden. Bevorzugt ist erfindungsgemäß das (verlässliche) silencing der Target-RNA. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das (verlässliche) silencing der Target-RNA verstanden, wobei das silencing ausgewählt ist aus RNA, DNA oder CRISPR/Cas-vermitteltem silencing.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die in den Schritten (ii), (iii) und/oder (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten eNAs (sRNAs, antisense DNA-Oligonukleotide (ASO) bzw. g/crRNAs) eine Konsensussequenz aufweisen. Dies hat den Vorteil, dass die entsprechende Endonuklease effektiver arbeitet, z.B. indem die Konsensussequenz die Affinität der eNA an diese Endonuklease erhöht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die eNA eine siRNA. Beispiele für geeignete Konsensussequenzen des guide-Strangs der siRNA, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, sind ausgewählt, z.B., aus i) U U X1X2X3 AX4X5 AX6 A UX7 U XgACXgXioU Xu (SEQ ID Nr. 1) wobei
Xi ausgewählt ist aus G und A;
X2 ausgewählt ist aus C und G;
X3 ausgewählt ist aus C und A;
X4 ausgewählt ist aus C und G;
X5 ausgewählt ist aus A, G und U;
Xe ausgewählt ist aus A und U;
X7 ausgewählt ist aus C, G und A;
Xg ausgewählt ist aus U, G und A;
Xg ausgewählt ist aus U und A;
X10 ausgewählt ist aus U und G; und
Xu ausgewählt ist aus C und A; und ii) AAAX12X13AX14CAAX15AX16X17X18X19X20UX21X22A (SEQ ID Nr.: 2) wobei
X12 ausgewählt ist aus G und U;
X13 ausgewählt ist aus A, C und U; Xi4 ausgewählt ist aus G, A und C;
Xis ausgewählt ist aus C, A und G;
Xi6 ausgewählt ist aus A und U;
Xi7 ausgewählt ist aus A, U und C;
Xis ausgewählt ist aus G, C und A;
Xi9 ausgewählt ist aus U und C;
X20 ausgewählt ist aus C und U;
X21 ausgewählt ist aus A und U; und
X22 ausgewählt ist aus U, A und C;
Bevorzugte Konsensussequenzen sind die Sequenzen UUGCCACAAAAUCUUACUUUC (SEQ ID Nr.: 3) und AAAGAAGCAACAAAGUCUAUA (SEQ ID Nr: 4).
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die eNA eine sRNA, d.h. jedwede Form von siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) oder jedwede Form von miRNAs und die Endonuklease ist ein AGO-Protein. Argonaute Proteine (AGO-Proteinen) sind eine Familie von Proteinen, deren Vertreter evolutionär stark konserviert sind. Sie kommen in fast allen Organismen vor, wo sie eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Regulation der Genexpression spielen. Vertreter der AGO-Familie sind am transkriptioneilen gen e-silencing (TGS) und am posttranskriptioneilen gene- silencing (PTGS) beteiligt (37). Die eNAs eignen sich besonders für das RNA-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die eNA jedwede Form eines antisense DNA-Oligonukleotids (ASO) und die Endonuklease ist eine RNase H. Die Ribonukleasen Fl (von Ribonuklease FHybrid, synonym RNase Fl) umfassen eine Gruppe von Enzymen (Ribonukleasen), die RNA in DNA-RNA-Flybriden abbauen. Sie werden in zwei Gruppen unterteilt, RNase FH I (in Bakterien) bzw. RNase FH 1 (in Eukaryoten) und RNase FH 11 (in Bakterien) bzw. RNase FH2 (in Eukaryoten). Ribonukleasen des Typs Fl kommen in fast allen Lebewesen vor und sind sequenzunspezifische Endonukleasen, welche die Phosphodiester-Bindung von RNA in Doppelsträngen von DNA und RNA hydrolysieren, wodurch eine 3'-Hydroxygruppe und eine 5'- Phosphatgruppe entstehen (6). Diese eNAs eignen sich besonders für das DNA-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können. In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleinsäure jedwede Form einer CRISPR RNA oder eine von der CRISPR RNA abgeleitete g/crRNA und die Endonuklease ist ein Cas-Protein. Das DNA- oder RNA-schneidende Enzym namens Cas (von englisch CRISPR-associated ,CRISPR-assoziiert') bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Vor oder nach dieser RNA-Sequenz befindet sich eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine Target-DNA oder Target-RNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die g/crRNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden Target-DNA oderTarget-RNA. Durch die Verkettung des Enzyms Cas, der g/crRNA und der Target-DNA oder Target-RNA wird die Endonuklease Cas in die räumliche Nähe des Targets gebracht, woraufhin Cas dieses hydrolysiert (51). Diese eNAs eignen sich besonders für das Cas-vermittelte silencing von Target-RNAs, so für das silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
Beispiele für geeignete eNAs, die von der Erfindung bereitgestellt werden, sind ausgewählt aus den in Tabellen 1, 2 und 3 dargestellten Sequenzen.
Tabelle 1: Beispiele für als eNAs geeignete siRNAs
Figure imgf000021_0001
Tabelle 2: Beispiele für als eNAs geeignete antisense DNA-Oligonukleotide (ASO)
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Tabelle 3: Beispiele für eine als eNA geeignete CRISPR-RNA
Figure imgf000022_0002
nicht unterstrichen: ,Spacer'-Sequenz (Erkennung der Target-RNA) unterstrichen: , direct repeat' (Bindung durch Casl3b-Protein)
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Nukleinsäuren (eNAs), die Endonukleasen ausgewählt aus AGO-, RNase H und Cas- Proteinen an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren und damit, vorzugsweise verlässlich, die Funktionen dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern, wobei die Target-RNAs beispielsweise durch endonukleolytische Hydrolyse ( slicing/cleavage ) oder Translationsinhibition inaktiviert werden und es somit zu einem silencing der Target-RNA kommt.
Wie oben erwähnt, sind die eNAs vorzugsweise ausgewählt aus jedweder Art von siRNAs, jedweder Art von miRNAs, jedweder Art von antisense DNA-Oligonukleotiden und jedweder Art von g/crRNAs. Diese eNAs eignen sich besonders zur Verwendung beim, vorzugsweise verlässlichen, RNA- vermittelten, DNA-vermittelten und/oder CRISPR/Cas-vermittelten silencing von RNAs die zellulären aber auch pathogenen Ursprungs sein können.
Die eNAs können in transgener oder transienter (non-transforming) Form zur Pathogenbekämpfung oder zur gezielten, transkriptioneilen und post-transkriptionellen Regulation der Genexpression eingesetzt werden. Sie eignen sich besonders zur Verwendung in der Pathogenbekämpfung in Pflanzen/Nutzpflanzen, Tieren/Nutztieren und im Menschen, z. B. als Viruzide, Bakterizide, Fungizide, Nematizide und Insektizide.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine eNA, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine eNA, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde und fakultativ ein(e) Trägersubstanz/Hilfsstoff, die/der zur Verabreichung in/auf Pflanzen, in Nematoden, Insekten, Oomyceten, Pilzen, Tieren und im Menschen geeignet ist.
Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Lösung, die in direkter Form z.B. als Nährlösung oder als Aerosol/Spray, verabreicht werden kann. Damit lassen sich besonders einfach Erkrankungen an Pflanzen/Nutzpflanzen sowie in Tieren und auch im Menschen Vorbeugen oder behandeln.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzungen für die parenterale, enterale, intramuskuläre, mukosale oder orale Verabreichung bereit, die eine eNA gemäß der Erfindung, optional in Kombination mit üblichen Träger und/oder Hilfsstoffen enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzungen, die für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen in Tieren/Nutztieren und/oder im Menschen geeignet sind.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische bzw. veterinärmedizinische Zusammensetzung wenigstens einen physiologisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, und/oder Hilfsstoff. Die eNAs gemäß der vorliegenden Erfindung können in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, z.B. in einem herkömmlichen Medium, wie einem wässrigen Salzmedium oder einer Pufferlösung als pharmazeutische Zusammensetzung zur Injektion enthalten sein. Ein solches Medium kann auch herkömmliche pharmazeutische Stoffe enthalten, wie zum Beispiel pharmazeutisch verträgliche Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsmittel und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören physiologische Kochsalzlösung und Humanserum. Ein besonders bevorzugtes Medium ist PBS-gepufferte Kochsalzlösung.
Weitere geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann beispielsweise aus Remington's Practice of Pharmacy, 13. Ausgabe und J. of. Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 52, Nr. 5, Sept-Okt., S. 238-311, bekannt.
Die eNA gemäß der Erfindung weist in einer bevorzugten Ausführungsform eine oder mehrere chemische Modifikationen auf, wobei die chemischen Modifikationen ausgewählt sein können aus 2'- Ribosemodifikationen (2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-0-(methoxyethyl) (2'-MOE)), Zuckermodifikationen (,locked' (LNA) oder unlocked, (UNA)), ,Backbone'-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder , peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino). Hierdurch werden die Stabilität und oder Lebensdauer/Halbwertszeit der eNAs bei der Anwendung, z.B. in der Pathogenbekämpfung erhöht.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 5 Figuren und 6 Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1A Beispiele von Konsensussequenzen von siRNAs (guide-Strang), die als optimal für das pflanzliche AGOl (links) bzw. AG02 (rechts) ermittelt wurden. Zur Bestimmung der Konsensussequenzen wurden zunächst doppelsträngige RNAs von Tomato bushy stunt virus (TBSV) oder Cucumber mosaic virus (CMV) in BYL durch endogene Dicer/DCLs zu siRNAs prozessiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und die viralen siRNAs mittels RNA-Seq charakterisiert (,DCL-Assay'). In weiteren Ansätzen wurde parallel zur siRNA- Generierung entweder AGOl- oder AG02-Protein mit N-terminalem FLAG-fag durch in vitro- Translation entsprechender mRNAs produziert. Anschließend wurden die mit viralen siRNAs beladenen AGO/RISC durch eine Immunopräzipitation mit Hilfe eines Anti-FLAG-Antikörpers isoliert, die siRNAs aus den Komplexen gereinigt und mittels RNA-Seq charakterisiert (,AGO- IP') (9). Durch Vergleich der relativen Fläufigkeiten, mit der individuelle siRNAs jeweils in ,DCL-Assay' und ,AGO-IP' detektiert wurden, konnten siRNAs identifiziert werden, die eine hohe Affinität zu AGOl oder AG02 aufweisen. Aus den Sequenzen der 50 am stärksten in den ,AGO-IPs' angereicherten 21 nt siRNAs wurden Konsensussequenzen für AGOl und AG02 abgeleitet. Positionen, an denen mehrere Nukleotide die (nahezu) maximale Aktivität ermöglichen, sind entsprechend durch untereinanderstehende Buchstaben gekennzeichnet. In ähnlicher Form wurde dies für AGO-Proteine aus anderen Organismen (z.B. Pilz und Mensch durchgeführt).
Figur 1B Beispiele von ,Slicer-Assays', die mit einer 21 nt esiRNA und mit Konsensus-optimierten 21 nt esiRNAs durchgeführt wurden; links mit AGOl/RISC, rechts mit AG02/RISC. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26), als Konsensus-optimierte siRNAs die Sequenzen aus Figur 2A (obere Zeile). Die pflanzlichen AGO-Proteine wurden in BYL mittels in v/iro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der zu testenden, synthetischen siRNA- Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der gewünschten siRNAs in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde eine radioaktiv markierte Target-RNA mit der entsprechend passenden Target-Sequenz zugegeben und inkubiert. Die 21 nt langen Target-Sequenzen lagen jeweils in einem Segment einer GFP-mRNA (in anf/sense-Orientierung) vor, sodass die umgebende Sequenz in allen Fällen identisch war. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Figur 2 Ergebnisse von ,Slicer-Assays' in BYL, die mit einer esiRNA sowie mit AGO/RISC-Komplexen aus Mensch, Pflanze (Nicotiana benthamiana) und Pilz ( Colletotrichum graminicola) durchgeführt wurden. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Die verwendete esiRNA enthält am 5'-Ende ein Uridin (5'U), sodass alle drei AGO-Proteine mit dieser siRNA agieren konnten. Zudem wurde die esiRNA mit einem 5'-Adenosin mit dem pflanzlichen AG02/RISC getestet. Die AGO- Proteine wurden in BYL mittels in v/iro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart des synthetischen siRNA-Duplexes durchgeführt, sodass es zum Einbau der siRNA in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt eine praktisch vollständige Übereinstimmung des Reaktionsmusters - es entstehen die jeweiligen Spaltprodukte in praktisch analogen Quantitäten. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert.
Figur 3 dass a-Sites, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, auch für ASO zugänglich sind.
A) ,Slicer-Assays' durchgeführt in BYL mit einer Target-RNA, einer esiRNA und einem in der Sequenz mit dem guide-Strang der esiRNA entsprechenden antisense DNA-Oligonukleotid (ASO). Links: in Abwesenheit von translatiertem AGO-Protein; Rechts: in Anwesenheit von translatiertem pflanzlichem AGO-Protein. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Eine in v/iro-Translationsreaktion erfolgte ohne (links) bzw. mit (rechts) AGO-mRNA jeweils in Gegenwart der angegebenen Mengen an synthetischem siRNA-Duplex oder ASO. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass eine Spaltung mit ASO stets durch die im Extrakt enthaltenen RNase H-Aktivitäten, d. h. unabhängig von AGO, erfolgt, während die siRNA-vermittelte Spaltung nur bei Anwesenheit von zusätzlich generiertem AGO erfolgt. Die Größe des jeweils entstehenden 5'-Spaltproduktes ist identisch.
B) Slicer-Assays in BYL, durchgeführt mit genomischer TBSV-RNA als Target und verschiedenen siRNAs, assoziiert an pflanzliches AGOl (links) oder AG02 (Mitte). Rechts - analoger Assay mit ausgewählten ASO, welche die entsprechende Sequenz wie die guide- Stränge entsprechender siRNAs aufweisen. Die hier verwendeten siRNAs wurden aufgrund ihrer hohen Affinität zu AGOl bzw. AG02, ermittelt durch ,DCL-Assay' und ,AGO-IP' (siehe Figur 2A) ausgewählt. Die AGO-Proteine wurden in BYL mittels in v/iro-Translation entsprechender mRNAs generiert (links, Mitte). Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der synthetischen siRNA-Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der siRNA in den AGO/RISC kam. Der Einsatz der ASO erfolgte unter identischen Bedingungen, allerdings ohne Zugabe von AGO-mRNA (rechts). Anschließend wurde radioaktiv markierte, genomische TBSV-RNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierendem Agarosegel und Autoradiographie auf eine Abnahme der Menge an Target-RNA und das Auftreten von Spaltprodukten analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass auf der komplexen TBSV-RNA nur die ASO eine Spaltung induzieren, deren siRNA-Pendant ebenfalls eine Spaltung erzeugen kann. Die ASO sind inaktiv, deren jeweiliges siRNA-Pendant ebenfalls inaktiv ist. Mit anderen Worten: a-Sites, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind auch für ASO/RNase H zugänglich. Sites, die nicht für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, sind auch nicht für ASO/RNase H zugänglich.
C) Pflanzenprotektionsexperimente mit esiRNA 209 (siR209) und dem entsprechenden ASO- Pendant (ASO209) sowie Kontrollen mit unspezifischen (GFP) siRNAs bzw. ASO und mit zuvor als nicht effizient (siehe Figur 4B) erkannten ASO. Die siRNAs bzw. ASO wurden zusammen mit genomischer TBSV-RNA auf die Oberfläche zweier Blätter von Nicotiana benthamiana- Pflanzen aufgerieben (rub-in). Anschließend wurden die Pflanzen drei Wochen lang hinsichtlich des Auftretens von Symptomen einer TBSV-Infektion beobachtet (dpi - days post infection).
D) Pflanzenprotektionsexperimente mit chemisch modifizierten und nicht modifizierten ASO 209 sowie Kontrolle mit nicht modifiziertem, unspezifischen (GFP) ASO. Das Experiment wurde wie unter C) beschrieben durchgeführt. (MOE - 2'-0-(methoxyethyl); LNA - Locked Nucleic Acid; PTO - Phosphorothioat; dpi - days post infection).
Figur 4 die Ergebnisse eines ,Slicer-Assays' durchgeführt mit zytoplasmatischem FleLa S10-Extrakt (55) mit einer Target-RNA und dazu passender siRNA oder ASO in Gegenwart (rechts) und in Abwesenheit (links) von translatiertem humanen AG02. Als esiRNA wurde die 21 nt lange Variante der für GFP-mRNA spezifischen gf698-siRNA verwendet (25, 26). Eine in vitro- Translationsreaktion erfolgte ohne (links) bzw. mit (rechts) AGO-mRNA jeweils in Gegenwart von synthetischem siRNA-Duplex oder ASO. Anschließend wurde ein radioaktiv markiertes Segment einer GFP-mRNA als Target-RNA zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass auch in HeLa-Extrakt analoge endonukleolytische Hydrolysen durch die jeweiligen sRNA/AGO/RISC- bzw. ASO/RNase H-Komplexe erfolgen. Während eine Spaltung mit ASO unabhängig von AGO-Protein durch die im Extrakt enthaltenen RNase H-Aktivitäten erfolgt, wird die Aktivität der siRNA durch die mittels in v/iro-Translation erhöhte AG02-Menge deutlich verbessert.
Figur 5 die Ergebnisse eines CRISPR/Cas ,cleavage'-Experiments, durchgeführt mit BYL, Casl3b und TBSV-RNA im Vergleich zu einem , Slicer-Assay' mit pflanzlichem AGO-Protein. Die Target- Sequenz der hier verwendeten CRISPR-RNA 200 (crR200) überlappt mit den Target- Sequenzen der esiRNAs 186 und 209 (siR186, siR209). AGO-Protein sowie Casl3b aus Prevotella sp. P5-125 wurden in BYL mittels in v/iro-Translation entsprechender mRNAs generiert. Die Translationsreaktionen wurden in Gegenwart der synthetischen siRNA- Duplexe bzw. der crRNA durchgeführt, sodass es zur Ausbildung der entsprechenden Nukleinsäure/Endonuklease-Komplexe kam. Anschließend wurde ein radioaktiv markierter Bereich der genomischen TBSV-RNA als Target zugegeben und inkubiert. Aus den Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender PAGE und Autoradiographie auf Spaltprodukte analysiert. Die verwendete Target-RNA bzw. die entstandenen Spaltprodukte sind jeweils markiert. Man erkennt, dass in Gegenwart von Casl3b und CRISPR-RNA 200 eine Spaltung der viralen RNA erfolgt, die durch die esiRNAs 186 bzw. 209 erkannten a-Sites sind also auch durch crR200/Casl3b angreifbar.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Slicer-Assay
Benutzt wurde die experimentell bestimmte RNA-Sekundärstruktur des Genoms des Tomato bushy stunt virus (TBSV) (30). Diese weist Segmente, die funktionale, weitreichende RNA-RNA- Wechselwirkungen ausbilden, auf. Diese genomische virale RNA wurde alsTarget-RNAin einem in vitro , Slicer-Assay' mit ausgewählten 21 nt siRNAs, die eine hohe Affinität zu den pflanzlichen AGO- Proteinen AGOl oder AG02 zeigten, eingesetzt. Dazu wurde die AGO-Proteine in BYL mittels in vitro- Translation generiert. Die Translationsreaktion wurde in Gegenwart der zu testenden, synthetischen siRNA-Duplexe durchgeführt, sodass es zum Einbau der gewünschten siRNAs in den AGO/RISC kam. Anschließend wurde radioaktiv markiertes TBSV-Genom als Target zugegeben und inkubiert. Aus diesen Ansätzen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels denaturierender Agarose-Gelelektrophorese und Autoradiographie auf slicing/cleavage-Produkte analysiert. Die Position des 5'-Nukleotids der getesteten siRNAs (bzw. das 3'-Ende der Target-Sequenz) wurde ermittelt. Die 21 nt stromaufwärts davon entsprechen der Target-Sequenz, in deren Mitte erfolgt die endonukleolytische Spaltung durch den RISC. Für siRNAs, die eine Hydrolyse der Target-RNA induzieren konnten, wurden entsprechende Spaltfragmente detektiert. siRNAs, die nicht oder kaum zu einer Hydrolyse der Target-RNA führten, konnten ebenfalls bestimmt werden (9). Anhand der Strukturanalyse war prognostiziert worden, dass solche Regionen, die hier größtenteils einzelsträngig vorliegen, zugänglich für RNAi sind und solche, die im Wesentlichen doppelsträngig vorliegen, nicht zugänglich sind. Es konnte keine klare Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des ,Slicer-Assays' und der prognostizierten Sekundärstruktur festgestellt werden (9).
Beispiel 2: Ermittlung von Konsensus-Sequenzen von siRNAs verbessern AGO/RISC Aktivität.
In RNA-seq Analysen, die während des zweiten Schrittes (AGO-IP) von esiRNA/fRNA screens verschiedener Target-RNAs (virale RNAs und verschiedene mRNAs) durchgeführt wurden, wurde eine statistisch relevante Anzahl von siRNAs analysiert, die von verschiedenen AGO-Proteinen gebunden werden. Aus diesen Analysen wurden für die jeweiligen AGOs guide-Strang-Konsensussequenzen erstellt: Diese geben für jede einzelne Position der sRNA jeweils die Nukleotidvariante bzw. Nukleotidvarianten (bei mehreren Möglichkeiten) wieder, für die ermittelt wurde, dass sie jeweils den besten Beitrag zu einer effizienten Bindung der sRNA an das entsprechende AGO-Protein leistet (Figur 1A). Um den Effekt der ermittelten Konsensussequenzen zu ermitteln wurde ein Slicer-Assay durchgeführt, in der eine nicht-optimierte siRNA im Vergleich zu einer Konsensus-optimierten siRNA getestet wurde. Die Target-RNA wurde dabei so angepasst, dass beide siRNAs jeweils mit der kompletten Sequenz an diese hybridisieren können. Auf diese Weise ließ sich der Effekt der Konsensussequenz auf die Aktivität des AGO/RISC unabhängig von der Zugänglichkeit der Target-RNA feststellen. Es wurde so gezeigt, dass sich das durch diese so optimierten esiRNAs/fRNAs ausgelöste slicing der Target-RNA im Vergleich zu der ursprünglichen esiRNA nochmals erhöhen lässt (Figur 1B). Das esiRNA/fRNA screen Verfahren wurde somit dahingehend verbessert, dass es nun nicht mehr ausschließlich auf der empirisch/experimentellen Ermittlung effizient wirksamer esiRNAs und Auswahl eines an das jeweilige AGO-Protein angepassten 5'-Nukleotides beruht. Durch Anpassung an die Konsensussequenz kann die Bindung eines esiRNA/fRNA guide-Stranges an das jeweils verwendete AGO-Protein erhöht und damit die RNA s/Venc/ng-Aktivität des resultierenden sRNA/AGO/RISC gezielt verbessert werden.
Beispiel 3: Nachweis, dass AGO/RISC-Komplexe aus unterschiedlichen Organismen, bei gebundenen esiRNAs/fRNAs gleicher Bindesequenz, identisch auf einer Target-RNA agieren. Bislang wurde gezeigt, dass es mit einem esiRNA/fRNA screen Verfahren, das in pflanzlichen cytoplasmatischen Extrakten (BYL) durchgeführt wird, möglich ist, experimentell siRNAs zu ermitteln, die, als esiRNAs, besonders effizient auf einer Target-RNA, z.B. der genomischen RNA eines Pflanzenvirus, agieren können. Als wichtiger Faktor für die Effizienz einer siRNA auf einer Target-RNA wurde dabei die Affinität an das jeweils agierende AGO-Protein ermittelt. Die Affinität zu AGO wird zum einen durch das 5'-Nukleotid der siRNA bestimmt (29); zum anderen, wie hier erfindungsgemäß gezeigt, durch eine optimale Sequenz (Konsensussequenz; s.o.). Als weiterer Faktor für die Effizienz einer siRNA im RN Ai wurde, wie ausgeführt, die Zugänglichkeit der Target-RNA für AGO/RISC vermutet. Eine zentrale Frage, die sich in diesem Zusammenhang stellte, war, ob Bereiche einer Target-RNA, die für pflanzliche AGO/RISC zugänglich sind, dies in ähnlicher Weise auch für AGO/RISC aus anderen Organismen sind. Um dies zu testen wurden die AGOl- und AG02-Proteine aus Pflanze (Nicotiana benthamiana), das AG02-Protein aus Mammalia (Homo sapiens) und das AGOl-Protein aus Fungi ( Colletotrichum graminicola) in BYL exprimiert und in Slicer-Assays mit einer Target-RNA getestet. Die verwendeten siRNAs hatten jeweils die identische Bindesequenz (die Sequenz, die vollständig mit der komplementären Sequenz der Target-RNA hybridisiert) und ein 5'-Nukleotid, das jeweils an die Bindepriorität des jeweiligen AGO angepasst war: Für das pflanzliche AGOl war dies 5'U, für das pflanzliche AG02 5Ά, für das humane AG02 5'U oder 5Ά und für das pilzliche AGOl 5'U. Aus den durchgeführten Slicer-Assays ließen sich zwei wesentliche Erkenntnisse ableiten: (i) Alle eingesetzten AGO-Proteine bilden in den BYL funktionelle RISC und (ii) alle AGO/RISC zeigen eine direkt vergleichbare slicing/cleavage- Aktivität (Figur 2). Damit wurde deutlich, dass AGO/RISC aus Spezies dreier verschiedener Reiche ( Plantae , Fungi und Animalia der Eukarya-Domäne), wenn sie mit sRNAs gleicher Bindesequenz beladen werden, in sehr vergleichbarer Weise auf der entsprechenden Target- RNA aktiv sind.
Dieser Befund ist neu und unerwartet, denn es wird gezeigt, dass die Zugänglichkeit eines Target-RNA- Moleküls allgemein für alle AGO/RISC gegeben ist, solange diese durch die gleiche Nukleinsäure dirigiert werden. Dies können siRNAs, aber z.B. auch miRNAs (28), oder andere Arten von Nukleinsäuren (siehe auch unten) sein.
Beispiel 4: Nachweis, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, auch zugänglich sind für ASO/RNase H.
Die Tatsache, dass Bereiche einer Target-RNA, die für einen sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, in gleicher Weise für einen sRNA/AGO/RISC aus einem anderen organismischen Reich zugänglich sind, deutete darauf, dass sich mit sRNA/AGO/RISC generell zugängliche Bereiche, a-Sites, einer komplexen Target-RNA detektieren lassen. Dies führte wiederum zu der Hypothese, dass diese a-Sites dann auch für andere Nukleinsäure/Nuklease-Komplexe wie beispielsweise ASO/RNase H zugänglich sein sollten. In dazu durchgeführten Studien wurde zunächst deutlich, dass BYL auch eine RNase H Aktivität enthalten. So konnte erstmals demonstriert werden, dass bei Supplementierung von BYL mit einem einzelsträngigen ASO, das zu einem bestimmten Bereich einer Target-RNA komplementär ist, diese Target-RNA, ASO-dirigiert, in definierte Fragmente hydrolysiert wird. Diese endonukleolytische Hydrolyse konnte somit unabhängig von der Anwesenheit eines rekonstituierten AGO/RISC beobachtet werden, und sie generiert 3' -Spaltprodukte, die von denen eines AGO/RISC differieren (Figur 3A). Bisher erhaltene Daten, die hier nicht im Detail dargelegt werden, deuten darauf, dass in BYL sowohl RNase Hl- als auch RNase H2-Aktivitäten messbar sind (C. Gruber, nicht publizierte Daten).
Zur Prüfung unserer Hypothese wurden ASO synthetisiert, die in ihrer Bindesequenz exakt zuvor mit pflanzlichen AGO/RISC identifizierten esiRNAs/fRNAs entsprachen. In einer Serie von Experimenten konnte dann erfindungsgemäß gezeigt werden, dass Bereiche, die zuvor als zugänglich für siRNA/AGO/RISC-mediierte Endonukleolyse charakterisiert wurden, dies in analoger Weise für ASO/RNase H-mediierte Endonukleolyse sind. So wird eine virale Target-RNA, die durch einen esiRNA- vermittelten AGO/RISC endonukleolytisch gespalten wird, an gleicher Stelle durch ASO-mediierte RNase H-Aktivität endonukleolytisch gespalten. Dagegen sind ASO, deren Sequenz inaktiven siRNAs entspricht, nicht auf dieser Target-RNA aktiv (Figur 3B). In nachfolgenden Studien in vivo konnte demonstriert werden, dass ASO, ähnlich wie siRNAs, in der Lage sind, virale Infektionen in Pflanze zu verhindern. Wie erwartet, wirken nur solche ASO antiviral, die in ihrer Sequenz esiRNAs entsprechen und somit an komplementäre a-Sites in den Target-RNAs binden können. Dagegen war kein antiviraler Effekt mit ASO zu beobachten, die siRNAs entsprachen, die zu anderen, offenbar nicht zugänglichen Bereichen der verwendeten Target-RNA komplementär sind (Figur 3C). Wie hier gezeigt können in diesen Experimenten auch MOE-, LNA- und PS(PTO)-modifizierte ASO als antivirale Substanzen eingesetzt werden (Figur 3D).
Beispiel 5: Nachweis, dass sRNA/AGO/RISC- und ASO/RNase H-Komplexe aus cytoplasmatischen Extrakten pflanzlicher und humaner Zellen, bei Verwendung von sRNAs oder ASO identischer Bindesequenz, identisch auf einer Target-RNA agieren.
Die nächste Frage, die sich stellte, war, ob sich analoge Ergebnisse auch in cytoplasmatischen Extrakten erhalten lassen, die nicht, wie BYL, aus pflanzlichen Zellen gewonnen werden. Um dies zu überprüfen, bot es sich an, S10 Extrakte aus humanen HeLa-Zellen unter ähnlichen Bedingungen wie BYL zu testen. In HeLa S10-Extrakten kann AGO/RISC-Aktivität unter sehr ähnlichen Bedingungen in vitro rekonstituiert werden (56); zudem enthalten diese Extrakte RNase H-Aktivität (55). Entsprechend der Aufgabe wurden in HeLa S10 Slicer-Aassays mit dem humanen AG02-Protein, einer Target-RNA, einer passenden esiRNA und einem davon abgeleiteten ASO durchgeführt (Figur 4). Dabei wurde deutlich, dass hier, analog zu der Situation in BYL, die Target-RNA von beiden endonukleolytischen Aktivitäten wiederum in sehr ähnlicher Weise gespalten wird, d.h. es entstand jeweils das gleiche 5' -Spaltprodukt. Im Gegensatz zu BYL konnte in HeLa S10 AGO/RISC-Aktivität auch ohne zusätzlich exprimiertes (in vitro translatiertes) AGO rekonstituiert werden; bei zusätzlich exprimiertem AG02, ließ sich die Aktivität aber steigern (Figur 4). Damit wurde folgendes deutlich: In cytoplasmatischen Extrakten völlig verschiedener Zelltypen erfolgt die Faltung einer komplexen Target-RNA offenbar in sehr ähnlicher Weise. Die Faltung erfolgt vermutlich über RNA-RNA- und auch RNA-Protein-Interaktionen mit in den Extrakten enthaltenen RNA-bindenden Proteinen.
Es wurden esiRNA/fRNA screens in FleLa S10 durchgeführt. Als Target-RNAs wurden mRNAs eines humanen Virus eingesetzt. Die dabei in vitro identifizierten esiRNAs und davon abgeleiteten (modifizierte) ASO wurden anschließend in vivo, d.h. durch Applikation im Mausmodell auf eine protektive Wirkung gegen eine Virusinfektion getestet. Es wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit den in vitro identifizierten esiRNAs und ASO behandelt wurden, im Vergleich zu entsprechenden Kontrolltieren einen deutlich verbesserten Schutz gegen die Virusinfektion aufwiesen.
Durch ein screening mit sRNA/AGO/RISC können in einer Target-RNA a-Sites identifiziert werden, die zugänglich für AGO/RISC und auch für ASO/RNase Fl sind. Mit BYL und anderen cytoplasmatischen Extrakten, also z.B. humanen FleLa-Extrakten, können entsprechend zugängliche Bereiche auf Target- RNAs gezielt ermittelt werden und diese entweder sRNA- oder auch ASO-mediierter Regulation, z.B. Inhibition der Genexpression durch endonukleolytischen Abbau, zugeführt werden.
Damit können cytoplasmatische Extrakte von Zellen, in denen es möglich ist, sRNA/AGO/RISC zu rekonstituieren, erfindungsgemäß dazu eingesetzt werden, die für diese Komplexe als auch für ASO/RNase Fl zugänglichen Bereiche, a-Sites, auf komplex gefalteten und mit RNA-bindenden Proteinen assoziierten Target-RNAs zu detektieren.
Beispiel 6: Nachweis, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC und ASO/RNase Fl zugänglich sind, auch für CRISPR/Cas zugänglich sind.
Dem oben beschriebenen Grundprinzip folgend wurde nachkommend postuliert, dass Bereiche einer Target-RNA, die für sRNA/AGO/RISC zugänglich sind, dies auch für g/crRNA-dirigierte Cas-Proteine sind. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde das Casl3b-Protein aus Prevotella sp. (P5-125) gemeinsam mit crRNAs individueller Wahl als endonukleolytische Komplexe in BYL oder HeLa S10 rekonstituiert. Die crRNAs waren dabei so konzipiert (Figur 5), dass sie mit Bereichen einer Target-RNA überlappten, für die zuvor gezeigt werden konnte, dass sie für esiRNA/AGO/RISC zugänglich sind. In einem entsprechenden endonukleolytischen Assay konnte gezeigt werden, dass mit diesen g/crRNAs eine durch Casl3b katalysierte spezifische Hydrolyse der Target-RNA an ähnlichen Stellen wie mit den entsprechenden esiRNA/AGO/RISC erfolgen kann. D.h. mit rekonstituierten sRNA/AGO/RISC und rekonstituierten g/crRNA/Casl3b Komplexen, in denen die verwendeten s- und g/crRNAs an jeweils homologe Bereiche auf der Target-RNA hybridisieren, wurden jeweils Abbauprodukte generiert (Figur 5).
Damit können cytoplasmatische Extrakte von Zellen, in denen es möglich ist, sRNA/AGO/RISC zu rekonstituieren, erfindungsgemäß dazu eingesetzt werden, die für diese Komplexe als auch für ASO/RNase Fl, als auch für CRISPR/Cas zugänglichen Bereiche, a-Sites, auf komplex gefalteten Target- RNAs zu detektieren. Die Target-RNA kann dann verlässlich mit RNA, DNA oder CRIPR/Cas Verfahren in ihrer Funktion verändert, z.B. durch silencing inaktiviert werden.
Referenzliste
1. Shabalina S.A., Koonin E.V. (2008). Origins and evolution of eukaryotic RNA interference. Trends Eco! Evol 23, 578-587.
2. Carthew R.W., Sontheimer E.J. (2009). Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-655.
3. Guo Z., Li Y., Ding S.-W. (2019). Small RNA-based antimicrobial immunity. Nat Re v Immunol 19, 31-44.
4. Bennett C.F. (2019). Therapeutic antisense oligonucleotides are coming of age. Annu Re v Med 70, 307-21.
5. Shen X., Corey D.R. (2018). Chemistry, mechanism and clinical Status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Res 46, 1584-1600.
6. Moelling K., Broecker F., Russo G., Sunagawa S. (2017). RNase Fl as gene modifier, driver of evolution and antiviral defense. Front Microbiol 8, 1745.
7. Bevilacqua P.C., Ritchey L.E., Su Z., Assmann S.Z. (2016). Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Ann Rev Gen 50,235-266.
8. Baltz A.G., Munschauer M., Schwanhausser B., Vasile A., Murakawa Y., Schueler M., Youngs N., Penfold-Brown D., Drew K., Milek M. et al. (2012) The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell 46, 674-690.
9. Gago-Zachert S., Schuck J., Weinholdt C., Knoblich M., Große I., Pantaleo V., GursinskyT., Behrens, S.-E. (2019). FHighly efficacious antiviral protection of plants by small interfering RNAs identified in vitro. Nucleic Acids Res 47, 9343-9357.
10. Vickers T.A., Crooke S.T. (2015). The rates of the major Steps in the molecular mechanism of RNase Fll-dependent antisense oligonucleotide induced degradation of RNA. Nucleic Acids Res 43, 8955- 8963.
11. Lucks J.B., Mortimer S.A., Trapneil C., Luo S., Aviran S., Schroth G.P., Pachter L., Doudna J.A., Arkin A.P. (2011). Multiplexed RNA structure characterization with selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SFIAPE-Seq). Proc NatiAcad Sei USA 108, 11063-11068.
12. Rouskin S., Zubradt M., Washietl S., Kellis M., Weissman J.S. (2014). Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature 505, 701-705.
13. Shao Y., Chan C.Y., Maliyekkel A., Lawrence C.E., Roninson I.B., Ding Y. (2007). Effect of target secondary structure on RNAi efficiency. RNA 13, 1631-1640.
14. Tafer FL, Ameres S.L., Obernosterer G., Gebeshuber C.A., Schroeder R., Martinez J., Flofacker I.L. (2008). The impact of target site accessibility on the design of effective siRNAs. Nat Biotechnol 26, 578-583.
15. Lima W.F., Vickers T.A., Nichols J., Li C., Crooke S.T. (2014). Defining the factors that contribute to on-target specificity of antisense oligonucleotides. PLoS ONE 9, el01752. 16. Ho S.P., Britton D.H., Stone B.A., Behrens D.L., Leffet L.M., Hobbs F.W., Miller J.A., TrainorG.L. (1996). Potent antisense oligonucleotides to the human multidrug resistance-1 mRNA are rationally selected by mapping RNA-accessible sites with oligonucleotide libraries. Nucleic Acids Res 24, 1901-1907.
17. Fakhr E., Zare F., Teimoori-Toolabi, L. (2016). Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther 23, 73.
18. Birmingham A. et al. (2007). A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc 2, 2068-2078.
19. Han Y., He F., Tan, X., Yu, H. (2017) IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (BIBM 2017) 16-21.
20. Eastman P., Shi J., Ramsundar B., Pande V. S. (2018) Solving the RNA design problem with reinforcement learning. PLOS Comput Biol 14, el006176.
21. Carboneil A., Lopez C., Darös J.-A. (2019). Fast-forward Identification of highly effective artificial small RNAs against different Tomato spotted wilt virus isolates. Mol Plant Microbe Interact 32, 142-156.
22. Duan C.-G., Wang C.-H., Fang R.-X., Guo H.-S. (2008). Artificial microRNAs highly accessible to targets confer efficient virus resistance in plants. J Virol 82, 11084-11095.
23. Miozzi L., Gambino G., Burgyan J., Pantaleo V. (2013). Genome-wide Identification of viral and host transcripts targeted by viral siRNAs in Vitis vinifera. Mol Plant Pathol 14, 30-43.
24. Komoda K., Naito S., Ishikawa M. (2004). Replication of plant RNA virus genomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts. Proc Natl Acad Sei U SA 101, 1863-1867.
25. Iki T., Yoshikawa M., Nishikiori M., Jaudal M.C., Matsumoto-Yokoyama E., Mitsuhara I., Meshi T., Ishikawa, M. (2010). In vitro assembly of plant RNA-induced silencing complexes facilitated by molecular chaperone HSP90. Mol Cell 39, 282-291.
26. Schuck J., GursinskyT., Pantaleo V., Burgyan J., Behrens, S.-E. (2013). AGO/RISC-mediated antiviral RNA silencing in a plant in vitro System. Nucleic Acids Res 41, 5090-5103.
27. Gursinsky T., Pirovano W., Gambino G., Friedrich S., Behrens S.-E., Pantaleo V. (2015). Homeologs of the Nicotiana benthamiana antiviral ARGONAUTEI show different susceptibilities to microRNA168-mediated control. Plant Physiol 168, 938-952.
28. Pertermann R., Tamilarasan S., Gursinsky T., Gambino G., Schuck J., Weinholdt C., Lilie H., Grosse I., Golbik R.P., Pantaleo V., Behrens S.E. (2018). A viral suppressor modulates the plant immune response early in infection by regulating microRNA activity. mBio 9, e00419-18.
29. Mi S., Cai T., Hu Y, Chen Y., Hodges E., Ni F., Wu L., Li S., Zhou H., Long C., Chen S., Hannon G.J., Qi Y. (2008). Sorting of Small RNAs into Arabidopsis Argonaute Complexes Is Directed by the 5' Terminal Nucleotide. Cell 133, 25-26
30. Wu B., Grigull J., Ore M.O., Morin S., White K.A. (2013). Global Organization of a Positive-strand RNA Virus Genome. PLoS Pathog 9, el003363.
31. Gursinsky T., Schulz B., Behrens S.-E. (2009). Replication of Tomato bushy stunt virus RNA in a plant in vitro System. Virology 390, 250-260.
32. Carthew R.W., Sontheimer E.J. (2009). Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-655.
33. Guo Z., Li Y., Ding S.-W. (2019). Small RNA-based antimicrobial immunity. Nat Rev Immunol 19, 31-44.
34. Ding S-W (2010). RNA-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol 10, 632-644.
35. Fukudome A., Fukuhara, T. (2017). Plant dicer-like proteins: double-stranded RNA-cleaving enzymes for small RNA biogenesis. J Plant Res 130, 33-44.
36. Parent J.-S., Bouteiller N., Elmayan T., Vaucheret, H. (2015). Respective contributions of Arabidopsis DCL2 and DCL4 to RNA silencing. Plant J 81, 223-232.
37. Meister G. (2013). Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nat Rev Genet 14, 447-459.
38. Kobayashi H., Tomari Y. (2016). RISC assembly: Coordination between small RNAs and Argonaute proteins. Biochim Biophys Acta 1859, 71-81. 39. Carboneil A., Carrington J.C. (2015). Antiviral roles of plant ARGONAUTES. Curr Opin Plant Bio 127, 111-117.
40. Maillard P.V., van der Veen A.G., Poirier E.Z., Reis e Sousa C. (2019) Slicing and dicing viruses: antiviral RNA interference in mammals. EMBO J 38, el00941.
41. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498.
42. Setten R.L., Rossi J.J., Han S.-P. (2019). The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Disc 18, 421-446.
43. Qureshi A., Tantray V.G., Kirmani A.R., Ahangar A. G. (2018). A review on currents Status of antiviral siRNA. Rev Med Virol 28, el976.
44. Dowdy S.F. (2017). Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics. Nat Biotechnol 35, 222-229.
45. Bennett C.F. (2019). Therapeutic antisense oligonucleotides are coming of age. Annu Rev Med 70, 307-21.
46. Cerritelli S.M., Crouch R.J. (2009). Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes. FEBSJ 276, 1494- 1505.
47. Houseley J., Tollervey D. (2009). The many pathways of RNA degradation. Cell 136, 763-776.
48. Shen X., Corey D.R. (2018). Chemistry, mechanism and clinical Status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Res 46, 1584-1600.
49. Hagedorn P.H., Hansen B.R., Koch T., Lindow M. (2018). Managing the sequence-specificity of antisense oligonucleotides in drug discovery. Nucleic Acids Res 45, 2262-2282.
50. Nan Y., Zhang Y.-J. (2018). Antisense phosphorodiamidate morpholino oligomers as novel antiviral Compounds. Front Microbiol 9, 750.
51. Wright A.V., Nufiez J.K., Doudna J.A. (2016). Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell 164, 29-44.
52. Cox D.B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Franklin B., Kellner M.J., Joung J., Zhang F. (2017). RNA editing with CRISPR-Casl3. Science 358, 1019-1027.
53. Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B.T., Shmakov S. et al. (2016) C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573.
54. Sampson T.R., Saroj S.D., Uewellyn A.C., Tzeng Y.-L. Weiss, D.S. (2013) A CRISPR/Cas System mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature 497, 254-257.
55. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. (1983). Accurate transcription Initiation by RNA polymerase ll in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res 11, 1475- 1489.
56. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Lührmann R., Tuschl T. (2002). Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110, 563-574

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von zugänglichen Bereichen (,a-Sites') in komplexen RNA-Molekülen (Target-RNAs), wobei an die a-Sites Nukleinsäuren oder Komplexe aus diesen Nukleinsäuren und damit assoziierten Endonukleasen binden und die Funktion der Target-RNAs verändern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(i) Bereitstellung einer Target-RNA;
(ii) esiRNA/eRNA Screen, der siRNAs identifiziert, die in Komplexen mit Argonaute (AGO) Proteinen verlässlich eine Funktionsänderung dieser Target-RNA induzieren können;
(iii) anschließender Test mit davon abgeleiteten antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) darauf, ob diese in Gegenwart oder in Abwesenheit von RNase Fl eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können und/oder
(iv) anschließender Test mit davon abgeleiteten g/crRNAs darauf, ob diese in Gegenwart eines Cas-Proteins eine Funktionsänderung der Target-RNA induzieren können; und
(v) Identifizierung der a-Sites in der Target-RNA, wobei an die a-Sites Nukleinsäuren verschiedenen Typus (,eNAs') binden und entweder allein oder durch eine assoziierte Endonuklease die Funktion dieser Target-RNA verändern.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionsänderung der Target-RNA eine effiziente Endonukleolyse oder eine Inhibition der Translation der Target-RNA und damit z.B. ein silencing (Funktionsverlust) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-RNA eine RNA ist, die aus Viren, Bakterien, Pflanzen, Pilzen, Tieren oder dem Menschen stammt.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs ausgewählt sind aus jedweder Art von siRNAs (siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) und/oder jedweder Art von miRNAs und/oder jedweder Art von antisense DNA-Oligonukleotiden und/oder jedweder Art von g/crRNAs, vorzugsweise jedwede Art der genannten eNAs, wie z. B. natürlich vorkommende, synthetische, rekombinante oder artifiziell erzeugte eNAs.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Endonuklease ausgewählt ist aus Argonaute (AGO)-, RNase Fl und/oder Cas-Proteinen.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Funktion der Target-RNA ausgewählt ist aus RNA-, DNA- oder CRISPR/Cas-vermitteltem silencing.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Funktion der Target-RNA verlässlich ist, d.h. stets erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs eine Konsensussequenz aufweisen, die die Affinität zu der Endonuklease erhöht.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von siRNAs (z.B. siRNAs, vsiRNAs, tasiRNAs, hpsiRNAs, natsiRNAs, vasiRNAs, hetsiRNAs, piwi RNAs, easiRNAs, phasiRNAs, endo-siRNAs) oder jedwede Art von miRNAs sind und die Endonuklease ein AGO-Protein ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von antisense DNA-Oligonukleotiden (ASO) sind und die Endonuklease eine RNase H ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs jedwede Art von g/crRNAs sind und die Endonuklease ein Cas-Protein ist.
12. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche zur Identifizierung von eNAs, die Endonukleasen, die ausgewählt sind aus AGO-, RNase H und Cas-Proteinen, an die a-Sites von Target-RNAs dirigieren und damit, vorzugsweise verlässlich, die Funktion dieser RNA-Moleküle beeinflussen/verändern.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zum, vorzugsweise verlässlichen, RNA-vermittelten, DNA vermittelten und/oder CRISPR/Cas-vermittelten silencing.
14. Verwendung der nach einem Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 identifizierten eNAs zur Pathogenbekämpfung in Pflanzen/Nutzpflanzen, Tieren/Nutztieren und/oder im Menschen, z. B. als Viruzide, Bakterizide, Fungizide, Nematizide und Insektizide.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die eNAs in transgener oder transienter (non-transforming) Form zur Pathogenbekämpfung oder zur gezielten, post- transkriptionellen Regulation der Genexpression eingesetzt werden.
16. Zusammensetzung umfassend mindestens eine eNA, die mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 identifiziert wurde.
17. Zusammensetzung nach Anspruch7 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine Lösung oder ein Aerosol/Spray ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung ist.
19. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung zur parenteralen, enteralen, intramuskulären, mukosalen oder oralen Verabreichung oder zur Verabreichung als Aerosol geeignet ist.
20. Verfahren, Verwendung oder Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die eNA eine oder mehrere chemische Modifikationen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die chemischen Modifikationen ausgewählt sind aus z.B. 2'-Ribosemodifikationen (2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-0-(methoxyethyl) (2'-MOE)), Zuckermodifikationen (,locked' (LNA) oder unlocked, (UNA)), ,Backbone'-Veränderungen wie Phosphorothioate (PS) oder , peptide nucleic acids' sowie Zuckerphosphat-Modifikationen wie Morpholino/PMO (phosphorodiamidate morpholino).
PCT/EP2022/057596 2021-03-25 2022-03-23 Zuverlässige identifikation von bereichen (,a-sites') in komplexen rna-molekülen, die zugänglich sind für nukleinsäuren oder komplexe von nukleinsäuren mit endonukleasen WO2022200407A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22718104.7A EP4314288A1 (de) 2021-03-25 2022-03-23 Zuverlässige identifikation von bereichen (,a-sites') in komplexen rna-molekülen, die zugänglich sind für nukleinsäuren oder komplexe von nukleinsäuren mit endonukleasen
CN202280037538.2A CN117836410A (zh) 2021-03-25 2022-03-23 核酸或核酸与核酸内切酶复合物可接近的复合RNA分子中区域(“a-位点”)的可靠鉴定
CA3213865A CA3213865A1 (en) 2021-03-25 2022-03-23 Reliable identification of regions ('a sites') in complex rna molecules that are accessible for nucleic acids or complexes of nucleic acids with endonucleases
BR112023018851A BR112023018851A2 (pt) 2021-03-25 2022-03-23 Método para detecção de áreas acessíveis (sítios-a) em moléculas de rna complexas (rnas alvo), composições e usos
US18/552,397 US20240175015A1 (en) 2021-03-25 2022-03-23 Reliable identification of regions ('a sites') in complex rna molecules that are accessible to nucleic acids or complexes of nucleic acids with endonucleases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102021107508.4A DE102021107508B4 (de) 2021-03-25 2021-03-25 Zuverlässige Identifikation von Bereichen (,a-Sites') in komlexen RNA-Molekülen, die zugänglich sind für Nukleinsäuren oder Komplexe von Nukleinsäuren mit Endonukleasen
DE102021107508.4 2021-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022200407A1 true WO2022200407A1 (de) 2022-09-29

Family

ID=81384663

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2022/057596 WO2022200407A1 (de) 2021-03-25 2022-03-23 Zuverlässige identifikation von bereichen (,a-sites') in komplexen rna-molekülen, die zugänglich sind für nukleinsäuren oder komplexe von nukleinsäuren mit endonukleasen

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240175015A1 (de)
EP (1) EP4314288A1 (de)
CN (1) CN117836410A (de)
BR (1) BR112023018851A2 (de)
CA (1) CA3213865A1 (de)
DE (1) DE102021107508B4 (de)
WO (1) WO2022200407A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4365297A1 (de) * 2022-11-07 2024-05-08 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Nukleinsäurewirkstoffe gegen verschiedene pflanzenpathogene

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003076668A2 (de) * 2002-03-08 2003-09-18 Medigene Ag Verfahren zum identifizieren von spezifischen rna-inhibitoren
WO2005042705A2 (en) 2003-10-22 2005-05-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Short interfering rna and micro-rna compounds and methods of designing, making and using the same
WO2019001602A1 (de) 2017-06-26 2019-01-03 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Methode zur gezielten identifizierung hocheffizienter "small interfering rnas "ernas" zur anwendung in pflanzen und anderen zielorganismen
WO2019222036A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Insideoutbio, Inc. Genetically engineered argonaute proteins with enhanced gene silencing activity and methods of use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003076668A2 (de) * 2002-03-08 2003-09-18 Medigene Ag Verfahren zum identifizieren von spezifischen rna-inhibitoren
WO2005042705A2 (en) 2003-10-22 2005-05-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Short interfering rna and micro-rna compounds and methods of designing, making and using the same
WO2019001602A1 (de) 2017-06-26 2019-01-03 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Methode zur gezielten identifizierung hocheffizienter "small interfering rnas "ernas" zur anwendung in pflanzen und anderen zielorganismen
WO2019222036A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Insideoutbio, Inc. Genetically engineered argonaute proteins with enhanced gene silencing activity and methods of use thereof

Non-Patent Citations (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Practice of Pharmacy", 13. AUSGABE UND J. OF. PHARMACEUTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY, vol. 52, no. 5, pages 238 - 311
ABUDAYYEH O.O., GOOTENBERG J.S., KONERMANN S., JOUNG J., SLAYMAKER I.M., COX D.B.T., SHMAKOV S.: "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", SCIENCE, vol. 353, 2016, pages aaf5573, XP055407082, DOI: 10.1126/science.aaf5573
ABUDAYYEH OMAR ET AL: "Tips and Tricks for Cas13", 6 December 2020 (2020-12-06), XP055942807, Retrieved from the Internet <URL:http://web.archive.org/web/20201206193802/https://zlab.bio/cas13> [retrieved on 20220714] *
BALTZ A.G., MUNSCHAUER M., SCHWANHAUSSER B., VASILE A., MURAKAWA Y., SCHUELER M., YOUNGS N., PENFOLD-BROWN D., DREW K., MILEK M.: "The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts", MOL CELL, vol. 46, 2012, pages 674 - 690, XP028522157, DOI: 10.1016/j.molcel.2012.05.021
BENNETT C.F.: "Therapeutic antisense oligonucleotides are coming of age", ANNU REV MED, vol. 70, 2019, pages 307 - 21
BEVILACQUA P.C., RITCHEY L.E., SU Z., ASSMANN S.Z.: "Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure", ANN REV GEN, vol. 50, 2016, pages 235 - 266
BIRMINGHAM A.: "A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity", NAT PROTOC, vol. 2, 2007, pages 2068 - 2078
CARBONEIL A.CARRINGTON J.C.: "Antiviral roles of plant ARGONAUTES", CURR OPIN PLANT BIOL, vol. 27, 2015, pages 111 - 117
CARBONEIL A.LOPEZ C.DARÖS J.-A.: "Fast-forward identification of highly effective artificial small RNAs against different Tomato spotted wilt virus isolates", MOL PLANT MICROBE INTERACT, vol. 32, 2019, pages 142 - 156, XP055639090, DOI: 10.1094/MPMI-05-18-0117-TA
CARTHEW R.W.SONTHEIMER E.J.: "Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs", CELL, vol. 136, 2009, pages 642 - 655, XP055091221, DOI: 10.1016/j.cell.2009.01.035
CERRITELLI S.M.CROUCH R.J.: "Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes", FEBSJ, vol. 276, 2009, pages 1494 - 1505, XP055039642, DOI: 10.1111/j.1742-4658.2009.06908.x
COX D.B., GOOTENBERG J.S., ABUDAYYEH O.O., FRANKLIN B., KELLNER M.J., JOUNG J., ZHANG F: "RNA editing with CRISPR-Casl3", SCIENCE, vol. 358, 2017, pages 1019 - 1027, XP055491658, DOI: 10.1126/science.aaq0180
DIGNAM J.D.LEBOVITZ R.M.ROEDER R.G.: "Accurate transcription initiation by RNA polymerase 11 in a soluble extract from isolated mammalian nuclei", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 11, 1983, pages 1475 - 1489
DING S-W: "RNA-based antiviral immunity", NAT REV IMMUNOL, vol. 10, 2010, pages 632 - 644, XP055462021, DOI: 10.1038/nri2824
DOWDY S.F.: "Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics", NAT BIOTECHNOL, vol. 35, 2017, pages 222 - 229, XP037135278, DOI: 10.1038/nbt.3802
DUAN C.-G.WANG C.-H.FANG R.-X.GUO H.-S.: "Artificial microRNAs highly accessible to targets confer efficient virus resistance in plants", J VIROL, vol. 82, 2008, pages 11084 - 11095, XP055140122, DOI: 10.1128/JVI.01377-08
EASTMAN P.SHI J.RAMSUNDAR B.PANDE V. S.: "Solving the RNA design problem with reinforcement learning", PLOS COMPUT BIOL, vol. 14, 2018, pages e1006176
ELBASHIR S.M.HARBORTH J.LENDECKEL W.YALCIN A.WEBER K.TUSCHL T: "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells", NATURE, vol. 411, 2001, pages 494 - 498, XP002529540, DOI: 10.1038/35078107
FAKHR E.ZARE F.TEIMOORI-TOOLABI, L: "Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing", CANCER GENE THER, vol. 23, 2016, pages 73, XP055432543, DOI: 10.1038/cgt.2016.4
FANG HUAFENG ET AL: "Native mRNA antisense-accessible sites library for the selection of antisense oligonucleotides, PNAs, and siRNAs", RNA, vol. 16, no. 7, 24 May 2010 (2010-05-24), US, pages 1429 - 1435, XP055942722, ISSN: 1355-8382, Retrieved from the Internet <URL:https://rnajournal.cshlp.org/content/16/7/1429.full.pdf> DOI: 10.1261/rna.1940610 *
FAR ROSEL KRETSCHMER-KAZEMI ET AL: "The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: A comparison with antisense oligonucleotides", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 31, no. 15, 1 August 2003 (2003-08-01), pages 4417 - 4424, XP002317031, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/NAR/GKG649 *
FUKUDOME A.FUKUHARA, T: "Plant dicer-like proteins: double-stranded RNA-cleaving enzymes for small RNA biogenesis", J PLANT RES, vol. 130, 2017, pages 33 - 44, XP036549028, DOI: 10.1007/s10265-016-0877-1
GAGO-ZACHERT S., SCHUCK J., WEINHOLDT C., KNOBLICH M., GROSSE I., PANTALEO V., GURSINSKYT., BEHRENS, S.-E.: " Highly efficacious antiviral protection of plants by small interfering RNAs identified in vitro", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 47, 2019, pages 9343 - 9357
GAGO-ZACHERT SELMA ET AL: "Highly efficacious antiviral protection of plants by small interfering RNAs identified in vitro", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 47, no. 17, 21 August 2019 (2019-08-21), GB, pages 9343 - 9357, XP055942724, ISSN: 0305-1048, Retrieved from the Internet <URL:https://watermark.silverchair.com/gkz678.pdf?token=AQECAHi208BE49Ooan9kkhW_Ercy7Dm3ZL_9Cf3qfKAc485ysgAAAtQwggLQBgkqhkiG9w0BBwagggLBMIICvQIBADCCArYGCSqGSIb3DQEHATAeBglghkgBZQMEAS4wEQQMqOt3j3RKoGA12G5fAgEQgIICh2ZuDNArBQRQjCu_aiI-uLvJ8DVYIsQx6SZm5PB1McQtXh3NIC8Qx5G4ibd7iae--F6_Qwdn77Ahf4njhDXKDwLsbTTom> DOI: 10.1093/nar/gkz678 *
GUO Z.LI Y.DING S.-W.: "Small RNA-based antimicrobial immunity", NAT REV IMMUNOL, vol. 19, 2019, pages 31 - 44, XP036664305, DOI: 10.1038/s41577-018-0071-x
GURSINSKY T., PIROVANO W., GAMBINO G., FRIEDRICH S., BEHRENS S.-E., PANTALEO V.: "Homeologs of the Nicotiana benthamiana antiviral ARGONAUTE1 show different susceptibilities to microRNA168-mediated control", PLANT PHYSIOL, vol. 168, 2015, pages 938 - 952
GURSINSKY T.SCHULZ B.BEHRENS S.-E.: "Replication of Tomato bushy stunt virus RNA in a plant in vitro system", VIROLOGY, vol. 390, 2009, pages 250 - 260, XP026284545, DOI: 10.1016/j.virol.2009.05.009
HAGEDORN P.H.HANSEN B.R.KOCH T.LINDOW M: "Managing the sequence-specificity of antisense oligonucleotides in drug discovery", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 45, 2018, pages 2262 - 2282, XP055517757
HAN Y., HE F., TAN, X., YU, H., BIOMEDICINE (BIBM 2017, 2017, pages 16 - 21
HO S.P., BRITTON D.H., STONE B.A., BEHRENS D.L., LEFFET L.M., HOBBS F.W., MILLER J.A., TRAINORG.L.: "rationally selected by mapping RNA-accessible sites with oligonucleotide libraries", NUCLEIC ACIDS, vol. 24, pages 1901 - 1907, XP002006548, DOI: 10.1093/nar/24.10.1901
HOUSELEY J.TOLLERVEY D: "The many pathways of RNA degradation", CELL, vol. 136, 2009, pages 763 - 776
IKI T., YOSHIKAWA M., NISHIKIORI M., JAUDAL M.C., MATSUMOTO-YOKOYAMA E., MITSUHARA I., MESHI T.: "In vitro assembly of plant RNA-induced silencing complexes facilitated by molecular chaperone HSP90", MOL CELL, vol. 39, 2010, pages 282 - 291
KOBAYASHI H.TOMARI Y: "RISC assembly: Coordination between small RNAs and Argonaute proteins", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1859, 2016, pages 71 - 81, XP029378027, DOI: 10.1016/j.bbagrm.2015.08.007
KOMODA K.NAITO S.ISHIKAWA M: "Replication of plant RNA virus genomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 101, 2004, pages 1863 - 1867
LIMA W.F.VICKERS T.A.NICHOLS J.LI C.CROOKE S.T.: "Defining the factors that contribute to on-target specificity of antisense oligonucleotides", PLOS ONE, vol. 9, 2014, pages e101752
LUCKS J.B.MORTIMER S.A.TRAPNELL C.LUO S.AVIRAN S.SCHROTH G.P.PACHTER L.DOUDNA J.A.ARKIN A.P.: "Multiplexed RNA structure characterization with selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 108, 2011, pages 11063 - 11068, XP003031115, DOI: 10.1073/PNAS.1106501108
MAILLARD P.V., VAN DER VEEN A.G., POIRIER E.Z., REIS E SOUSA C: "Slicing and dicing viruses: antiviral RNA interference in mammals", EMBO J, vol. 38, 2019, pages e100941
MARGIT MUTSO ET AL: "RNA Interference-Guided Targeting of Hepatitis C Virus Replication with Antisense Locked Nucleic Acid-Based Oligonucleotides Containing 8-oxo-dG Modifications", PLOS ONE, vol. 10, no. 6, 3 June 2015 (2015-06-03), pages e0128686, XP055555138, DOI: 10.1371/journal.pone.0128686 *
MARTINEZ J.PATKANIOWSKA A.URLAUB H.LÜHRMANN R.TUSCHL T: "Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi", CELL, vol. 110, 2002, pages 563 - 574, XP002281436, DOI: 10.1016/S0092-8674(02)00908-X
MEISTER G: "Argonaute proteins: functional insights and emerging roles", NAT REV GENET, vol. 14, 2013, pages 447 - 459, XP055412037, DOI: 10.1038/nrg3462
MI S., CAI T., HU Y, CHEN Y., HODGES E., NI F., WU L., LI S., ZHOU H., LONG C., CHEN S., HANNON G.J., QI Y.: "Sorting of Small RNAs into Arabidopsis Argonaute Complexes Is Directed by the 5' Terminal Nucleotide.", CELL, vol. 133, 2008, pages 25 - 26
MIOZZI L.GAMBINO G.BURGYAN JPANTALEO V: "Genome-wide identification of viral and host transcripts targeted by viral siRNAs in Vitis vinifera", MOL PLANT PATHOL, vol. 14, 2013, pages 30 - 43
MIYAGISHI M ET AL: "Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells", ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT, MARY ANN LIEBERT, INC., NEW YORK, US, vol. 13, no. 1, February 2003 (2003-02-01), pages 1 - 7, XP002432810, ISSN: 1087-2906, DOI: 10.1089/108729003764097296 *
MOELLING K.BROECKER F.RUSSO G.SUNAGAWA S.: "RNase H as gene modifier, driver of evolution and antiviral defense", FRONT MICROBIOL, vol. 8, 2017, pages 1745
NAN Y., ZHANG Y.-J.: "Antisense phosphorodiamidate morpholino oligomers as novel antiviral Compounds", FRONT MICROBIOL, vol. 9, 2018, pages 750
PARENT J.-S., BOUTEILLER N., ELMAYAN T., VAUCHERET, H.: "Respective contributions of Arabidopsis DCL2 and DCL4 to RNA silencing", PLANT J, vol. 81, 2015, pages 223 - 232
PERTERMANN R., TAMILARASAN S., GURSINSKY T., GAMBINO G., SCHUCK J., WEINHOLDT C., LILIE H., GROSSE I., GOLBIK R.P., PANTALEO V., B: "A viral suppressor modulates the plant immune response early in infection by regulating microRNA activity", MBIO, vol. 9, 2018, pages e00419 - 18
QURESHI A.TANTRAY V.G.KIRMANI A.R.AHANGAR A. G.: "A review on currents status of antiviral siRNA", REV MED VIROL, vol. 28, 2018, pages e1976
ROUSKIN S.ZUBRADT M.WASHIETL S.KELLIS M.WEISSMAN J.S.: "Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo", NATURE, vol. 505, 2014, pages 701 - 705, XP055659179, DOI: 10.1038/nature12894
SAMPSON T.R.SAROJ S.D.LLEWELLYN A.C.TZENG Y.-L.WEISS, D.S.: "A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence", NATURE, vol. 497, 2013, pages 254 - 257, XP055265324, DOI: 10.1038/nature12048
SCHUCK J.GURSINSKY T.BEHRENS S.-E., METHODE ZUR GEZIELTEN IDENTIFIZIERUNG HOCHEFFIZIENTER ,SMALL INTERFERING RNAS, ERNAS' ZUR ANWENDUNG IN PFLANZEN UND ANDEREN ZIELORGANISMEN, 2018
SCHUCKJ., GURSINSKYT., PANTALEO V., BURGYAN J., BEHRENS, S.-E.: "AGO/RISC-mediated antiviral RNA silencing in a plant in vitro system. ", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 41, 2013, pages 5090 - 5103, XP002785628, DOI: 10.1093/nar/gkt193
SETTEN R.L.ROSSI J.J.HAN S.-P.: "The current state and future directions of RNAi-based therapeutics", NAT REV DRUG DISC, vol. 18, 2019, pages 421 - 446, XP036796447, DOI: 10.1038/s41573-019-0017-4
SHABALINA S.A.KOONIN E.V.: "Origins and evolution of eukaryotic RNA interference", TRENDS, vol. 23, 2008, pages 578 - 587, XP025425555, DOI: 10.1016/j.tree.2008.06.005
SHAO Y.CHAN C.Y.MALIYEKKEL A.LAWRENCE C.E.RONINSON I.B.DING Y.: "Effect of target secondary structure on RNAi efficiency", RNA, vol. 13, 2007, pages 1631 - 1640
SHEN X.COREY D.R.: "Chemistry, mechanism and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 46, 2018, pages 1584 - 1600
TAFER H., AMERES S.L., OBERNOSTERER G., GEBESHUBER C.A., SCHROEDER R., MARTINEZ J., HOFACKER I.L.: "The impact of target site accessibility on the design of effective siRNAs", NOT BIOTECHNOL, vol. 26, 2008, pages 578 - 583
VICKERS T.A.CROOKE S.T.: "The rates of the major steps in the molecular mechanism of RNase Hl-dependent antisense oligonucleotide induced degradation of RNA", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 43, 2015, pages 8955 - 8963
WESSELS HANS-HERMANN ET AL: "Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP US, NEW YORK, vol. 38, no. 6, 16 March 2020 (2020-03-16), pages 722 - 727, XP037167639, ISSN: 1087-0156, [retrieved on 20200316], DOI: 10.1038/S41587-020-0456-9 *
WRIGHT A.V., NUNEZ J.K., DOUDNA J.A.: "Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering", CELL, vol. 164, 2016, pages 29 - 44, XP029385497, DOI: 10.1016/j.cell.2015.12.035
WU B., GRIGULL J., ORE M.O., MORIN S., WHITE K.A.: " Global Organization of a Positive-strand RNA Virus Genome", PLOS PATHOG, vol. 9, 2013, pages e1003363
Z. J. LU ET AL: "Fundamental differences in the equilibrium considerations for siRNA and antisense oligodeoxynucleotide design", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 36, no. 11, 15 May 2008 (2008-05-15), GB, pages 3738 - 3745, XP055347254, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/gkn266 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4365297A1 (de) * 2022-11-07 2024-05-08 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Nukleinsäurewirkstoffe gegen verschiedene pflanzenpathogene
WO2024100038A1 (de) 2022-11-07 2024-05-16 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Nukleinsäurewirkstoffe gegen verschiedene pflanzenpathogene

Also Published As

Publication number Publication date
US20240175015A1 (en) 2024-05-30
CA3213865A1 (en) 2022-09-29
CN117836410A (zh) 2024-04-05
DE102021107508B4 (de) 2023-06-15
BR112023018851A2 (pt) 2023-10-10
DE102021107508A1 (de) 2022-09-29
EP4314288A1 (de) 2024-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Glazier et al. Chemical synthesis and biological application of modified oligonucleotides
DE69435005T2 (de) Antisense Oligonukleotide die anomales Splicing verhindern und deren Verwendung
Nielsen et al. Group I introns: moving in new directions
DE60310944T2 (de) Neue formen von interferierenden rns-molekülen
KR20200074104A (ko) 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
DE202013012241U1 (de) Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
EP3199633B1 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virus-ähnlicher partikel
CN113840925A (zh) 修饰非编码rna分子对于在真核细胞中的沉默基因的特异性
EP1951870B1 (de) Dna-konstrukte zur spezifischen hemmung der genexpression durch rna-interferenz
CN109415729A (zh) 具有降低毒性的基因编辑试剂
DE102010004957A1 (de) Biologisch wirksame Moleküle zur Beeinflussung von Virus-, Bakterien-, Parasiten-infizierten Zellen und/oder Tumorzellen und Verfahren zu deren Anwendung
DE102021107508B4 (de) Zuverlässige Identifikation von Bereichen (,a-Sites&#39;) in komlexen RNA-Molekülen, die zugänglich sind für Nukleinsäuren oder Komplexe von Nukleinsäuren mit Endonukleasen
Lim et al. Invention and early history of gapmers
Wdowikowska et al. Antisense oligonucleotide technology as a research tool in plant biology
WO2019001602A1 (de) Methode zur gezielten identifizierung hocheffizienter &#34;small interfering rnas &#34;ernas&#34; zur anwendung in pflanzen und anderen zielorganismen
DE102011009470A1 (de) Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von Zellen, Verwendung derselben sowie Applikationskit
WO2006027099A2 (de) Hochspezifisch mit dna interagierende enzym-konjugate mit programmierbarer spezifität
EP1664338B1 (de) Verfahren zur synthese von nukleinsäuren und deren anwendung
DE102012022596B4 (de) Neue zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren Anwendung
DE69733696T2 (de) Verfahren zur eliminierung von spezifischen sequenzen während der herstellung von dns-bibliotheken
WO2003025169A2 (de) Nukleinsäure für einen klonierungsvektor
US20210054367A1 (en) Methods and compositions for targeted editing of polynucleotides
DE102004038535B4 (de) Zelluläre Einschleusung von Nukleinsäurewirkstoffen
L Hefferon Innovations in siRNA research: A technology comes of age
Saxena RNA interference and its applications

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22718104

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3213865

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18552397

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023018851

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023018851

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20230915

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023127013

Country of ref document: RU

Ref document number: 2022718104

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022718104

Country of ref document: EP

Effective date: 20231025

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280037538.2

Country of ref document: CN