DE20114079U1 - Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäure - Google Patents
Vorrichtung zur Aufreinigung von NukleinsäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäuren, bestehend aus einem Säulenkörper mit Einlass- und Auslassöffnung und mindestens einer darin angeordneten Membran, bevorzugt einer Silicamembran.
Eine weit verbreitete Technologie zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Gemischen ist die chromatographische Aufreinigung mittels Silikatechnologie unter Verwendung chaotroper Salze.(Vogelstein und Gillespie, 1979). Bei dieser Methode wird die Nukleinsäure aus einer biologischen Probe, durch Adsorbtion der Nukleinsäure an einer Silikaoberfläche in Gegenwart chaotroper Salze isoliert und anschließend von dieser Oberfläche eluiert.
Eine einfache und schnelle Durchführung der Aufreinigung von Nukleinsäuren wird durch die Verwendung von Chromatographiesäulen mit darin eingebauten Silikamembranen erreicht. Die dazu einsetzbaren Membranen bzw. Silikamembranen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Der Durchmesser der verwendeten Silikamembranen wird dabei stets so gewählt, dass er entweder gleich groß oder aber größer als der Innendurchmesser des Säulenkörpers ist. Dadurch wird verhindert, dass die Nukleinsäure-haltige Lösung an der Membran vorbeilaufen könnte, ohne dass die Nukleinsäure sich an die Membran bindet. Durch einen solchen Bypass der Nukleinsäure-haltigen Lösung an der Membran vorbei würde die Nukleinsäure, naturgemäß für die nachfolgenden Maßnahmen verloren gehen.
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Membranen mit einem Durchmesser, der größer oder gleich dem Innendurchmesser der Säule ist, haben jedoch den Nachteil, dass die an die Membranen gebundene Nukleinsäure mit relativ großen Volumina an Elutionspuffer wieder von der Membran eluiert werden muss.
Die zwangsläufige Folge davon ist, dass die aufgereinigte und eluierte Nukleinsäure in einem relativ großen Elutionsvolumen vorliegt, so dass sie für manche nachfolgenden molekularbiologischen Anwendungen in zu verdünnten Konzentrationen vorliegt und weiter eingeengt werden muss. Dies bedeutet für den Anwender zusätzliche Arbeit und einen nicht unwesentlichen Zeitaufwand.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu überwinden und eine Vorrichtung bereitzustellen, die so gestaltet ist, dass die an eine Membran gebundene Nukleinsäure mit möglichst geringem Volumen an Elutionsmitteln gewonnen werden kann.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellung einer Vorrichtung, bestehend aus einem Säulenkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung und mindestens einer darin angeordneten Membran, dadurch gekennzeichnet, dass der Außendurchmesser der Membran um 1%- 57%, bevorzugt 7% - 29%, ganz besonders bevorzugt 10% - 20% kleiner ist als der Innendurchmesser des Säulenkörpers.
Die Reduktion des Außendurchmessers der Membran(en) in der erfindungsgemäßen Vorrichtung führt zu einer Verringerung des Totvolumens bei der Elution der gebundenen Nukleinsäure von dieser Membran.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann bei der Isolierung von Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder Oligonucleotiden aus Agarosegelen bzw.
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Polyacrylamidgele, aus Nukleinsäure modifizierende Reaktionen wie z. B. Labeling-, Restriktions-, PCR-Reaktionen bzw. RT-PCR-Reaktionen sowie bei der Isolierung von z. B. genomische DNA, Plasmid-DNA, RNA, viraler RNA/DNA aus sämtlichen biologischen Proben eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Isolierung der Nukleinsäuren an einer porösen oder nicht porösen SiO2-haltigen Membran. Die SiO2 -haltigen Membranen können aus Glas, Silica oder modifiziertem Glas oder Silika bestehen.
Fig. 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die aus einem Hohlkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung besteht. Im Hohlkörper ist zwischen einem Träger 3 und einer Fixiereinrichtung 1 eine Membran 2 angeordnet.
Fig. 2 beschreibt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, in deren Hohlkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung die Membran 2 eine selbsttragende Membran ist, die mit einer Fixiereinrichtung 1 befestigt ist.
Fig. 3 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, in deren Hohlkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung eine oder mehrere Membranen 2 zwischen einem Träger 3 und einer Fixiereinrichtung 1 angeordnet sind.
Fig. 4 zeigt die DNA - Konzentration in Abhängigkeit vom Membrandurchmesser.
Fig. 5 zeigt die RNA - Konzentration in Abhängigkeit vom Membrandurchmesser.
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Der Hohlkörper ist vorzugsweise zylindrisch und besteht aus Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyester (PET), Polystyrol, SAN oder anderen Kunststoffen. Glas ist ebenfalls denkbar. Der Träger 3 besteht vorzugsweise aus porösen Membranen oder Filtern aus Kunststoff wie Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Polyethersulfon (PES), Nylon oder anderen Kunststoffen. Poröse Membranen oder Filter aus gesintertem Glas (Fritten), Glas oder Keramik sind ebenfalls geeignet.
Die Fixiereinrichtung 1 kann vorzugsweise eine poröse Scheibe oder ein Ring aus beispielsweise gesintertem Glas oder Kunststoff sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gemäß Fig. 3 beträgt der Innendurchmesser des Säulenkörpers aus Polypropylen (PP) 7 mm und der Außendurchmesser der darin eingebauten Membranen z. B. 6,0 mm oder 5,0 mm, was eine Reduktion des Außendurchmessers der Membran um 14,3% bzw. 28.6% bedeutet. Vorzugsweise wird eine poröse Silicamembran mit einer Porengröße von 0,5 bis 5 pm, besonders bevorzugt von 0,7 bis 3 pm sowie ganz besonders bevorzugt von 0,7 bis 1,5 pm verwendet.
Wird eine solche Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren gemäß Beispiel 1 verwendet, so ist es durch diese Reduktion des Innendurchmessers der Membran(en) möglich, das Elutionsvolumen auf 10 &mgr;&Igr; bzw. 5 &mgr;&Igr; zu reduzieren, ohne große Verluste in der absoluten Nukleinsäureausbeute zu erhalten.
Beispiel 1: Reinigung von PCR-Fraqmenten mit 500bp
100 &mgr;&Igr; eines PCR-Amplifikationsproduktes werden mit 500 &mgr;&Igr; Puffer, enthaltend 3,5 M GuHCI (Guanidinium Hydrochlorid) und 30 % (w/v) Ethanol, versetzt und in eine erfindungsgemäße Vorrichtung pipettiert. Die DNA bindet
100 &mgr;&Igr; eines PCR-Amplifikationsproduktes werden mit 500 &mgr;&Igr; Puffer, enthaltend 3,5 M GuHCI (Guanidinium Hydrochlorid) und 30 % (w/v) Ethanol, versetzt und in eine erfindungsgemäße Vorrichtung pipettiert. Die DNA bindet
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an die Silicamembran und wird nach dem Waschen mit 5, 10 bzw. 50 &mgr;&Igr; eluiert. Verwendet wurde ein zylindrischer Säulenkörper mit einem Innendurchmeser der Säule von 7 mm und Silicamembranen mit Außendurchmesser von 7,5 mm, 6 mm und 5mm.
Aufgereinigt wurden jeweils 3 &mgr;g eines 500 bp-Fragmentes, wobei mit 50 &mgr;&Igr; (bei 7,5 mm Membrandurchmesser), 10 &mgr;&Igr; (bei 6 mm Membrandurchmesser) bzw. 5 &mgr;&Igr; (bei 5 mm Membrandurchmesser) eluiert wurde.
Fig. 4 verdeutlicht, dass die Reduktion des Membrandurchmessers bei konstantem Innendurchmesser des Säulenkörpers eine Reduktion des Elutionsvolumens ermöglicht und eine höhere DNA-Konzentrationen zur Folge hat.
2 &mgr;g Gesamt-RNA aus Heia-Zellen in einem Volumen von 50 &mgr;&Igr; mit 350 &mgr;&Igr; Puffer, enthaltend 2 M Guanidiniumthiocyanat sowie 30% (w/v) Ethanol, gemischt und in eine erfindungsgemäße Vorrichtung pipettiert. Die DNA bindet an die Silicamembran und wird nach dem Waschen mit 5, 10 und 50 &mgr;&Igr; Elutionspuffer eluiert.
Verwendet wurde ein zylindrischer Säulenkörper mit einem Innendurchmesser der Säule von 7 mm und Silikamembranen mit Außendurchmesser von 7,5 mm, 6 mm und 5mm.
Aufgereinigt wurden jeweils 2 &mgr;g Gesamt-RNA aus HeLa-Zellen, wobei mit 50 &mgr;&Igr; (bei 7,5 mm Membrandurchmesser), 10 &mgr;&Igr; (bei 6 mm Membrandurchmesser) bzw. 5 &mgr;&Igr; (bei 5 mm Membrandurchmesser) eluiert wurde.
Fig. 5 verdeutlicht, dass die Reduktion des Membrandurchmessers bei konstantem Innendurchmesser des Säulenkörpers eine Reduktion des Elutionsvolumens ermöglicht und eine höhere DNA-Konzentrationen zur Folge hat.
Claims (9)
1. Vorrichtung, bestehend aus einem Säulenkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung und mindestens einer darin angeordneten Membran, dadurch gekennzeichnet, dass der Außendurchmesser der Membran um 1%-57% kleiner ist als der Innendurchmesser des Säulenkörpers.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bestehend aus einem Säulenkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung und mindestens einer darin angeordneten Membran, dadurch gekennzeichnet, dass der Außendurchmesser der Membran um 7%-29% kleiner als der Innendurchmesser des Säulenkörpers ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bestehend aus einem Säulenkörper mit einer Einlass- und einer Auslassöffnung und mindestens einer darin angeordneten Membran, dadurch gekennzeichnet, dass der Außendurchmesser der Membran um 10%-20% kleiner als der Innendurchmesser des Säulenkörpers ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran(en) eine oder mehrere poröse oder nicht-poröse Silicamembran(en) ist/sind.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Innendurchmesser des Säulenkörpers 7 mm und der Außendurchmesser der darin eingebauten Membran(en) 6 mm beträgt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Innendurchmesser des Säulenkörpers 7 mm und der Außendurchmesser der darin eingebauten Membran(en) 5 mm beträgt.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine poröse Silicamembran mit einer Porengröße von 0,5 bis 5 µm verwendet wird.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine poröse Silicamembran mit einer Porengröße von 0,7 bis 3 µm verwendet wird.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine poröse Silicamembran mit einer Porengröße von 0,7 bis 1,5 µm verwendet wird.
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2001
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| US20030042188A1 (en) | 2003-03-06 |
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