EP2115137A1 - Vorrichtung und verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren

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Publication number
EP2115137A1
EP2115137A1 EP08701209A EP08701209A EP2115137A1 EP 2115137 A1 EP2115137 A1 EP 2115137A1 EP 08701209 A EP08701209 A EP 08701209A EP 08701209 A EP08701209 A EP 08701209A EP 2115137 A1 EP2115137 A1 EP 2115137A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
sec
materials
chromatography
purification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08701209A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2115137A1 publication Critical patent/EP2115137A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for the purification of nucleic acids and the use of the device,
  • nucleic acids are used in a number of fields, such. B. of recombinant genetic engineering, in medical diagnostics, as probes and much more. There is often the need Nukieinklagemische of different origin of contaminating, subsequent reactions disturbing substances to separate. For this, various methods are known.
  • the nucleic acids are often purified and / or concentrated by chromatographic methods in which they are attached to surfaces of, for. B. Adsorbed silica, silica polymers, magnesium silicate or the like, fortified by washing and desorption in each case with suitable solvents. In this case, the unwanted impurities are removed by the washing, and finally the desired nucleic acids are eluted by the desorption.
  • This routine results in all purification processes in which the target molecule to be purified (eg nucleic acids) first binds to a support material (silica, ion exchanger, hydrophobic-interaction chromatography resins, reversed phase
  • a support material silicon, ion exchanger, hydrophobic-interaction chromatography resins, reversed phase
  • high-quality preparations of the target molecule generally result from this procedure, the number of working steps is relatively high.
  • SEC size exclusion chromosome
  • GPC gel permeation chromatography
  • a GPC system or SEC system generally includes pump, injection system, separation column (s), and detector (s).
  • the pump sucks the mobile phase, e.g. a suitable elution buffer, and generates a flow throughout the system.
  • the injection system (manual or automatic) applies the sample to the separation column, in which the sample is separated due to the different hydrodynamic radius of the components. The detection is done by detectors.
  • the separation fins are filled with the stationary phase, ie with small beads of a porous highly crosslinked material.
  • the stationary phase ie with small beads of a porous highly crosslinked material.
  • Sephadex is widely used ® , Sephacryl ® or Sepharose ® (Pharmacia), Biogel ® (Bio-Rad), or Fractogel ® (Merck).
  • SEC separation is based on the distribution of molecules between the liquid between the chromatographic material globules and the liquid in the pores within these areas.
  • the diameter of the beads is in the micron range.
  • the small molecules pass into the pores of the stationary phase and therefore linger longer on the column as the larger molecules that are therefore eluted first.
  • the columns used have a very small pore size distribution and separate very well in a certain molecular size range. In order to achieve a separation over a larger molecular weight range, several columns of different pore sizes have to be connected in series.
  • a DNA ultrafiltration process is e.g. disclosed in DE-A 1 02 01 487.
  • US 2004/0002081 discloses a process for isolating and purifying an industrial-scale polynucleotide which is of a type chromophthalic method using at least two different chromatographic steps selected from hydrophobic interaction chromatography, polar interaction chromatography and anion exchange chromatography, wherein in at least one step the chromatographic support is a monolithic porous bed.
  • EP-A-1 719 16 discloses a DNA separation and purification material which is an integral monolithic porous body of glass or silica having pores extending from one end to the other, corresponding to nucleic acid sizes from 35 bp to 100 Kbp, so that the corresponding nucleic acids are retained in these pores.
  • WO 01/94574 discloses a material for purifying DNA sequencing reaction products, ie for separating the DNA sequencing fragments from sequencing templates, enzymes, salts and nucleotides, combining a filtration medium with a molecular cut-off filter in a single chromatography column.
  • a material for purifying DNA sequencing reaction products ie for separating the DNA sequencing fragments from sequencing templates, enzymes, salts and nucleotides, combining a filtration medium with a molecular cut-off filter in a single chromatography column.
  • an SEC-material such as Sephadex ® G-50 or Sephacryl ® with a Whatman Polyfiltronics ® - combined ultrafiltration membrane.
  • EP-A-1 589 337 discloses a packing material for FJ chromatography comprising particle mixtures of at least two components for the separation of small molecules, proteins or nucleic acids.
  • the particles may consist of any inorganic and / or inorganic-organic hybrid materials suitable for chromatographic application, e.g., silica particles.
  • the two components each have a particle size distribution and an average particle diameter, wherein the difference between two average particle diameters is less than or equal to 40% of the larger average.
  • WO 2004/01 1 142 discloses an apparatus for purifying a sample, eg containing nucleic acids, in which an SEC material and an ion exchange material! (IEC material) are combined.
  • IEC material an ion exchange material!
  • SEIE size-exclusion ion-exchange particles
  • a core of an ion exchange material which may be capable of size exclusion, is surrounded by a shell of an SEC material.
  • SEIE materials may also be used in a single chromatography column.
  • the dimensions of the column and the amount of the stationary phase is adapted to the amount of substance to be cleaned suitably.
  • the solvent is introduced under pressure (generated by pumping) into the top of the column.
  • the stationary phase is introduced into the wells of microtiter plates, the mixture to be separated in the wells, introduced eluants in the wells and then eluted by applying a vacuum, or the stationary phase is placed on a frit in an open-bottom Eppendorf tube, the The substance to be separated and the eluent are applied and then the tube is placed in a centrifuge tube and the elution is effected by centrifugation so that the egguate collects in the centrifuge tube and can be removed therefrom and processed further.
  • z. B. in the workup of PCR reaction mixtures by centrifugation with DyeEx ® (Qiagen GmbH) chromatographed to separate color markers and primers from the PCR products.
  • a chromatography device for nucleic acids or the combination of chromatography and membrane method was desired, with which the selectivity and the retention time and the cut-off properties (cut-off) can be easily adjusted.
  • a one-step method was desired in which the desired nucleic acids of a particular size can be separated in a single step from both smaller impurities and larger nucleic acids.
  • the object of the invention is therefore to provide such a device.
  • SEC media of various selectivities are combined for the first time and used as a mixture or in layers in a single device. So far, it has always been necessary to connect several Chromatographievorraume ⁇ , each containing different SEC media, one behind the other. By the device according to the invention, therefore, a considerable time savings is possible.
  • combination with micro and or Uifrafiitrationsmeimbranen an arbitrarily adjustable selectivity is possible. So far, such membranes have not been combined with SEC materials to further adjust selectivity.
  • nucleic acids can be purified and / or concentrated.
  • genomic DNA for example, genomic DNA, plasmid DNA, various RNAs, PCR ⁇ fragments, oligos or restriction fragments.
  • Particularly suitable is the device for separation of RNAs from mixtures containing larger DNAs.
  • this separation principle can lead to a separation of the protein fraction from the RNA fraction and gDNA fraction from a sample and be available for further analysis, so that a parallel downstream analysis of the genome, transcriptome and proteome is possible.
  • the separation principle described can also be used for other applications such as plasmid purification etc ..
  • the samples are i, a.
  • the solution may be a product solution obtained directly from a reaction or a sample solution obtained after any work-up.
  • the sample can be prepared before application to the device according to the invention, for example by filtration or centrifugation (eg clarification of alkaline bacterial lysates.
  • SEC materials all known SEC materials can be used, for example, Superdex ®, Sephacryl ® or Superose ® (Pharmacia), Biogel Biosil ® and ® (Bio-Rad), and Fractogel EMD BioSEC ® (Merck).
  • SEC materials with cut-offs from 1 00 to 500 000 Da or more are available. The materials are suitably combined so that the desired size selection tailored to the target molecule is achieved in a desired manner in one step.
  • unwanted impurities such as salts, metabolites, proteins, unwanted nucleic acids, fats etc. be retained on the column, while the desired nucleic acids, but also protein fractions, are eluted and thus can be isolated.
  • the outer shape of the device is not particularly limited. Any customary form used for the chromatography can be used. Normally, round columns of glass or plastic are used, which have openings at the top and bottom, and whose diameter is small in relation to the length. Preferably, the device contains at the lower end of a frit made of glass or other suitable material. It also has preferred devices for applying a vacuum or for generating overpressure, these too are well known.
  • the size of the device is also not limited, it can be designed for separations from the nanogram range to quantities of several grams to kilograms. It can therefore be used with the apparatus according to the invention on a laboratory scale (ng to microgram scale) to the preparative scale (g to kg scale).
  • the device can in particular also be in the form of a microtiter plate, in the wells of which the SEC materials are mixed either substantially homogeneously or in layers, or else in the form of open-bottomed tubes, e.g. Eppendorf tubes into which the SEC media are largely homogeneously mixed or layered.
  • the tubes in this case expediently have a frit at the lower end so that the SEC medium is kept in the tube.
  • the device can also be present as a cavity in a microfluidic chip.
  • the SEC materials can either be mixed before filling the device and then filled into the device as a largely homogeneous mixture, or they are filled in layers, the layer thicknesses being suitably selected, depending on the capacity of the material chosen for the contaminant to be removed stoichiometric ratio to the presence of such a contaminant in the sample.
  • the layer thicknesses of the individual layers can be approximately the same or different.
  • the device according to the invention particularly preferably has one or more micro- and / or ultrafiltration membranes, which are arranged below and / or above the SEC media.
  • the membranes can also be arranged within the SEC materials, ie either the mixture or individual layers can be arranged both above and below the membrane.
  • These membranes are selected from the usual commercially available on the market, for example, microfiltration membranes of cut-off ranges between 0.2 .mu.m to 1 0 .mu.m, for coarse clarifications z. B. Miracloth ® (Calbiochem) and
  • the SEC materials and micro- or ultrafiltration membranes are suitably selected according to the invention according to the size of the nucleic acids to be isolated.
  • Large nucleic acids can either be purified by reverse purification with SEC media of large size exclusions, or they can be retained by micro- or ultrafiltration with membranes with appropriate cut-off.
  • Smaller nucleic acids can be retained on the column by combining different SEC materials with appropriate cut-offs.
  • the mixing of different SEC materials with different size selectivities thus allows the retention of undesired impurities while eluting the desired nucleic acids.
  • the combination of multiple SEC media with micro and / or ultrafiltration membranes can further increase size selectivity in a single cleaning step. The same applies to the addition of further separation principles within the same column body.
  • RNAs in a single purification step on the one hand from small impurities such as templates, primers, fats, salts, metaboiifen, proteins, which are separated by the suitably selected SEC materials are retained on the column, and at the same time separate the unwanted larger nucleic acids such as genomic DNA also in the same step as these are retained and separated by the UF / MF membrane.
  • the genomic DNA is present Application to such a composite column precipitated only on selectively precipitating agents, which then makes possible separation over coarse-pored filter materials from the micro and deep filtration area,
  • elution medium suitable conventional elution or running buffers or solvents are used, e.g. Water, or slightly buffered solutions such as Tris, Pug, and Citrate Buffers.
  • the eluate is collected in fractions of any size.
  • the detection is carried out by conventional detectors, z. With ultraviolet light (UV detector) or with functional assays such as PCR reactions.
  • UV detector ultraviolet light
  • functional assays such as PCR reactions.
  • fractions containing the desired nucleic acids are further analyzed either directly in ⁇ achmenten ⁇ reactions or concentrated by methods of the prior art for further analysis (precipitation / re-suspension, ultrafiltration, binding to another column and concentrated elution),
  • a 2.0 ml plastic reaction tube with outlet at the bottom is filled first with 500 ⁇ l Sephadex G50 and then with 500 ⁇ l Sephacryl S-500. Both materials are retained in the reaction vessel by the frit of suitable, commercially available material lying in front of the opening. After application of 1 ml of clarified, plasmid-containing bacterial lysate, the vessel is centrifuged. The run contains purified and desalted plasmid DNA.

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Abstract

Offenbart wird eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren durch negative Chromatographie, umfassend einen Hohlkörper mit jeweils einer Öffnung am oberen und am unteren Ende, welcher eine stationäre feste Phase enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase mindestens 2 verschiedene Chromatographie - Harze wie z.B. Größenauschluss - Gelfiltrationsmaterialien (SEC - Materialien) beinhaltet, sowie ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren und die Verwendung der Vorrichtung.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichfung und ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie die Verwendung der Vorrichtung ,
Verschiedene Nukleinsäuren werden in einer Reihe von Gebieten eingesetzt, so z. B. der rekombinanten Gentechnik, in der medizinischen Diagnostik, als Sonden und vieles mehr. Dabei besteht häufig die Notwendigkeit, Nukieinsäuregemische verschiedensten Ursprungs von kontaminierenden, nachfolgende Reaktionen störenden, Substanzen aufzutrennen. Dafür sind verschiedene Verfahren bekannt.
Generell werden die Nukleinsäuren häufig durch chromatographische Verfahren gereinigt und/oder aufkonzentriert, bei denen sie an Oberflächen aus z. B . Siliziumdioxid, Siliziumdioxidpolymeren, Magnesiumsilikat oder ähnlichem adsorbiert werden, gefoigt von Waschen und Desorption jeweils mit geeigneten Lösungsmitteln. Hierbei werden durch das Waschen die unerwünschten Verunreinigungen entfernt, und durch die Desorption schließlich die gewünschten Nukleinsäuren eluiert.
Diese im Laborjargon als „biπd-wash-elute" bezeichnete Routine ergibt sich bei allen Aufreinigungsverfahren, bei welchen das aufzureinigende Zieimolekül (z.B. Nukleinsäuren) zuerst in eine Bindung mit einem Trägermaterial (Silika, Ionenaustauscher, hydrophobe-lnteraktion Chromatographie-Harze, Reversed-Phase-Chromatographie-Harze , Mixed- Mode-Chromatographie- Harze, Affinitätschromatographie- Harze) gebracht wird. Zwar ergeben sich aus dieser Verfahrensweise in der Regel qualitativ hochwertige Präparationen des Zielmoleküls, andererseits ist jedoch die Anzahl der Arbeitsschritte relativ hoch.
Es wäre wünschenswert, ähnliche Reinheitsstufen mit
Aufreinigungsmethoden, die weniger Schritte beinhalten, zu erhalten . Besonders geeignet ist hierfür die Größenαusschlusschromαtogrαphie (size exclusion chromαtogrαphy, SEC). Wenn ein organisches Lösungsmittel als mobile Phase verwendet wird, wird dieses Verfahren auch als Gelpermeationschromatogrphie (GPC) bezeichnet, bei Verwendung einer wässrigen mobilen Phase als Gelfiitrationschromatographie. Bei der SEC erfolgt die Trennung rein aufgrund der Größe (genauer gesagt des hydrodynamischen Volumens) der Moleküle in der Probenlösung. Für ähnlich geformte Moleküle ist der hydrodynamische Radius proportional zum Molekulargewicht, daher wird die SEC auch als massenbasiertes Trennverfahren bezeichnet,
Ein GPC-System oder SEC-System umfasst im allgemeinen Pumpe, Injektionssystem, Trennsäule(n) und Detektor(en). Die Pumpe saugt das Laufmittel (mobile Phase), z.B. einen geeigneten Elutionspuffer, an und erzeugt einen Fluss durch das gesamte System. Durch das Injektionssystem (manuell oder automatisch) erfolgt das Aufbringen der Probe auf die Trennsäule, in der die Probe aufgrund des unterschiedlichen hydrodynamischen Radius der Bestandteile aufgetrennt wird. Der Nachweis erfolgt durch Detektoren.
Die Trennsäuien sind mit der stationären Phase gefüllt, d.h. mit kleinen Kügelchen eines porösen hochvernetzten Materials. Es gibt zahlreiche verschiedene chromatographische Materialien für die SEC. Jedes Material ist durch ein „Exklusionslimit" charakterisiert, das die geeignete obere Grenze für die Moleküle bezeichnet, die mit diem Material getrennt werden können. Als Materialien kommen z.B. Polyacrylamid, Dextran oder Agarose oder auch Silika, vernetztes Polystyrol o.a. zur Anwendung. Verbreitet werden Sephadex®, Sephacryl® oder Sepharose® (Pharmacia), Biogel® (Bio-Rad), oder Fractogel® (Merck) verwendet.
Die Trennung bei der SEC basiert auf der Verteilung der Moleküle zwischen der Flüssigkeit zwischen den Kügelchen aus chromatographischen Material und der Flüssigkeit in den Poren innerhalb dieser Kügeichen. Der Durchmesser der Kügelchen liegt im μm-Bereich. Eluiert man eine Probe, die Moleküle verschiedener Größe enthält, so gelangen die kleinen Moleküle in die Poren der stationären Phase und verweilen daher länger auf der Säule als die größeren Moleküle, die daher zuerst eluiert werden. Im allgemeinen haben die verwendeten Säulen eine sehr geringe Porengrößenverteilung und trennen sehr gut in einem bestimmten Molekülgrößenbereich. Um eine Trennung über einen größeren Molekulargewichtsbereich zu erzielen, müssen mehrere Treπnsäulen mit verschiedenen Porengrößen hintereinander geschaltet werden.
Bei der üblichen SEC-Chromatographie von Nukleinsäuren werden folglich die Verunreinigungen mit geringer Molekülgröße auf der Säule zurückgehalten, während die gewünschten Nukleinsäuren gemeinsam mit Verunreinigungen wie anderen unerwünschten Nukleinsäuren eluiert werden, so dass anschließend noch weitere Trennschritte erforderlich sind, um diese Gemische aufzutrennen. Dieses Verfahren, bei dem die gewünschten abzutrennenden Substanzen zuerst eluiert werden, bezeichnet man auch als „negative Chromatographie". Insbesondere bei der Isolierung von RNA, z.B. aus PCR-Reaktionen, ist es aber problematisch, dass mehrere Nukleinsäuren unterschiedlicher Größe gemeinsam eluiert werden, da durch die übliche SEC-Chromatographie die RNA gemeinsam mit großen DNA-Molekülen eluiert wird, während nur kleinere Moleküle auf der Säule verbleiben, und die RNA dann in einem weiteren Schritt von den DNAs abgetrennt werden muss,
Als weiteres Verfahren zur Abtrennung und Aufkonzentrierung hochmolekularer Substanzen Ist die Ultrafiltration (für Partikel von < 0, 1 μm Durchmesser ) bzw. Mikrofiltration (für Partikel von > 0, 1 μm) Durchmesser) bekannt. Beide Verfahren sind physikalische Membrantrennverfahren. Alle Inhaltsstoffe in Flüssigkeiten, die größer als die Membranporen sind, werden von der Membran zurückgehalten. Treibende Kraft in beiden Verfahren ist die Druckdifferenz zwischen Zulauf und Ablauf der Filterfläche. Der Werkstoff der Filterfläche kann z. B. Edelstahl, Kunststoff oder textiles Gewebe sein. Die Ausschlussgrenze (Cut-off) wird üblicherweise als NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-off) in der Einheit Dalton (Da) angegeben.
Ein DNA-Ultrafiltrationsverfahren ist z.B. in DE-A 1 02 01 487 offenbart.
US 2004/0002081 offenbart ein Verfahren zur Isolation und Reinigung eines Polynukleotids im industriellen Maßstab, welches von einem chromαtogrαphischen Verfahren Gebrauch macht, bei dem mindestens zwei verschiedene chromatographische Schritte durchgeführt werden, ausgewählt aus hydrophober Wechseiwirkungs-Chromatographie, polarer Wechselwirkungs-Chromatographie und Anionenaustauschchromatographie, wobei in mindestens einem Schritt der chromatographische Träger ein monolithisches poröses Bett ist.
EP-A 1 719 1 6 offenbart ein Material zur Abtrennung und Reinigung von DNA, das ein integraler monolithischer poröser Körper aus Glas oder Silika ist, der von einem zum anderen Ende durchgehende Poren aufweist, die Nucleinsäuregrößen von 35 bp bis 1 00 Kbp entsprechen, so dass die entsprechenden Nukleinsäuren in diesen Poren zurückgehalten werden.
WO 01 /94574 offenbart ein Material zur Reinigung von DNA- Sequenzierungsreaktionsprodukten, d.h. zur Abtrennung der DNA- Sequenzierungsfragmente von Sequenzierungs-Templaten, Enzymen, Salzen und Nucleotiden, wobei ein Filtrationsmedium mit einem molekularen Cutoff-Filter in einer einzigen Chromatographie-Säule kombiniert wird. Z.B. wird ein SEC-Material wie Sephadex® G-50 oder Sephacryl® mit einer Whatman-Polyfiltronics®- Ultrafiltrationsmembran kombiniert.
EP-A- 1 589 337 offenbart ein Packungsmaterial für die FJüssigkeitschromatographie, welches Partikelmischungen aus mindestens zwei Komponenten umfasst, zur Trennung von kleinen Molekülen, Proteinen oder Nukleinsäuren. Die Partikel können aus beliebigen anorganischen und/oder anorganisch-organischen Hybridmaterielien bestehen, die für die chromatographische Anwendung geeignet sind, z.B,, Silikapartikeln . Die beiden Komponenten haben jeweils eine Partikelgrößenverteilung und einen mittleren Partikeldurchmesser, wobei die Differenz zwischen zwei mittleren Partikeldurchmessern geringer ist oder gleich 40% des größeren Mittelwerts ist.
WO 2004/01 1 142 offenbart eine Vorrichtung zur Reinigung einer Probe, z.B. enthaltend Nukleinsäuren, in der ein SEC-Material und ein lonenaustauschmateria! (IEC-Material) kombiniert sind. Insbesondere werden sogenannte „size-exclusion ion-exchange" (SEIE) Partikel offenbart, wobei beispielsweise ein Kern aus einem lonenausfauschermaterial, das ggf. zum Größeπausschluss fähig ist, von einer Hülle aus einem SEC-Material umgeben ist, Es können auch mehrere derartige SEIE-Materialien in einer einzigen Chromatographiesäule verwendet werden.
Im aligemeiπeπ werden die bekannten Chromatographieverfahren im mg- Maßstabe (bezogen auf die zu trennende Substanz) auf üblichen Treππsäulen durchgeführt, wobei die Abmessungen der Säule und die Menge der stationären Phase an die Menge der zu reinigenden Substanz geeignet angepasst wird. Für die Elution wird das Lösungsmittel unter Druck (durch Pumpen erzeugt) in das obere Ende der Säule eingebracht.
Zur Reinigung kleinerer Mengen von weniger als 1 0 mg zu reinigender Substanz sind auch wesentlich kleinere Chromatographievorrichtungen bekannt. Z.B. wird die stationäre Phase in die Vertiefungen von Mikrotiterpiatten eingebracht, das zu trennende Gemisch in die Vertiefungen gegeben, Laufmittel in die Vertiefungen eingebracht und dann durch Anlegen von Vakuum eluiert, oder die stationäre Phase wird auf einer Fritte in ein unten offenes Eppendorfröhrchen gegeben, die zu trennende Substanz und das Laufmittel werden aufgebracht, und dann wird das Röhrchen in ein Zentrifugeπröhrchen gegeben und die Elution durch Zentrifugieren bewirkt, so dass das Eiuat sich im Zentrifugenröhrchen sammelt und dort entnommen und weiter aufgearbeitet werden kann. Auf diese Weise wird z. B. bei der Aufarbeitung von PCR-Reaktionsgemischen durch Zentrifugieren mit DyeEx® (Qiagen GmbH) chromatographiert, um Farbmarker und Primer von den PCR-Produkten abzutrennen.
Auch Chromatographievorrichtungen in mikrofluidischen Chips sind bekannt.
Bei all diesen Verfahren im kleinen Maßstabe ist im Stand der Technik aber jeweils nur die Verwendung eines einzigen SEC-Materials pro Chromatographieschritt bekannt, so dass ggf . mehrere
Chromatographieschritte nacheinander durchgeführt werden müssen.
Ein Problem bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren zum Reinigen von DNA besteht daher darin, dass zum Kombinieren mehrerer Selektivitäten immer mehrere Säulen hintereiπαndergeschαitet werden müssen. Die Auslegung der Säulen auf bestimmte gewünschte Selektivitäten war daher immer sehr zeit- und materialaufwendig.
Es war also eine Chromatographievorrichtung für Nukleinsäuren, bzw. die Kombination von Chromatographie und Membranverfahren gewünscht, mit der die Selektivität bzw. die Retentionszeit und die Ausschlusseigenschaften (Cut-off) leicht eingestellt werden können . Zudem war ein Einschritt- Verfahren erwünscht, bei dem die gewünschten Nukleinsäuren einer bestimmten Größe in einem einzigen Schritt sowohl von kleineren Verunreinigungen als auch von größeren Nukleinsäuren abgetrennt werden können.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer solchen Vorrichtung.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung zur negativen Chromatographie nach Anspruch 1 . Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen 2 bis 6 definiert, Weiter werden ein Verfahren zur Aufreinigung von DNA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie die Verwendung der Vorrichtung beansprucht.
Erfindungsgemäß werden erstmals SEC-Medien verschiedener Selektivitäten kombiniert und als Gemisch oder schichtweise in einer einzigen Vorrichtung eingesetzt. Bisher war es immer notwendig, mehrere Chromatographievorrichtungeπ, die jeweils verschiedenen SEC-Medien enthielten, hintereinander zu schalten. Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ist daher eine beträchtliche Zeitersparnis möglich. Insbesondere durch die als bevorzugte Ausführungsform beanspruchte Kombination mit Mikro- und oder Uifrafiitrationsmeimbranen ist eine beliebig einstellbare Selektivität möglich. Bisher wurden derartige Membranen nicht mit SEC- Materialien kombiniert, um so die Selektivität weiter einzustellen.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können verschiedenste Nukleinsäuren gereinigt und/oder aufkonzentriert werden., z.B. genomische DNA, Plasmid-DNA, verschiedenste RNAs, PCR~Fragmente, Oligos oder Restriktionsfragmente. Besonders geeignet ist die Vorrichtung zur Abtrennung von RNAs aus Gemischen, die größere DNAs enthalten. Allgemein kann aber dieses Trennprinzip zu einer Separation der Proteinfraktion von der RNA- Fraktion und gDNA-Fraktion aus einer Probe führen und für weitere Analysen zur Verfügung stehen, so dass eine parallel nachgeschaltete Analyse des Genoms, Transkriptoms und Proteoms möglich ist. Das beschriebene Trennprinzip kann weiterhin auch für andere Applikationen wie Plasmidaufreinigung etc eingesetzt werden. Die Proben liegen i ,a . in Form einer Lösung vor, wobei als Lösungsmittel üblicherweise salzhaltige, geklärte Zelllysate verwendet werden . Die Lösung kann eine direkt aus einer Reaktion erhaltene Produktlösung oder eine nach einer beliebigen Aufarbeitung erhaltene Probenlösung sein. Die Probe kann vor dem Aufgeben auf die erfindungsgemäße Vorrichtung z.B. durch Filtration oder Zentrifugation, vorbereitet werden (z. B. Klärung von alkalischen Bakterienlysaten.
Als SEC-Materialien können alle bekannten SEC-Materialien eingesetzt werden, z.B. Superdex®, Sephacryl® oder Superose® (Pharmacia), Biogel® und Biosil® (Bio-Rad), und Fractogel EMD BioSEC® (Merck). Es sind SEC-Materialien mit Ausschlussbereichen (Cut-off) von 1 00 bis 500.000 Da oder mehr verfügbar. Die Materialien werden in geeigneter Weiser so kombiniert, dass die gewünschte Größenselektion maßgeschneidert auf das Zieimolekül in gewünschter Weise in einem Schritt erzielt wird. Durch geeignete Wahl der SEC-Kombination können unerwünschte Verunreinigungen wie Salze, Metabolite, Proteine, unerwünschte Nukleinsäuren, Fette etc . auf der Säule zurückgehalten werden, während die erwünschten Nukleinsäuren, aber auch Proteinfraktionen, eluiert werden und somit isoliert werden können.
Es ist des weiteren vorstellbar innerhalb einer solchen „Verbund"-Säule weitere Selektivitäten wie z. B. Anionenaustauscher und HIC-Funktionalitäten bzw. -resins hinzuzufügen. So wäre z.B. die Kombination eines Anionenaustauscher-Harzes, geschichtet oberhalb eines Entsalzungs- Gelfiltrationsmateriales innerhalb eines Zentrifugations- oder Vakuumröhrchens geeignet zur stufenweisen Elution von entsalzten Protein-, RNA- und gDNA-Fraktionen.
Die äußere Form der Vorrichtung ist nicht besonders beschränkt. Es kann jede übliche für die Chromatographie verwendete Form eingesetzt werden. Normalerweise werden runde Säulen aus Glas oder Kunststoff eingesetzt, die am oberen und unteren Ende Öffnungen aufweisen, und deren Durchmesser im Verhältnis zur Länge klein ist. Bevorzugt enthält die Vorrichtung am unteren Ende eine Fritte aus Glas oder einem anderen geeigneten Material. Sie weist weiter bevorzugt Vorrichtungen zum Anlegen von Vakuum oder zum Erzeugen von Überdruck auf, auch diese sind allgemein bekannt.
Die Größe der Vorrichtung ist ebenfalls nicht beschränkt, Sie kann für Trennungen vom Nanogrammbereich bis zu Mengen von mehreren Gramm bis Kilogramm ausgelegt werden. Es kann daher mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Labormaßstab (ng bis μg-Maßstab) bis zum präparativen Maßstab (g- bis kg-Maßstab) gearbeitet werden.
Erfindungsgemäß kann die Vorrichtung insbesondere auch in Form einer Mikrotiterplatte vorliegen, in deren Vertiefungen die SEC-Materialien entweder weitgehend homogen gemischt oder schichtweise eingebracht werden, oder auch in Form von unten offenen Röhrchen, z. B. Eppendorf- Röhrchen, in die die SEC-Medien weitgehend homogen gemischt oder schichtweise eingebracht werden. Zweckmäßig weisen die Röhrchen in diesem Fall am unteren Ende eine Fritte auf, damit das SEC-Medium im Röhrchen gehalten wird. Die Vorrichtung kann auch als Kavität in einem mikrofluidtschen Chip vorliegen.
Die SEC-Materialien können erfindungsgemäß entweder vor dem Befüllen der Vorrichtung gemischt und dann als weitgehend homogenes Gemisch in die Vorrichtung eingefüllt werden, oder sie werden geschichtet eingefüllt, wobei die Schichtdicken geeignet ausgewählt werden, je nach Kapazität des gewählten Materials für die zu entfernende Kontaminante im stöchiometrischen Verhältnis zum Vorhandensein einer solchen Kontaminante in der Probe. Die Schichtdicken der einzelnen Schichten können annähernd gleich oder auch unterschiedlich sein. Durch die Befüllung in Schichten wird überraschenderweise erreicht, dass die Trennleistung sich, vergiichen mit dem korrespondierenden mixed-bed- Modus, erhöht. Die Vorrichtung ist hinsichtlich der Anschlüsse so aufgebaut, dass sie im Zentrifugations-, Vakuum-, Druck- oder Schwerkraft-Modus betrieben werden. Es handelt sich hierbei um den üblichen im Stand der Technik bekannten Aufbau einer Chromatographievorrichtung. Besonders bevorzugt ist es, die Vorrichtung für Trennungen im kleinen Maßstabe einzusetzen (bis zu 1 0 mg zu trennende Substanz) und dann die Elution durch Vakuum, Druck oder Zentrifugieren zu bewirken.
Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße Vorrichtung darüber hinaus eine oder mehrere Mikro- und/oder Ultrafiltrationsmembranen auf, die unterhalb und/oder oberhalb der SEC-Medien angeordnet werden. Die Mebranen können auch innerhalb der SEC-Materiaiien angeordnet sein, d. h. entweder das Gemisch oder einzelne Schichten können sowohl oberhalb als auch unterhalb der Membran angeordnet sein. Diese Membranen werden aus den üblichen am Markt erhältlichen in geeigneter Weise ausgewählt, z.B. Mikrofiltrationsmembranen der Cut-off-Bereiche zwischen 0,2 μm bis 1 0 μm, für Grobklärungen z. B. Miracloth® (Calbiochem) und
Ultrafiltrationsmembranen zwischen 50 und 1 000 kDa ..
Die SEC-Materialien und Mikro- bzw. Ultrafiltrationsmembranen werden erfindungsgemäß entsprechend der Größe der zu isolierenden Nukleinsäuren geeignet ausgewählt. Große Nukleinsäuren können entweder durch reverse Reinigung mit SEC-Medien mit großen Ausschlussgrößen gereinigt werden, oder sie können durch Mikro- oder Ultrafiltration mit Membranen mit geeignetem Cut-off zurückgehalten werden. Kleinere Nukleinsäuren können durch Kombination verschiedener SEC-Materialien mit geeigneten Cut-offs auf der Säule zurückgehalten werden. Das Mischen verschiedener SEC- Materialien mit unterschiedlichen Größenselektivitäten ermöglicht so das Zurückhalten unerwünschter Verunreinigungen, während die gewünschten Nukleinsäuren eluiert werden. Die Kombination mehrerer SEC-Medien mit Mikro- und/oder Ultrafütrationsmembranen kann die Größenselektivität in einem einzigen Reinigungsschritt weiter erhöhen. Das Gleiche gilt für die Addition von weiteren Trennprinzipien innerhalb desselben Säulenkörpers, So ist es erfindungsgemäß erstmals möglich, z.B. RNAs in einem einzigen Reinigungsschritt einerseits von kleinen Verunreinigungen wie Templaten, Primern, Fetten, Salzen, Metaboiifen, Proteinen abzutrennen, die durch die geeignet ausgewählten SEC-Materialien auf der Säule zurückgehalten werden, und gleichzeitig die unerwünschten größeren Nukleinsäuren wie genomische DNA ebenfalls in demselben Schritt abzutrennen, da diese durch die UF/MF-Membran zurückgehalten und abgetrennt werden, In einer Variante dieser Anwendung wird die genomische DNA vor Auftrag auf eine solche Verbundsäule erst über selektiv präzipitierende Agentien ausgefällt, was dann eine Abtrennung über grobporigere Filtermaterialien aus dem Mikro- und Tiefenfiltrationsbereich möglich macht,
Als Elutionsmedium werden geeignete übliche Elutions- bzw. Laufpuffer oder Lösungsmittel eingesetzt wie z.B. Wasser, oder leicht gepufferte Lösungen wie Tris-, Mops- und Citratpuffer.
Das Eluat wird in Fraktionen beliebiger Größe aufgefangen.
Die Detektion erfolgt durch übliche Detektoren, z. B. mit ultraviolettem Licht (UV-Detektor) oder mit funktionellen Assays wie PCR-Reaktionen.
Die die gewünschten Nukleinsäuren enthaltenden Fraktionen werden entweder direkt in πachgeschalteteπ Reaktionen weiter analysiert oder durch Methoden des Stands der Technik für weitere Analysen aufkonzentriert (Fällung/Resuspension, Ultrafiltration, Bindung an eine weitere Säule und konzentrierte Elution) ,
Beispiele
Ein 2,0 ml Plastik-Reaktionsgefäß mit Auslass am unteren Ende wird zuerst mit 500 μl Sephadex G50 und anschließend mit 500 μl Sephacryl S-500 befüllt. Beide Materialien werden durch die vor der Öffnung liegende Fritte aus geeignetem, handelsüblichem Material in dem Reaktionsgefäß zurückgehalten , Nach Auftrag von 1 ml geklärtem, Plasmid-haltigem Bakterienlysat wird das Gefäß zentrifugiert. Im Durchlauf befindet sich aufgereinigte und entsalzte Plasmid-DNA.
Durch Auflegung einer Ultrafiltrationsmembran z.B. mit einem „Cut-off" von 500 kDa oberhalb der Fritte oder oberhalb des Resin-Bettes können kontaminierende gDNA-Anteile auf der Säule zurückgehalten und an einer Co-Elution mit der Plasmid-DNA gehindert werden,

Claims

Qiαgen GmbHPatentansprüche
1 . Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren durch negative Chromatographie, umfassend einen Hohlkörper mit jeweils einer Öffnung am oberen und am unteren Ende, welcher eine stationäre feste Phase enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase mindestens 2 verschiedene Chromatographie-Harze wie z.B. Größenauschtuss-Gelfiltrationsmaterialien (SEC- Materialien) beinhaltet.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , darüber hinaus umfassend eine oder mehr Ultrafiltrations- und/oder Mikrofiltrationsmembranen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 , darüber hinaus umfassend ein oder mehr Chromatographie-Harze zusätzlicher Selektivitäten wie z.B. hydrophobe Interaktionschrorrtatographie- Harze, Affiπitätschromatographie- Harze, lonenaustauschchromatographie- Harze
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, wobei die SEC-Materialien in weitgehend homogenem Gemisch vorliegen.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche I bis 4, wobei die SEC- Materialien in Schichten angeordnet sind.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, darüber hinaus umfassend eine oder mehrere Fritten.
7. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, darüber hinaus umfassend Anschlussvorrichtungen zum Anlegen von Vakuum oder Überdruck, zur Zentrifugation, und/oder zur Detektion,
8. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche in Form einer Mikrotiterplatte oder eines Eppendorffröhrchens,
9. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche durchgeführt wird.
10. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.
1 1 . Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die
Nukleinsäuren ausgewählt werden aus genomischer DNA, Plasmid-DNA, RNA, PCR-Fragmenten oder Oügos.
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