DE102018009773A1

DE102018009773A1 - Kalibrierbare partikelbasierte Analysen

Info

Publication number: DE102018009773A1
Application number: DE102018009773.1A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2020-06-18

Abstract

Die Microarray Technologie zum parallelen Durchführen von Einzelnachweisen wird bislang mittels ortsaufgelöstem Aufbringen von Biomolekülen auf spezielle chemisch funktionaliserte Oberflächen und nachvollgender Interaktion mit der Probe durchgeführt. Das neue Verfahren soll die nachteiligen Schritte der Notwendigkeit der Nutzung von speziellen chemischen Oberflächen sowie dem ortsaufgelösten Aufbringen von Biolmolekülen als Fängersonden vermeiden sowie die Möglichkeit einer internen Kalibrierung eröffnen. Somit ist eine bislang schwierige Nutzung im Bereich der klinischen Diagnostik möglich.Die Nutzung von funktionalisierten, größenkodierten Partikeln welche mit Fängersonden und Farbstoffen versehen werden können ermöglicht die Generierung von immobilisierten Partikelpupulationen welche nach einer Immobilisierung auf hydrophilen Oberflächen mittels Adsorption für die Umsetzung mit dem Probenmaterial und nachfolgender Auswertung mit der üblichen Ausstattung zur Microarray Analyse zur Verfügung steht. Die interne Kalibrierung erfolgt durch die Generierung von Partikelpopulationen mit photostabilen Fluoreszenzfarbstoffen sowie deren Immobilisierung in einem ausgewählten Areal der Analyseplattform und der Nutzung zum Soll/Ist Abgleich mit den Auslesegeräten.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Methode zur parallelen Durchführung von molekularbiologischen Einzelnachweisen umfassend größenkodierte Partikel mit chemischer Modifikation zur Immobilisierung von Biomolekülen und zur Immobilisierung auf Oberflächen sowie mit der Möglichkeit zur Einfärbung mit Farbstoffen, die zum Einsatz in der klinischen Diagnostik oder der pharmazeutischen Forschung geeignet ist.
Der Microarray beschreibt ein molekularbiologisches System, das die parallele Analyse von vielen Einzelnachweisen mit einer geringen Menge an biologischem Probenmaterials ermöglicht. Grob klassifizieren lässt sich dieses System in niedrigdichte Microarrays mit einer Dichte unter 100 Nachweisen pro 30 Quadratmillimetern und hochdichten Microarrays mit Dichten von mehreren zehntausend Einzelnachweisen pro 30 Quadratmillimetern. Als verschiedene Ausprägung an Microarrays ist der bislang dominierende Sektor der DNA- und Protein-Microarrays zu nennen, während Transfektions-, Gewebe- und auch Kohlenhydrat-Microarrays noch Nischenanwendungen sind. Das Hauptnutzungsgebiet ist in der Grundlagenforschung und hier im Gebiet der Expressionsanalyse anhand von hochdichten Microarrays gegeben. Der Arbeitsablauf am Beispiel des DNA-Microarrays beruht auf dem Prinzip des Aufbringens von bekannten, konservierten, einsträngigen Sequenzen von cDNA, Oligonukleotiden oder Fragementen von PCR Produkten auf chemisch funktionalisierten Oberflächen, im Regelfall im Objektträgerformat, worauf mittels verschiedener möglicher Kopplungsmechanismen ein stabiles Bindungsarrangement zwischen Oberfläche und Biomolekül entsteht, was in einer Immobilisierung des Biomoleküls resultiert. Meist sind die immobilisierten Biomolekülen, auch Sonden genannt, bereits mit Fluoreszenzfarbstoffen für die nachgelagerte Versuchsauswertung versehen. Bei Zugabe von ebenfalls fluorophor markiertem, komplementärem einsträngigen Probenmaterial kommt es zur Anlagerung der komplementären Einzelsträngen, auch Hybridisierung genannt. Nach verschiedenen Waschschritten, welche der Entfernung von nicht gebundenem Probenmaterial dienen, erfolgt die Auswertung des generierbaren Fluoreszenzsignals mittels selektiver Anregung durch gängige Microarray Auslesegeräte. Eine zuverlässige Auswertung kann demnach nur erfolgen, wenn eine möglichst hohe Bindungskapazität und dabei auch sehr präzise und ortsgenaue Dosierung der Biomoleküle bei der Immobilisierung des Sondenmaterials, auch Printprozess genannt, realisiert werden kann. Diese geforderte hohe Reproduzierbarkeit führt zu hohen Produktionskosten und oft fehlender Wirtschaftlichkeit im Bereich der klinischen Diagnostik mit hohem Durchsatz und ist somit bislang eine Schwachstelle der Microarray Technologie.
Die beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen Microarray Technologie resultieren in hohen Produktionskosten, welche eine potentielle Nutzung speziell in der klinischen Diagnostik erschweren, sowie in der bislang fehlenden Möglichkeit zur on Chip Kalibrierung, welche eine wichtige Komponente im regulierten Bereich der Medizinprodukte und in vitro Diagnostika ist, und welche Schwankungen fluoreszenzbasierten Arrays und der zugehörigen Auslesegeräte minimieren und somit die klinische Aussagekraft einer solchen Technologie erhöhen kann. Die Kostentreiber in der Herstellung solcher Microarrays sind zum einen die Oberflächenchemie, da nasschemische Verfahren wie SOL Gel Verfahren oder photochemische Prozesse genutzt werden müssen, um eine optimale Sondenimmobilisierung zu erreichen. Weiterhin ist die Methode der gezielten, ortsaufgelösten Aufbringung der Sonden in Spots von Durchmessern von 10 - 200 µm auf die chemisch funktionalisierte Microarrayplattform mittels Kontakt- oder Nicht-Kontakt-Verfahren aufgrund des hohen Aufwandes und großer Ausschusszahlen hinsichtlich der Wirtschaftlichtkeit problematisch. Eine Kombination aus einer Senkung der Produktionskosten bei gleicher Sensitivität und Spezifität des Microarrays kombiniert mit einer erhöhten Testsicherheit aufgrund einer eingeführten on Chip Kalibrierung des fluoreszenzbasierten Systems ist ein deutlicher Fortschritt, um niedrigdichten Microarrays den Zugang zu Anwendungen in der klinischen Diagnostik oder der pharmazeutischen Forschung zu eröffnen.
Beschreibung der Erfindung
Die Lösung des zugrunde liegenden Problems herkömmlicher Microarray Plattformen hinsichtlich der Herstellung von niedrigdichten Arrays zur parallelen Analyse von Einzelnachweisen wird im folgenden hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit, der Aussagekraft und der Kalibrierfähigkeit beschrieben. Die Nutzung von Partikeln definierter Größe im mikrometer Bereich ermöglicht die Etablierung neuer Microarray Plattformen.
Die eingesetzten Partikel sind in bevorzugter Ausführung metalloxidbasiert wie TiO₂, SiO₂, Fe₃O₄, ZnO, Zr₂O₅, Ta₂O₅ und in bevorzugtester Form kunststoffbasiert unter Nutzung von PMMA, COC, COP, PS, PC, PET, PETB, SAN, HMDSO sowie von Materialmischungen und Materialhybriden.
Als bevorzugte Partikelgrößen sind Bereiche zwischen 10 Mikrometer und 200 Mikrometer, am bevorzugtesten zwischen 30 und 100 Mikrometer zu nennen. Diese Dimensionen resultieren aus dem gegenwärtigen Stand der Technik der Auflösung von Auslesegeräten wie Microarray Scannern und der Handhabbarkeit von Partikeln in der Array Herstellung.
Eine chemische Funktionalisierung der Partikel erfolgt über die Ausrüstung mit denen für Microarray Funktionseinheiten in bevorzugter Weise mit Aminen, Carbonsäuren, aktivierten Carbonsäureestern, Epoxiden, Aldehyden, gekoppeltem Steptavidin oder Ketonen sowie Mischungen dieser chemischen Funktionseinheiten. Zur Minimierung unspezifischer Bindung aus komplexen Proben kann eine gleichzeitige, zusätzliche chemische Funktionalisierung mit quartären Ammoniumionen oder in bevorzugter Ausführung mit Polyethylenglycoleinheiten mit HLB (hydrophilic-lipophilic-balance) Klassifizierungen mit den Werten von 5-8 in bevorzugtester Ausführung. Chemisch funktionalisierte Partikel unterschiedlicher Größen dieser Art sind bereits Stand der Technik und von vielen kommerziellen Quellen erhältlich.
Weiterhin ist über einen Teil der chemischen Funktionseinheiten auf den Partikeln je nach Erfordernis der Microarray Analyse eine Einfärbung dieser Partikel mit den üblichen Fluoreszenzfarbstoffen wie Cy- oder Atto-Farbstoffen in den für Microarrays relevanten Anregungs- und Emissionswellelängen möglich, um beispielsweise eine on Chip Kontrolle einer erfolgreichen Partikelimmobilisierung auf der Microarrayplattform zu ermöglichen.
Die Nutzung einzelner Beadpopulationen zur zusätzlichen Kalibrierung des Fluoreszenzscanners ist gegeben, wenn die ausgewählte Beadpopulation beispielsweise mit einem durch H. Langhals et. al., Angew. Chem. 2005, 117, 2479-2480 beschriebenen photostabilen Fluoreszenzfarbstoffen versehen wird. Der Einfärbeschritt kann mittels gängiger Kopplungsschritte wie beispielsweise mittels NHS/DCC erfolgen. Für die Beadpopulation zur Kalibrierung ist auf der Microarrayplattform ein für diese Population reserviertes Areal exklusiv vorzusehen.
Die Immobilisierung der Beadpopulationen auf den Plattformen erfolgt in bevorzugter Ausführung mittels Adsorption auf hydrophilen Oberflächen. Kunststoffartikel als auch Metalloxid basierte Träger als Plattformen welche mittels Beflammung, Corona Entladung oder Niederdruckplasmen kostengünstig behandelt sind, weisen in hohem Masse polare, protische Gruppen auf, welche zur Interaktion mittels Wasserstoffbrücken, ionischen Wechselwirkungen, Van der Waals Kräften mit den Beadpopulationen befähigt sind und dadurch eine Immobilisierung bei Kontakt mit Suspensionen an Beadpopulationen durch Adsorption bewirken.
Im Bereich der Mikroplatten als Microarray Plattform sind vielfältige hydrophil ausgerüstete Formate je nach Anforderung an die Analyse auch mit Glasböden erhältlich. Im Objektträgerformat, das bevorzugt für die Microarray Analyse genutzt wird sind sowohl Kunststoffträger als auch Glasobjektträger auch im Multiwellformat am Markt. In der Applikation der klinischen Diagnostik, wo in Laboren meist mehrere Patientenproben simultan abzuarbeiten sind ist die Nutzung von Multiwellobjektträgern notwendig, wobei hier zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen je ein Well pro Patientenanalyse genutzt wird und optional ein Well für die On Chip Kalibrierung vorzusehen ist.
Die Möglichkeiten zur Generierung eindeutig identifizierbarer Beadpopulationen über die Optionen der Größenkodierung und Nutzung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe zur Farbkodierung, resultieren in einer Ergänzung der herkömmlichen Microarray Technologie, die für die Multiparameteranalytik genutzt werden kann, wobei der Arbeitsablauf wie folgt beschrieben werden kann: Je eine vereinzelte Beadpopulation mit verschiedenen Größen und optional mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen eingefärbt wird mit je einer Sorte Biomolekül gekoppelt. Die für die Analyse notwendigen Beadpopulationen mit jeweils gekoppelten Biomolekülen und gegebenenfalls Farbstoffen werden vereinigt und bilden somit die Beadmischung für die parallelisierte Analyse der Zielparameter. Die Suspension dieser Mischung wird auf die hydrophile Plattform aufgebracht, wobei in bevorzugter Ausführung Multiwellplatten und Multiwellobjektträger als Plattformen genutzt werden. Es genügen eine Flüssigkeitsmenge die bei geeigneter Wahl der Anzahl an Partikel pro Volumeneinheit gewährleistet, dass einerseits das Well komplett benetzt ist und eine ausreichende Menge an Partikel der einzelnen Populationen enthält, wobei in bevorzugter Ausführung 50 Partikel pro Quadratmillimeter Oberfläche, in der bevorzugtesten Ausführung 14 Partikel pro Quadratmillimeter Oberfläche der Plattform genutzt werden. In der bevorzugten Ausführung wird nach einer Inkubationszeit von 15 min eine Verstärkung der Beadimmobilisierung durch eine UV-B Bestrahlung mit 120 000 mJ/cm² herbeigeführt. Nach weiteren Waschschritten mit wässrigen Lösungen zur Entfernung nicht ausreichend immobilisierter Partikel und der nachfolgenden Trocknung kann das somit einsatzfähige System entsprechend gängigen Microarray Protokollen zur Hybridisierung mit Probenmaterial versetzt und prozessiert werden. Nach dem Scanvorgang kann das erhaltene Bild geeignete gängige Software die Beadpopulationen anhand Größe und Farbe identifizieren und somit eine Auswertung der Microarray Analyse durchgeführt werden. Bei der Implementierung der internen Kalibrierung wird das Well mit der Kalibrierbeadpopulation genutzt um einen Soll/Ist Abgleich der Signalstärken der Fluoreszenzsignale durchzuführen und nach der Definition geeigneter Schwellwerte eine Vergleichbarkeit des Ergebnisses mit Tests auf anderen Auslesegeräten und/oder anderen Plattformen zu ermöglichen. Im Fall des Verzichtes auf die Nutzung Fluoreszenzbasierter Farbstoffe und bei Nutzung einer Beschränkung auf die Größencodierung kann unter Nutzung beispielsweise einer enzymatischen Farbreaktion eine Auswertung über ein Kamerasystem mit geeigneter Auflösung und nachgeschalteter Bildauswertung erfolgen, wobei hier eine on Chip Kalibrierung nicht möglich ist. Im Falle der Nutzung von Universalsonden mit nur einer farbgebenden Komponente kann der Nachweis visuell durch den Durchführenden erfolgen.
Beispiel1 : Nachweis der Chlamydien: Chlamydia Trachomatis, Chlamydia pneumonia und chlamydia psittaci.
Cy3 eingefärbte Partikelpopulationen der Größen 20, 40 , 60, 80 und 100 µm mit einer Aktivesterfunktion werden wie folgt mit charakteristischen, konservierten aminomodifizierten Oligonucleotiden gekoppelt. 20 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Trachomatis. 40 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Pneumonia, 60 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für eine interne Hybridisierungskontrolle, 80 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Psittaci sowie einer 100 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für eine interne PCR Kontrolle.
Die Beadpopulationen mit den Fängersonden werden in einem Puffersystem Wasser, 30 % DMSO und 0.001% TWEEN 20 vereinigt und die Suspension mit einer Partikelkonzentration von ungefähr 13 Partikeln/ µl gemischt. Zwei Partikelansätze der Größe 60 µm, welche je mit photostabilen Farbstoffen der Anregungswellenlängen 532 nm respektive 635 nm eingefärbt ist werden als wässrige Suspension mit Partikelkonzentrationen von ungefähr 10 Partikeln/ µl vorbereitet. 40 µl der Partikelsuspension mit Fängersonden werden in je ein Well eines hydrophilen Multiwellobjektträgers mit einer Fläche von 36 mm² überführt. Ein noch verbleibendes unbefülltes Well wird mit 40 µl Suspension an photostabil eingefärbten Partikeln befüllt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur erfolgt die Verstärkung der Immobilisierung durch UV B Bestrahlung mit einem Leistungseintrag von 120 000 µJ/cm². Es wird zwei mal in einem 50 ml Reaktionsgefäss mit 4xSSC und 0.1%SDS gewaschen und der Objektträger bei 40 °C getrocknet.
Die resultierende Arrayplattform kann im Anschluss nach Microarray Prozessierungen identischem Protokoll beinhaltend DNA Extraktion der Probe, Amplifikation und Fluorophormarkierung, Hybridisierung und Auswertung prozessiert werden.
Beispiel2 : Nachweis der Chlamydien Chlamydia Trachomatis, Chlamydia pneumonia und chlamydia psittaci mittels Farbreaktion
Partikelpopulationen der Größen 20, 60, und 100 µm mit einer Epoxidfunktion werden wie folgt mit charakteristischen, konservierten aminomodifizierten Oligonucleotiden gekoppelt. 20 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Trachomatis. 60 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Pneumonia und 100 µm Partikelpopulation mit einer Fängersonde für Chlamydia Psittaci. Je 50 µl der Partikelsuspension mit Fängersonden werden in je ein Weil einer hydrophilen 96 well Mikroplatte mit einer Fläche von 36 mm² überführt und für 60 min inkubiert. Es wird zwei Mal mit je 100 µl 4×SSC + 0.1%SDS gewaschen die Mikroplatte bei 40 °C getrocknet.
Die resultierende Plattform kann nach üblichen Methoden prozessiert werden, welche DNA Extraktion der Probe gefolgt von Amplifikation mit Biotinylierung und der Probenaufgabe in die Wells zur Hybridisierung. Die Farbreaktion wird durch Zugabe eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase Konjugates gefolgt von der Initiation der Farbreaktion durch Zugabe von Tetramethylbenzidin induziert. Die Auswertung erfolgt durch ein Kamerasystem mit einer Auflösung von 6 µm gefolgt von einer Bildauswertung zur Identifizierung der größenkodierten Partikel.
Beispiel 3 : Nachweis Legionelle pneumophila mittels Farbreaktion für die Anwendung an der Wasserquelle
Eine Partikelpopulation wird mit einer für Legionellen pneumophila und Legionella spp. spezifischen Universalsonde gekoppelt. Die Größe der Partikel kann der jeweiligen Probenbehälter angepasst werden. Als Behälter und Reaktionsgefäss können bsp. transparente Kunststoffröhrchen genutzt werden. Die resultierende Plattform kann nach üblichen Methoden prozessiert werden, welche DNA Extraktion der Probe gefolgt von Amplifikation mit Biotinylierung und der Probenaufgabe in die Wells zur Hybridisierung. Die Farbreaktion wird durch Zugabe eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase Konjugates gefolgt von der Initiation der Farbreaktion durch Zugabe von Tetramethylbenzidin induziert. Im Falle einer Färbung der Lösung kann durch visuelle Detektion durch die durchführende Person ein Legionellenbefall der Wasserleitung festgestellt werden.

1a Partikel/Partikel unterschiedlicher, standardisierter Größe Die Partikel sind funktionalisiert zur Immobilisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, Biomolekülen, zur Reduktion von unspezifischer Bindung sowie um über die die verbleibenden nicht benötigten Funktionen zur Adsorption an Oberflächen Beitrag zu leisten.
1b Die Partikel aus 1a werden genutzt, um je Population je eine Sorte Biomolekül mittels chemischer Bindung zu koppeln.
2a zeigt die Immobilisierung der Beadpopulationen auf einer Oberfläche.
2b zeigt den initialen Schritt der Umsetzung mit einer markierten Probe, wobei die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Reagenz zur Umsetzung in einer Farbrekation, beispielsweise mit der Meerrettichperoxidase sein kann.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

H. Langhals et. al., Angew. Chem. 2005, 117, 2479-2480 [0009]

Claims

Partikel gekennzeichnet durch unterschiedliche Größen in bevorzugter Ausführung im Bereich von 10 µm bis 200 µm, in bevorzugtester Ausführung in Größen von 20 µm bis 120 µm, die auf Oberflächen immobilisiert werden.
Partikel gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet durch funktionelle Gruppen, vorzugsweise Carbonsäuren, Aldehyde, Ketone, besonders bevorzugt Amine, Epoxide und aktivierte Ester.
Partikel gemäß Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet durch die Einfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen.
Partikel gemäß Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet durch die Verküpfung mit Molekülen für die Generierung von Farbreaktionen.
Verfahren zur Kopplung von Partikeln gemäß Anspruch 1-3 mit Biomolekülen als Fängersonden.
Verfahren zur Kopplung von Partikeln gemäß Anspruch 1-3 mit Biomolekülen als Fängersonden und der Immobilisierung der Kopplungsprodukte auf Oberflächen von Multiwellplatten und Multiwellobjektträgern oder geschlossenen microfluidischen Trägern.
Verfahren gemäß Anspruch 3 gekennzeichnet durch die Immobilisierung von mit photostabilen Fluoreszenzfarbstoffen versehenen Partikelpopulationen bevorzugt in Wells, bevorzugtest in einem Weil einer Multiwellplatte oder Multiwellslides zur Zwecken der Kalibrierung des Testsystems.
Verfahren gemäß Anspruch 5 wobei durch spezifische Interaktion der Fängersonden mit Probenmaterial in bevorzugter Ausführung eine Genotypisierung erfolgt.