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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Anreicherung von Zellen, Zellfragmenten und Molekülen aus Vollblut für einen spezifischen Nachweis mindestens einer darin enthaltenen Population von Zellen, Zellfragmenten oder Molekülen.
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Zellen im Sinne der Erfindung sind biologische Zellen, eukaryotische und prokaryotische Zellen, kernhaltige oder kernlose, sowie einzellige Lebewesen, und Mehrzeller. Zellfragmente im Sinne der Erfindung sind Teile von Zellen, einschließlich Zellwandbestandteile, Organelle, Membranbestandteile, Blutplättchen und Mizellen, sowie Viren. Moleküle im Sinne der Erfindung umfassen Makromoleküle einschließlich Proteine, Peptide, und Oligonukleotide wie DNA und RNA, oder Lipide, Kohlenhydrate und kleine Moleküle.
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Zellen oder Viren, die nachgewiesen werden sollen, werden nachfolgend als Zielobjekte bezeichnet. Pathogene wie etwa Bakterien, Pilze, Einzeller und Viren können ebenfalls Zielobjekte sein. Zielobjekte können aber auch fötale Zellen im mütterlichen Blut oder zirkulierende Tumorzellen sein. Der Nachweis kann zum Ziel haben, die DNA, RNA oder Antigene der Zielobjekte, Fragmente der Zellen, oder die ganzen Zellen nachzuweisen. Vereinfachend werden diese Nachweise nachfolgend auch als Nachweis von Zielobjekten bezeichnet.
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Zellen, die mit den Zielzellen gemeinsam im Vollblut auftreten, werden nachfolgend als Matrixobjekte bezeichnet. Matrixzellen umfassen insbesondere die verschiedenen Arten von Immunzellen (Lymphozyten) sowie Erythrozyten und Zellfragmente wie beispielweise Plättchen.
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Verfahren, mit denen Zielobjekte, deren Moleküle und insbesondere ihre DNA aus Vollblut nachgewiesen werden, umfassen beispielsweise molekularbiologische Techniken wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder Arrays, seit Kurzem auch Sequenzierung, NMR oder Massenspektroskopie.
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Insbesondere bei geringer Konzentration (insbesondere kleiner 1000 Zellen pro ml Vollblut) der zu analysierenden Zielobjekte im Vollblut zeigt sich eine Limitation hinsichtlich der Detektionsgrenze (insbesondere der Sensitivität und Spezifität) der Nachweisverfahren. Aus diesem Grund erstreben etablierte Verfahren eine möglichst vollständige Aufbereitung des Probenmaterials an, um für das Detektionsverfahren möglichst viel Analyt bereitzustellen (Banada et al. 2012).
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Außerdem wurden Technologien entwickelt, mit denen die gesuchten Zielobjekte oder die in ihnen enthaltenen Moleküle aus Vollblut spezifisch angereichert werden können. So ist der „Cell Collector“ von Gilupi, Potsdam, eine Vorrichtung, mit der in vivo zirkulierende Tumorzellen an der Oberfläche eines Metallstabs angereichert werden. MagNA Lyser beads von Roche Diagnostics, Mannheim, sind keramische Magnetobeads für den mechanischen Aufschluss von Zellen und der nachfolgenden Anreicherung der darin enthaltenden DNA. Ähnlich dienen die beads der µMACS-Serie von Miltenyi, Bergisch-Gladbach der Anreicherung von DNA und RNA aus Zellen. Damit können Sensitivität und Spezifität des Nachweis' erhöht werden. Allerdings kosten diese Verfahren viel Zeit und sind meist mit großem apparativem Aufwand verbunden. Zudem beruhen diese Methoden meist auf einzelnen molekularen Zielstrukturen, die für die Zielobjekte charakteristisch sind. Das bedeutet, dass Zielobjekte oder deren Moleküle je nach verwendeten Fänger-Strukturen, beispielsweise Antikörpern, spezifisch angereichert werden. Bei der beispielsweisen Verwendung von Antikörpern zum Anreichern einer bestimmten Pathogenspecies werden möglicherweise jedoch andere, gleichzeitig vorkommende Pathogene nicht angereichert.
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Darüber hinaus wurden zur Erhöhung der Spezifität Technologien entwickelt, aus dem analysierten Vollblut isolierte Ziel-DNA anzureichern Die VYOO-Plattform von Analytik Jena, Jena, verwendet eine Affinitätschromatographie mit einem vom CXXC-Fänger-Protein 1 abgeleiteten immobilisierten Protein, um die DNA von Pathogenen spezifisch anzureichern (Popp et al., 2015). Nachteilig ist auch hier der hohe Zeitwand (Hands-on-Time).
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Insbesondere zum Nachweis von Pathogenen in geringen Konzentrationen im Vollblut werden daher im Stand der Technik oft nicht-molekulare Methoden wie die Blutkultur bevorzugt verwendet, bei denen die Pathogene vor dem Nachweis einige Stunden oder gar Tage kultiviert werden, um sie zu vermehren und so die Sensitivität des Nachweises zu erhöhen. Diese Kultivierung kann auch einem molekularem Nachweis vorgeschaltet werden. In jedem Fall sind diese Kultivierungsverfahren zeitaufwendig, arbeitsintensiv und dahingehend problematisch, dass nicht alle Pathogene in der Blutkultur gleichermaßen kultiviert oder vermehrt und nachgewiesen werden können (Striebel, 2014, Thalhammer et al, 2016). Daraus resultiert eine limitierte Sensitivität oder Spezifität.
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Nachteilig bei allen Methoden im Stand der Technik ist, dass sie in der praktischen Anwendung viel zu langsam sind. Im Falle des Nachweises von Pathogenen im Krankheitsbild beispielsweise der Sepsis oder Endokarditis ist jedoch eine schnelle Analyse für eine erfolgreiche Therapie ausschlaggebend (Afshari et al., 2012). Der hohe apparative und logistische Aufwand, und die Komplexität der beschriebenen Methoden bedingen, dass der Nachweis zuverlässig nur durch besonders qualifizierte Mitarbeiter mit Laborerfahrung und damit nicht oder nicht sicher am Point-of-Care durchgeführt werden kann. Stattdessen werden die Proben in zentrale Labore gebracht und dort analysiert, wodurch die Laufzeiten vom Patienten bis zum Adressaten des Nachweises, insbesondere des behandelnden Arztes vor allem außerhalb der regulären Arbeitszeiten meist zu lang sind (Afshari et al., 2012).
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein breites Spektrum von Zielobjekten einschließlich ihrer Moleküle einfach, schnell und dennoch sensitiv und spezifisch aus Vollblut nachzuweisen.
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Überraschend wurde gefunden, dass auch bei unvollständig quantitativer Aufbereitung der Probe ein spezifischer und sensitiver Nachweis von Zielobjekten erreicht werden kann, wenn dafür wenige Populationen, insbesondere einzelne Populationen Matrixobjekte des Vollblutes vor der Probenaufbereitung angereichert werden. Überraschend ist dies vor allem, weil im Stand der Technik argumentiert wird, dass die Sensitivität und Spezifizität vor allem von der vollständigen Aufbereitung der Zielobjekte abhängt (Banada et al., 2012).
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Beispielsweise können im Fall von Pathogen-Infektionen im Vollblut durch die Anreicherung von Matrixobjekten, insbesondere von Immunzellen oder einzelner Immunzell-Populationen, deren Aufarbeitung, DNA-Isolation und nachfolgende PCR selbst wenige Pathogene (3-1000 Pathogene/ml Vollblut) mittels PCR sicher, spezifisch und sensitiv nachgewiesen werden. Möglicherweise stehen eine spezifische Anbindung der Matrixobjekte an Zielobjekte wie Pathogene, oder spezifische Phagozytoseprozesse damit im Zusammenhang. Diese Effekte könnten das Verhältnis von Pathogen zu eukaryotischen Material erhöhen und damit bei einigen Nachweisverfahren, insbesondere bei der PCR, das Hintergrundsignal in der Analyse verringern (Loonen et al, 2013). Dabei ist bereits bekannt, dass eine nested PCR geeignet ist, Staphylococcus aureous aus Lymphozyten nachzuweisen, die mit CD45-markierten magnetischen Beads isoliert und nachfolgend zentrifugiert wurden. CD45 bindet jedoch an alle Lymphozyten und nicht spezifisch an einzelne Populationen (Banada et al. 2012). Im Vergleich zur direkten PCR aus Vollblut zeigt dieses Verfahren jedoch keinen Sensitivitätsvorteil und ist zudem durch die Verwendung einer Zentrifuge technisch aufwendig. Der Prozess ist zudem komplex und benötigt viele Einzelschritte. Auch das Polaris Verfahren (Loonen et al., 2013) benötigt Zentrifugations- und mehrere komplexe Einzelschritte.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Anreicherung der Matrixobjekte mit Hilfe von Partikeln erfolgen, die an spezifische Matrixobjekte spezifisch oder unspezifisch binden. Die Bindung der Partikel an die Matrixobjekte kann durch die Beschichtung oder Kopplung der Partikel mit Fängermolekülen, insbesondere Antikörpern oder anderen Proteinen, Peptiden oder Aptameren vermittelt werden. Die Partikel können weitere Eigenschaften aufweisen wie beispielsweise magnetische, akustische oder dielektrische Eigenschaften, die es ermöglichen, sie direkt anzureichern oder zu isolieren. In einer weiteren Ausführungsform kann die Größe von Partikeln in einem spezifischen Bereich liegen, so dass sie mit einem Partikelfilter angereichert werden können.
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Die Anreicherung kann jedoch auch chromatographisch erfolgen, wenn auch mit größerem apparativen Aufwand der Vorrichtung. Bei dieser Ausführungsform fließen die Matrixobjekte an den immobilisierten Beads, insbesondere Beads mit Fängermolekülen vorbei, mit denen die Oberfläche einer Durchflussvorrichtung beschichtet ist, Die beschriebenen Beads können auch als Packmaterial einer chromatographischen Säule verwendet werden. Ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt kann die Anreicherung noch verbessern, erhöht aber die Komplexität des Verfahrens. Daher kann es vorteilhaft sein, die Anreicherung ohne Zentrifugationsschritt durchzuführen.
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Die Anreicherung kann auch mit einem Durchflusszytometer erfolgen.
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Es kann bevorzugt sein, die Zielobjekte vor der Detektion von den Matrixobjekten zu lösen.
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Matrixobjekte, die gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens angereichert werden können, umfassen Leukozyten, insbesondere Monozyten, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, NK-Zellen, eosinophile, basophile und neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen, aber auch Erythrozyten. Matrixobjekte können auch natürliche Zellfragmente, einschließlich Blutplättchen, oder Zelltrümmer sein, die durch mechanische oder chemische Einwirkung oder biologische Prozesse wie Apoptose entstehen. Es kann bevorzugt sein, beim erfindungsgemäßen Verfahren mehr als eine Population Matrixobjekte anzureichern, inbesondere durch die Verwendung von Partikeln oder Beads, die für mehrere Matrixobjekte spezifisch sind, oder von unterschiedlichen Partikeln, die für je eine Sorte Matrixobjekte spezifisch sind. Dabei ist die Anreicherung des gesamten Lymphozytenspektrums jedoch offenbar ungünstig (Banada et al., 2012)
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Vorteilhaft ist die Anreicherung der Immunzellen des Ausführungsbeispiels beispielsweise über Antikörper, die an ein Trägersystem (insbesondere Partikel, insbesondere Beads, oder feste Matrices) gebunden sind. Ähnlich vorteilhaft kann die Anreicherung in fluidischen oder mikrofluidischen Systemen erfolgen, in denen die Immunzellen oder die Partikel durch Kräfte oder Energieeintrag, insbesondere durch akustische oder dielektrophoretische Effekte im Flüssigkeitsstrom angereichert werden, oder aber im Durchflusszytometer.
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Es kann vorteilhaft sein, die Matrixobjekte zusammen mit den Zielobjekten histologisch zu untersuchen und vorzugsweise mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung oder Antikörperfärbung zu analysieren.
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Es kann weiterhin vorteilhaft sein, die angereicherten Matrixobjekte zu lysieren und damit die Nukleinsäuren, insbesondere DNA und RNA der Zielobjekte und insbesondere der Pathogene freizusetzen. Dazu stehen verschiedene Verfahren aus dem Stand der Technik zur Verfügung, einschließlich der Trizollyse, anderer chemische Methoden, und mechanischem Aufschluss. Nachfolgend sind oft eine Fällung der DNA oder RNA mit Ethanol, sowie eine Aufreinigung über Säulen von Vorteil.
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Für die Detektion der DNA oder RNA sind PCR, isotherme Amplifikationsverfahren, Sequenzierung oder Array-basierte Verfahren geeignet. Bei der PCR lassen sich Multiplex- und Einzel-PCR unterscheiden, von denen letztere besonders vorteilhaft ist, weil sie einen besonders einfachen Ablauf ermöglicht. Damit ist die Einzel-PCR besonders geeignet, das Verfahren am Point of Care durchzuführen und spezifische Pathogene sowie Resistenzindikatoren oder -gene zu detektieren.
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Die Erfindung umfasst auch eine Vorrichtung zur Isolation, optional ergänzt um den Nachweis von Zielobjekten.
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In einem konkreten Ausführungsbeispiel umfasst ein Kartuschensystem eine Vorrichtung zu Probeneingabe, Speicherorte für verschiedene Waschpuffer, Speicherorte für ein Bead-Antikörper-System zur Bindung von spezifischen Matrixobjekten, insbesondere Immunzellen, sowie eine Möglichkeit zur Lyse von isolierten Matrixobjekten, und optional eine Vorrichtung zur Entnahme der RNA oder DNA. Im Kartuschensystem wird dem Vollblut das Antikörper-Bead-System zugegeben, mit Waschpuffer gewaschen, über ein Sieb-System oder magnetisch das Antikörper-Bead-System mit gebundenen Matrixobjekten isoliert, mit Zell-Lyse-Puffer versetzt und die ausgefällte DNA entnommen. In diesem Kartuschensystem wird eine schnelle und einfache Anreicherung der Matrixobjekte, sowie die Lyse und DNA-Isolation in einem nahezu abgeschlossenen Behältnis durchgeführt und so die Gefahr von Kontamination der Probe mit Fremd-DNA verringert.
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In einer weiteren Ausführungsform verbleibt die RNA oder DNA im Kartuschensystem und wird nicht entnommen. Stattdessen wird durch ein Fenster in der Kartusche oder mit integrierten Heiz- und Detektionselementen die PCR innerhalb der Kartusche durchgeführt. Sie enthält dann einen weiteren Speicherort für die PCR-Reagenzien.
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In einem weiteren konkreten Ausführungsbeispiel wird die isolierte DNA direkt auf eine PCR-Analyse-Platte aufgetragen, welche standardisiert alle Chemikalien zur Analyse verschiedener Pathogene enthält. Diese Platte kann als Multiplex-PCR oder als parallelisiert ablaufende Einzel-PCR ausgefertigt sein.
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Die Auftragung der isolierten DNA aus der Kartusche in die PCR-Platte kann manuell und insbesondere mit einer Pipette oder direkt aus der Kartusche über ein spezielles Dosiersystem erfolgen.
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Dabei ist die DNA-Lyse in der Kartusche und die nachfolgende PCR nur eine Möglichkeit der Analyse; weitere Ausführungsbeispiele umfassen die Analyse der Zellen über spektroskopische, enzymatische, kolorimetrische, histologische, chemisch-analytische (insbesondere MALDI-TOF-MS), elektrochemische und andere physikalische Methoden (insbesondere NMR).
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Des weiteren kann es vorteilhaft sein, die Auswertung des Analyseverfahrens automatisch mittels einer Software durchzuführen und Ergebnisse mit einer Datenbank abzugleichen und Handlungsempfehlungen für die Therapie abzuleiten, insbesondere direkt aus Guidelines, Leitlinien oder durch adaptive oder selbst-lernende Verfahren.
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Das erfindungsgemäße Verfahren, die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Applikationskit können für den Nachweis einer Vielzahl von Krankheiten und physiologischen Zuständen verwendet werden. Dazu zählen folgende Beispiele:
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Bei der dem „Systemic Inflammatory Response Syndrome“ (SIRS) ist der unmittelbare Nachweise von Interesse, ob den am Patienten beobachteten Symptomen eine Sepsis, d.h. Pathogene im Blutstrom, oder andere Ursachen zugrunde liegen. Dabei können Pathogene Viren, Bakterien, Fungi oder Parasiten sein, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden. Dieser Nachweis ermöglicht dem behandelnden Arzt, eine bessere antibiotische oder Anti-Pathogen Therapie mit optimalen Medikamenten einzuleiten.
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Auch bei Endocarditis besteht Bedarf, für eine Therapieentscheidung Pathogene im Blut schnell nachzuweisen. Gerade bei der Endocarditis gelten die Bedingungen für die Blutkultur als besonders anspruchsvoll und zeitraubend. (Durack et al. 1994). Pathogene, die im Labor besonders langsam wachsen, aber für etwa 3% der Endocarditis-Fälle relevant sind, werden in der HACEK - Gruppe zusammengefasst (Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, and Kingella kingae).
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Bei Pneumonien sind Bakterien nach einigen Tagen im Urin nachweisbar. Vor allem bei den immer häufiger vorkommenden nokosomialen und durch Klimaanlagen bedingten Pneumonien werden im Stand der Technik Blutkulturen empfohlen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet auch bei diesen Infektionen den Vorteil eines schnelleren Nachweises.
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Zoonosen sind Infektionen mit einem großen Spektrum an Manifestationen, bei denen zum Teil auch Blutkulturen zur Diagnose angelegt werden, teils über 4 - 6 Wochen wie beispielsweise beim Verdacht auf Brucellose. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet auch bei diesen Infektionen den Vorteil eines schnelleren Nachweises.
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Durch die spezifische Anreicherung hat das erfindungsgemäße Verfahren zudem Anwendungspotenzial bei viralen Erkrankungen, insbesondere bei der HIV-Detektion bei Schwangeren, bei denen eine sichere Diagnose besonders wichtig ist, um Maßnahmen einzuleiten, die die Übertragung auf das Kind verhindern.
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In der Qualitäts- und Verlaufskontrolle von CAR-T Therapien (Chimeric Antigen Receptor T-Zell Therapien) kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls eingesetzt werden.
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In einer konkreten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte: Zunächst wird dem Patienten eine oder mehrere Blutproben entnommen, deren Koagulation im EDTA / Citratpuffer vermieden wird. Zu dieser Probe werden Beads, beispielsweise Anti-CD14 Beads von pluriSelect dazugegeben, die die Matrixobjekte, beispielsweise alle CD14 tragende Zellen wie Monozyten und Makrophagen binden. Anschließend werden die Beads durch ein Sieb abgetrennt, beispielsweise mit dem Cell Strainer von pluriSelect. Die Probe mit den so angereicherten Matrixobjekten wird in einem folgenden Schritt einer DNA-Lyse unterworfen (beispielsweise Trizol-Fällung). Anschließend wird die Probe auf mehrere Probengefäße, beispielsweise Wells einer qPCR-fähigen Mikrotiterplatte verteilt. Diese Wells enthalten bereits Reagenzien für eine qPCR, einschließlich der für jedes well unterschiedlichen Primer für eine bekannte Sequenz, die der Identifikation eines Zielobjektes oder seiner Therapieresistenz.über einen genetischen Marker dient. Anschließend wird eine Einzel-qPCR durchgeführt. Die Quantifizierung des Signals ermöglicht festzustellen, welche Zielobjekte oder Resistenzgene in der Probe vorhanden sind.
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Vorteilhaft kann dabei auch die Verwendung einer herkömmlichen PCR mit anschließender Gel-Elektrophorese zum Nachweis der PCR-Fragmente sein, genau so wie eine Multiplex-PCR.
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Die Erfindung umfasst auch ein Applikationskit zur Isolation und Analyse von Zellen, Zellfragmenten und Molekülen, bestehend zumindest aus
- - wenigstens einer Kartusche zur Isolation von Matrixobjekten aus Vollblut, welche optional um die Möglichkeit der DNA-Isolation erweitert sein kann
- - eines Probenträgers für den Nachweis, insbesondere eines PCR-Probenträgers und insbesondere einer PCR-Probenplatte, welche alle Reagenzien für den Nachweis und insbesondere zur Durchführung einer PCR und dem Nachweis von Zielobjekten, beispielsweise Pathogenen und optional deren Resistenzen enthält
- - Verdünnungs- und Reaktionspuffer
- - eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien
- - eine Vorschrift zur Anwendung.
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Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
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Es zeigen:
- 1: Darstellung des allgemeinen Workflows zur Aufreinigung von Matrixobjekten und Detektion von von Zielstrukturen
- 2: Darstellung des vorgeschlagenen erfindungsgemäßen Arbeitsablaufes zur Anreicherung von Matrixobjekten und des Nachweises von Pathogenen
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In 1 ist der erfindungsgemäße Arbeitsablauf dargestellt. Aus einer Probe werden Matrixobjekte spezifisch isoliert, die mit Zielstrukturen assoziiert sind. Nach einer Prozessierung der Proben erfolgt das eigentliche Nachweisverfahren der Zielstrukturen.
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In 2 ist ein spezifischer erfindungsgemäßer Arbeitsablauf zur Detektion von Pathogenen im Blut dargestellt. Dabei wird EDTA-Vollblut in das erfinungsgemäße Kartuschensystem eingebracht, in dem die Probe mit CD14-Beads inkubiert, mit Puffer gewaschen und über ein Sieb-System die Beads zusammen mit gefangenen Monozyten/Makrophagen (Matrixobjekte) und den darin/daran enthaltenen Pathogenen (Zielobjekte) isoliert. Im Anschluss erfolgt die Zell-Lyse und Isolierung/Aufreinigung der DNA, bevor die DNA-Probe mittels Pipetten aus der Kartusche in die ebenfalls erfindungsgemäßen PCR-Wellplatten überführt wird. In diesen Platten sind bereits in lyophilisierter Form alle für die PCR notwendigen Chemikalien enthalten; die Polymerase wird zusammen mit der DNA-Probe auf die Well-Platte gegeben. Im Anschluss erfolgt die PCR und damit die spezifische Detektion der Erreger. Durch die Anreicherung der Zielobjekte mit den Matrixobjekten bzw. die Abreicherung von nicht-Zielobjekten kann eine erhöhte Sensitivität und Spezifität des Nachweisverfahrens im Vergleich zum Stand der Technik erreicht werden; die Nutzung des erfindungsgemäßen Arbeitsablaufes und des Kartuschensystems führt zu schnellen Ergebnissen unter Benutzung von Standard-Laborausrüstung.
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Literatur
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- Popp et al. 2015: J. Popp, M. Bauer: „Modern Techniques for Pathogen Detection“, John Wiley & Sons, 23 Feb 2015, p. 86
- Streibel 2014: H.-W. Striebel: „Operative Intensivmedizin: Sicherheit in der klinischen Praxis“, Schattauer Verlag, 6 Oct 2014, p. 869
- Thalhammer et al. 2016: F. Thalhammer, P. Apfalter, M. Frick, H. Gabriel, R. Gattringer, A. Grisold, R. Krause, Ch. Loewe, L. Müller, H. J. Nesser, A. Wechsler-Fördös, G. Weiss, Ch. Wenisch, S. Winkler, A. Zuckermann, R. Zweiker, K. Huber: „Die infektiöse Endokarditis“ Österreichische Ärztezeitung, Supplementum, 8/2016, p. 2
- Afshari et al., 2012: A. Afshari, J. Schrenzel, M. Ieven, St. Harbarth „Bench-tobedside review: Rapid molecular disgnostics for bloodstream infection - a new frontier?" Crit Care. 2012; 16(3): 222. Published online 2012 May 29. doi: 10.1186/cc11202
- Banada et al. 2012: P. P. Banada, S. Chakravorty, D. Shah, M. Burday, F. M. Mazzella, D. Alland: „Highly Sensitive Detection of Staphylococcus aureus Directly from Patient Blood" PLOS one, 17 February 2012 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0031126
- Loonen et al., 2013: A. J. M. Loonen, M. P. Bos, B. van Meerbergen, S. Neerken, A. Catsburg, I. Dobbelaer, R. Penterman, G. Maertens, P. van de Wiel, P. Savelkoul, A. J. C. van den Brule: „Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections" 15 August 2013, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0072349
- Durack et al. 1994: Durack DT, Lukes AS, Bright DK „New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings." Duke Endocarditis Service, Am J Med. 1994 Mar;96(3):200-9.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Striebel, 2014, Thalhammer et al, 2016 [0009]
- Afshari et al., 2012 [0010]
- Afshari et al., 2012: A. Afshari, J. Schrenzel, M. Ieven, St. Harbarth „Bench-tobedside review: Rapid molecular disgnostics for bloodstream infection - a new frontier?“ Crit Care. 2012; 16(3): 222. Published online 2012 May 29 [0043]
- Banada et al. 2012: P. P. Banada, S. Chakravorty, D. Shah, M. Burday, F. M. Mazzella, D. Alland: „Highly Sensitive Detection of Staphylococcus aureus Directly from Patient Blood“ PLOS one, 17 February 2012 [0043]
- Loonen et al., 2013: A. J. M. Loonen, M. P. Bos, B. van Meerbergen, S. Neerken, A. Catsburg, I. Dobbelaer, R. Penterman, G. Maertens, P. van de Wiel, P. Savelkoul, A. J. C. van den Brule: „Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections“ 15 August 2013 [0043]
- Durack et al. 1994: Durack DT, Lukes AS, Bright DK „New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings.“ Duke Endocarditis Service, Am J Med. 1994 Mar;96(3):200-9 [0043]
