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Stand der Technik
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Hier beschrieben werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von biologischen Bestandteilen aus einer Probe. Die Vorrichtung ist insbesondere ein sogenanntes „Lab-on-Chip“. Das Verfahren kann insbesondere mit bzw. in einem derartigen Lab-on-Chip durchgeführt werden.
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In üblichen Verfahren zur Isolierung werden Nukleinsäuren aus den verschiedensten Probenmatrizen nach einem immer ähnlichen Grundprinzip extrahiert. Beim Einsatz von Nukleinsäure-bindenden Festphasen werden Nukleinsäuren im ersten Schritt zunächst an die Festphase angebunden. Anschließend wird mittels Waschpuffern die Festphase von ungewünschten Bestandteilen gesäubert. Die Zusammensetzung des Waschpuffers sollte dabei eine Waschwirkung aufweisen und zusätzlich die Aufrechterhaltung von Bindebedingungen für Nukleinsäuren gewährleisten (Trade-Off). Vor der Elution wir die Festphase häufig noch mit Ethanol gespült und dann durch Verdampfen vollständig davon befreit. Im letzten Schritt werden die gebundenen Nukleinsäuren unter Verwendung eines Elutionspuffers eluiert, d.h. von der Festphase abgelöst.
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In üblichen Verfahren werden hauptsächlich zwei verschiedene Festphasen eingesetzt, an welchen die Nukleinsäuren binden.
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Dies sind zum einen stationäre Festphasen in Kombination mit „mobilen Flüssigkeiten“. Hierbei kommen meistens Silicafilter zum Einsatz, die von den Prozessflüssigkeiten durchströmbar sind. Meist erfolgt die Durchströmung durch Zentrifugation, bei der die Prozessflüssigkeit durch eine Zentrifugalkraft in bzw. auf die Festphase gedrückt wird. Nukleinsäuren binden dabei an Silicamoleküle des Filtermaterials, während andere Bestandteile des aufgeschlossenen Zellgemisches ungehindert die Festphase passieren.
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Dies sind zum anderen mobile Festphasen in Kombination mit „stationären Flüssigkeiten“. Die mobilen Festphasen sind häufig funktionalisierte, magnetische Partikel (sogenannte Beads), deren Oberfläche silicafunktionalisiert ist. Bei solchen Beads handelt es sich um wenige Mikrometer große Magnetpartikel an deren Oberfläche Nukleinsäuren unter bestimmten Bedingungen spezifisch binden. Die Beads werden einer Flüssigkeit, die aufgeschlossene Zellen enthält, zugegeben. Die Bindung erfolgt durch durch Bewegung der Flüssigkeit generierten Kontakt der Nukleinsäure an die an die Beadoberfläche gebundenen Silanolgruppen. Die magnetischen Beads können durch ein magnetisches Feld aus der Flüssigphase abgetrennt werden, wobei die Nukleinsäuren durch die Silicaoberfläche festgehaltenwerden. Zum Zwecke des Pufferaustausches können die Beads durch Magneten ortsfest gehalten werden, während die Flüssigkeiten ausgetauscht werden. Beads können z.B. auch mit Antikörpern, Aptameren oder MIPs (molecular imprinted polymer) ausgestattet sein. Diese Moleküle erkennen spezifische Strukturen auf der Oberfläche von Zellen und sorgen damit für die Bindung der Beads an die zu isolierenden Zellen. Beim Durchfluss des Zellgemisches durch eine Säule können die mit den Beads markierten Zellen zurückgehalten werden, während die Flüssigkeiten ausgetauscht werden.
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Beide Methoden haben den Nachteil, dass sich Restbestandteile der Probe (insbesondere sogenannte Prozessflüssigkeiten, welche in der Probe enthalten sind) nach einem Prozessschritt nicht rückstandsfrei von der Festphase entfernen lassen. Dadurch besteht die Gefahr, dass potentiell störende Stoffe/Bestandteile in den nächsten Schritt überführt werden. Dadurch kann zum einen die Effizienz des nächsten Schrittes vermindert sein oder eine Nachweisreaktion (PCR-Reaktion, spektrometrische Analyse) beeinflusst werden.
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Bei Implementierung derartiger Verfahren in ein Lab-on-Chip ist man zusätzlich vor folgende Herausforderungen gestellt:
- • Beim Einsatz flüchtiger Medien (Ethanol, Isopropanol) können die Kunststoffe einer Lab-on-Chip Kartusche verändert werden.
- • Derartige flüchtige Stoffe können nicht vollständig abdampfen und befinden sich in dem geschlossenen Kanalsystem eines Lab-on-Chips.
- • Im Stand der Technik werden Flüssigkeiten aus filterartigen Festphasen meist mittels Zentrifugation entfernt. Aufgrund der feinen Poren des Filtermaterials werden trotzdem immer kleinste Mengen Prozessflüssigkeit aufgrund von Kapillarkräften festgehalten und können nachfolgende Prozessschritte beeinflussen. Bei den meisten Lab-on-Chip-Systemen (außer zentrifugalmikrofluidischen Systemen) können keine für diesen Schritt vorteilhaften Volumenkräfte (Zentripetalkraft) erzeugt werden.
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Offenbarung der Erfindung
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Hiervon ausgehend sollen hier ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben werden, mit welchen die Isolierung von bestimmtem biologischen Material aus einer Probe rückstandsfrei möglich ist. Mit dem Begriff „rückstandsfrei“ ist hier insbesondere gemeint, dass keine unerwünschten Substanzen aus der Probe mehr an dem zu isolierenden biologischen Material verbleiben.
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Diese Aufgaben werden gelöst mit einem Verfahren sowie einer Vorrichtung (Lab-on-Chip) gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Beschrieben werden soll in diesem Zusammenhang zunächst ein Verfahren zum Isolieren von biologischen Bestandteilen aus einer Probe, aufweisend (zumindest) die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer Haftoberfläche,
- b) Beaufschlagen der Haftoberfläche mit der Probe,
- c) Binden der biologischen Bestandteile an der Haftoberfläche,
- d) Entfernen von Restbestandteilen der Probe von der Haftoberfläche durch Verdrängung mit Hilfe eines Verdrängermediums.
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Vorteilhafterweise kann das Verfahren mit einer hier angegebenen Vorrichtung bzw. einem hier vorgeschlagenen Lab-on-Chip durchgeführt werden.
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In der Regel werden die Schritte a), b), c) und d) (zumindest einmal) in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. In diesem Zusammenhang kann vorgesehen sein, dass für jede Wiederholung der Schritt a) bis d) eine neue Haftoberfläche oder eine erneuerte Haftoberfläche bereitgestellt wird. Es kann auch vorgesehen sein, dass Schritt a) nur einmal durchgeführt wird und/oder den Schritten b), c) und d) (zeitlich) deutlich vorgelagert ist. In diesem Zusammenhang kann vorgesehen sein, dass die einmal bereitgestellte Haftoberfläche mehrfach verwendet werden kann. In der Regel werden (hierbei) zumindest die Schritte b), c) und d) in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Dabei können die Schritte b), c) und d) auch mehrfach in der angegebenen Reihenfolge hintereinander wiederholt werden. Insbesondere die Schritte b) und c) können darüber hinaus auch zumindest teilweise parallel oder sogar gleichzeitig durchgeführt werden.
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Besonders vorteilhaft ist, wenn die Haftoberfläche eine Silicaoberfläche ist. In weiteren Ausführungsvarianten kann die Haftoberfläche eine Oberfläche mit Fängermolekülen, wie z.B. Antikörper, Aptamere, MIP (molecular imprinted particles) sein. Die Haftoberfläche wird bevorzugt in einem Reaktionsgefäß bereitgestellt, welches beispielsweise ein dafür vorgesehenes Kompartment auf einem Lab-on-Chip sein kann.
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Üblicherweise ist vorgesehen, dass sich in Schritt b) (ggf. auch in den Schritten b) und c)) das zu isolierende biologische Material an der Haftoberfläche anlagert bzw. dieses dort (gezielt) angelagert wird. Die Haftoberfläche kann eine Dreidimensionalität aufweisen. Das biologische Material kann in der Haftoberfläche bzw. in die Haftoberfläche (d.h. bis (kurz) unter der Haftoberfläche bzw. bis in das die Haftoberfläche bildende Material hinein) eingelagert sein. Die Haftoberfläche kann beispielsweise eine Art Filter sein.
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Durch Schritt c) ist insbesondere ausgedrückt, dass eine feste Verbindung zwischen dem zu isolierenden biologischen Material und der Haftoberfläche gebildet wird. Diese feste Verbindung ist bevorzugt eine mechanisch feste Verbindung. Dies bedeutet mit anderen Worten insbesondere, dass das zu isolierende biologische Material nicht (mehr) ohne weiteres (insbesondere nicht ohne zusätzliche (chemische, biologische oder mechanische) Lösungsmittel) von der Haftoberfläche gelöst werden kann. Vielmehr sollen die Moleküle des zu isolierenden biologischen Materials eine derart feste Verbindung mit der Haftoberfläche eingehen, dass sie während der Verdrängung der Restbestandteile der Probe an der Haftoberfläche verbleiben.
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In Schritt d) erfolgt die Verdrängung insbesondere durch physikalische (besonders bevorzugt durch mechanische) Kräfte, die das Verdrängermedium (beispielsweise in der Art eines Stempels bzw. Kolbens) auf die Probe ausübt. Diese Kräfte wirken dabei in der Regel gleichermaßen auf das zu isolierende biologische Material wie auch auf Restbestandteile der Probe. In vorteilhafter Weise haftet das zu isolierende biologische Material dabei allerdings derart fest an der Haftoberfläche an, dass es von dort nicht (mit) verdrängt wird. So können die Restbestandteile der Probe von dem zu isolierenden biologischen Material durch Verdrängung (physikalisch und/oder mechanisch) entfernt bzw. getrennt werden. Bei dem Verdrängen handelt es sich insbesondere um ein physikalisches Verschieben von nicht gebundenen Molekülen.
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Weiter vorteilhaft ist das beschriebene Verfahren, wenn die zu isolierenden biologischen Bestandteile Nukleinsäuren sind. Besonders vorteilhaft ist das beschriebene Verfahren, wenn die zu isolierenden biologischen Bestandteile DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder RNA (Ribonukleinsäure) sind. Dies bedeutet mit anderen Worten insbesondere, dass die zu isolierenden biologischen Bestandteile DNA, RNA oder zumindest Bestandteile von DNA oder RNA umfassen.
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Außerdem vorteilhaft ist das beschriebene Verfahren, wenn die zu isolierenden biologischen Bestandteile bestimmte Zellen sind. Solche bestimmten Zellen können beispielsweise bestimmte Zellen aus einer Blutprobe sein, wenn die Probe eine Blutprobe ist. Solche Zellen können aber beispielsweise auch bestimmte Tumorzellen sein. Die Formulierung „bestimmte Zellen“ meint dabei insbesondere eine bestimmte Art oder Sorte von Zellen und nicht unbedingt bestimmte einzelne Zellen. Dies bedeutet mit anderen Worten insbesondere, dass zum Beispiel Zellen von einem ersten Typ isoliert werden sollen, wohingegen Zellen von einem sich davon unterscheidenden zweiten Typ nicht isoliert werden sollen. Insbesondere können die zu isolierenden biologischen Bestandteile Zellen sein, die ein Indikator für einen bestimmten Zustand und/oder eine bestimmte Erkrankung eines Patienten sein können.
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Weiterhin vorteilhaft ist das beschriebene Verfahren, wenn die Probe eine Prozessflüssigkeit umfasst, die zumindest eine der folgenden Flüssigkeiten umfasst:
- - Ethanol, und/oder
- - Wasser.
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Insbesondere Ethanol oder Wasser können für nachfolgende Prozessschritte, die mit dem zu isolierenden biologischen Material durchgeführt werden sollen, negativ sein. Daher ist es vorteilhaft, diese mit dem beschriebenen Verfahren aus der Probe zu entfernen.
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Besonders vorteilhaft ist das Verfahren, wenn das Verdrängermedium zumindest eine der folgenden Substanzen umfasst:
- - Alkane,
- - Silikonöle,
- - halogenisierte Kohlenwasserstoffe,
- - Fluorkohlenwasserstoffe.
- - Paraffine, und/oder
- - Mineralöl.
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Als Verdrängermedium kommen insbesondere Alkane (Paraffine, Mineralöl) zum Einsatz. Das Verdrängermedium ist insbesondere aprotisch und/oder unpolar. Es kann auch als aprotisches Lösungsmittel oder als unpolares Lösungsmittel bezeichnet werden. Die Begriffe „aprotisch“ und „unpolar“ beschreiben insbesondere Lösungsmittel, die kein inhärentes Dipolmoment aufweisen. Häufig sind beide Begriffe deckungsgleich. Das heißt ein aprotisches Lösungsmittel ist immer unpolar. Es gibt aber unpolare Lösungsmittel, die nicht aprotisch sind und nur aus Symmetriegründen kein Dipolmoment aufweisen. Die Nachteile solcher Verdrängermedien können allerdings Viskosität, die Restlöslichkeit für DNA/RNA, die Benetzung von Oberflächen und/oder die „Maskierung von Oberflächen“ sein. Demgegenüber steht allerdings der Vorteil, dass eine Inertisierung von LoC-Oberflächen durch Benetzung/Belegung (Vermeidung von Nukleinsäure-Verlust an Oberflächen) erfolgen kann.
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Verdrängermedien können weiter bevorzugt halogenisierte Kohlenwasserstoffe aufweisen. Halogenisierte Kohlenwasserstoffe weisen in der Regel eine geringere Benetzung von Oberflächen auf. Hieraus folgt üblicherweise eine geringere Restlöslichkeit von bzw. für DNA/RNA. Allerdings kann der Einsatz derartiger Verdrängermedien mit den meisten Kunststoffen problematisch sein. Dem stehen allerdings die Vorteile einer Inertisierung von LoC-Oberflächen durch Benetzung/Belegung (Vermeidung von Nukleinsäure-Verlust an Oberflächen) gegenüber, wie oben schon angedeutet ist.
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Eine weitere Gruppe von möglichen Verdrängermedien sind Silikonöle. Silikonöle als Verdrängermedien können den Nachteil einer geringen Viskosität sowie einer Restlöslichkeit für DNA/RNA haben. Vorteilhaft ist allerdings die Benetzung von Oberflächen und/oder „Maskierung von Oberflächen“.
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Noch eine weitere Gruppe von möglichen Verdrängermedien sind Fluorkohlenwasserstoffe, Perfluoralkane oder ähnliche Verbindungen. Zum Beispiel könne hierfür: FC40, FC70, FC77 und/oder Fomblin angeführt werden.
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Außerdem vorteilhaft ist das Verfahren, wenn das Verdrängermedium so gewählt ist, dass es zumindest eine der nachfolgenden Reaktionen nicht beeinflusst:
- - PCR-Reaktion, und/oder
- - Nukleinsäuren-Extraktionsprozess.
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Beispiele für ein geeignete Verdrängermedien sind perfluorierte Verbindungen. Konkrete Beispiele sind:
- - Perfluoroalkan,
- - Perfluorotri-alkyl-amin,
- - Alkane (z.B. Paraffin oder Mineralöl),
- - cyclo-Alkan,
- - Tri-Alkyl-amin, oder
- - Siliconöl.
Es sind auch Mischungen derartiger Medien denkbar.
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Diese Verfahren werden bevorzugt nach der Durchführung des beschriebenen Verfahrens mit den zu isolierenden biologischen Bestandteilen durchgeführt. Durch die Verwendung eines Verdrängermediums, welches diese Reaktionen nicht beeinflusst, kann in vorteilhafter Weise sichergestellt werden, dass auch (geringe) Rückstände des Verdrängermediums für das/die beschriebene(n) (nachfolgende(n)) Verfahren unschädlich sind.
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Weiterhin vorteilhaft ist das Verfahren, wenn der Probe vor Schritt c) ein Bindepuffer hinzugegeben wird, der eine Anbindung des zu isolierenden biologischen Materials an der Haftoberfläche unterstützt, wobei der Bindepuffer in Schritt d) durch Verdrängung mit entfernt wird. Dies erlaubt den besonderen Vorteil, dass eine möglichst feste Verbindung zwischen zu isolierendem biologischen Material und Haftoberfläche mit möglichst hoher Sicherheit gewährleistet werden kann, bei gleichwohl möglichst geringer Beeinflussung des zu isolierenden biologischen Materials.
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Bevorzugt beinhaltet der Bindepuffer zumindest eine der nachfolgenden Substanzen:
- - Chaotrope,
- - Salz, und/oder
- - Beads.
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Als Beads kommen insbesondere sogenannte magnetische Beads in Betracht, die weiter oben auch schon beschrieben sind. Durch diese Stoffe kann ein Anhaften von den zu isolierenden biologischen Bestandteilen an der Haftoberfläche vorteilhaft unterstützt werden.
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Ein Beispiel für eine Zusammensetzung eines Bindepuffer soll hier mit folgenden Inhaltsstoffen angegeben werden:
- - chaotrope Salze, wie Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid in einer Konzentration von ca. 2 M - 5 M.
- - zusätzlich wenigstens ein organisches Lösemittel, bspw. Isopropanol oder Ethanol in einer Konzentration zwischen ca. 40 % - 70 %.
Zudem ist der Bindepuffer bevorzugt leicht sauer. Der Bindepuffer hat beispielsweise einen PH-Wert im Bereich zwischen pH 4,5 und pH 6,5. Hierdurch wird die Bindung der Nukleinsäuren an die Silicamembran besser vermittelt.
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Darüber hinaus vorteilhaft ist das Verfahren, wenn nachfolgend zu Schritt d) das isolierte biologische Material für zumindest eines der folgenden (bzw. zumindest einen der folgenden Prozesse) bereitgestellt wird:
- - PCR-Reaktion, und/oder
- - Nukleinsäuren-Extraktionsprozess.
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Hier auch beschrieben werden soll eine Vorrichtung zum Isolieren von biologischen Bestandteilen aus einer Probe, wobei die Vorrichtung insbesondere ein Lab-on-Chip ist, aufweisend ein Reaktionsgefäß mit einer Haftoberfläche zur Anlagerung eines zu isolierenden biologischen Materials sowie mit mindestens einem Reservoir, in welchen ein Verdrängermedium bereitgestellt ist, mit welchem Prozessflüssigkeiten aus dem Reaktionsgefäß verdrängt werden können.
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Bevorzugt sind in dem hier beschriebenen Lab-on-Chip sämtliche benötigten Reagenzien vorgehalten. Das bedeutet die Reagenzien sind von Anfang an und direkt mit der Auslieferung des Lab-on-Chips in diesem bevorratet. Das gilt in jedem Fall für das Verdrängermedium. Das Verdrängermedium hat die weiter oben beschriebenen besonderen Eigenschaften.
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Die Vorrichtung bzw. das Lag-on-Chip ist insbesondere zur Durchführung des hier auch beschriebenen Verfahrens eingerichtet. Die für das beschriebene Verfahren erläuterten besonderen Vorteile und Ausgestaltungsmerkmale sind in analoger Weise auf die beschriebene Vorrichtung (das Lab-on-Chip) anwendbar und übertragbar.
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Bevorzugt umfasst die beschriebene Vorrichtung (das Lab-on-Chip) mehrere Reservoire, aus denen Medien in das Reaktionsgefäß gefördert werden können. Hierzu zählen insbesondere Reservoire für die Probe (ein sogenanntes Probenreservoir), Reservoire für Bindemittel, Reservoire für das Verdrängermedium sowie ggf. Reservoire für ein Eluat, mit welchem das isolierte biologische Material zu Stellen zur Durchführung nachfolgender Prozessschritte (wie z. B. PCR oder Nukleinsäuren-Extraktionsprozesse) gefördert werden kann. Bevorzugt existiert ein Leitungssystem, welches die verschiedenen Reservoire mit dem Reaktionsgefäß verbindet. Bevorzugt existieren darüber hinaus Ventile, mit welchen gezielt einzelne Reservoire mit dem Reaktionsgefäß verbunden werden können sowie eine Fördereinrichtung, mit der die Substanzen aus den einzelnen Reservoiren in das Reaktionsgefäß und wieder aus dem Reaktionsgefäß hinaus gefördert werden können. Bevorzugt existiert auch ein Abfallreservoir, in welches nicht mehr benötigte, bereits prozessierte (im Reaktionsgefäß verwendete) Substanzen gefördert werden können. Die Fördereinrichtung ist oder umfasst insbesondere eine Pumpe, die sowohl zum Saugen als auch zum Bedrucken der Prozesskammer eingerichtet ist.
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Durch das hier beschriebene Verfahren und die beschriebene Vorrichtung wird die Entfernung von Prozessflüssigkeiten von DNA/RNA-enthaltenden Oberflächen durch direkte und vollständige Volumenverdrängung zum Beispiel aus einem Filter oder von Beads in besonders vorteilhafter Weise möglich. Dabei haben die Verdrängermedien vorzugsweise viele, besonders bevorzugt alle folgenden Eigenschaften:
- • Inert, d.h. keinerlei chemische Aktivität/Reaktivität,
- • Aprotisch (unpolar, wasserabweisend),
- • Keine Mischbarkeit mit Prozessflüssigkeiten,
- • Niedrige Viskosität, hohe Filtergängigkeit,
- • Keine Lösevermögen für Nukleinsäuren,
- • Keine Aktivität in nachfolgenden biochemischen Reaktionen und Nachweisen, und/oder
- • Keine Bindung an die Filteroberfläche.
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Das beschriebene Verfahren ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise die vollständige Entkopplung der Prozessbedingungen von aufeinander folgenden Schritten, weil sämtliche Rückstände (Prozessflüssigkeiten) aus einem ersten Schritt vor der Durchführung eines zweiten Schrittes entfernt werden können. Dies wird durch den Einsatz von Verdrängermedien für die vollständige Entfernung von Prozessflüssigkeiten nach dem jeweiligen Prozessschritt erreicht.
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Durch das beschriebene Verfahren können sich insbesondere einer oder mehrere der folgenden Vorteile ergeben:
- • Keine Beeinflussung einer nachfolgenden PCR-Reaktion durch Prozessflüssigkeiten, weil aufgrund der Verdrängung keine die PCR störenden Substanzen/Prozessflüssigkeiten (konkret Ethanol oder Bestandteile des Binde- oder Waschpuffer) in das Eluat für die nachfolgende PCR-Reaktion überführt werden.
- • Das Verdrängermedium selbst hat keinen Einfluss auf eine biochemische Folgereaktion oder Nachweisverfahren (z.B. spektrometrisch), dafür nachfolgende Reaktionen „unsichtbar“.
- • Es erfolgt keine Beeinflussung nachfolgender Schritte der Nukleinsäure-Extraktion, da nicht mit den Prozessflüssigkeiten mischbar und Nukleinsäuren nicht in dem Verdrängermedium lösbar. Dadurch erhöht sich die Effizienz einer Nukleinsäure-Extraktion.
- • Es müssen keine für die Materialien einer LoC-Kartusche problematischen Alkohole wie Isopropanol oder Ethanol mehr eingesetzt werden, da eine vollständige Entfernung von Prozessflüssigkeiten des vorhergehenden Schrittes durch das Verdrängermedium erreicht werden kann.
- • Vereinfachung der Binde- Wasch- und Elutionsstrategien/Puffer durch Vermeidung eines direkten Kontaktes der Prozessflüssigkeiten.
- • Auch ohne den Einsatz von Zentrifugalkräften können die Prozessflüssigkeiten nach Beendigung des jeweiligen Schrittes vollständig von der Festphase entfernt werden. Daher ist das erfinderische Vorgehen der Schlüssel zum Erfolg für eine effiziente Nukleinsäure-Extraktion auf einem Lab-on-Chip.
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Das beschriebene Verfahren wird nachfolgend anhand der Figuren erläutert. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Figuren nur schematisch sind und insbesondere keine Größenverhältnisse zeigen. Die Figuren zeigen im Einzelnen, schematisch und beispielhaft:
- 1a bis 1e: Den prinzipiellen Ablauf einer Nukleinsäurenaufreinigung mit inerten Verdrängermedien;
- 2: Eine Ausgangssituation für das beschriebene Verfahren in einem Lab-on-Chip;
- 3a und 3b: Das Einstellen von Bindebedingungen und Binden der Nukleinsäuren an eine Silicaoberfläche;
- 4: Ein restloses Verdrängen von ungebundenen Molekülen im Rahmen des beschriebenen Verfahrens;
- 5a und 5b: Ein Eluieren der Nukleinsäuren durch Aufheben der Bindebedingungen und ein Lösen des gefriergetrockneten PCR-Mastermixes; und
- 6: Eine Verbesserung der Aufreinigungseffizienz von Nukleinsäuren, die mit dem beschriebenen Verfahren gegenüber herkömmlichen Verfahren erreicht werden kann.
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In den Figuren wird das beschriebene Verfahren an dem Beispiel von Nukleinsäuren als zu isolierendem biologischen Material beschrieben. Hierauf sind das beschriebene Verfahren und die beschriebene Vorrichtung aber nicht begrenzt.
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In 1a bis 1e wird die generelle Abfolgesequenz des beschriebenen Verfahrens bzw. des dem beschriebenen Verfahren zu Grunde liegenden Prozesses gezeigt. In allen 1a bis 1e ist jeweils ein Reaktionsgefäß 5 gezeigt, in welchem die einzelnen Prozessschritte in den 1a bis 1e in der durch die Buchstabenkürzel a) bis e) angegebenen Reihenfolge hintereinander ablaufen.
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1a zeigt dabei die Ausgangssituation. Zu erkennen ist eine in dem Reaktionsgefäß 5 bereitgestellte Haftoberfläche 4 (bevorzugt eine Silicaoberfläche 4) sowie ein in das Reaktionsgefäß 5 eingebrachter Bindepuffer 6 in welchem die Nukleinsäuren 2 gelöst sind, wobei in dem Bindepuffer ebenfalls Proteine 3 und Lipide 7 gelöst sind.
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Eine Direversible (mehrfach reversible) Bindung von Nukleinsäuren 2 an eine Oberfläche (in diesem Ausführungsbeispiel eine Silicaoberfläche 4) wird durch die Eigenschaften des Bindepuffers 6 vermittelt. Dieser Binderpuffer verändert seine Eigenschaften, indem die Eigenschaften der im Bindepuffer 6 gelösten Nukleinsäure 2 auf eine (bestimmte) Weise verändert werden. Die Nukleinsäure 2 ist zum Start des beschriebenen Verfahrens negativ geladen und hat Phosphatreste. Die negativ geladene Nukleinsäure 2 kann sich mit ihrem Phosphatrest an die Silanolgruppen anlagern. Diese Silanolgruppen sind an der Silicaoberfläche 4 bereitgestellt. Zusätzlich gibt es hydrophobe Wechselwirkungen der Nukleinsäurenbase der Nukleinsäure 2 an die hydrophobe Silica-Region. Im Bindepuffer gelöste Chaotrope 1 (bezeichnet chemische Substanzen, die geordnete Wasserstoffbrückenbindungen im Wasser stören, insbesondere Salze) führen zu einer Dehydratisierung der Nukleinsäure 6 und der Ausbildung von eine Salzbrücke zwischen der negativ geladenen Silicaoberfläche und des ebenfalls negativ geladenen Nukleinsäurenrückgrats der Nukleinsäure 2 durch positiv geladene Ionen. Hierdurch haftet die Nukleinsäure 2 an der Silicaoberfläche 4. Dies ist in 1b gezeigt.
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1b zeigt weiter, dass weitere Zellbestandteile, nämlich beispielsweise Proteine 3 und Lipide 7 so von den Nukleinsäuren 2 abgetrennt werden können.
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In 1c bis 1e ist nun der Einsatz des Verdrängermediums 8 dargestellt. 1c zeigt zunächst das Einbringen des Verdrängermediums 8. Das Verdrängermedium wird durch das Material durchgespült. Das Verdrängermedium verdrängt alle Bestandteile des Bindepuffers 6 vollständig von den an die Festphase (die Silicaoberfläche 4) gebundenen Nukleinsäuren 2 und wird verworfen. Das Medium ist nicht mit anderen verwendeten Lösungen und Bindepuffer 6 mischbar und inert. Es handelt sich um ein physikalisches Verschieben von nicht gebundenen Molekülen. Mit dem Begriff physikalisches Verschieben ist hier insbesondere gemeint, dass durch physikalische Parameter (Druck, Reibung etc.) ein Verschieben der gebundenen Moleküle erfolgt. In 1 d ist der Zustand gezeigt, in welchem diese Verschiebung bereits erfolgte. Das Verdrängermedium befindet sich nun zusammen mit den von den Nukleinsäuren 2 getrennten Bestandteilen (Proteinen 3, Lipiden 7 und Chaotropen 1 bzw. Salzen) unterhalb der Silicaoberfläche 4. Die Nukleinsäuren 2 werden anschließend durch Auflösen der Bindebedingungen unter Verringerung der Salzkonzentration wieder von der Festphase (der Silicaoberfläche 4) gelöst. Dies ist in 1e dargestellt.
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2 5b zeigen, wie ein solches Verfahren in einem Lab-on-Chip- 9 stattfinden kann. In 2 ist zunächst der Aufbau eines derartigen Lab-on-Chips 9 erläutert. Anschließend wird in den 3a bis 5b das beschriebene Verfahren, ausgeführt in diesem Lab-on-Chip 9, erläutert.
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Auf einem Lab-on-Chip 9 werden alle für den Prozess notwendigen Reaktionsmedien vorgelagert. Dafür sind in dem Lab-on-Chip 9 Reservoirs 10 für die einzelnen Medien vorgesehen. Sowohl die Anzahl und Art der Medien als auch die Maximalvolumina sind abhängig von der Chip-Geometrie des Lab-on-Chips 9. Bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren werden mindestens drei bis vier unabhängig voneinander wirkende Reagenzien benötigt, die in Reservoirs 10 bereitgehalten werden können.
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Zur Durchführung des eigentlichen Verfahrens (wie es auch schon in den 1a bis 1e beschrieben ist) wird in dem Lab-on-Chip ein Reaktionsgefäß 5 mit der Silicaoberfläche 4 bereitgestellt. Die einzelnen Reservoirs 10 sind mit dem Reaktionsgefäß 5 über ein Leitungssystem 14 verbunden. Die Zugabe von Reagenzien aus den einzelnen Reservoirs 10 zu dem Reaktionsgefäß 5 kann über Ventile 15 gesteuert werden. Gegebenenfalls ist bei einzelnen Reagenzien eine Mischung erforderlich, damit die im Rahmen des beschriebenen Verfahrens notwendigen Prozessschritte durchgeführt werden können. Dann ist zwischen den jeweiligen Reservoirs 10 dieser Reagenzien und dem Reaktionsgefäß 5 jeweils ein Mischer 11 vorgesehen.
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Das Lab-on-Chip 9 weist bevorzugt eine Fördereinrichtung 12 (typischerweise eine Pumpe) auf, mit welcher das Reagenz aus dem Reservoir in das Reaktionsgefäß 5 gelangen kann. Typischerweise wird das Reagenz in das Reaktionsgefäß 5 angesaugt. Aus dem Reaktionsgefäß 5 kann der dort enthaltene Inhalt (Reagenzien) mittels der Pumpe auch angesaugt werden und dann ggf. auch in ein Abfallreservoir 13 gefördert werden. Dies kann ggf. durch eine Umkehrung der Förderrichtung der Fördereinrichtung 12 geschehen.
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Die 2 zeigt (wie schon beschrieben) eine Ausgangssituation, in welcher sich alle Reagenzien in den Reservoiren befinden. Eines der auf dem Lab-on-Chip 9 vorhandenen Reservoire ist ein Probenreservoir 16, in welchem die Probe 17 enthalten ist, die mit dem beschriebenen Verfahren verarbeitet werden soll und aus welcher Nukleinsäuren 2 herausgelöst werden sollen.
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Für die Durchführung des beschriebenen Verfahrens wird zunächst ein chaotropes Reagenz erzeugt. Dies ist in 3a gezeigt, in welcher die in dem Probenreservoir 16 enthaltene Probe 17 mit einem Bindungsvermittler aus einem weiteren Reservoir 10 versetzt wird. Dieser Bindungsvermittler ist bevorzugt eine hochsalzige Lösung, beinhaltend Chaotrope. Dieses Versetzen geschieht in dem Mischer 11. Die Mischung wird dann gemäß 3b in das Reaktionsgefäß 5 gegeben. In 3b ist ein Zustand gezeigt, in welchem ein Anhaften von Nukleinsäuren 2 an der Silicaoberfläche 4, erfolgt ist wobei hierbei Salze bzw. Chaotrope 1 die Bindung vermitteln, aus der Probe bereits herausgelöst und in das Abfallreservoir 13 gefördert wurden Lipide 7 und Proteine 3.
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Als weitere Reagenz kann eine weitere hochsalzige Lösung aus einer Vorlagerung über den Silicafilter geführt werden. Dies ist in 3b gezeigt. So können Zellreste, wie Proteine 3 oder Lipide 7 entfernt werden. Diese sind in 3b bereits in das Abfallreservoir 13 gelangt.
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Die restlose Entfernung der Salze bzw. der Chaotrope 1 oder weiteren ungebundenen Verbindungen erfolgt durch Verwendung des inerten Verdrängermediums 8 gemäß 4. Unter Aufhebung der Bindeeigenschaften werden die gebundenen Nukleinsäuren von der Oberfläche gelöst und zu einem gefriergetrockneten PCR-Mastermix gegeben. Dies geschieht gemäß 5a und 5b. Gemäß 5a wird aus dem oberen Reservoir 10 eine Trägerflüssigkeit bereitgestellt, mit welcher die an der Silicaoberfläche 4 haftenden Nukleinsäuren 2 abtransportiert werden können. Gemäß 5b ist dargestellt, wie diese Nukleinsäuren 2 über die Fördereinrichtung 12 bereitgestellt werden.
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6 zeigt die experimentell ermittelte Verbesserung der Aufreinigungseffizienz von Nukleinsäuren aus einem Trägermedium durch den Einsatz von inertem Verdrängermedium. Im Vergleich ist die Aufreinigungseffizienz eines Referenzkits nach herkömmlichen Verfahren gezeigt, wobei der rechte Balken die Effizienz des beschriebenen Verfahrens zeigt, welche im Verhältnis zu üblichen Verfahren 333% beträgt.
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Das mit einer Probe das beschriebene Verfahren durchgeführt wurde, ist insbesondere durch optische Inspektion eines Reaktionsträgers und/oder durch spektrometrische Analyse der Nachweisreagenzien nachweisbar.
