DE102017008885A1 - Massenspektrometrisches Verfahren und MALDI-TOF-Massenspektrometer - Google Patents
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Abstract
Zur Normalisierung von MALDI-TOF-Daten existieren eine Reihe von Standardmethoden, die jedoch die beobachtete technische Variabilität nur unzureichend ausgleichen können. Die Erfindung schafft ein verbessertes Normalisierungsverfahren für MALDI-TOF-Massenspektrometriedaten. Das wird durch eine Intensitätsprofilnormalisierung erreicht, wobei
1. zunächst für jedes einzelne Spektrum ein Intensitätsprofil gebildet wird, wobei durch das Intensitätsprofil die statistische Verteilung der Intensitätswerte innerhalb verschiedener Massenbereiche beschrieben wird,
2. anschließend wird für ein Ensemble von Spektren ein mittleres Referenzprofil gebildet,
3. und schließlich werden die einzelnen Spektren so transformiert, dass ihre Intensitätsprofile dem Referenzprofil entsprechen.
1. zunächst für jedes einzelne Spektrum ein Intensitätsprofil gebildet wird, wobei durch das Intensitätsprofil die statistische Verteilung der Intensitätswerte innerhalb verschiedener Massenbereiche beschrieben wird,
2. anschließend wird für ein Ensemble von Spektren ein mittleres Referenzprofil gebildet,
3. und schließlich werden die einzelnen Spektren so transformiert, dass ihre Intensitätsprofile dem Referenzprofil entsprechen.
Description
- Die Erfindung betrifft ein massenspektrometrisches Verfahren zum Auswerten von Daten einer MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Analyse von Makromolekülen aus biologischen Proben gemäß Anspruch 1 sowie ein MALDI-TOF-Massenspektrometer gemäß Anspruch 11.
- Bei der Matrix assisted laser ionization / desorption Time-of-flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie wird eine biologische Gewebeprobe nach einer geeigneten Probenpräparation mit einer Matrixlösung überzogen und in Vakuum Laserstrahlung ausgesetzt (siehe, Caprioli RM, Farmer TB, and Gile J., Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS, Analytical Chemistry, 69(23):4751-4760, 1997. doi:10.1021/ac970888i). Dabei werden biologische Makromoleküle ionisiert und aus dem Gewebe herausgelöst. Typischerweise weisen die ionisierten Makromoleküle eine positiven Ladung auf. Die Ionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und von einem Detektor registriert. Aus der Flugzeit der Ionen von dem Gewebe zu dem Detektor, die sich aus dem ionisierenden Laserpuls und dem Detektorsignal bestimmen lässt, kann der m/z-Wert, d.h. das Verhältnis zwischen Masse und Ladung des ionisierten Moleküls bestimmt werden. Die relative Zahl der registrierten Ionen (spektrale Intensität) stellt als Funktion der m/z-Werte ein Massenspektrum dar. Unter der Annahme einer einfach positiven Ionisierung der Moleküle ist der m/z-Wert identisch mit der Masse des ionisierten Moleküls. Die Masse der Moleküle wird in Dalton (Da) als ein Vielfaches der atomaren Masseneinheit angegeben (1 Da = 1 amu, atomic mass unit).
- Bei der Akquisition von MALDI-TOF-Massenspektrometriedaten von biologischen Gewebeschnitten wird eine Vielzahl von Informationen über die proteomische Struktur der Gewebeproben gewonnen. Gleichzeitig unterliegt die Messung einer Reihe von potentiellen Störungen, die zu Verzerrungen und somit zur Verfälschungen der gewonnenen Informationen führen können. Die Variabilität dieser Störungen ist selbst unter identischen Messbedingungen relativ hoch und führt dazu, dass die Ergebnisse mehrerer Messungen oft nur eingeschränkt miteinander verglichen werden können. Bei Messungen in unterschiedlichen Laboren oder unter nicht exakt identischen Bedingungen ist diese Vergleichbarkeit oftmals überhaupt nicht mehr gegeben.
- Es existieren eine Reihe von Standardmethoden zur Korrektur derartiger Störungen und zur Normalisierung von MALDI-TOF-Daten, die jedoch die beobachtete technische Variabilität nur unzureichend ausgleichen können. Darüber hinaus fehlt es an objektiven und leicht anwendbaren Maßstäben, die eine Aussage darüber erlauben, in welchem Umfang zwei unterschiedliche Messungen miteinander vergleichbar sind.
- Ein häufig zu beobachtender Effekt technischer Variabilität innerhalb der gemessenen Daten besteht in systematischen Differenzen bzgl. der gemessenen spektralen Intensitäten, die auch unter sorgfältig kontrollierten experimentellen Bedingungen auftreten und die vergleichende Beurteilung zweier Messungen erschweren. Herkömmliche Methoden zur Korrektur solcher Intensitätsunterschiede sind in vielen Fällen nicht ausreichend.
- Die gemessenen Intensitäten für die m/z-Werte stellen untereinander lediglich relative Werte dar, die jeweils nur innerhalb eines einzelnen Spektrums miteinander vergleichbar sind. Aufgrund des komplexen Desorptions- und Ionisierungsprozesses unterscheiden sich die absolut gemessenen Intensitäten zwischen zwei Spektren stark, weswegen MALDI-TOF-Spektren üblicherweise vor der weiteren Auswertung normalisiert werden. Die gebräuchlichsten Normalisierungen sind die Total Ion Count- (TIC) sowie die Median-Normalisierung (siehe bspw., Deininger SO, Cornett DS, Paape R, Becker M, Pineau C, Rauser S, Walch A, Wolski E., Normalization in MALDI-TOF imaging datasets of proteins: Practical considerations, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 401(1):167-181, 2011. doi: 10.1007/s00216-011-4929-z, und Deininger SO, Wolski E., Normalization of mass spectra acquired by mass spectrometric imaging, 2011, Europäische Patentanmeldung
EP 2 388 797 (A1 )). - Bei allen bisher vorgeschlagenen Normalisierungen werden alle Intensitäten eines Spektrums mit einem gemeinsamen Faktor multipliziert, der für jedes Spektrum individuell bestimmt wird. In der Praxis beobachtet man jedoch, dass sich die Effekte, die zu unterschiedlichen absoluten Intensitäten in zwei Spektren führen, in verschiedenen Bereichen der Massenachse unterschiedlich auswirken. Die Normalisierung kann diese Unterschiede nicht ausgleichen, so dass abhängig vom Massenbereich deutliche Differenzen in den Intensitätsniveaus der einzelnen Spektren bestehen bleiben. Beispiele derartiger Differenzen in Intensitätsniveaus zwischen einzelnen Spektren (Spectrum 1 und Spectrum 2) für verschiedene Massenbereiche sind in den
1 a ,1 b und1 c dargestellt. - Diese Normalisierungsmethoden transformieren ein Spektrum unter Bezug auf eine willkürliche, für alle Spektren gleich gewählte Bezugsgröße (z.B. Median = 1 im Falle der Median-Normalisierung). Die Normalisierung wird daher prinzipiell auf jedes Spektrum einzeln angewandt, unabhängig von den übrigen Spektren derselben oder weiterer Messungen.
- Mit dem Begriff „Cross-Normalisierung“ wird dagegen eine Transformation bezeichnet, die zwei oder mehr Spektren so transformiert, dass sie in Bezug auf bestimmte Merkmale möglichst ähnlich bzw. vergleichbar sind, ohne dass hierfür ein externer Bezugspunkt festgelegt wird. Eine Cross-Normalisierung kann daher immer nur für ein Ensemble von Spektren durchgeführt werden.
- In Anlehnung an die Median-Normalisierung könnte z.B. von Cross-Normalisierung gesprochen werden, wenn zwei Spektren jeweils mit einem Faktor so multipliziert werden, dass die Mediane der Intensitäten dem Mittelwert der ursprünglichen Mediane entsprechen. Gegenüber der üblichen Median-Normalisierung hätte diese Form der Cross-Normalisierung jedoch natürlich keinen Vorteil.
- Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe besteht darin, ein verbessertes Normalisierungsverfahren für MALDI-TOF-Massenspektrometriedaten, insbesondere für gemessene spektrale Intensitäten, zu schaffen.
- Zur Lösung der Aufgabe weist das Verfahren die Maßnahmen des Anspruchs 1 auf. Demnach ist ein massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Makromolekülen, wie beispielsweise Peptiden, aus biologischen Proben unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers vorgesehen, wobei die Massenspektrometriedaten, insbesondere die spektralen Intensitäten der Spektren, mittels einer Intensitätsprofilnormalisierung in folgenden Schritten normalisiert werden:
- 1. zunächst wird für jedes einzelne Spektrum ein Intensitätsprofil gebildet, wobei durch das Intensitätsprofil die statistische Verteilung der Intensitätswerte innerhalb verschiedener Massenbereiche beschrieben wird,
- 2. anschließend wird für ein Ensemble von Spektren ein mittleres Referenzprofil gebildet,
- 3. und schließlich werden die einzelnen Spektren so transformiert, dass ihre Intensitätsprofile dem Referenzprofil entsprechen.
- Bevorzugt kann es erfindungsgemäß weiter vorgesehen sein, dass das Intensitätsprofil eines Spektrums gebildet wird, indem zunächst eine Unterteilung einer Abszissenachse des Spektrums, vorzugsweise eine Massenachse, in Teilintervalle I, insbesondere 4-8 Intervalle gleicher Breite, festgelegt wird.
- Vorzugsweise kann es ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorsehen, dass eine Quantil-Skala mit einer Folge von p-Werten innerhalb des Intervalls (0,1) festgelegt wird.
- Darüber hinaus ist es denkbar, dass die Quantil-Skala 10-20 Stützpunkte umfasst, die an den Enden des Intervalls dichter liegen als im Inneren und den Bereich 0,1 < p < 0,999 abdecken.
- Weiter kann ein Aspekt der Erfindung darin gesehen werden, dass für jedes Teilintervall I der Abszissenachse des Spektrums, insbesondere der Massenachse, die spektralen Intensitäten zusammengefasst und die jeweiligen empirischen p-Quantile zu den Punkten p der Quantil-Skala berechnet werden.
- Insbesondere kann es die Erfindung vorsehen, dass die Quantils-Werte logarithmiert und die Differenzen aufeinanderfolgender Werte gebildet werden.
- Schließlich kann eine vorteilhaftes Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens darin gesehen werden, dass zu einem Ensemble von MALDI-Spektren ein Referenzprofil gebildet wird, in dem elementweise ein arithmetischer Mittelwert der einzelnen Intensitätsprofile bestimmt wird, wobei undefinierte Einträge bei der Mittelung nicht berücksichtigt werden.
- Vorzugsweise kann es zusätzlich vorgesehen sein, dass zum Normalisieren eines einzelnen Spektrums auf das Referenzprofil, das Referenzprofil in Quantils-Werte zurück transformiert wird, wobei Matrixeinträge des Referenzprofils zeilenweise kumulativ aufsummiert und antilogarithmiert werden, wobei undefinierte Einträge ignoriert werden.
- Nach einem weiteren Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass die Quantils-Werte des zu normalisierenden Einzelspektrums und des Referenzprofiles als Stützpunkte einer Transferfunktion aufgefasst werden, zwischen denen auf geeignete Weise, insbesondere linear oder mit Splines, interpoliert wird, während außerhalb des durch die Stützpunkte festgelegten Intensitätsbereiches die Transferfunktion konstant festgesetzt wird.
- Schließlich kann es vorgesehen sein, dass durch Anwenden der Transferfunktion auf die Intensitätswerte des Einzelspektrums das normalisierte Spektrum erstellt wird.
- Ein MALDI-TOF-Massenspektrometer zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe wird durch den Anspruch 11 beschrieben. Demnach ist es vorgesehen, dass ein MALDI-TOF-Massenspektrometer zur Durchführung eines Verfahrens nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 10 ausgebildet ist.
- Weitere Maßnahmen sowie Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung im Übrigen und aus den Ansprüchen. Vorteilhafte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
-
1a Beispiel für Differenzen in Intensitätsniveaus einzelnen Spektren, -
1b Beispiel für Differenzen in Intensitätsniveaus einzelnen Spektren, und -
1c Beispiel für Differenzen in Intensitätsniveaus einzelnen Spektren, -
2 eine beispielhafte Quantil-Skala mit 15 Stützpunkten. - Im Folgenden wird ein Verfahren zur Cross-Normalisierung der spektralen Intensitäten in MALDI-TOF-Massenspektrometriedaten beschrieben, mit dem mehrere Datensätze so modifiziert werden, dass sie untereinander besser vergleichbar werden und charakteristische spektrale Features leichter extrahiert werden können. Das Verfahren beruht auf der statistischen Modellierung der in einem Spektrum gemessenen Intensitäten in Abhängigkeit von der gemessenen Masse.
- Hierfür wird zunächst für jedes einzelne Spektrum ein Intensitätsprofil gebildet, das die statistische Verteilung der Intensitätswerte innerhalb verschiedener Massenbereiche beschreibt. Anschließend wird für ein Ensemble von Spektren ein mittleres Referenzprofil gebildet und die einzelnen Spektren werden so transformiert, dass ihre Intensitätsprofile dem Referenzprofil entsprechen. Im Folgenden wird für diese Methode der Begriff Intensitätsprofilnormalisierung verwendet.
- Das Intensitätsprofil eines Spektrums wird gebildet, indem zunächst eine Unterteilung der Massenachse in Teilintervalle festgelegt wird, typischerweise in 4-8 Intervalle gleicher Breite. Weiter wird eine Quantil-Skala festgelegt, d.h. eine Folge von p-Werten innerhalb des Intervalls (0,1). Typischerweise umfasst die Quantil-Skala 10-20 Stützpunkte, die an den Enden des Intervalls dichter liegen als im Inneren und den Bereich 0,1 < p < 0,999 abdecken (
2 ). - Für jedes Teilintervall I der Massenachse werden nun die spektralen Intensitäten zusammengefasst und es werden die jeweiligen empirischen p-Quantile zu den Punkten p der Quantil-Skala berechnet. In einem nächsten Schritt werden die Quantils-Werte logarithmiert und die Differenzen aufeinanderfolgender Werte gebildet. Aufgrund dieser Transformation ist der resultierende Profilvektor unabhängig von einer linearen Skalierung der spektralen Intensitäten, z.B. als Folge einer etwaigen vorherigen Normalisierung nach einer der Standardmethoden (s. oben). Das Intensitätsprofil eines Spektrums besteht dann aus einer Matrix, in der die einzelnen Zeilen jeweils die Profilvektoren zu einem Teilintervall enthalten.
- Da spektrale Intensitäten den Wert 0 annehmen können, gilt dies auch für Quantils-Werte am unteren Ende der Quantil-Skala. Die Logarithmen dieser Werte und die zugehörigen Matrixeinträge des Intensitätsprofiles können in diesem Fall nicht berechnet werden und werden als undefiniert behandelt.
- Zu einem Ensemble von MALDI-Spektren wird ein Referenzprofil gebildet, in dem elementweise der arithmetische Mittelwert der einzelnen Intensitätsprofile bestimmt wird. Undefinierte Einträge werden bei der Mittelung nicht berücksichtigt.
- Um ein einzelnes Spektrum auf das Referenzprofil zu normalisieren, wird zunächst das Referenzprofil in Quantils-Werte zurück transformiert, indem die Matrixeinträge des Referenzprofils zeilenweise kumulativ aufsummiert und antilogarithmiert werden. Undefinierte Einträge werden wiederum ignoriert. Die Quantils-Werte des zu normalisierenden Einzelspektrums und des Referenzprofiles werden dann als Stützpunkte einer Transferfunktion aufgefasst, zwischen denen auf geeignete Weise interpoliert wird (z.B. linear oder mit Splines). Außerhalb des durch die Stützpunkte festgelegten Intensitätsbereiches wird die Transferfunktion konstant fortgesetzt. Durch Anwenden der Transferfunktion auf die Intensitätswerte des Einzelspektrums erhält man das normalisierte Spektrum.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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- Zitierte Patentliteratur
-
- EP 2388797 A1 [0006]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Deininger SO, Cornett DS, Paape R, Becker M, Pineau C, Rauser S, Walch A, Wolski E., Normalization in MALDI-TOF imaging datasets of proteins: Practical considerations, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 401(1):167-181, 2011 [0006]
- Deininger SO, Wolski E., Normalization of mass spectra acquired by mass spectrometric imaging, 2011 [0006]
Claims (11)
- Massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Makromolekülen aus biologischen Proben unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers, wobei die Massenspektrometriedaten, insbesondere die spektralen Intensitäten der Spektren, mittels einer Intensitätsprofilnormalisierung in folgenden Schritten normalisiert werden: 1. zunächst wird für jedes einzelne Spektrum ein Intensitätsprofil gebildet, wobei durch das Intensitätsprofil die statistische Verteilung der Intensitätswerte innerhalb verschiedener Massenbereiche beschrieben wird, 2. anschließend wird für ein Ensemble von Spektren ein mittleres Referenzprofil gebildet, 3. und schließlich werden die einzelnen Spektren so transformiert, dass ihre Intensitätsprofile dem Referenzprofil entsprechen.
- Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Intensitätsprofils eines Spektrums gebildet wird, indem zunächst eine Unterteilung einer Abszissenachse des Spektrums, vorzugsweise eine Massenachse, in Teilintervalle /, insbesondere 4-8 Intervalle gleicher Breite, festgelegt wird. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Quantil-Skala mit einer Folge von p-Werten innerhalb des Intervalls (0,1) festgelegt wird. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Quantil-Skala 10-20 Stützpunkte umfasst, die an den Enden des Intervalls dichter liegen als im Inneren und den Bereich 0,1 < p < 0,999 abdecken. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, dass für jedes Teilintervall I der Abszissenachse des Spektrums, insbesondere der Massenachse, die spektralen Intensitäten zusammengefasst und die jeweiligen empirischen p-Quantile zu den Punkten p der Quantil-Skala berechnet werden. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, dass die Quantils-Werte logarithmiert und die Differenzen aufeinanderfolgender Werte gebildet werden. - Massenspektrometrisches Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zu einem Ensemble von MALDI-Spektren ein Referenzprofil gebildet wird, in dem elementweise ein arithmetischer Mittelwert der einzelnen Intensitätsprofile bestimmt wird, wobei undefinierte Einträge bei der Mittelung nicht berücksichtigt werden.
- Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, dass zum Normalisieren eines einzelnen Spektrums auf das Referenzprofil das Referenzprofil in Quantils-Werte zurück transformiert wird, wobei Matrixeinträge des Referenzprofils zeilenweise kumulativ aufsummiert und antilogarithmiert werden, wobei undefinierte Einträge ignoriert werden. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, dass die Quantils-Werte des zu normalisierenden Einzelspektrums und des Referenzprofiles als Stützpunkte einer Transferfunktion aufgefasst werden, zwischen denen auf geeignete Weise, insbesondere linear oder mit Splines, interpoliert wird, während außerhalb des durch die Stützpunkte festgelegten Intensitätsbereiches die Transferfunktion konstant fortgesetzt wird. - Massenspektrometrisches Verfahren nach
Anspruch 9 , dadurch gekennzeichnet, dass durch Anwenden der Transferfunktion auf die Intensitätswerte des Einzelspektrums das normalisierte Spektrum erstellt wird. - MALDI-TOF-Massenspektrometer mit einer Steuereinheit zur Analyse von Makromolekülen aus biologischen Proben unter Anwendung eines Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis10 .
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