DE102016013365A1

DE102016013365A1 - Methoden und Apparatur zur Messung von Aktivitäten technischer Enzyme

Info

Publication number: DE102016013365A1
Application number: DE102016013365.1A
Authority: DE
Inventors: Ovidiu Dicoi; Hermann Bellenberg; Thomas Brand; Helmut Reinhard
Original assignee: Raehse Wilfried Dr
Current assignee: Raehse Wilfried Dr
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2018-05-09

Abstract

Die Erfindung beschreibt innovative Bestimmungen des zeitlichen Verlaufs von enzymatischen Hydrolysereaktionen biologischer Substrate im Bereich der Wasch- und Reinigungsmittel sowie der Lebensmittelindustrie. Das wichtigste Merkmal ist die Messung in Echtzeit. Dadurch lassen sich die Geschwindigkeiten der Prozesse in Abhängigkeit von der Temperatur und von anderen Bestandteilen der Flüssigkeit bestimmen sowie Enzymhemmungen identifizieren. Die Messungen erfolgen in einer neu konzipierten Apparatur der Mikroreaktionstechnik direkt im temperierten Mikrorührkessel mittels spektroskopischer Aufnahmen von einer oder von mehreren charakteristischen Bindungs-Banden. Diese werden über die UV/VIS-, FTIR- und/oder Raman-Spektroskopie in einer Flüssigkeit oder mittels FTR/FTIR an der Grenzfläche fl/f erzeugt.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung findet vorzugsweise Anwendung in der Waschmittel- und der Lebensmittelindustrie. Sie betrifft erstens eine innovative Methode zur online und/oder offline- Echtzeitmessung des Verlaufs von Enzymaktivitäten hydrolytischer Reaktionen in wässriger Phase. Hierbei geht es um die Spaltung von biologischen Substraten durch einzelne oder mehrere Hydrolasen (Biokatalysatoren, wie Proteasen/Peptidasen, Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Mannasen, Glucanasen, Glycoamylasen, Pullulanasen, Pektinasen, Lactasen, Dextranasen, Xylanasen) in flüssigen Mehrstoffgemischen, üblicherweise in wässrigen Systemen. Als biologische Substrate werden natürliche, enzymatisch hydrolysierbare Substanzen betrachtet, also Öle und Fette, Proteine, Kohlenhydrate oder Saccharide (u.a. Stärke und Cellulose). Die Messung umfasst in der Regel die Kinetik der enzymatischen Reaktion, den Umsatz der Umwandlung von Substraten in Produkte, den Hydrolysierungsgrad biologischer Substrate sowie die Enzymeinheiten (Units).
Die vorliegende Erfindung betrifft zweitens eine neuartige Mikrotechnik-Apparatur zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen enzymatischen Hydrolyse und zur Durchführung von Messungen mit einer bzw. mit zwei Sonde(n) in einem Mikroreaktor.
Die Enzymaktivität wird sowohl mit ausgewählten Substraten als auch mit für die Anwendung spezifischen Substraten gemessen. Substrate sind Stoffe, die sich durch eine enzymatische Reaktion hydrolysieren lassen. Geeignete synthetische Substrate werden durch Bindung von Chromophore an Moleküle mit mindestens einer spezifischen chemischen Gruppe hergestellt Die Menge und Art der Substrate sowie die Komponenten des flüssigen, realen Gemisches nehmen Einfluss auf die Messwerte der enzymatischen Reaktionen, die über eine Eichung quantifiziert werden können.
Stand der Enzym-Analyse-Technik
Für jedes Enzym stehen mehrere Methoden (Assays) zur Bestimmung der Enzymaktivität zur Verfügung. Aus der enzymkatalysierten Reaktion mit dem Substrat wird die Menge eines Spaltproduktes gemessen. Das Verhältnis zwischen der gemessenen Spaltproduktmenge, bezogen auf die eingesetzten Mengen von Substraten und Enzymgemischen bei definierbaren Bedingungen (Reaktionsdauer,Temperatur, pH, Ionenstaerke, u. a.), wird als Enzymaktivität definiert.
In der biochemischen Reaktion des Enzyms erfolgt die Hydrolyse des Substrates und die Freisetzung der Spaltprodukte. Zur Messung der Konzentration an Spaltprodukten stehen meist zwei Methoden zur Verfügung: Erstens die kontinuierliche Messung (continuous assay) mittels Lichtspektroskopie und/oder des pH-Wertes. Zweitens lässt sich die absolute Menge des produzierten Spaltproduktes durch chemische Methoden (Umsetzungen) bestimmen. Die einzusetzende Methode hängt von den ausgewählten Assays und Substraten sowie von dem Zweck der Bestimmung der Enzymaktivität ab. Die Enzymreaktion wird in Mikroplatten, Küvetten und Mikroreaktoren durchgeführt. Eine Übertragung der Wirkung von Enzymen von einem Substrat auf andere Substrate ist nicht ohne weiteres möglich [1].
Die üblichen Methoden zur Bestimmung der Enzymaktivität erfassen die einzelnen eingesetzten Enzyme (technische Qualität, gereinigt). Einflüsse begleitender Substanzen aus dem Mehrstoffgemisch werden üblicherweise nicht berücksichtigt, obwohl die effektive Aktivität der Enzyme von Begleitstoffen der Lösung und vom Substrat abhängt. Aus komplexen Gemischen mit Enzymbestandteilen und biologischen Substraten sind die Aktivitäten der einzelnen Enzymen mit üblichen Methoden nicht exakt zu bestimmen. Die Mehrheit der bekannten Assays [2-4] stützt sich auf Enzymkatalysierte Reaktionen von reinen Substraten.
Während der Reaktion nimmt die Konzentration der Substrate ab, und Produkte bilden sich. Die Bestimmung der Konzentration der Produkte oder Substrate kann neben der optischen Messung mit Hilfe einer zweiten Reaktion, der chemischen Umsetzung, erfolgen. Dafür werden meist Zwischenproben entnommen und mit titrimetrischen, gravimetrischen, physikalischen und spektrometrischen Methoden analysiert.
Die pH-Stat-Methode wird zur kontinuierlichen Messung des Hydrolysegrads von Glyceriden und Proteinen eingesetzt. Die Titration mit Natronlauge (NaOH) erlaubt ein Konstanthalten des pH-Wertes während der Hydrolyse, weil die NaOH entstehende Carboxygruppen in die Salze überführen. Diese Methode gelangt beispielsweise bei der kontinuierlichen Hydrolyse der Triglyceride (Olivenöl, Tributyrin, Triolein) mit Lipase zum Einsatz [5]. Ebenso erfolgt die Bestimmung der Aminosäuren bei der Hydrolyse von Proteinen (Eiweißpulver aus Molke, Gelatine u. a.) mit Protease [6].
Der Hydrolysegrad der Kohlenhydrate (z. B. von Stärke) wird mit dem Dextrose-Equivalent (DE) beschrieben. Die Bestimmung der DE-Zahl nutzt die Reaktionen der Fehling-Lösung, bei der die Aldehyd-Bindung der Stärkeabbauprodukte durch eine alkalische Kupferkomplex-Lösung u. a. zur Carboxy-Bindung oxidiert; aus der Reaktion scheidet sich Kupfer(I)-oxid ab. Die Bestimmung des Cu₂O-Niederschlags erfolgt gravimetrisch oder titrimetrisch [7].
Die pH-Stat-Methode zur Bestimmung der Carboxy-Bindungen und auch die DE-Bestimmung der reduzierenden Eigenschaften von Stärkeabbauprodukten können nicht gleichzeitig zur Messung des Hydrolysegrads von biologischen Substratgemischen eingesetzt werden. Zur Quantifizierung der Hydrolyse benötigen beide Methoden eine zweite Reaktion zwischen entstehenden chemischen Bindungen (COOH, CHO) mit spezifischen Reagenzien. Danach erfolgt die eigentliche quantitative Bestimmung.
Die Analyse der Enzyme aus den Waschmitteln erfolgt nach den Standardmethoden zur Identifikation der Proteinen und Bestimmung der Enzymaktivität. Dies sind für die qualitative und quantitative Bestimmung von Amylase/Cellulase coulometrische Methoden, die Freisetung der reduzierten Zucker oder der Spaltprodukte von chromogenen Substraten. Für die Lipase werden die pH-Titration und für die Protease die Dimethyl-Cassein-Methode neben der Bestimmung von Spaltprodukten chromogener Substrate eingesetzt [8].
Die vorliegende Erfindung betrifft die gleichzeitige Hydrolyse von Gemischen aus biologischen Substraten mit enzymhaltigen Gemischen unter Waschbedingungen sowie die Messung des Hydrolysegrads für alle Substrate. Zur kontinuierlichen Bestimmung der Aktivität eines enzymhaltigen Gemisches wird nur die Hydrolysereaktion der Substrate benötigt. Der Hydrolysegrad lässt sich mit spektrometrischen Messmethoden unmittelbar während der Reaktion messen.
Neben den biologischen Substraten können auch chromogene Substrate zur Bestimmung der Aktivität der Hydrolase eingesetzt werden. Aus der Lipase katalysierten Hydrolyse von p-Nitrophenylalkanoate (z. B. p-Nitrophenylacetat u. a.) entsteht p-Nitrophenol, dessen Konzentration spektrometrisch messbar ist [9]. So wird die Erhöhung der Extinktion bei 405 nm während der Hydrolyse von p-Nitrophenylbutyrat pNP-C4 oder p-Nitrophenylcaprylat pNP-C8 mit Lipase zur Bestimmung der Lipaseaktivität genutzt.
Im US-Patent (20110201536) [10] sind zwei Methoden zur Bestimmung der Proteaseaktivität beschrieben: a) Hydrolyse des chromophoren Substrats suc-L-Ala-L-Ala-Pro-L-Phe-p-nitroanilide bei 25°C durch Messung der Zunahme der Absorbanz bei 410 nm (UV/VIS-Spektroskopie), b) Hydrolyse des Kaseins, Reaktion mit Folin-Ciocalteu-Reagenz und spektrometrische Messung der Aminosäure Tyrosin bei der Absorbanz um 660 nm. Die Aktivität der α-Amylase aus Saliva lässt sich mit dem chromophoren Substrat p-Nitrophenyl α-D-Maltoside bestimmen [11].
Die oben erwähnten Methoden setzen chromogene Substrate mit mindestens einer spezifischen, hydrolytisch spaltbaren Bindung ein. Die Absorbanz der Spaltprodukte (p-Nitrophenol, p-Nitroanilin) wird bei 405 bzw 410 nm gemessen. Da die Anschaffungskosten für die chromogenen Substrate mit spezifischen chemischen Bindungen sehr hoch liegen, ist deren Anwendung für industrielle Messungen prohibitiv.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die kontinuierliche Messung der Aktivität enzymhaltiger Gemische mit unspezifischen chromogenen Substraten. P-Nitrophenylacetat als chromogenes Substrat wird von allen Waschmittelenzymen hydrolysiert Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Messanlage sowohl zur Messung der Enzymaktivität mit chromogenen Substraten als auch mit spezifischen biologischen Substraten eingesetzt werden kann. Das Messverfahren liefert in Echtzeit die Enzymaktivität von Gemischen, auch während deren Herstellung. Der Vergleich „Ist-Aktivität“ mit „Soll-Aktivität“ kann bei der Qualitätssicherung und Optimierung der Produktionsanlagen verwendet werden.
In der Fachliteratur wird die Schwingungsspektroskopie zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der chemischen und biologischen Stoffe empfohlen. Die folgenden Beispiele aus der Fachliteratur zur Messung des Hydrolysegrads von Rapsöl, der Gelatine und Stärke belegen die Möglichkeit der FTIR- (Fourier transform infrared) Spektrometrie. Die Hydrolyse der Stärke mit α-Amylase wurde durch Erfassung der zeitlichen Veränderung der Absorbanz bei spektralen Banden 1018-1157cm^-1 mit der FTIR-Spektroskopie gemessen [12].
Die Messung der Hydrolyse des Kaseins mit der Protease Trypsin erfolgte über die FTIR-Spektrometrie, wobei sich der Hydrolysegrad aus der FTIR-Transmission über die spektralen Banden 1615-1689 cm^-1 ermittelt lässt [13]. Die Lipase-Hydrolyse von Rapsöl in einer W/O-Emulsion wurde mit der ATR (Attenuated Total Reflection)-FTIR-Spektroskopie untersucht [14]. Die Auswertung der FTIR-Spektren sind durch Überlappung mit den Wasser-Spektren erschwert. Dieser Nachteil wird durch Verwendung von Messzellen mit einem Wandabstand unter 20 µm verringert. Solche durchströmenden Küvetten sind aber für Echtzeitmessung der Enzymaktivität und Kinetik der Hydrolyse von Substraten nicht geeignet.
In der vorliegenden Erfindung wird die Aktivität der enzymhaltigen Gemische und der Hydrolysegrad von wässrigen biologischen Substratgemischen wie Fette-Öl (Olivenöl u. a), Proteine (Gelatine, Kasein, u. a.) und Kohlenhydrate (Stärke, Maltodextrine, u. a.) in Echtzeit bevorzugt mit Raman-Spektroskopie gemessen. Die Raman-Intensität der signifikanten chemischen Bindungen, wie die Ester (Glyceride), Amid- und glykosidische Bindungen, sind bei validierten spektralen Banden gleichzeitig messbar. Die Messungen erfolgen während der enzymatischen Hydrolyse der Substrate. Die Validierung der spektralen Banden ist ein Bestandteil des Messverfahrens und wird bei Änderungen der Formulierung der Gemische vorgenommen. Aus dem Vergleich des Hydrolysegrads aus spektralen Messungen mit dem aus chemischen Messmethoden werden die signifikanten spektralen Banden identifiziert. Danach erfolgt eine zusätzliche Überprüfung mit Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis PCA).
In der vorliegenden Erfindung wird die ATR-FTIR-Spektroskopie für Messungen in Grenzschicht fl (flüssig)/fl(flüssig) und fl/f(fest) eingesetzt.
Enzyme
Beschreibung der Wirkung
Die Enzyme sind Biokatalysatoren, die biologische Reaktionen beschleunigen. Sie arbeiten sehr effizient, in lebenden Wesen im neutralen Milieu bei milden Temperaturen und in sehr geringen Konzentrationen. Dagegen vertragen technische Enzyme, etwa für Waschmittel, alkalische Bedingungen und enzymabhängige Temperaturen von 50 bis 90 °C aus. Hydrolasen ermöglichen die Abspaltung bzw. den Abbau (Hydrolyse) von Biopolymeren (Proteinen, Kohlenhydraten wie Stärken und Cellulosen) und von Fetten/Ölen. Chemisch unterschiedliche Bindungen hydrolysieren: Lipoproteinlipasen spalten die Ester-Gruppen in Glyceriden, Peptidasen die Amid-Gruppen in Proteinen/Peptiden und Glucosidasen die glycosidischen Bindungen der Kohlenhydrate. Hydrolasen sind in der Lage, die Reaktionen in beide Richtungen zu katalysieren, d. h. sie können unter anderen Bedingungen auch Kondensationsreaktionen (Umkehr der Hydrolyse) beschleunigen.
Die Enzymaktivität ist nicht homogen über die Gesamtoberfläche der Moleküle verteilt, sondern auf begrenzte Areale, den „aktiven Zentren“, konzentriert. Im ersten Schritt einer enzymatischen Reaktion erfolgt die spezifische Bindung des Substrates an das katalytische Zentrum des Enzyms. Das aktive Zentrum des Enzyms bilden Teile der Polypeptidkette und/oder Kofaktoren bzw. prosthetische Gruppen. Das Substrat reagiert genau in die vom Enzym vorgegebene Richtung (Wirkungsspezifizität) durch Absenkung der Aktivierungsenergie. Anschließend erfolgt die Ablösung der Spaltprodukte. Die Enzymaktivität wird von der Konformation der Enzymmoleküle und von den Effektoren (Aktivatoren, Inhibitoren) bestimmt In einem Mehrstoffgemisch befinden sich die in verschiedenen Zuständen vorliegenden Enzymmoleküle (aktiv, inaktiv oder denaturiert) in Mischung mit anderen Aktivatoren und/oder Inhibitoren der Lösung, die eine Steigerung bzw. Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit bewirken. Die Enzymaktivität wird durch das Milieu und die Betriebsbedingungen (Temperatur, pH, Ionenstärke, UV-Strahlung u. a.) nennenswert beeinflusst.
Produktion der Enzyme
Die biotechnologische Herstellung von Waschmittelenzymen unterscheidet sich von anderen Fermentationsverfahren durch den hohen Sauerstoffbedarf in der Wachstumsphase. Zur Sauerstoffversorgung von Bacillus licheniformis ist für den Sauerstoffübergang in die flüssige Phase ein ungewöhnlich hoher Leistungseintrag von ca. 10kW/m³ notwendig. Die dabei dissipierte Energie kann zu unerwünschten Temperaturerhöhungen in der Suspension führen. Das Sicherstellen einer konstanten Arbeitstemperatur im Bereich von 35-40 °C mit Kühlwasser erfordert entweder eine Erhöhung der Wärmeaustauschflächen und/oder eine Absenkung der Kühlwassereintrittstemperatur.
Die technische und wirtschaftliche Optimierungsaufgabe betrifft die Zusammensetzung und die Menge der Nährlösung. Die Rohstoffe für die Nährlösung befinden sich in Tanks und Fässern, Silos und Säcken und werden in einem separaten Rührbehälter entsprechend der Rezeptur in Wasser suspendiert. Die Sterilisation der Nährlösung (20°min, 121°C, 2 bar) erfolgt bevorzugt im Hauptfermenter. Hierbei färbt sich die Lösung aufgrund der Maillard-Reaktion braun, also der Reaktion von Aminosäuren mit reduzierenden Zuckern. Die Glucoselösung karamellisiert während der Sterilisation durch die Temperatureinwirkung über die Oxidation mit Sauerstoff, sodass die Fermenterbrühe insgesamt eine braune Farbe aufweist. Der selektierte Stamm, von der Agarkultur in der Petrischale über den Schüttelkolben und verschieden großen Fermentern (25 l, 250 l, 2,5 m³ bis zu 10 m³, abhängig von der Grüße des Hauptfermenters) hochgezüchtet, steht steril im Vorfermenter unter Wachstumsbedingungen in ausreichender Menge zur Verfügung. Nach der 3 bis 5 Stunden dauernden Sterilisation incl. Aufheizen/Abkühlen erfolgt bei 35 °C die Beimpfung und anschließend die Begasung und Glucosedosierung zur Vermehrung der Biomasse. Die folgende Enzymbildung sowie der Glucosegehalt kann messend verfolgt werden.
Enzyme im Waschprozess
Das Ziel des Waschens ist nicht nur die Schmutz- und Fleckentfernung, sondern auch der einwandfreie, möglichst knitterfreie Zustand der Wäsche und der textilen Oberflächen. Das Optimum ergibt sich aus der Zusammenwirkung von Textilien, Wäscheschmutz, Wasser, Waschmaschine und Waschmittel.
Die Anschmutzungen mit einem Betrag von 1 bis 4% des Wäschegewichtes bestehen aus ca. 20 % wasserlöslichen Stoffen (Kochsalz, Harnstoff) und ca. 80% wasserunlöslichen Stoffen wie Fette und Öle (Triglyceriden, Wachse, Kohlenwasserstoffe, Hautfett), Proteine (Hautschuppen, Gelatine, Ei, Milch, Blut, Kakao), Kohlenhydrate wie Stärke (Mehl, Sossen) und Cellulose (Fasernreste) sowie Farbstoffe, Pigmente. Neben der Zusammensetzung der komplexen Anschmutzungen, Ansammlungen von Proteinen und die mit Luftsauerstoff teilweise oxidierten Lipide, spielen der Zustand und die Teilchengrösse des Schmutzes sowie die Eigenschaften der Textilien eine wesentliche Rolle bei der Schmutzentfernung über enzymatische Hydrolysen.
Die Schmutzhaftung auf Fasern wird durch unterschiedliche Kräfte beeinflusst: mechanische Haftung (z. B. der Schmutz lagert sich in Faserhohlräumen ab, Adsorptionskräfte), intermolekulare Wechselwirkungen (van-der-Waals-Kräfte, Dipolkräfte), Coulomb-Kräfte (elektrostatische Aufladungen, Ionenstärke) sowie insbesondere Flüssigkeits- und Materialbrücken. Die Schmutzablösung von den Fasern erfolgt durch die Wirkung des Systems Tensid-Enzym in der Grenzschicht fl/f. Im ersten Schritt benetzen Tenside die hydrophoben Oberflächen der Substrate. Die Abstoßungskräfte mit der wässrigen Lösung werden minimiert und die molekularen Anziehungskräfte mit den Substraten maximiert. Die Wirkung der Tenside allein hängt von der Kräftebilanz zwischen der Schmutzhaftung und Anziehungskraft der Tenside ab und reicht oft zur Schmutzablösung nicht aus. Zusätzlich sind die langkettigen Substrate mit großem Molekulargewicht von Tensiden schwer zu transportieren. Diese Vorgänge werden mit den entwickelten Methoden und Apparaturen durch Messung der zeitlichen Veränderung der Flüssigphase sowie in der Grenzschicht fl/f erfasst. Z. B. ist die Zunahme der Ester-Bindungen aus den Triglyceriden in der Flüssigphase ein Hinweis auf einen Stofftransport der Fette und Öle an die Festoberfläche.
Im Gemisch Tensid-Enzym, wie es im Waschprozess vorliegt, hängt die Mobilität und Aktivität der Enzyme deutlich von der Art und Konzentration der Tenside ab. Die Enzymmoleküle besitzen eine große Oberfläche, die teilweise mit Tensiden bedeckt ist.
Die Enzyme benetzen ebenso die immobilisierten Substrate an den Fasern. Tenside allein sind oft nicht in der Lage, die Haftkräfte der Lipid-Protein-Komplexe und Kohlenhydrate an den Fasern zu überwinden. Die Enzyme docken mit ihrem aktiven Zentrum an die Substrate. Die enzymatische Hydrolyse der spezifischen chemischen Bindungen setzt ein. Durch die Hydrolyse entstehen Spaltprodukte, die nicht fest gebunden sind. Weitere Vorgänge hängen von dem Stofftransport und den Eigenschaften der Spaltprodukte ab. Die wasserlöslichen Spaltprodukte verlassen die Festoberflächen durch molekulare Diffusion durch die Grenzschicht und erreichen den Kern der Flüssigphase. Andere Spaltprodukte lösen sich in den adsorbierten Substraten und können, weiter an den vorhandenen Enzymen als Enzym-Substrat-Komplex (ES) gebunden, nochmals hydrolysiert werden. Einige dieser (ES)-Komplexe hemmen die weitere Aktivität der Enzyme. Ein großer Teil der Spaltprodukte diffundiert, von Tensiden benetzt, mizellar in die Flüssigphase. Die Hydrolyse der Spaltprodukte setzt sich in der Flüssigphase fort. Durch die weitere Hydrolyse wird deren Kettenlänge reduziert und die Größe der Mizellen nimmt ab.

Die Dynamik der Veränderung einiger physikalischen Eigenschaften der Waschflotte während eines Waschprozesses ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1. Ergebnisse aus den Messungen der physikalischen Eigenschaften einer Waschflotte.

Eigenschaften	Dimension	Waschlauge nach 5 min Waschzeit	Waschlauge nach 60 min Waschzeit
Physikalische Eigenschaften
- dynamische Viskosität	mPas	0,890 (25°C)	0,890 (25°C)

- Dichte	g/cm³	0,996 (40°C)	0,996 (40°C)

- Brechungsindex	n_D	1,3320 (40°C)	1,3325 (40°C)
Teilchengrössenverteilung mittlerer Durchmesser
- volumenbezogen	nm	560,5	371,8
- intensitätbezogen	nm	672,8	332,6
Zeta-Potential
- Potential	mV	-20,2	-54,3
- Teilchenmobilität	cm/(Vs)	-1,594	-4,297
pH-Wert		7,95	7,81
Elektrische Konduktivität	mS/cm	0,42	0,12

Wichtige Eigenschaften der Mizellen veränderten sich während des Waschprozesses: die Mizellgröße nimmt um ca. 50% ab, die Stabilität der mizellaren Lösung (Zeta-Potential von -20V auf -54V) sowie die Mobilität der Teilchen nehmen zu. Diese Veränderungen haben einen starken Einfluss auf die Mobilität und Kinetik der Enzyme.
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung behandelt erstens die Optimierung der Hydrolysereaktionen von Enzymen. Im Gegensatz zum Stand der Technik erfolgen die Messungen nicht offline unter synthetischen Bedingungen, sondern vorzugsweise online unter den typischen Bedingungen der Anwendung. Im Falle einer Reinigung bedeutet dies das Arbeiten in wasch- oder reinigungsmittelhaltigen Flüssigkeiten unter Waschbedingungen (pH, Temperatur, Mechanik). So lässt sich einerseits der Enzymcocktail in Abhängigkeit von den Substraten optimieren und andererseits der Einfluß der Bestandteile des Mittels studieren und anpassen. Die zur Analyse diskontinuierlich oder kontinuierlichen entnommenen, flüssigen oder gelösten Wasch- oder Reinigungsmittel oder Spezialprodukte (Fleckentfernung, Oberflächenreinigung, Hygiene), werden mit Wasser und einer Pufferlösung (zur pH-Konstanz) verdünnt und vorzugsweise im Mikroreaktor mit dem löslichen und/oder unlöslichen Substraten zur Reaktion gebracht.
Zweitens lassen sich erfindungsgemäß bei der Herstellung von Waschmitteln, insbesondere von flüssigen Waschmitteln, über das in Echtzeit verfügbare Messsignal der kontinuierlichen Analyse die Dosiereinrichtungen für die Enzyme in der Produktion regeln. Drittens betrifft die Erfindung die Optimierung der Fermentation zur Herstellung der Enzyme in biotechnischen Anlagen.
Mit den hier beschriebenen spektroskopischen Methoden lassen die Enzym und Substrat abhängigen Hydrolysen im zeitlichen Ablauf in Echtzeit verfolgen. Die Messungen erfolgen in der erfindungsgemäßen Mikroapparatur unter definierten Bedingungen, insbesondere bezüglich der Temperatur und des weitgehend konstanten pH-Wertes.
Die Lehren der Erfindung sind nicht eingeschränkt auf die in der Waschmittelindustrie eingesetzten bzw. überprüften Enzyme, sondern lassen sich auch auf andere technische, in der Lebensmittelindustrie genutzte Enzyme anwenden. Insgesamt sind die Lehren auf folgende Enzyme in der Reaktion mit löslichen und/oder unlöslichen Substraten anwendbar, ohne sich darauf einzuschränken: Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Mannase (Mannosidase), Glucanase, Glycoamylase, Pullulanase, Pektinase, Lactase, Dextranase, Xylanase.
Wasch- und Reinigungsmittel sowie Spezialprodukte
Enzyme werden heute in praktisch allen Wasch- und Reinigungsmitteln sowie in Spezialprodukten eingesetzt. Dies sind erstens insbesondere die Voll-(Universal-) und die Color- sowie die Feinwaschmittel (außer Wolle und Seide) und die Fleckentferner. Zweitens verbessern Enzme in Geschirrspülmitteln, vorzugsweise in Tabletten für das maschinelle Geschirrspülen, die Reinigungsleistung.
Die hohe Leistung moderner Wasch- und Reinigungsmittel wäre ohne den Einsatz von spezifischen Enzymen und besonders von abgestimmten Enzymmischungen nicht möglich. Diese Biokatalysatoren zeichnen sich durch eine hohe hydrolytische Wirksamkeit bei gleichzeitig geringer Spezifität aus. Sie arbeiten in alkalischen, tensidischen Medien bis etwa 60°C, auch in Gegenwart von bleichenden Substanzen.
Die modernen Enzyme weisen hohe Aktivitäten bereits bei niedrigen Temperaturen auf. Dadurch konnte die Waschtemperatur deutlich abgesenkt werden. So lassen sich im Niedrigtemperaturbereich zwischen 20 und 40°C akzeptable Waschleistungen erreichen. Das Waschen bei tieferen Temperaturen bringt eine beträchtliche Energieeinsparung im Vergleich zur Wäsche bei 60°C, weil der Aufheizvorgang in der Waschmaschine die meiste Energie der Prozesskette „Herstellung, Transport, Waschen“ erfordert. Darüber hinaus liefern die Enzyme einen bedeutenden Beitrag zur Reduzierung der Waschmittelmenge, die 1980 pro 5 kg Wäsche noch bei 275 g lag und heute bei festen Kompaktwaschmitteln etwa 65-80 g beträgt.
Bei Waschmitteln erfolgt die Messung der Enzymleistung im Anwendungstest über das Waschen von Lappen, die verschiedene, definierte Testverschmutzungen aufweisen. Das Waschen wird in der Waschmaschine bei Temperaturen von 20, 30, 40 und 60°C durchgeführt. Nach der Wäsche entscheidet der Weißgrad der ursprünglich mit biologischen Materialien angeschmutzten Stellen auf dem Lappen über die Effektivität der Enzyme in der Waschlauge.
Die wissenschaftliche Untersuchung zeigt, dass die Enzymleistung nicht nur von der biologischen Anschmutzung abhängt, sondern auch von anderen Größen beeinflusst wird. Dies sind neben der Art des Textils die temperaturabhängigen Wechselwirkungen der Tenside mit anderen Waschmittelbestandteilen. Ferner spielen die Erneuerung der Grenzflächen an den adsorbierten Substraten durch die bewegte Waschlauge und der Stofftransport von Spaltprodukten weg von der Faser eine Rolle.
Das Stoffsystem Enzym-Tensid beeinflusst sowohl die Enzymaktivität als auch die Stofftransportvorgänge. In wässriger Lösung bilden sich komplexe Aggregate zwischen den Mizellen und Enzymmolekülen. Diese Aggregate werden von Tensiden an der Oberfläche der Garne bzw. Substrate transportiert. Die Tensidkonzentration bestimmt den Sättigungsgrad auf der Oberfläche und die Adsorption der Enzyme an den Substraten.
Die Hydrolyse der Substrate läuft in der Grenzschicht ab, die sich auf der Textiloberfläche mit der Waschlauge bildet. Die Anlagerung der Enzyme an gelöste und an der Textiloberfläche immobilisierte Substrate erfolgt in wässriger Lösung spontan. Die folgende katalytische Reaktion kann in mehreren Stufen stattfinden. Bei der Hydrolyse von Triglyceriden (Estern) werden zuerst der Rest R mit der OH-Gruppe und danach die Säuren mit der COOH-Gruppe desorbiert. Die Entfernung der wasserunlöslichen Spaltprodukte hängt von der Chemie der Tenside sowie der Strömungsmechanik ab. Also beeinflusst die Strömungsmechanik die Desorption. CFD-Berechnungen (Computer Fluid Dynamik) in der Maschine liefern für die Waschflotte Werte von ca. 0,03 m/s bis 0,2 m/s für die Strömungsgeschwindigkeit durch das Gewebe. Möglicherweise erfolgt eine weitergehende Hydrolyse der Spaltprodukte, die dann in der Flüssigphase an der Grenzschicht fl/fl abläuft.
Feinchemikalien und Verarbeitung von nachwachsenden Rohstoffen
Anwendungsbereiche für den Einsatz der erfindungsgemäßen Messmethoden sind alle Umsetzungen unter der Mitwirkung von technischen Enzymen, wie die Biomassewertung (Biofuel), die Herstellung von Fein- (Aminosäuren, Sirup, u. a.) und Grundchemikalien (Produkte aus Stärke, Essigsäure u. a.) sowie Anwendungen für Nahrungs- und Futtermittel (Bier, Wein, Käse, u. a.), Fasern und Textilien sowie für Papier.
Bei den Anwendungen dominieren die Reaktionen mit gelösten Enzymen. Der Abbau der hochmolekularen Substrate erfolgt nur mit gelösten Enzymen schnell, da der Stofftransport von Substraten zu den Aktivzentren immobilisierter Enzyme meist langsam ist. Die Echtzeitmessung der Enzymaktivität und -spezifizität hilft bei der Optimierung und Steuerung der Prozesse. Die biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien und von Biofuel sind gekennzeichnet durch relativ lange Reaktionszeiten, geringe Ausbeuten oder Selektivitäten. Daher sind die Aktivität und die Erreichbarkeit der Enzyme für diese Prozesse von großer Bedeutung. Der Einsatz löslicher Enzyme ist durch die einmalige Anwendung wirtschaftlich limitiert. Daher wurden neue Verfahren und geeignete Reaktoren mit immobilisierten Enzymen entwickelt.
Möglichkeiten durch den Einsatz der Erfindung
Die Formulierung enzymhaltiger Produkte basiert auf der Bestimmung des anwendungstechnischen Effektes in Abhängigkeit von der Enzymaktivität unter Standardbedingungen im Labor bei konstanter Temperatur. Aus den Ergebnissen und wirtschaftlichen Überlegungen werden die Enzymtypen und deren erforderlichen Mengen festgelegt. Die Aktivität der einzelnen Enzyme und/oder die Zusammensetzung der Enzymmischungen, ihre Mengen und katalytischen Eigenschaften beeinflussen die Reaktionszeit bis zum Endpunkt der Umsetzung. Häufig stellt sich die Frage aus der Enzymkinetik, welche Mengen an Enzymen im vorliegenden bzw. in einem optimierten Milieu bei vorgegebener Temperatur mindestens eingesetzt werden müssten. Der Endpunkt ist erreicht, wenn Produkteigenschaften und -konzentrationen, Umsatz oder Wirkung nahezu konstant bleiben.
Wegen den hohen Kosten der Enzyme soll mit der minimalen Menge ein maximaler Effekt erzielt werden. Die Ermittlung der minimalen Menge in einer enzymverträglichen wässrigen Lösung stellt die technische und wirtschaftliche Herausforderung dar, auf die die Erfindung Antworten gibt. Insbesondere lässt sich die Frage beantworten, welche Mischung synergetische Effekte zeigen, die wirtschaftlich interessant sind. Die hier erwähnten Möglichkeiten sind als Beispiele zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht einerseits eine Optimierung des Enzymcocktails enzymhaltiger Formulierungen von Wasch- und Reinigungsmitteln sowie von Spezialprodukten. Hierfür kann die Leistungsfähigkeit des Enzyms bzw. der Enzymmischung über die Aktivität in Abhängigkeit vom Milieu und/oder der Enzymkonzentrationen sowie der Zusammensetzung temperaturabhängig untersucht werden. Die Messungen können im Labor, in den Anlagen zur Produktherstellung, Verpackung und Lagerung der Wasch- und Reinigungsmittel sowie direkt an den Bioreaktoren oder in der Waschmaschine erfolgen. Andererseits lässt die Erfindung eine Optimierung der anderen Bestandteile der Formulierung zu. Jede anwesende Substanz beeinflusst die Enzymaktivität Eine Minderung der negativen Einflüsse erlaubt die Absenkung des Enzymgehaltes. Auch sind Relativmessungen mit Produkten der Konkurrenz möglich.
Ein US Patent [10] beschreibt die Verbesserung der Reinigungsleistung eines Wasch- und Reinigungsmittels durch die zusätzliche Anwendung eines Aktivators. Die Bewertung der Erhöhung der Reinigungsleistung erfolgt nur über den Weißgrad. Durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung und Quantifizierung der Vorgänge möglich, die die synergetischen Reinigungsleistung bewirken.
Ferner kann die wirksame Enzymaktivität des Produktes online während der Produktion durch eine kontinuierliche Messung in der erfindungsgemäßen Apparatur eingestellt und überwacht werden. Die Methode eignet sich durch direkte Messung insbesondere für flüssige Phasen, während Feststoffe erst gelöst und in der Konzentration eingestellt werden müssen. Neben der Enzymaktivität wird zusätzlich der Gehalt an Enzymen gemessen. Die Messdaten aus der Echtzeitmessung des Gehaltes und der Aktivität der Enzymen während der Produktion von enzymhaltigen Gemischen (Wasch- und Reinigungsmittel) dienen der Steuerung und Regelung der Produktionsanlage. Die Umwandlung der Messdaten in Wissen erfolgt mit Hilfe der Multivariaten Analyse.
Erfindungsgemäße Messapparatur und Messverfahren
Die Messungen der Enzymaktivität und der Kinetik enzymatischer Reaktionen erfolgen mit der UV/VIS-, Raman- und ATR-FTIR-Spektroskopie. Die Auswahl von Apparatur und spektroskopischer Messmethode hängt sowohl von der Art der Messung, Aktivität und/oder Kinetik als auch von der Art der Substrate und enzymhaltigen Gemische ab. 1 zeigt schematisch Messalternativen.
Je nachdem, ob das Gemisch Substratbestandteile bereits enthält oder nicht, erfordert die Messung der Aktivität eines enzymhaltigen Gemisches fallweise die Zugabe von Substraten zur Hydrolyse. Die Messungen erfolgen offline oder bevorzugt online. Hierbei werden zunächst der pH-Wert mit einer Pufferlösung und die Verdünnung der konzentrierten, enzymhaltigen Gemische durchgeführt. In der zweiten Stufe findet die enzymkatalysierte Hydrolyse der Substrate in einem Mikroreaktor statt. Daran schließen sich die lichtspektroskopischen Messungen (UV/VIS, Raman und ATR-FTIR) der Konzentrationen an Substraten an.
Die erfindungsgemäße, mikroreaktionstechnische Anlage mit dem Verfahrensfließbild zur kontinuierlichen Echtzeitmessung der Enzymaktivität und Kinetik enzymkatalysierter Reaktionen ist in 2 dargestellt Der Rührreaktor zur kontinuierlichen und Batch-Hydrolyse von Substraten, zur spektroskopische Messungen mit Sonden für UV/VIS- und Raman-Spektroskopie kann 3 entnommen werden. Die Variante 3a steht für Messung im Reaktor mit einstellbarem Puffervolumen, 3b mit konstantem Volumen, 3c für die Messung im Bypass und 3d für non-invasive Messungen (Sonde befindet sich außerhalb). 4 zeigt den Mikroreaktor mit integrierter Messzelle für die ATR-FTIR- und Raman-Spektroskopie zur Messung der Vorgänge in Grenzschicht fl/fl und fl/f. Die Anlagen sind für folgende Messungen konzipiert:

- Kontinuierliche Messung hydrolysierter Bestandteile in enzymhaltigen Gemischen mit der Raman-Spektroskopie.
- Kontinuierliche Messung der Enzymaktivität mit UV/VIS-(Elektronenabsorptions-), Raman- und ATR-FTIR- Spektroskopie.
- Messung der Vorgänge in der Grenzschicht fl/fl und fl/f mit ATR-FTIR-Spektroskopie.
- Batchbetrieb; Messung der Aktivität mit UV/VIS-, Raman- und ATR-FTIR-Spektroskopie.
- Stopped-Flow; Messung der Aktivität mit UV/VIS-, Raman- und ATR-FTIR-Spektroskopie.
- Kalibrierung der chromogenen Lösung und der biologischen Substrate.
- Spülmodus mit deionisiertem Wasser und mit getrockneter Luft oder Inertgas (Stickstoff).

Kontinuierliche Fahrweise
Die kontinuierliche Echtzeitmessung (2) der Aktivität eines enzymhaltigen Gemisches lässt sich fallweise ohne oder mit Zugabe von Substratbestandteilen durchführen Es wird zunächst ein Teilstrom (1) aus Leitungen, Behältern oder Bioreaktoren entnommen und über ein Filter (2) von Festteilchen befreit Nach der Druckreduzierung (3) erfolgen die Einspeisung der Flüssigkeit (5) mittels der Dosierpumpe (6) und der Verdünnungsflüssigkeit (Pufferlösung, deionisiertes Wasser) aus dem Behälter (7) mit der Dosierpumpe (9) in den Mikromischer (10). Die Konzentration an Enzymen (11) wird durch das Verhältnis zwischen dem Dosiervolumen der Pumpe (6) und (9) eingestellt. Der Teilstrom (13) strömt mit Hilfe der Umwälzpumpe (30) in den Mikromischer (10) zurück. Der andere Teil (12), die wässrige enzymhaltige Lösung (14) fließt in den Mikroreaktor (20). Dorthin strömt ebenfalls die über eine Dosierpumpe (17) aus dem Behälter (15) geförderte Substratlösung (18). Für biologische Substrate besteht auch die Möglichkeit der Einspeisung über (19) direkt in den Mikromischer (10).
Das Verhältnis zwischen den Dosiervolumina der Pumpen (6), (9) und (17) bestimmt die Konzentration an Enzymen und an Substraten. Das Reaktionsgemisch (21) teilt sich in die zwei Ströme (22) und (23) auf. Der Teilstrom (22) fließt laminar durch die Messzellen des Messkopfes (24). Der andere Teil (23) läuft mit dem Strom (26) zum Abwasser (27). Der Messkopf (24) besteht aus einer Durchlaufküvette und Messzelle. Durch die modulare Bauweise des Messkopfes (24) kann die Messzelle auf UV/VIS- und Raman- Messung umgestellt werden. Die Temperatur der Verdünnung, Reaktion und Messung ist zwischen 25 bis 90°C einstellbar. Bei Einsatz chromogener Substrate wird die Temperatur des Behälters (15) auf max.10°C eingestellt.
Die modulare Bauweise des Mikromischers (10) und Mikroreaktors (20) ermöglicht eine -Vermischung der Reaktanden in kurzen Zeiten. Dadurch werden hohe Umsätze erreicht und eventuelle Nebenreaktionen der Substrate mit anderen Bestandteilen unterdrückt. Die Umwälzkreise um den Mikromischer (10) und Mikroreaktor (24) gelangen bei schwer mischbaren Produkten zum Einsatz. Für Hydrolyse von biologischen Substraten werden Mikrorührreaktoren (20, 3a, b) aus Edelstahl bevorzugt, während Reaktionen mit chromogenen Substraten vorzugsweise in kleinen Strömungsreaktoren (Rohr- oder Kanalreaktoren) mit mikrostrukturierten Elementen ablaufen.
Der kontinuierlich betriebene Rührreaktor (20), dargestellt in den 2 und 3, erhält ständig dosierten Zulauf an enzymhaltiger Lösung (14) und an Substratgemisch (18). Die Fahrweise des Rührreaktors hängt von der Viskosität der Flüssigkeit und der Blasenbildung ab. Daher sind zwei Fahrweisen vorgesehen. Zum ersten ist ein Zwischenbehälter vorgesehen mit freiem Raum oberhalb des Flüssigkeitsniveaus ( 3a). Das Rührorgan befördert die eingeschlossenen Luftblasen aller Größen an die Oberfläche und entgast die Flüssigkeit. Im zweiten Fall ist der Zwischenpuffer voll gefüllt (3b). Im kontinuierlichen Betrieb wird der ständige Ablauf durch die nachgeschaltete Dosierpumpe (41) oder mit dem Überlauf (42) gewährleistet. Für Messungen mit immobilisierten Substraten an Textilien ist der Rührreaktor (20) in 3a mit einem Rührwerk (34) vorgesehen, der von dem gesteuerten Elektromotor (35) Angetrieben wird. Die Drehung des Rührwerkes ist einstellbar in Richtung des Uhrzeigers oder entgegengesetzt sowie Stillstand. Lappen werden (36) am Rührwerk aufgehängt. Die Heizung/Kühlung des Rührreaktors erfolgt mittels strömender Flüssigkeit durch den Doppelmantel oder elektrisch (Heizung).
Reaktionen mit biologischen Substraten erfolgen bevorzugt im Rührreaktor:

a) Kontinuierliche Messung des Gehaltes der Bestandteile des enzymhaltigen Gemisches (z. B. Enzyme u. a.)
b) Kontinuierliche Messung der Enzymaktivität mit biologischen Substraten
c) Kalibrierung der Hydrolyse mit biologischen Substraten

Betriebsweise zu Pkt. a)
Zuerst wird der Mikroreaktor (20) entleert, das Absperrventil (40) zugedreht und das ver- oder unverdünnte enzymhaltige Gemisch (2, 14) in den leeren Rührwerkreaktor (3, 20) dosiert. Wenn das gewünschte Vorlagevolumen erreicht ist, wird das Absperrventil (3, 40, Variante a) geöffnet und die Austragpumpe (41) in Betrieb gesetzt. Der Volumenstrom der Pumpe (41) muss den der Pumpen (6) und (9) entsprechen. Ist der Reaktor (3, 20 Variante b) eingesetzt, dann erfolgt die Abfuhr des Flüssigkeitsüberschusses über (42).
UV/VIS- und Raman-Spektren werden mit der Immersion-Sonde (3) aufgenommen. Die spektrale Analyse erfolgt in Echtzeit. Aus den Spektren lassen sich signifikante Kennzahlen, wie die Abweichung der Formulierung vom „Ist-Zustand“, Gehalt an Enzymen und Spaltprodukten, ermitteln.
Betriebsweise zu Pkt.b)
Die wässrige enzymhaltige Lösung (14) fließt in den Mikroreaktor (20). Dorthin fließt ebenfalls das Substratgemisch (18) (2). Die Bestandteile des Substratgemisches (Emulsion, Lösung) (18) sind an die Art des enzymhaltigen Gemisches angepasst. Das Verhältnis zwischen den Dosiervolumina der Pumpen (6, 9, 17) bestimmt die Konzentration an Enzymen und an Substraten im Reaktionsgemisch. Die Verweilzeit des Reaktionsgemisches lässt sich aus dem Verhältnis des Vorlagevolumens und der Pumpenrate (6, 9, 17,) errechnen. Das Reaktionsgemisch wird über (40) mit der Pumpe (41) oder über (42) zum Abwasser (27) geleitet Die Temperatureinstellung für Reaktion und Messung erfolgt durch über eine Flüssigkeit im Doppelmantel des Reaktors oder elektrisch. Sie kann Werte zwischen 25 und 90°C einnehmen. Die Drehzahl des Rührwerkes (20) wird über das Spektrum angepasst. Während der enzymatischen Reaktion erfolgt kontinuierlich die Aufnahme des Raman-Spektrums und die Auswertung in Echtzeit. Aus den spektralen Banden lassen sich Kennzahlen zur Berechnung des Umsatzes bzw. Hydrolysegrades für einzelne Substrate sowie die Enzymaktivität herleiten.
Betriebsweise zu Pkt.c)
Die Kinetik der Hydrolyse der biologischen Substrate wird einerseits mit spektralen Messungen sowie andererseits mit bekannten chemischen Messmethoden (z. B. pH-Stat-Methode, Biuret-Lösung, Fehling-Lösung u. a.) erfasst Die spektralen Messungen erfolgen mit zwei Immersion-Sonden: Erstens die UV/VIS- Sonde für Messungen von chromophoren Stoffen aus den Reaktionen mit Biuret- und Fehling-Lösungen und zweitens die Raman-Sonde für Reaktionen mit biologischen Substraten.
Sowohl die optimale Verweilzeit als auch der „Soll-Wert“ der Enzymaktivität werden aus der Messung der Kinetik der Enzymreaktion im Batchbetrieb gewonnen und an die Produktformulierung angepasst. Bei der Überwachung der Produktionsanlage bilden diese Parameter die Grundlage zur kontinuierlichen Regelung der Enzymdosierung. Bei Grenzwertüberschreitungen reagiert das Steuerungsprogramm durch Meldungen an die Produktionsüberwachung und/oder Einstellung des Sollwertes.
Diskontinuierliche Fahrweise
In der Batchfahrweise wird nach Einstellung des Verhältnisses Substrat/Enzym, des Verdünnungsgrades sowie der Temperatur und des pH-Wertes die Kinetik der enzymkatalysierten Reaktion aufgenommen. Aus dem Verlauf des Messsignals mit der Zeit lassen sich die optimalen Parameter entnehmen, wie etwa die Aktivität und Verweilzeit. Im Batchbetrieb werden die Dosierpumpen (6, 9, 17) nicht genutzt. Das Reaktionsgemisch (25 bzw. 28) wird von der Pumpe (29) im Mikroreaktor (20) umgewälzt. Die Stoffströme (12, 23, 26) sind ausgeschaltet. Die Messungen erfolgen mit dem ausgewählten Messkopf (24).
Bei Einsatz des Rührreaktors (3a, 20) müssen die Pumpen (6, 9, 17, 41) abgestellt sein.
Stopped-Flow
Die Apparatur ist auch für Messungen der Aktivität im Stopped-Flow-Modus durch Unterbrechung der Stoffströmung (22) und (25) geeignet. Die Vermischung der Reaktanden erfolgt dann nur durch molekulare Diffusion. Die spektroskopischen Messungen und Auswertung der Messdaten laufen analog der Batchfahrweise.
Kalibrierung der chromogenen Substrate
Die Chromophoren (z. B. p-Nitrophenol, p-Nitroanilin) entstehen durch die hydrolytische Spaltung chromogener Substrate. Die Kalibrierung des Messsignals wird mit der UV/VIS-Spektroskopie vorgenommen. In alkalischen wässrigen Lösungen dissoziiert p-Nitrophenol in das p-Nitrophenoxy-anion. Die Absorbanz des p-Nitrophenols wird vom pH der wässrigen Lösung bestimmt; bei pH<7 bis 5 liegt der Peak bei 320 nm; bei pH >7,5 liegt die Absorbanz bei 405 nm und hängt nur von der p-Nitrophenol-Konzentration ab; in diesem Fall ist die Absorbanz bei 320 nm vernachlässigbar [15].
Beispielsweise lässt sich die konzentrationsabhängige Lichtabsorption des p-Nitrophenols in Gegenwart einer verdünnten enzymhaltigen Lösung feststellen. Die Fahrweise erfolgt analog der kontinuierlichen Messung der Aktivität (Abschn. 6.1), wobei statt der Substratlösung die Chromophorlösung aus dem Behälter (31) mit der Pumpe (17) in den Mikroreaktor (20) dosiert wird. Die Abhängigkeit der Absorbanz von der molaren Konzentration der Chromophoren erfolgt nach dem Lambert-Beer-Ansatz. Für p-Nitrophenol errechnet sich aus dem Verhältnis der molaren Konzentration und der Absorbanz bei 405 nm und pH>7,5 ein Umrechnungsfaktor, der für die Ermittlung des Umsatzes enzymatischer Reaktionen genutzt wird.
Kalibrierung der biologischen Substrate
Die Umrechnung der spektrometrischen Messsignale in den Konzentrationen der chemischen Bindungen erfolgt über gemessene Eichgeraden. Zur Bestimmung der Eichgeraden stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung:

a) Durchführung der Hydrolyse mit einzelnen Substraten, Probenahme und Bestimmung der spezifischen Kennzahlen im Labor. Die Hydrolyse der Substrate findet im Rührreaktor (20, 3) statt. Die Reaktion wird wahlweise kontinuierlich (Abschn. 6.1) oder batchweise (Abschn. 6.2) geführt.
b) Die Kennzahlen (Veresterungszahl für Öle und Fette, Amid-Zahl für Proteine, Dextrose-Equivalent für Kohlenhydrate) werden aus der Spezifikation der eingesetzten Substrate entnommen. Aus dem Verhältnis der spektralen Messsignale, gemessen an spezifischen spektralen Banden, zu den Kennzahlen aus der Spezifikation der Substrate lassen sich die Umrechnungsfaktoren ermitteln. Deren Gültigkeit wird mit Methoden a) und c) validiert.
c) Die Kalibrierung der Ester-, Amid- und glykosidischen Bindungen erfolgt während der Hydrolyse von Ölen und Fetten, Proteinen oder Kohlenhydraten.

Die Hydrolyse der Fettsäuren wird im Rührreaktor kontinuierlich oder batchweise durchgeführt. Dabei erfolgen quantitative Bestimmungen mit der pH-Stat-Methode (NaOH oder KOH) sowie Messungen mit der Raman-Spektroskopie. Die Bestimmung der Konzentration an Peptid-Bindungen erfolgt nach der Biuret-Methode [16]. Die Biuret-Reaktion ist spezifisch für alle Substanzen mit zwei oder mehr Peptidbindungen (Dipeptide und Aminosäuren reagieren nicht). Proteine ergeben mit Cu²⁺ - Salzen in alkalischer Lösung einen rot- bis blauvioletten Farbkomplex, dessen Absorbanz bei 540 bis 550 nm sich mit der UV/VIS-Spektrometrie bestimmen lässt. Die Intensität der dunkelvioleten Farbe des Komplexes ist proportional der Anzahl der Peptid-Bindungen. Parallel wird die Raman-Intensität mit der Immersion-Sonde aufgenommen. Die Kennzahlen der Raman- Banden für Amid-Bindungen werden mit der gemessenen Absorbanz bzw. Konzentration der Peptid-Bindungen korreliert.
Zur Bestimmung der Konzentration der glykosidischen Bindungen wird die Fehling-Lösung (Gemisch: Kupfersulphat-Pentahydrat und Potassium-Sodium Tartrat) eingesetzt Während der Hydrolyse der Kohlenhydrate (Stärke) werden Saccharide mit freien Aldehyd-Bindungen gebildet. Durch die Reduktion der Kupfer-Ionen Cu²⁺ zu Cu⁺ wird die Aldehyd-Bindung zur Carboxy-Bindung oxidiert. Cu⁺-Ionen bilden einen orangen-roten Niederschlag von Kupfer(I)oxid (Cu₂O). Die Bestimmung der Konzentration der oxidierten Carbonyl-Bindungen erfolgt durch gravimetrische Messung des Cu₂O-Niederschlags. Als Alternative wird der Redox-Indikator „Methylenblau“ zur Bestimmung des Umschlagpunktes der Reaktion eingesetzt. Sind alle Cu²⁺-Ionen umgesetzt, dann wird das Methylenblau reduziert. Am Umschlagpunkt findet ein Farbwechsel von blau nach farblos statt. Die Veränderung der Absorbanz der Lösung lässt sich mit der Immersion UV/VIS-Sonde messen. Die Kennzahlen der Raman- Banden für glykosidische Bindungen werden mit den Messergebnissen des Fehling-Reagenz korreliert.
Eine einfache Methode beruht auf dem Einsatz der Lugolschen Lösung (Iod-/Kaliumiodid). Poly-Iodidionen lagen sich innerhalb der schraubförmigen Helix der Amylose (bis zu 6000 Glucosebausteine; ca. 20-30% in pflanzlichen Stärke enthalten) ein. Der Komplex besitzt eine tiefblaue Farbe. Durch die Hydrolyse werden die Glucoseketten gespaltet und die Helixlänge nimmt ab. Aus diesem Grund werden immer weniger Polyiodid-Anionen eingelagert und die Intensität der Blaufarbe nimmt im gleichen Maße ab. Das verzweigte und verästelte Amylopektin (60.000 bis 600.000 Glucosebausteine; Hauptbestandteil der pflanzlichen Stärke mit ca. 70-80%) besteht aus Abschnitten von D-Glucose-Monomeren, die 1,4-α-glycosidisch miteinander verbunden sind. Etwa alle 15-30 Monomere erfolgt eine α-1,6-glycosidisch verknüpfte Seitenkette, wodurch eine baumartige Verzweigung entsteht Diese Seitenketten können kurz (mit 12 bis 20 Glucoseeinheiten), lang (mit 30 bis 45 Glucoseeinheiten) und sehr lang mit durchschnittlich 60 Glucoseeinheiten sein. Die Kettenlänge der Polyiodid-Anionen, eingelagert in dem Abschnitt mit 1,4-α-glykosidische Bindung des Amylopektins, ist relativ kurz und liefert eine schwach rote Färbung.
Der Farbton des Iod-Stärke-Komplexes (Absorptionsmaximum) hängt von der Helixlänge ab. Das Absorptionsmaximum verändert sich durch viele 1,6-Verzweigungen, sodass die Lösung in einem anderen Blauton erscheint. Bei Absorption von langwelligerem Licht, wie dies bei Amylose der Fall ist, wird eine dunkelblaue Lösung erzeugt. Amylopektin hingegen absorbiert im kürzeren Wellenlängenbereich, was zu einem roten Farbeindruck führt. Die Mischfarbe von diesen zwei Anteilen ergibt dann den Gesamtfarbeindruck der Lösung. Dies erklärt auch, warum ein Versuch zum Farbnachweis mit Iod-Kaliumiodid zu unterschiedlichen Blautönen führt. Je nachdem, in welchem Verhältnis die beiden Bestandteile der Stärke vorliegen, erscheint die Lösung dem Betrachter eher dunkelblauviolett oder rotblau. Daher kann auf diese Weise indirekt auf die Zusammensetzung der Stärken in den verschiedenen Produkten geschlossen werden.
Die Absorbanz wird zwischen 550 und 800 nm gemessen. Aus der spektralen Analyse lassen sich die spezifischen Banden der Polyiodid-Anionen, eingelagert in der 1,4-α-glykosidischen Bindung der Amylose und des Amylopektins, ermitteln. Gleichzeitig wird die spezifische Raman-Bande der glykosidischen Bindung bestimmt. Die gemessene Absorbanz des Iod-Stärke-Komplexes wird mit dem Dextrose-Equivalent (DE) sowie mit der Raman-Intensität korreliert.
Spülmodus mit deionisiertem Wasser und getrockneter Luft oder Inertgas (Stickstoff)
Deionisiertes Wasser wird durch (33) in die Anlage gespeist. Die Pumpen (6, 9, 17, 29, 30) befinden sich im Spülmodus. Danach erfolgt die Spülung mit getrockneter Luft oder mit Inertgas (Stickstoff). Die Reinigung des Mikromischers (10) und Mikroreaktors (20) sowie des Rührreaktors (20) erfolgt nach einem cleaning-in-place-Verfahren.
Messung der Enzymaktivität und der Hydrolysekinetik mit immobilisierten Substraten
Die enzymkatalysierte Hydrolyse der Substrate erfolgt entweder in homogener Flüssigphase (wie beschrieben) oder heterogen an der Grenzschicht fl/fl oder fl/f.
Zwei alternative Versuchsanordnungen haben sich für die Hydrolyse mit immobilisierten Substraten bewährt:

a) Lappen, beladen mit Substraten (wie biologischen Anschmutzungen), werden an dem Rührorgan des Rührreaktors (3a, 20) aufgehängt. Nach Einstellung der Drehzahl erfolgt kontinuierlich die Messung der Konzentration spezifischer chemischer Bindungen mit der Raman-Sonde (37). Auf diese Weise lassen sich die Kinetik und die Transportvorgänge der Einzelsubstrate messen.
b) Die Messungen an der Grenzschicht (fl/fl, fl/f) erfolgen in der erfindungsgemäßen Kombination aus Reaktor und Messzelle gemäß 4.

Der Deckel der neu entwickelten Anordnung aus Mikroreaktor und Messzelle besteht aus einem ZnSe-Kristall und der Boden aus Saphirglas. Der Abstand zwischen Boden und Deckel wird nach der Art der Messung (fl/fl, fl/f) sowie am Volumenstrom der Eintrittsflüssigkeit angepasst. Peltier-Elemente temperieren die Anordnung. Die fl/fl-Messungen erfolgen an der Grenzschicht zwischen zwei Filmen. Der lipophile Film besteht aus öllöslichen Stoffen, die hydrophile Phase bildet eine wässrige, tensid- und enzymhaltige Lösung. In den Messungen wird die Kinetik der Hydrolyse und Penetration des lipophilen Stoffes ermittelt.
Die Bildung der Filme fl/fl geschieht durch folgende drei Schritte. A) Vorbereitung eines Gemisches aus wässriger enzymhaltiger Lösung mit dispersen Olivenöl-Tropfen im Rührreaktor (3a, 20); B) laminare Durchströmung der Messzelle mit der Dosierpumpe (41); C) plötzliche Unterbrechung der Durchströmung, wobei in kurzer Zeit die Phasentrennung mit der Bildung von zwei Filmen stattfindet. An der oberen Grenzschicht erfolgen die Messungen mit der ATR-FTIR-Spektroskopie (59, 51, durch einen ZnSe-Kristall, 53) und an der unteren wässrigen Grenzschicht mit der Raman-Spektroskopie (58, durch Saphirglas, 57).
Für die fl/f-Messungen wird zwischen Boden (Saphirglas) und Deckel (ZnSe-Kristall) ein mit biologischen Substraten beladener Lappen gelegt Danach erfolgt die Durchströmung der Flüssigkeit durch die freien Räume zwischen den Garnen. Wie gerade für fl/fl beschrieben, lassen sich die spektroskopischen Messungen in der Grenzschicht entweder mit der ATR-FTIR durch den ZnSe-Kristall sowie mit der Raman-Sonde durch Saphirglas oder mit Raman-Immersion-Sonde im Rücklauf (56, 4) durchführen.
Zur Messung der Leistung von Waschmitteln können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Zum einen erfolgt die Messung in der Anordnung Mikroreaktor/Messzelle nach Zugabe von Substraten zur Waschlösung. Alternativ lässt sich die Leistung einer Waschflotte in der Waschmaschine über die Entnahme eines Teilstroms und Messung im Rührreaktor (20) bestimmen. Ferner ist es möglich, durch Einbringen der Immersion Raman-Sonde direkt in die Waschmaschine zu messen.
Messköpfe für die spektroskopische Messungen
Für UV/VIS und Raman sind zwei verschiedene Messanordnungen vorgesehen, nämlich die In-situ und Non-invasive Messmethode. Die In-situ Messungen erfolgen mit Immersion-Sonden meist inline (3a, b, c), also direkt im Mikroreaktor, Behälter oder in der Rohrleitung. Alternativ wird online im By-pass gemessen (3c). Im Gegensatz dazu befindet sich bei Messung der Flüssigkeit in durchströmten Küvetten die Sonde außerhalb (non-invasiv, 3d).
Messungen mit der UV/VIS-Spektroskopie
Der Lichtstrahl durchdringt das laminar, durch die Messzelle (2, 24) fließende Reaktionsgemisch, wobei die Flüssigkeit einen Teil der Lichtintensität absorbiert. Die Messzelle weist einen Wandabstand von 5 bis 10mm auf. Als Lichtquelle dienen wahlweise LED- oder Halogenquellen mit einer Strahlungsintensität von ca. 200µW bis 5W bei 400 bis 1000 nm. Der Detektor ist ein Spektrophotometer mit einem Messbereich von 200 bis 800 nm und einer Belichtungszeit von 10µs bis 10s. Die Absorbanz des durchgehenden Lichtes wird mit dem Spektrometer gemessen und in die Chromophor-Konzentration umgerechnet. Die quantitative Abhängigkeit der Absorbanz von der Konzentration an Chromophor entspricht dem Lambert-Beer-Ansatz. Alternativ kann die Messung mit einer Immersion-Sonde (3a, b, c, 38) erfolgen.
Messungen mit der Raman-Spektroskopie
Bei der Raman-Streuung wird das Molekül vom einfallenden Photon in einen angeregten Schwingungszustand versetzt. Die gestreute Strahlung ist energetisch ärmer als die einfallende Strahlung, d. h. sie besitzt eine niedrigere Frequenz. Die Energiedifferenz zwischen einfallender und gestreuter Strahlung ist die zur Schwingungsanregung der Moleküle benötigte Energie. Der Frequenzunterschied bzw. die Wellenzahlverschiebung zwischen dem Anregungslicht und der Raman-Streuung wird als Raman-Shift bezeichnet und in der Wellenzahl relativ zur Anregungsfrequenz angegeben.
Als Lichtquelle dienen Laser mit einer Wellenlänge von 785 nm. Die Auswahl des Spektrometers hängt vom Raman-Shift-Bereich (200 bis 4000 cm^-1) sowie von der erforderlichen Sensitivität der Messung ab. Die Raman-Sonde ist mit angepasstem Filter versehen, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis in den ausgewählten spektralen Banden zu erhöhen. Die Integrationszeit, Auswahl der spektralen Banden, das Signal-Rausch-Verhältnis und die Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit im Messraum müssen an die Messaufgabe (enzymhaltige Gemische, biologischen Substrate) angepasst werden. Die Raman-Sonde kann direkt in die zu untersuchende Flüssigkeit eintauchen oder auf die Oberfläche (2 (24) und 4) der Messzelle angeordnet werden.
Zusätzlich umfasst die erfindungsgemäße Anordnung einen Multiplexer zum Anschluss mehrerer Raman-Sonden an ein Spektrometer. So können in Produktionsanlagen zahlreiche Messungen mit Raman-Sonden an verschiedenen Stellen durchgeführt werden. Die Sonden sind am von Prozessrechner gesteuerten Spektrometer angeschlossen.
Ein Nachteil der Raman-Spektroskopie ist die schwache Strahlung. Sie erfordert sehr empfindliche Spektrometer, sodass auch andere Strahlungen aufgenommen werden. Außerdem besteht die Gefahr der Überlagerung des Raman-Spektrums durch Fluoreszenz von aktiv optischen Stoffen.
Messungen mit der FTIR-Spektroskopie
Die (ATR-FTIR)- Infrarot-Spektroskopie ist, vergleichbar zur UV/VIS-Spektroskopie, eine absorptions-spektroskopische Methode. Sie nutzt zur Bestrahlung der Proben eine Infrarotstrahlung mit Wellenlängen von 1µm bis 1 mm. Die Absorption führt zur Anregung von Schwingungen, weil sich das Dipolmoment der Moleküle ändert.
Die Messungen erfolgen über ein ZnSe-Kristall, wobei die Probe, in der Anordnung Mikroreaktor/Messzelle (4), im direkten Kontakt darunter angeordnet ist. Der Kristall weist einen hohen Brechnungsindex auf. Der Infrarotstrahl (50) trifft in einem Winkel von 45° auf den Kristall. An der Grenzfläche zwischen der Probe und dem Kristall wird der Strahl mindestens 10-mal reflektiert. Ein Teil des Strahles dringt ca. 1 bis 2µm in die Probe ein und wird absorbiert. Diese Abschwächung der Intensität des Infrarotstrahls stellt die Messgröße dar. Die entwickelte Mikroreaktor-Messzelle ist mit einer Vorrichtung zur Führung des inzidenten (50) und reflektierten Strahls (51) passend zu den meisten kommerziellen FTIR-Spektrometern versehen.
Methoden zur Auswertung der Spektren
Die UV/VIS-Spektroskopie wird bei Messung der Absorbanz von Chromophoren eingesetzt, bei ca. 400 bis 410 nm für p-Nitrophenol oder p-Nitroanilin. Der gemessene Wert wird unmittelbar zur Berechnung der Aktivität des Enzymgemisches genutzt.
Die Auswertung der gemessenen Spektren von biologischen Substraten ist komplexer. Die Spektren entsprechen nicht mehr einem reinen Stoff, sondern setzen sich als Ergebnis der Überlagerung der vorhandenen Stoffe im Gemisch zusammen. In Literatur und Datenbanken sind spektrale Banden für unterschiedliche chemische Bindungen angegeben. Deren Anwendung ist sehr begrenzt. Wegen der Komplexität der Gemische (Tenside, Enzyme u. a), der Wechselwirkung zwischen den Bindungen, wie Wasserstoffbrücken, sowie der ständigen Änderungen in der Zusammensetzung und Löslichkeit, verursacht durch die auftretenden Spaltprodukte, findet eine Verschiebung der spektralen Banden statt.
Die vorliegende Erfindung schließt die Auswertung der spektralen Messungen sowie die Validierung der spektralen Banden wie folgt ein:

a) Qualitative und quantitative Messungen der Bestandteile der enzymhaltigen Gemische. In Echtzeit werden Parameter für signifikante Banden (Bandbreite, Fläche, Peakentfaltung (Peak Deconvolution)) berechnet. An hand der berechneten Parameter werden der Gehalt an signifikanten Stoffen sowie die Varianz der Formulierung ermittelt.
b) Gegenüberstellung der berechneten Hydrolysegrade aus spektralen Messungen (Abschn. 9) und chemische Methoden (Abschn. 6.5).
c) Anwendung der Principal Component Analysis (PCA) zur Validierung der signifikanten spektralen Banden.

Die Schritte b) und c) werden iterativ durchgeführt, bis ein Optimum erreicht ist.
Erfindungsgemäße Messung und Berechnung kinetischer Daten
Allgemeine Beschreibung
Die entwickelten und in Abschn. 6 beschriebenen Messmethoden können zum einen zur Messung der Kinetik enzymatischer Reaktionen sowie zum anderen der Stofftransportvorgänge der Stoffsysteme Tensid-Enzym-Substrat, Tensid-Substrat und Enzym-Substrat eingesetzt werden. Die kinetischen Messungen erfolgen in der Flüssigphase oder direkt an der Grenzschicht fl/fl (mikroheterogene Systeme wie Mizellen, Mikroemulsion, u. a.) und fl/f (adsorbierte Substrate oder Enzyme an Festoberflächen). Integrale Messwerte erfassen neben der Reaktionskinetik auch die Stofftransportvorgänge als Folge der turbulenten Strömung, molekularen Diffusion oder des Transportes der Substrate/Produkte durch Mizellen. Des Weiteren ermöglichen die Methoden eine Untersuchung der Einflüsse unterschiedlicher Parameter (Milieu, Betriebsbedingungen) auf die Kinetik und die Transportvorgänge.
Die Methoden und Apparaturen sind sowohl zur Messung der Enzymaktivität mit chromogenen und biologischen Substraten als auch zu qualitativen und quantitativen Messungen der Bestandteile der Formulierung der Wasch- und Reinigungsmittel geeignet Die Messungen werden mit einer Immersion-Raman-Sonde durchgeführt. Messungen der Flüssigkeiten (in-situ oder non-invasive) können in der Produktion sowie bei der Verpackung und Lagerung der Wasch- und Reinigungsmittel vorgenommen werden. Die Qualität der flüssigen Produkte kann auch außerhalb der Verpackung gemessen werden.
Ermittlung kinetischer Daten
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Echtzeitmessung der Enzymaktivität eines Mehrstoffgemisches mit Hilfe von zugesetzten chromogenen und/oder spezifischen biologischen Substraten. Aus der Hydrolyse des Substrates/der Substrate entstehen Spaltprodukte. Deren Zu- und/oder Abnahme wird in Echtzeit mit Hilfe der Lichtabsorptionsspektroskopie (UV/VIS) und Schwingungsspektroskopie (Raman und FTIR) gemessen und ermöglicht einen direkten Rückschluss auf die Enzymaktivität.
Über den zeitlichen Verlauf der Konzentration der Spaltprodukte lässt sich die Kinetik errechnen, also auch die Reaktionsgeschwindigkeiten als Funktion der Zeit Durch Anpassung der Reaktionsgeschwindigkeit mittels ausgewählter empirischer Beziehungen erfolgt die Herleitung der kinetischen Parameter. Diese werden mit der Konzentration von signifikanten Stoffen sowie mit Prozessparametern wie Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Tensidgehalt u. a. korreliert. Die so gewonnenen Beziehungen zwischen Kinetik, Formulierung und Prozessparameter bilden die Grundlagen zur Optimierung der Formulierung, der Vorausberechnung von Aktivität und Wirkung der Mehrstoffgemische mit Enzymbestandteilen. Die entwickelten Verfahren und Apparaturen sind an die Art der Substrate sowie an den Zustand der Enzyme (gelöst oder immobilisiert) und den Substraten (molekulare oder mizellare Lösung, immobilisiert) angepasst.
Die Substrate lassen sich in chromogene und spezifische biologische Substrate unterteilen. Chromogene Substrate stellen chemische Stoffe mit einem Chromophor dar, der mindestens über eine chemische Bindung an Fettsäuren, Amiden und Glucose gebunden ist. Beispiele sind p-Nitrophenol oder p-Nitroanilin. Alle biologischen Substanzen lassen sich als natürliche Substrate ansehen.
Die Hydrolyse chromogener Verbindungen, die spaltbare Gruppen (Ester, Amide, glycosidische Bindung) enthalten, setzt ein Chromophor (p-Nitrophenol, p-Nitroanilin) frei. Aus der UV/VIS-Spektroskopie folgt die Absorbanz der Chromophoren bei 400 bis 410nm. Über Umrechnungsfaktoren lässt sich daraus die Chromophorkonzentration ermitteln. Sowohl die Enzymaktivität als auch die Kinetik der Hydrolyse werden indirekt über Messung der Konzentration der p-Nitrophenol oder p-Nitroanilin durch Lichtabsorptionsspektroskopie (UV/VIS) bestimmt, und zwar relativ oder nach Eichung auch absolut.
Das kleinste Molekül der bekannten chromogenen Substrate ist p-Nitrophenylacetat. Die Estergruppe des p-Nitrophenylacetats (gelöst in 1,4-Dioxan, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid) wird von Enzymen (Lipase, Protease, α-Amylase, Cellulase, Esterase u. a.) hydrolysiert. Die Hydrolyse des p-Nitrophenylacetats findet in sehr kurzer Zeit statt, sodass die Nebenreaktionen wie Veresterung, Umesterung, Alkoholyse und Acidolyse keinen Einfluss auf die gemessene p-Nitrophenol-Konzentration ausüben.
Für die Praxis ist die Messung der Aktivität des Enzymgemisches mit deren spezifischen biologischen Substraten von großer Bedeutung. Die spezifischen chemischen Bindungen der biologischen Substrate, wie Ester-Gruppen für Triglyceride, Amid-Gruppen für Proteine und Peptide sowie glycosidische Bindungen für Kohlenhydrate, werden von Lipasen, Proteasen bzw. α-Amylasen hydrolysiert. Mit den entwickelten Messmethoden und der Apparatur ist es möglich, in Echtzeit die Enzymaktivität in Gegenwart von biologischen Substraten und von anderen Substanzen (wie Waschmittelinhaltsstoffe) zu messen. Das Substratgemisch befindet sich beispielsweise in einer wässrigen mizellaren Lösung und/oder immobilisiert (adsorbiert) auf unterschiedlichen Trägern (Textilien).
Die Esterbindung der Fette und Öle wird spezifisch von Lipasen hydrolysiert, wodurch die Konzentration an Triglyceriden bzw. die Carbonyl-Gruppe der Ester abnimmt. Als Spaltprodukte bilden sich Mono- und Diglyceride sowie Glycerin und gesättigte/ungesättigte Fettsäuren. Die Protease hydrolysiert über Endopeptidasen die Amidbindungen von Proteinen (Eiweiß, aber auch von Enzymen). Als Spaltprodukte fallen wasserlösliche Peptide mit niedrigem Molekulargewicht an. Exopeptidasen dagegen spalten Peptidbindungen an den Enden der Aminosäurenkette. Aus einer Peptidbindung entstehen so Verbindungen mit einer Carboxy- und einer AminoGruppe. Die Konzentration der Amid-Gruppen nimmt ab und die Carbonyl-Gruppe der Säuren zu.
Amylasen spalten Stärkeverbindungen. Die 1,4-α-D-glycosidische Bindung wird von der α-Amylase und die 1,6- α-D-glycosidische Bindung von der β-Amylase hydrolysiert. Cellulasen sind in der Lage, die 1,4-β-D-glycosidische Bindung der Cellulosen zu spalten. Durch die Spaltung der Kohlenhydrate nimmt die Konzentration an glycosidischen Bindungen ab.
In der vorliegenden Erfindung erfolgt die Echtzeitmessung der Enzymaktivität und der Hydrolysekinetik biologischer Substrate durch Bestimmung der Ab- oder Zunahme spezifischer chemischer Bindungen. Als Besonderheit des Verfahrens kann gleichzeitig die Messung der Aktivität der einzelnen Enzyme aus einem Gemisch mit deren spezifischen Substraten erfolgen. Hierbei werden mehrere biologische Substrate durch ein Enzymgemisch hydrolysiert.
Zur Messung der Aktivität einzelner Enzyme aus einem Gemisch wird eine Mikroemulsion von Olivenöl mit definierten Tropfengrößen in einer wässrigen Lösung mit gelöster Gelatine und Stärke bevorzugt. Die Messungen erfolgen gleichzeitig für alle Enzyme bzw. Substrate. Das Verfahren funktioniert auch mit anderen Substratgemischen und mit immobilisierten Substraten.
Die chemischen Bindungen lassen sich aus den in Echtzeit gemessenen Spektren über die Lage der Peaks identifizieren, deren Höhe die Konzentration bestimmt Die Breite der Banden ist von der Kettenlänge der Substrate und Spaltprodukte abhängig. Die Messsignale aus den spektroskopischen Messungen werden mit bekannten Kenngrößen korreliert, wie z. B. Verseifungszahl für Glyceride, Amid-Zahl für Proteine und Dextrose-Equivalent (DE) für Kohlenhydrate (Abschn. 9).
Berechnung kinetischer Parameter
Für die Berechnung der kinetischen Parameter existieren zwei Modellarten, und zwar globale und diskrete Modelle. Erstere erfassen alle Vorgänge in Form von globalen kinetischen Gleichungen, deren Parameter von den Einflussgrößen abhängen. Die als zweite genannten, diskreten Modelle unterscheiden zwischen der chemischen Kinetik und den Stofftransportvorgängen.
Die Kinetik der enzymkatalysierten Reaktionen hängt wesentlich von dem Zustand der Enzyme ab. Hierbei ist zu unterscheiden zwischen der ungebundenen Form (E) oder der gebundenen Form mit Substraten als Enzym-Substrat-Komplex (ES). Die Substratkonzentration [S] beeinflusst die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymkatalysierten Hydrolyse. Nach dem Michaelis-Menten-Ansatz strebt die Geschwindigkeit der Enzymreaktionen mit steigender Substratkonzentration einem Maximalwert zu. Bei der vollständigen Sättigung des Enzyms durch Substrat, d. h. wenn die Konzentration des Komplexes [ES] mit der Enzymkonzentration [E] gleich ist, limitiert die Spaltungsgeschwindigkeit des Komplexes Enzym-Substrat (ES) den Umsatz. In diesem Bereich ist die Geschwindigkeit der Enzymreaktion proportional zu der Konzentration des Komplexes [ES]. Die entsprechende Katalysekonstante wird von dem langsamen Zerfall in Spaltprodukte unter Regenerierung des freien Enzyms bestimmt Da die Komplexkonzentration [ES] nicht ohne weiteres messbar ist, werden Alternativen über Michaelis-Menten-Parameter gesucht. Der Michaelis-Menten-Ansatz gilt für alle Enzyme, bei denen die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v₀ von der Startsubstratkonzentration [S₀] durch eine Hyperbel beschrieben werden kann. Für die Michaelis-Menten-Konstante gilt: Km = [S₀] wenn v₀=1/2V_max.
Die entwickelten Messmethoden und die Apparatur können sowohl im Batchbetrieb als auch im kontinuierlichen Betrieb bei der Ermittlung der Michaelis-Menten-Konstante Km und der maximalen Anfangsgeschwindigkeit V_max für Mehrstoffgemische eingesetzt werden. Zur Erläuterung der Vorgänge während der enzymkatalysierten Hydrolyse ist in 5 ein typischer Verlauf der Konzentration des Spaltproduktes p-Nitrophenol (P) während der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat mit Waschmittelenzymen dargestellt.
Aus dem Verlauf der Konzentration des Spaltproduktes [P] sind vier Abschnitte relevant:

A-B: „Burst-Reaktion“: Zwischen der enzymhaltigen Lösung und den Substratmolekülen findet eine spontane Reaktion statt. Die Komplexbildung zwischen Aktivzentren und den Substratmolekülen erfolgt mit extremer Geschwindigkeit (in Bruchteilen von Millisekunden).
B-C: Lineare Zunahme der Konzentration des Spaltproduktes (P) mit der Zeit t. Die Reaktionsgeschwindigkeit bleibt konstant $ν = \frac{d [P]}{d t} = k o n s t .$
Dieser Abschnitt ist sehr wichtig für die Ermittlung der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v₀ bzw. für die Berechnung der Michaelis-Menten-Parameter.
C-D: Nichtlineare Zunahme der Konzentration des Spaltproduktes (P). Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v₀ nimmt mit der Zeit ab. Die gebildeten Spaltprodukte verlassen langsamer die Aktivzentren. Dadurch erfolgt eine Anreicherung von Spaltprodukten, was zur Hemmung der Reaktion führen kann.
D-E: Theoretisch stellt sich der Gleichgewichtszustand ein. In der Praxis wird wegen verschiedener Nebenrektionen oft eine Abnahme der Konzentration des Spaltproduktes (P) beobachtet. Die kontinuierliche Messung der Aktivität von Enzymgemischen soll um den Punkt D erfolgen.

Die Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeit v₀ (Abschnitt B-C) erfolgt durch Anpassung der Messdaten an ein geeignetes Modell aus der Literatur [17]. $[P] = \frac{ν_{0}}{η} \times [1 - e^{- η \times t}]$

v₀ ist die Anfangsgeschwindigkeit (Abschnitt B-C $[\frac{m o l}{l \times s}]$
η ist ein Parameter [1/s]
t ist die Reaktionszeit [s]

Die Konzentration des Spaltproduktes [P] wird je nach der Art des Substrates definiert. Für chromogene Substrate steht [P] für die Konzentration des Chromophors. Seine Konzentration [P] ist direkt proportional zur gemessenen Absorbanz und wird mit Hilfe eines Kalibrierfaktors berechnet. Für die biologischen Substrate gibt es nicht nur ein Spaltprodukt, sondern ein Gemisch aus Oligomeren und Zwischenprodukten. Daher wird die Abnahme durch Hydrolyse der chemischen Bindungen als Messgröße gewählt. Daraus folgt, dass die Größe [P] als Differenz der Konzentrationen an chemischen Bindungen der Substrate am Anfang [S₀] und während der Hydrolyse [S] ermittelt wird.
Der Umsatz der Hydrolyse, im weiteren Hydrolysegrad genannt, wird für einzelne Substrate wie folgt berechnet $Hydrolysegrad = 1 - [S] / [S_{0}]$

[S] sind die Konzentration bzw. Gehalt des Substrates bzw. chemische Bindungen in dem Reaktionsgemisch während der Hydrolysereaktion.
[S₀] ist die Anfangskonzentration bzw. der Gehalt des Substrates an den chemischen Bindungen in dem Reaktionsgemisch.

Eine Enzymaktivitätseinheit (Units) ist als diejenige Enzymmenge in g definiert, die 1 µmol Substrat bzw. 1 µmol Molzahl der spezifischen chemischen Bindungen in einer Minute bei definierten Reaktionsbedingungen (Substratkonzentration [S₀], Temperatur, pH-Wert) umsetzt. Die Enzymmenge kann auch durch die gesamte Enzymaktivität ersetzt werden. Diese Größe wird aus der Enzymmenge am Start, multipliziert mit der spezifischen Enzymaktivität, berechnet.
Qualitative und quantitative Messung der Zusammensetzung der enzymhaltigen Gemische
Das Messverfahren erfasst das gesamte Spektrum der enzymhaltigen Gemische. Aus der spektralen Analyse werden Kennzahlen wie Gehalt an signifikanten Stoffen und Varianz der Formulierung ermittelt.
Messungen mit chromogenen Substraten
Das Messverfahren ist in der Fachliteratur nur für einzelne Enzyme unter Laborbedingungen beschrieben. In realen Mehrstoffgemischen mit Enzymen ist der signifikante Wellenlängen-Messbereich für p-Nitrophenol nicht immer eindeutig feststellbar. Diesen Nachteil beseitigt die vorliegende Erfindung. Aus der enzymatischen Hydrolyse der p-Nitrophenyl-Derivate als unspezifisches Substrat entsteht p-Nitrophenol. Der zeitliche Verlauf der Konzentration des p-Nitrophenols lässt sich über die Lichtabsorptionsspektroskopie ermitteln. Die Absorbanzbande des p-Nitrophenols wird im Mehrstoffgemisch bei 405nm und pH>7,5 gemessen.
Die UV/VIS-Spektren beschreiben die Abhängigkeit der Absorbanz als Funktion der Wellenlänge in nm. Der Wert der Absorbanz zeigt, wieviel Licht die Probe absorbiert, und liegt zwischen 0 und 3,5. Die Rechnung geschieht nach Gl. 3: $A b s o r b a n z (λ) = l o g_{10} [\frac{S_{λ} - D_{λ}}{R_{λ} - D_{λ}}]$

λ - ist die Wellenlänge in [nm]
S_λ - ist die Intensität bei λ [-]
D_λ - ist die Intensität des Hintergrunds (Background) bei λ [-]
R - ist die Intensität einer Referenz-Probe bei λ [-]

Die Absorbanz des p-Nitrophenols in Mehrstoffgemischen mit Enzymbestandteilen folgt dem Lambert-Beer-Ansatz und hängt linear von der molaren Konzentration des p-Nitrophenols ab. Die Umrechnung der Absorbanz in der molaren Konzentration des p-Nitrophenols [P] erfolgt mit der linearen Kalibrierungsfunktion: $[P] = a + b \times A b s o r b a n z$
Die Parameter a und b werden aus den Kalibrierungsmessungen gewonnen (Abschn. 6.4).
Die Konzentration des Substrates [S] lässt sich über die Beziehung, $[S] = [S_{0}] - [P]$
der Hydrolysegad über Gl. 2 berechnen. Die Messung der Hydrolyse erfolgt mit der entwickelten Apparatur in Batch- oder konti- Betrieb folgendermaßen:

- Parameter, wie Substratkonzentration, Temperatur, pH-Wert, Reaktionszeit u. a., werden nach Erfahrungswerten angepasst.
- die Messung der Enzymaktivität umfasst erstens die Vorbereitung der Gemische (Verdünnung, Zugabe der Substratlösung), zweitens die enzymatische Reaktion und mit der online- Messung der Absorbanz zwischen 400 und 410 nm mit einem UV/VIS-Spektrometer, drittens die Umrechnung der Absorbanz in Konzentration des p-Nitrophenols (Gl.4) sowie die Berechnung des umgesetzten Substrats (Gl.5) und der Enzymaktivität.
- Der Sollwert für Absorbanz, Enzymaktivität oder Umsatz soll der festgelegten Formulierung der Gemische entsprechen. Evtl. Abweichungen zwischen dem Ist- und Sollwert können zur Regelung einer Produktionsanlage eingesetzt werden.

Messungen mit biologischen Substraten
Die biologischen Substrate sind meist komplexe Polymere mit hohen Molekulargewichten und/oder Triglyceride mit gesättigten und ungesättigten Säuren. Durch die Hydrolyse der spezifischen Bindungen wird die Kettenlänge der Biopolymere reduziert und die Chemie der Teilstücke verändert. Beispielsweise entstehen bei Estern durch die Spaltung Alkohole und Säuren. Bei der Hydrolyse der Triglyceride nimmt die Anzahl der Estergruppen ab. Die Kette der Säuren, egal ob frei oder gebunden, bleibt unverändert. Durch die Hydrolyse der Proteine nimmt die Anzahl der Amid-Gruppen ab. Es entstehen Peptide und Aminosäuren. Die hydrolytische Spaltung glycosidischer Bindungen von Kohlenhydraten erzeugt Oligosaccharide als Spaltprodukte, die teilweise bis zu Monosacchariden abgebaut werden.

Eine Echtzeitmessung der Konzentration der einzelnen Substrate und Spaltprodukte ist wirtschaftlich nicht praktikabel. Daher wurden Messmethoden zur Echtzeitmessung der Konzentration von chemischen Bindungen, spezifisch für Substrate und Spaltprodukte, entwickelt (Tab. 2). Tabelle 2. Spezifische chemische Bindungen der Substrate und Spaltprodukte

Biologische	Kennzeichnende	Spaltprodukte mit
Substrate	chemische Bindung	spez. chemische Bindung
Triglyceride	Ester (-OCOR)	Ester (-OCOR) ^a)
		Diglyceride, Monoglyceride
		Alkohol (-OH); Carboxy (-COO)
Proteine	Amid (-CONH-)	Amid(-CONH-)^a)
		Amin (R-NH₂);
		Carboxy (-COO)
Kohlenhydrate	glykosidische	glykosidische Bindung ^a)
	Bindung	Aldehyde (-CHO), Ketone (-CO-)
^a) Abnahme der Konzentration der Bindungen während der Hydrolyse.

Die Kinetik der Substrathydrolyse bzw. die Enzymaktivität lässt sich durch Messung der Konzentration charakteristischer chemischer Bindungen der Substrate und/oder der Spaltprodukte ermitteln. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, in dem signifikante, spektrale Banden für Ester (Tri-, Di- und Monoglyceride), Amid- und glykosidische Bindungen gleichzeitig aus einem Spektrum ausgewertet und zur Berechnung des Hydrolysegrads der einzelnen Substrate eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß läuft die Messung wie folgt ab:

a) Hydrolyse von Substraten mit Enzymen. Die Hydrolyse findet im Rührwerkreaktor (20, 3) oder in externen Bioreaktoren (z. B. Waschmaschine) statt. Die spektroskopischen Messungen erfolgen in-situ mit eingetauchter Raman-Messsonde.
b) Spektrale Messungen während der Hydrolyse (Raman-, ATR-FTIR- und UV/VIS-Spektroskopie); Auswahl der spektralen Banden (Echtzeit spektrale Analyse) und Berechnung der Hydrolysegrade (Gl. 11, 12). Aus den Spektren, aufgenommen als Funktion der Zeit, werden die für chemische Bindungen charakteristischen Banden extrahiert. Die gewonnenen spektralen Daten lassen sich zur Berechnung von Kennzahlen wie Peakhöhe, Breite der Banden, Fläche u. a. nutzen. Weiter dienen die Kennzahlen der Berechnung von Hydrolysegraden der einzelnen Substrate.
c) Bestimmung der Konzentration der spezifischen Bindungen der Substrate mit chemischen Messmethoden; Berechnung des Hydrolysegrades (Gl.7, 8, 9)
d) Vergleich der Hydrolysegrade aus spektroskopischen und chemischen Messmethoden; Auswahl der spektralen Banden.
e) Herleitung von Korrelationen zwischen den chemischen Kennzahlen und spektralen Daten.
f) Anwendung der Principal Component Analysis (PCA) zur Validierung der ausgewählten spektralen Banden.
g) Die Echtzeitmessungen der Hydrolysegrade der Substrate erfolgt mit validierten spektralen Banden.

Hydrolyse mit einzelnen Enzymen

Der Verlauf der Hydrolyse lässt sich aus den Veränderungen der gemessenen spektralen Banden von Ester- und Amid- sowie glykosidischer Bindungen (charakteristische Bindungs-Banden) berechnen. Typische granulare Enzyme für feste Wasch- und Reinigungsmittel sowie für Spezialprodukte (Pulver, Granulate, Tabletten) oder gelöste flüssige Enzyme für flüssige und gelartige Wasch- und Reinigungsmittel sowie für Spezialprodukte (auch für Pasten und industrielle Reinigungsmittel) sind in Tab. 3 beschrieben. Die Enzyme werden einerseits in den Waschmitteln einzeln (meist Protease) oder andererseits im Gemisch von zwei, drei oder vier Enzymen eingesetzt. Beachtenswerterweise existieren für einige Gemische Synergien, die mit der erfindungsgemäßen Methoden nachweisbar sind, sodass die Messungen zur Optimierung der enzymatischen Wirkung genutzt werden können. Tabelle 3: Biokatalysatoren (Hydrolasen) in Waschmitteln

Enzym	Molekulargewicht	Wirkprinzipien	Wirkoptimum pH T [°C]		Funktionen im Waschmittel; Entfernung von
	[Da]
Alkalische	24.300	Hydrolyse von	10-11	60	Gras, Schleim, Kot, Blut,
Proteasen	(ca. 274	Peptidbindungen,			Soßen, Spinat, verschiedene
	Aminosäuren)	Ablösung von Proteinen auf der Faser			kosmetische Formulierungen und Lebensmittel (Eigelb)
α-	40.000-	Hydrolyse der α-1,4	8	>60	Nudeln, Soßen, Fleischsaft,
Amylasen	50.000	glykosid ischen			Pudding, Kakao (Schokolade),
		Polysaccharidbindungen; Verflüssigung von Stärke			Babynahrung, Kartoffeln
Cellulasen	52.000	Hydrolyse von β-1,4-	7-10	<60	Feinen Fasern und Pills
		D glykosidischen Cellulosebindungen in amorpher Cellulose; Anti- Pilling; Abbau von Mikrofibrillen; Entfernung von Pigmentschmutz			(Spließ, Knötchen); intensiviert den Farbeindruck; vermindert Kalk- und Pigmentablagerungen; Vergrauungshemmung
Lipasen	50.000-	Hydrolyse von	10	60	Öle, Butter, Margarine, techn.
(Esterasen)	67.000	Glyceriden			Fette, Kosmetik (Make up, Sonnencreme, Lippenstift)

Hydrolyse der Triglyceride mit Lipolase
Die katalysierte Hydrolyse der Triglyceride läuft heterogen an der Wasser/Öl-Grenzfläche ab, weil das Enzym (Lipase; Lipex 100 von Sigma-Aldrich, Lipolase 100L von Novozymes A/S) wasserlöslich und das Substrat lipophil ist. Die Aktivierung der Lipase erfolgt durch Kontakt mit der hydrophoben Oberfläche. Bei höherer Wasserkonzentration ist das Aktivzentrum des Enzyms mit festgebundenen Wassermolekülen belegt. Daher hängt die Aktivität der Lipase sehr stark von der Wasserkonzentration an der Phasengrenzfläche ab.
Die Kinetik der Hydrolyse wird von der Konzentration der Enzyme und Substrate in der Phasengrenzfläche beeinflusst. Dort findet pH-abhängig eine Anlagerung der wasserunlöslichen Spaltprodukte statt, insbesondere von grenzflächenaktiven Fettsäuren. Durch die Strömung erfolgen eine ständige Erneuerung der Grenzschicht und ein Abtransport der Spaltprodukte in die wässrige Phase. Die Lipaseaktivität hängt vom wässrigen Milieu (Inhibitoren, Aktivatoren, Tensidgehalte, Salze) und den Messbedingungen Temperatur, pH, Ionenstärke) ab.
In der vorliegenden Erfindung wird Olivenöl zur Messung der Aktivität der Lipase verwendet. Das Olivenöl wird als Emulsion O/W oder adsorbiert an festen Oberflächen (z. B. Garnen) eingesetzt. Der Verlauf der Hydrolyse des Olivenöls lässt sich aus den spektralen Banden für Ester-Bindungen der Triglyceride bei 1740-1755 und 1160-1280 cm^-1 sowie der Di- und Monoglyceriden bei 1700-1730 cm^-1 berechnen.
Hydrolyse der Proteinen mit Endoprotease
Serine Endoproteasen (Protease von Sigma-Aldrich, Savinase 16L von Novozymes A/S) hydrolysieren die Peptidbindungen des Substrates und der Spaltprodukte. Bei Substratüberschuss kann sich abseits des aktiven Zentrums ein weiteres Substratmolekül (S) an einen vorhandenen Enzym-Substrat-Komplex (ES) binden, ohne sich zu spalten. Inhibitoren ankern an der Oberfläche (reversible Enzyminhibition) und/oder an dem aktiven Zentrum des Enzyms (irreversible Enzyminhibition). Die Enzymmoleküle mit irreversiblen Inhibitoren nehmen nicht mehr an der Hydrolyse teil. Außerdem hydrolysiert die Protease die Peptidbindungen aller vorhandenen Enzyme (auch sich selbst). Zur Feststellung der Enzymaktivität wird zur Hydrolyse die Gelatine als Substrat bevorzugt eingesetzt. Im Waschprozess befinden sich die Proteine wie Ei, Milch, Kasein, Blut u. a auf festen Oberflächen (Garnen) und hydrolysieren nach Adsorption der Protease.
Die Ermittlung der Hydrolysekinetik erfolgt durch spektrale Messung der Abnahme der Amid-Bindungen. FTIR- und Raman-Spektroskopie erfassen die Schwingungen der Peptidbindungen. Die dabei für Proteine charakteristischen Amidbanden (Amid-I-, Amid-II und Amid-III-Banden) entstehen durch gekoppelte Schwingungen der Atome des Proteinrückgrats und werden zur quantitativen Bestimmung der Amidgruppen herangezogen.
Die sogenannte Amid-I Mode (Wellenzahl: 1600-1690 cm^-1) besteht im Wesentlichen in einer Streckschwingung der CO-Bindung. Die Amid-II Mode (Wellenzahl: 1450-1575 cm^-1) und die Amid-III Mode (Wellenzahl: 1229-1301 cm^-1) sind Kombinationen aus CN Streckschwingung und NH-Biegeschwingung in der Ebene des Peptidplättchens [18, 19]. Das Verfahren umfasst die Korrelation zwischen den Messungen der Intensität von Amidbanden mit der aus nasser Analytik (Biuret-Reaktion) sowie eine Validierung der ausgewählten Wellenzahlen mit der PCA-Analyse.
Hydrolyse der Kohlenhydrate mit α-Amylase
Die Kinetik der Hydrolyse von Kohlenhydraten ist von der Kettenlänge und dem Verhältnis der Amylose zu Amylopektin abhängig. Für Messungen in der Flüssigphase zur Feststellung der Enzymaktivität werden wasserlösliche Stärke und Maltodextrine bevorzugt. Im Waschprozess befinden sich Kohlenhydrate wie Mehl, Soßen u. a. auf festen Oberflächen (Garnen) immobilisiert und werden dort hydrolysiert. Die Kinetik der Hydrolyse der Kohlenhydrate folgt aus der Auswertung von Raman-Spektren bei spektralen Banden für glykosidische Bindung bei 1000 bis 1100 cm^-1. Die spektralen Messungen lassen sich durch Vergleich mit den nasschemischen Ergebnissen (Fehling- und/oder Lugol-Lösungen) sowie mit der PCA-Analyse validieren.
Im Rührwerkreaktor (20) können gleichzeitig Messungen mit Immersion-Sonden für UV/VIS und Raman-Spektrometrie erfolgen. Der zeitliche Verlauf des DE-Wertes (Abschn. 9) folgt aus Gl. 6, der Hydrolysegrad lässt sich aus der spektralen Raman-Intensität nach der Gl. 11, 12 berechnet. $D E (t) = D E (t = 0) + [100 - D E (t = 0)] \times H y d r o l y s e g r a d$
Hydrolyse von flüssigen biologischen Substraten
Substratgemische aus Ölen, Proteinen und Kohlenhydraten werden als Gemische der chemischen Bindungen (Ester-, Amid-, glykosidische Bindung) betrachtet. Jede charakteristische Bindung wird über ausgewählte spektrale Peaklage, Bandbreite- und Fläche sowie Peakhöhe erfasst. Die Validierung der spektralen Banden erfolgt durch Vergleich mit chemischen Messmethoden sowie mit der PCA-Analyse. Zur Aktivitätsbestimmung in der Flüssigphase wird ein wässriges Gemisch aus Olivenöl (O/W-Emulsion), Gelatine und Stärke bevorzugt hydrolysiert.
Vorzugsweise lässt sich die Raman-Intensität für glykosidische Bindungen zwischen 1080-1090 cm^-1 (Peak 1085±2,6 cm^-1) und für Amid-Bindung bei 1450-1460 cm^-1 (Peak 1456 ±0,78 cm^-1) bestimmen.
Hydrolyse von immobilisierten biologischen Substraten
In Praxis ist die Entfernung von immobilisierten biologischen Substraten an festen Oberflächen als Waschen bzw. Reinigung bekannt. Im Versuch werden zunächst Substrate, wie z. B. Blut, Milch, Voll-Ei, Schokolade, Olivenöl u. a., quantifizierbar auf Textilien immobilisiert und danach mit festgelegten Enzymmengen/Aktivitäten hydrolysiert. Anschließend erfolgen die Messungen mit verschmutzten Textilien zur Ermittlung der Vorgänge in der Grenzschicht fl/fl und fl/f mit der Raman- und ATR-FTIR-Spektroskopie. Für diesen Zweck ist der entwickelte Mikroreaktor mit integrierten Messstellen vorgesehen (4).
Berechnung von Kennzahlen für Substrate und Spaltprodukte
Für Fette und Öle wird die Konzentration der Ester-Bindung mit Hilfe der Veresterungszahl VEZ in mg KOH ermittelt. Die VEZ berechnet sich aus der Differenz der Verseifungszahl VSZ und Säurezahl SZ. $\begin{matrix} V E Z = V S Z - S Z & [mg KOH/g] \end{matrix}$
Die Verseifungszahl VSZ kennzeichnet die Carboxy-Bindungen, entstanden durch die vollständige Hydrolyse der Glyceride und dem ursprünglichen Säuregehalt des Substrates, während die Säurezahl SZ den ursprünglichen Säuregehalt des Substrates erfasst. Die Veresterungszahl VEZ steht für den tatsächlichen, spezifischen Laugenverbrauch (mg KOH/ g Substrat) für die Hydrolyse der vorhandenen Esterbindungen (COOR). Während der Hydrolyse der Glyceride nimmt die Veresterungszahl ab, bis der Wert Null erreicht ist und alle Glyceridbindungen hydrolysiert sind. Dort ist die Säurezahl mit der Verseifungszahl identisch.
Der Hydrolysegrad der Fette und Öle wird mit der folgenden Beziehung berechnet: $Hydrolysegrad = 1 - V E Z (t) / V E Z (t = 0)$

VEZ(t) - ist die Veresterungzahl bei der Zeit t
VEZ(t=0) - ist die Veresterungszahl am Anfang der Reaktion (t = 0)

Die Hydrolyse der nativen oder denaturierten Proteinen führt zu kleineren Proteineinheiten (Polypeptide bis hin zu den Grundbausteinen, den freien Aminosäuren). Mit Hilfe der Endopeptidasen entstehen Peptide unterschiedlicher Kettenlänge, die wiederum Substrate für die weitere Hydrolyse darstellen. Die Kennzahl für die Erfassung der Hydrolysekinetik von Proteinen wird als Amid-Kennzahl definiert und aus dem Verhältnis der Molzahl der Amid-Bindungen (CONH) bezogen auf 1g Substrat gebildet.
Zur quantitativen Messung der Konzentration der Amid-Bindung wird die Biuret-Reaktion eingesetzt (Abschn. 6.5). Der Hydrolysegrad der Amid-Bindung wird wie folgt berechnet: $H y d r o l y s e g r a d = 1 - N (t) / N (t = 0)$

N(t) - ist die Amid-Kennzahl bei der Zeit t
N(t=0) - ist die Amid-Kennzahl am Anfang der Reaktion (t = 0)

Der Hydrolysegrade der Kohlenhydrate wird mit Dextrose-Equivalent (DE) berechnet. Der DE-Wert ist ein Maß für die Kettenlänge der Saccharide: Null ist der Wert für Stärke und 100 für Glucose. Niedrige DE-Werte liefern die Kohlenhydrate mit einem hohen Anteil an Polysacchariden und einem niedrigen Gehalt an Oligomeren. Hohe DE-Werte zeigen die Spaltprodukte mit kürzerer Kettenlänge bzw. Molekularmasse. Die theoretischen DE-Werte können aus dem Verhältnis der Molmasse der Glucose, bezogen auf die Molmasse der Saccharide multipliziert mit 100 berechnet werden. Es resultieren für Monosaccharide (Glucose) 100; Disaccharide 52,6; Trisaccharide 35,7; Tetrasaccharide 27,0; Pentasaccharide 21,7; Hexasaccharide 18,2. Die Bestimmung der DE erfolgt mit Fehlinglösung (Abschn. 6.5).
Der Hydrolysegrad der Kohlenhydrate wird mit folgender Beziehung berechnet: $H y d r o l y s e g r a d = \frac{D E (t) - D E (t = 0)}{100 - D E (t = 0)}$

DE(t) - ist das Dextrose-Equivalent während der Hydrolyse bei der Zeit (t)
DE(t=0) - ist das Dextrose-Equivalent bei der Zeit t=0

Ein weiteres Problem besteht in der Identifizierung der spektralen Banden bzw. Kennzahlen, die sich mit den chemischen Kennzahlen korrelieren lassen. Aus dem Vergleich der Hydrolysegrade (chemisch/spektrometrisch) werden die charakteristischen spektralen Banden für jede chemische Bindung gewonnen.
Die Korrelation der spektralen Messsignale mit den chemischen Kennzahlen erfolgt mit Hilfe von Kalibrierungsfunktionen. Für die UV/VIS und FTIR gilt das Lambert-Beer-Gesetz, sodass die Kalibrierungsfunktion durch eine Eichgerade dargestellt wird. Die Raman-Intensität lässt sich theoretisch mit einer komplexen Beziehung berechnen, wobei das Messsignal auch direkt proportional zu der Konzentration ist [20].
Als Folge dessen können die Kalibrierungsfunktionen durch eine lineare Gleichung erfasst werden. $c h e m i s c h e K e n n z a h l = a + b \times M e s s i g n a l$
Für den Hydrolysegrad aus den spektralen Kennzahlen ergibt sich $H y d r o l y s e g r a d = 1 - \frac{a + b \times M e s s i g n a l (t)}{a + b \times M e s s i g n a l (t = 0)} = \frac{b \times [M e s s i g n a l (t = 0) - M e s s i g n a l (t)]}{a + b \times M e s s i g n a l (t = 0)}$

Messsignal: Absorbanz, IR-Transmission, Raman Intensität bei der Zeit t und t=0 (Anfang)
a, b: Parameter

Mit der Annahme, dass Parameter a kleine Werte annimmt ( a → 0 ), kann der Hydrolysegrad direkt aus den zeitlichen Messungen des Messsignals berechnet werden. $H y d r o l y s e g r a d = 1 - M e s s i g n a l (t) / M e s s i g n a l (t = 0)$
Die Validierung der spektralen Banden erfolgt mit Hilfe der PCA-Analyse. Die gemessenen Spektren stellen die Abhängigkeit der Intensität des Messsignals von der Wellenlänge bzw. Wellenzahl und dem Zeitschritt dar. Die Werte bilden einen Vektor, der die Breite der spektralen Banden (Hauptmuster) erfasst. Für jede Wellenlänge bzw. Wellenzahl wird ein zweiter Vektor mit der Intensität zu jedem Zeitschritt gebildet. Diese Vektoren (spektrale Daten) lassen sich in einer zweidimensionalen Matrize zusammenfassen. Die Spalten entsprechen den diskreten Zeiten der Datenaufnahme. Die Reihen stehen für die Breite der spektralen Banden. Anschließend erfolgt die Reduzierung der Spaltenanzahl auf eine einzige Spalte (Principal Component). Dann wird die Bewertung (Score) der einzelnen Wellenzahlen aus den spektralen Banden auf die Principal Component Achse projiziert. Die signifikanten spektralen Banden ergeben sich aus der Höhe der projizierten Werte auf die Principal Component Achse.
Beispiele zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Methoden und Apparaturen
Beispiel 1:
Kontinuierliche Messung des UV/VIS-Spektrums während der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat mit einer enzymhaltigen Waschmittellösung.
Messmethode: UV/VIS-Spektroskopie; Durchlauf-Küvette.
In 6 ist das UV/VIS-Absorbanzspektrum aus Echtzeitmessungen der enzymkatalysierten Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat in einer wässrigen 10%v/v Waschmittellösung bei vier verschiedenen Verweilzeiten dargestellt. Die Herstellung der enzymhaltigen Waschmittellösung erfolgte durch Verdünnen von Persil Universal Gel mit einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung in einer Konzentration von 0.023 [mol/l] Na₂HPO₄. Die Substratlösung wies eine Konzentration von 4.3105E-2 [mol/l] p-Nitrophenylacetat in getrocknetem 1,4-Dioxan auf. Am Start betrug die Substratkonzentration 2.0526E-3 [mol/l] p-Nitrophenylacetat. Die Reaktion lief bei 25°C und pH>7.5 ab. Aus den Messungen ist zu ersehen, dass der Wellenlängenbereich ca. 390nm eine starke Überlagerung der Peaks zeigt und daher nicht signifikant ist für eine quantitative Auswertung. Oberhalb von 390nm kann nur der Peak bei 405nm spezifisch dem p-Nitrophenol zugeordnet werden. Wegen der laufenden Reaktion nimmt die Absorbanz bei 405nm mit der Reaktionszeit zu.
Beispiel 2:
Batch-Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat mit einer enzymhaltigen Waschmittellösung; Ermittlung der Michaelis-Menten-Konstante.
Messmethode: UV/VIS-Spektroskopie; Durchlauf-Küvette.
Die Messung der Enzymaktivität einer Waschmittellösung mit unbekannten Enzymbestandteilen erfolgte mit p-Nitrophenylacetat als unspezifisches chromogenes Substrat bei 25°C und pH > 7,5. Die Waschmittellösung (10 %iges Persil Universal Gel) wurde mit einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung in einer Konzentration von 0.023 [mol/l] Na₂HPO₄ verdünnt. Die Zusammensetzung des Gels ist nicht bekannt. Die Konzentration der Substratlösung betrug 2,89E-2 [mol/l] p-Nitrophenylacetat gelöst in getrocknetem 1,4-Dioxan. Die Anfangskonzentration des Substrates [S₀] im Reaktionsgemisch variierte zwischen 11,5 bis 567 [µmol/l]. Die unterschiedlichen Verläufe (Parameter: [S₀] [µmol/l]) der Absorbanz, die Kinetik der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat mit einer Waschmittellösung aus Persil Universal Gel sind in 7 dargestellt.
Die Absorbanz bzw. die Konzentration an p-Nitrophenol nimmt mit der Zunahme der Startkonzentration des Substrates zu. Ebenso nimmt die Anfangsgeschwindigkeit v₀ mit der Substratkonzentration [S₀] zu; der Verlauf entspricht dem Michaelis-Menten-Ansatz. Für die Michaelis-Menten-Konstante Km ergab sich ein Wert von 277 [µmol/l]. Die Hydrolyse des p-Nitrophenylacetats mit Wasser oder Veresterung mit Na₂HPO₄ aus der Phosphatlösung ist vernachlässigt. Die Einheit der Aktivität der Enzymbestandteile wurde definiert mit der erforderlichen Gel Menge in l, um 1 µmol Substrat in einer Minute umzusetzen. In 8 sind die berechneten Enzymeinheiten (l Gel/µmol umgesetztes Substrat in 1 Minute) als Funktion der Substratanfangskonzentration [S₀] dargestellt. Die erforderliche Gel-Menge in Liter nimmt mit der Abnahme der Substratkonzentration [S₀] zu. Für die kontinuierliche Messung ergibt sich ein optimaler Arbeitsbereich zwischen 70 und 120s Reaktionszeit und Substratkonzentration [S₀] von ca. 0,01 [mol/l].
Beispiel 3:
Vergleich der Enzymaktivität von zwei enzymhaltigen Waschmittellösungen; Batch-Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat.
Messmethode: UV/VIS-Spektroskopie; Durchlauf-Küvette.
Die Kinetik der Hydrolyse (25 °C) von p-Nitrophenylacetat mit Waschmittellösungen (Persil Universal Gel, 9a, und Spee Aktiv Gel, 9b), wobei die Enzyme in Menge und Art nicht bekannt sind, ist in 9 gegenübergestellt. Die Waschmittellösungen wurden durch Verdünnung (mit einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung in einer Konzentration von 0.023 [mol/l] Na₂HPO₄) von Gelen bis auf 10%v/v hergestellt Die Konzentration der Substratlösung betrug 2,89E-2 [mol/l] p-Nitrophenylacetat gelöst in getrocknetem 1,4-Dioxan. Alle Messungen wurden bei einer Substratanfangskonzentration [S₀]= 59,4 [µmol/l] durchgeführt. Persil Universal Gel besitzt die höchste Enzymaktivität. In 10 sind die berechneten Enzymeinheiten (l Gel/µmol umgesetztes Substrat in 1 Minute) für die gemessenen Gele gegenübergestellt. Die optimale Reaktionszeit für die kontinuierliche Messung der Enzymaktivität liegt bei ca. 100 bis 160s und ca. 40 bis 60 [µmol/l] Substrat.
Beispiel 4:
Bestimmung der Aktivität von Waschmittellösungen mit Waschmittelenzymen (Lipolase 100L, Savinase 16L, Termamyl 300L, Carezyme 4500L; Novozymes A/S) durch eine Batch-Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat.
Messmethode: UV/VIS-Durchlauf-Küvette.

Die Bestimmung der Aktivitäten von Waschmittelenzymen mit p-Nitrophenylacetat erfolgte bei 25°C und pH>7,5. Die Waschmittellösung besteht aus Persil Universal Gel, das nach einer thermischen Belastung (2h bei 90 °C) zur Enzymdenaturierung mit einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung in einer Konzentration von 0.023 [mol/l] Na₂HPO₄ auf 10%v/v verdünnt wurde. Die Messung der Restaktivität der Waschmittellösung mit p-Nitrophenylacetat ergab keine signifikanten Werte für die Absorbanz bei 405nm. Anschließend sind gezielt Waschmittelenzyme der Fa. Novozymes A/S (Tab. 4) zur Waschmittellösung gegeben worden. Als Substrat diente eine p-Nitrophenylacetat-Lösung in getrocknetem 1,4-Dioxan in einer Konzentration von 2,8943E-2 [mol/l]. Durch die Änderung des Volumenstromes der Substratlösung variierten die Enzym/Substrat-Verhältnisse. Tabelle 4. Parameter der Messungen mit Waschmittelenzymen und p-Nitrophenylacetat als Substrat.

Fig.	Enzyme	spezifische	Novozymes	Enzymgehalt	p-
		Aktivität	Units	g/l	Nitrophenylacetat
					[µmol/l]
7	Lipolase	Esterbindungen	Lipolase	4 - 6	11,57 - 567
	100L	in	100 KLU/g
		Glyceriden
8	Savinase	Endoprotease	Protease	10 - 17	11,57 - 567
	16L	Amide-	16 KNPU-
		Bindungen	S/g
9	Termamyl	Endoamylase	Alpha-	7 - 15	11,57 - 567
	300L	1,4-alpha-D-	Amylase
		glycosidische Bindungen	300 KNU-T/g
10	Carezyme	Cellulase	Cellulase	0,3 - 3	11,57 - 286
	4500L	1,4-beta-D-	4500 CNU-
		glycosidische Bindungen	CA/g

Die folgenden Figuren zeigen die Kinetik der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat mit verschiedenen Enzymen bei 25 °C und pH>7,5): 11 mit Lipolase 100L (Enzymgehalt: 5,056 g/l), 12 mit Savinase 16L (Enzymgehalt: 15,3 g/l), 13 mit Termamyl 300L (Enzymgehalt: 7,44g/l) und 14 mit Carezyme 4500L (Enzymgehalt: 3,14/l). Aus diesen Darstellungen ist zu entnehmen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit des p-Nitrophenylacetats vom Enzymtyp abhängt. Außerdem wird die Kinetik von der Substratkonzentration beeinflusst. Die Hydrolyse des p-Nitrophenylacetats erfolgt mit Lipolase 100L und Savinase 16L wesentlich schneller als mit Termamyl 300L und Carezyme 4500L. Die Messungen ergaben für die Lipolase 100L und Savinase 16L Reaktionszeiten von 60 bis 120s statt über 300s für Termamyl 300L und Carezyme 4500L.
Der Verlauf der Anfangsgeschwindigkeit v₀ in Abhängigkeit von der Substratkonzentration p-Nitrophenylacetat ist in 15 dargestellt und entspricht dem Michaelis-Menten-Ansatz. Aus den kinetischen Daten der 11, 12, 13 und 14 sind die Enzymeinheiten berechnet und in 16 gegenübergestellt worden. Für eine Substratanfangskonzentration S₀ von 115 [µmol/l] benötigt die Lipolase 100L nur 0,05g, um 1 µmol Substrat in 1 Minute umzusetzen (Vergleich: Savinase 0,2 g, Termamyl 300L 5,4 g und Carezyme 4500L 6 g).
Beispiel 5:
Messung der Enzymaktivität von Waschmittellösung mit p-Nitrophenylacetat nach Zugabe von Lipolase 100L und Savinase 16L.
Messmethode: UV/VIS-Spektroskopie; Durchlauf-Küvette.

Die Bestimmung der Enzymaktivität von Waschmittellösungen erfolgte mit Gemischen aus Lipolase 100L und Savinase16L bei 25°C und pH>7,5. Hierbei wurde die denaturierte Waschmittellösung (s. Beispiel 4) mit aktiven Enzymen der Firma Novozymes vermischt. Die Zusammensetzung der vorbereiteten Waschmittellösungen ist in Tab. 5 angegeben. Tabelle 5. Zusammensetzung der Waschmittellösung mit Enzymgemischen.

Versuch (s.	Lipolase	Savinase	Lipolase 100L	p-Nitrophenylacetat
17,18)	100L [g/l]	16L [g/l]	Massenanteile	S₀ [µmol/l]
a	4,213	2,50	0,62	115
b	3,371	5,10	0,39	115
c	1,685	10,20	0,14	115

Der zeitliche Verlauf der Absorbanz bei 405nm während der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat ist für die drei Gemische a, b, c in 17 dargestellt. Die Kinetik der Hydrolyse hängt vom Anteil an Lipolase 100L ab. Für Gemische a und b liegt der optimale Messbereich der Absorbanz zwischen 1 bis 1,4 und ca. 40 bis 70s für die Reaktionszeit. Die Enzymeinheit ist als erforderliche Enzymgemischmenge in g definiert, die in 1 Minute 1 µmol Substrat umsetzt (18).
Beispiel 6:
Batch-Hydrolyse von Olivenöl (Emulsion und beladen auf Baumwolllappen) mit Waschmittellösung und Zugabe von Savinase 16L.
Messmethoden: Immersion-Raman-Sonde und ATR-FTIR-Spektroskopie.
Die Hydrolyse eines nativen Olivenöls (Extra aus EU, Verseifungszahl 196 mg KOH/g und Säurezahl 1 mg KOH/g) wurde mit Lipolase 100 L (Novozymes A/S, Tabelle 3) untersucht. Die Herstellung der enzymhaltigen Lösung erfolgte durch Zugabe von Lipolase 100L zu einer wässrigen Waschmittellösung, hergestellt durch Verdünnen von denaturiertem Persil Universal Gel (Beispiel 4) mit deionisiertem Wasser auf 10 %v/v. Die Hydrolyse erfolgte im Rührreaktor (3a, (20)) unter Vorlage von 150 ml Waschmittellösung. Danach wurde Lipase 100L zugegeben.
Die Zugabe des Olivenöls erfolgte auf zwei Arten. Im ersten Versuch ist das Substrat (Olivenöl) durch Einspeisung einer O/W-Emulsion (Tropfengröße ca. 0,05-0,1 mm) zugegeben worden. In den Versuchen 2, 3 und 4 dienten definierte, mit Olivenöl beladene Baumwolllappen (Baumwolle, wfk Standard ca. 0,0175 g/cm²) als Substratträger. In den Versuchen 2 und 3 wurden die Lappen am Rührwerk aufgehängt, während im Versuch 4 die Lappen in der Anordnung „Mikroreaktor/Messzelle“ (4) unterhalb des Kristalls lagen. Die spektralen Messungen in der Flüssigkeit des Rührreaktor sind mit der Immersion-Raman-Sonde durchgeführt worden.

Im Versuch 4 wurden zusätzliche Messungen mit ATR-FTIR-Spektroskopie an der Grenzschicht fl/f der aufgelegten Lappen in Mikroreaktor/Messzelle (4) vorgenommen. In Tab. 6 sind die Randbedingungen der Hydrolyse des Olivenöls zusammengefasst. Tabelle 6. Parameter der Versuche zur Batch-Hydrolyse von Olivenöl mit Lipolase 100L (Novozymes A/S) im Mikrorührreaktor.

Versuch	1	2	3	4
Enzymmenge [g] an Lipolase 100L	1,82	2,09	5,61	1,50
Aktivität Lipase Units	342	1607	4315	2083
[KLU/g Olivenöl]
Art der Substratzugabe:	O/W-Emulsion 0,53 g Olivenöl	Olivenöl von Lappen 0,13 g	Olivenöl von Lappen 0,13 g	Olivenöl von Lappen 0,072 g
Durchführung der Hydrolyse	Rührreaktor (3a, (20))	Rührreaktor (3a, (20))	Rührreaktor (3a, (20))	Rührreaktor ( 3a, (20)) und Mikroreaktor/Messzelle (4)
Temperatur	60 °C	24 - 25 °C	24 - 25 °C	40°C
Ort der Messung	Messung in der Flüssigphase: Immersion-Raman-Sonde	Messung in der Flüssigphase: Immersion-Raman-Sonde	Messung in der Flüssigphase: Immersion-Raman-Sonde	-Messung in der Flüssigphase: Immersion-Raman-Sonde
				- Messung an der Grenzschicht fl/f: ATR-FTIR-Spektroskopie

In 19 ist der zeitliche Verlauf der Veresterungszahl für den Versuch 1 (aus Tab. 5) dargestellt. Am Anfang (t = 0) entspricht die Veresterungszahl dem Wert des eingesetzten Olivenöls. Danach erfolgt die Bindung und die Grenzflächenaktivierung der Lipolase an der hydrophoben Oberfläche der Öltropfen (Abschn. a). In diesem Abschnitt nimmt die Veresterungszahl kaum ab. Nach ca. 20 min startet die Hydrolyse und in weiteren 12 min nimmt die Veresterungszahl von ca.180 mg KOH/g auf ca. 137 mg KOH/g ab (Abschn. b). Danach stellt sich der Gleichgewichtszustand ein (Abschnitt c).
Die Kinetik der Hydrolyse des Olivenöles am beladenen Baumwolllappen (Versuche 2 und 3 in Tab. 5) erfasst mehrere Vorgänge an der Textiloberfläche, wie die Aktivierung der Lipase und Hydrolyse an der Grenzschicht (Wasser/adsorbiertes Substrat), ferner den Stofftransport der Spaltprodukte von der Grenzschicht in die wässrigen Lösung durch Mizellen und die weitere Hydrolyse an der Grenzschicht Wasser/Spaltprodukte. Die Messergebnisse bei ca. 24-25 °C sind in 20 dargestellt. Der Unterschied zwischen den Versuchen 2 und 3 liegt im Verhältnis der Lipase Units bezogen auf die eingesetzte Menge an Olivenöl. Aus der Kinetik der beiden Versuche sind drei Abschnitte (a, b, c) sichtbar:

a) Am Anfang sind keine Glyceride in der Flüssigphase feststellbar, d. h. Veresterungszahl ist gleich Null. Danach nimmt die Veresterungszahl durch den Stofftransport der Spaltprodukte vom Lappen in die Flüssigphase deutlich zu. Die Spaltprodukte aus dem Versuch 3 (4315 Lipase Units/g Olivenöl) weisen im Vergleich zum Versuch 2 (1607 Lipase Units/g Olivenöl) eine niedrigere Veresterungszahl auf. Daraus folgt eine höhere Hydrolysegeschwindigkeit für Versuch 3 in der Textilgrenzschicht.
b) Die Veresterungszahl erreicht in der Flüssigkeit ein Maximum durch Anlagerung von partial hydrolysierten Glyceriden.
c) Die Veresterungszahl nimmt ab. Die Hydrolyse setzt sich in der Flüssigphase fort. Auch in diesem Abschnitt liegt die Geschwindigkeit der Hydrolyse für Versuch 3 höher als für Versuch 2.

Obwohl die Versuche unter gleichen Bedingungen durchgeführt wurden, sind die Unterschiede zwischen den Versuchen 2 und 3 sichtbar. Die Kinetik wird von dem Verhältnis Enzym/Substrat bestimmt. Eine Erhöhung des Verhältnisses von 1607 (Versuch 2) auf 4315 (Versuch 3) Lipase Units KLU/g Substrat führt zu einer Zunahme des Hydrolysegrades nach 40min von 59% bis auf 70%. Solch ein Vergleich erlaubt eine Aussage über Leistung und Wirtschaftlichkeit von unterschiedlichen Formulierungen der Waschmittel.
In weiteren erfindungsgemäßen Versuchen wurden die Kinetiken der Hydrolyse (Versuch 4, Tab. 5) einerseits in der Flüssigphase mit Immersion-Raman-Sonde ( 3a, (37)) und andererseits in der Grenzschicht (Wasser/adsorbiertes Substrat) mit der ATR-FTIR-Spektroskopie (4) gleichzeitig ermittelt.
Die Grenzschichtmessungen erfolgten in der Anordnung „Mikroreaktor/Messzelle“. Die getrocknete Baumwolllappen wurden auf die innere Oberfläche des Deckels (am ZnSe Kristall) gelegt und am Deckel befestigt. Enzymhaltige Flüssigkeit aus dem Rührreaktor strömt zunächst durch die angeschlossene Anordnung „Mikroreaktor/Messzelle“, dosiert mit der Pumpe (41), und anschließend zurück in den Rührreaktor. Während der laminaren Strömung der Flüssigkeit durch den Baumwolllappen reagiert das Gemisch Tensid/Enzym auf dem immobilisierten Olivenöl. Nach 60 min Hydrolyse bei 40°C ließen sich folgende Werte für die Veresterungszahl messen: 83 mg KOH/g in einer Tiefe von 1 bis 2 µm in den Garnen und 41 mg KOH/g für die Flüssigphase.
Beispiel 7:
Batch-Hydrolyse einer wässrigen Gelatine-Lösung mit dem Waschmittelenzym Savinase 16L.
Messmethode : Immersion-Raman-Sonde.

Die Hydrolyse der Gelatine (Rindgelatine mit einem Eiweißgehalt von 92 Gew. %, Fa. Töpfer GmbH; Molzahl der Amid-Gruppen CONH bezogen auf 1 g Protein beträgt 0,0111) erfolgte mit der Savinase 16L (Novozymes A/S, Tab. 3). Zu der im Rührreaktor vorgelegten, wässrigen Gelatinelösung (150 ml) mit einem Gehalt von 3,452 g/l kam eine Savinase 16L und hydrolysierte bei ca. 24-25°C. Die spektralen Messungen sind mit Immersion-Raman-Sonde durchgeführt worden. Tab. 7 gibt die Versuchsparameter wieder, die Kinetik der Hydrolyse ist in der 21 dargestellt. Der Hydrolysegrad wurde aus dem zeitlichen Verlauf der Raman-Intensitäten aus den spektralen Banden bei 1600-1660 cm^-1 berechnet. Die Hydrolyse der Gelatine durch Savinase 16L nimmt mit dem Verhältnis Enzym/Substrat zu (21). Tabelle 7. Parameter/Ergebnisse der Versuche zur Batch-Hydrolyse von Gelatinelösung mit Savinase 16L (Novozymes A/S) im Mikrorührreaktor.

Versuch	1	2	3
Vorlage 150 ml (pH>7)	Gelatinelösung	Gelatinelösung	Gelatinelösung
Gelatinegehalt	3,176 g/l	3,176 g/l	3,176 g/l
Molzahl Amid-Bindung	5,288E-3	5,288E-3	5,288E-3
Savinase 16L	6 g	30 g	45 g
Protease [Novo-Units/g Proteine]	202	1008	1511
Hydrolysegrad nach 1 min	0,14	0,26	0,38
Protein/ Amid-Bindung	8,10	21,82	22,40
[g/µmol]
Temperatur	24-25°C	24-25°C	24-25°C

Beispiel 8:
Batch-Hydrolyse von wässrigen Kohlenhydrate-Lösungen (Maltodextrine und Kartoffelstärke) mit Waschmittelenzym Termamyl 300L.
Messmethode: Immersion-Raman-Sonde.

Die Batch-Hydrolyse der Kohlenhydrate wurde im Rührreaktor (20) durchgeführt. Die Parameter der Messungen sind in der Tab. 8 erfasst. Nach der Vorlage von 150 ml wässrige Maltodextrin-Lösung (Versuche 1, 2) und Kartoffelstärke-Lösung (Versuch 3) erfolgte die Zugabe von Termamyl 300L und die Hydrolyse bei 24-25°C. Die Spektren sind mit der Immersion-Raman-Sonde aufgenommen worden. Die Belichtungszeit betrug 5s; nach je 10s wurde das Spektrum gespeichert. In 22 ist der zeitliche Verlauf der DE-Werte dargestellt. Die DE-Werte wurden mithilfe der Gl. 12 und Gl. 13 ermittelt. Tabelle 8. Parameter der Versuche zur Batch-Hydrolyse von Kohlenhydraten mit Termamyl 300L.

Versuch	1	2	3
Kohlenhydrat	Maltodextrin (Sigma Aldrich)	Maltodextrin (Sigma Aldrich)	Kartoffelstärke (Südstärke GmbH)
	DE 4/7	DE 16,5/19,5	DE 9,3
Vorlage 150ml	Maltodextrin	Maltodextrin	Kartoffelstärke
(pH>7)	Lösung	Lösung	Lösung
	4,976 g/l	4,944 g/l	5,014 g/l
Enzym	Termamyl 300L	Termamyl 300L	Termamyl 300L
	(Novozymes A/S)	(Novozymes A/S)	(Novozymes A/S)
Zugabemenge	20 g	20 g	20 g
Enzymaktivität der α-Amylase [Novo-Units/g Substrat]	8039	8091	7978

Beispiel 9:
Batch-Hydrolyse der wässrigen Subtratgemische Kartoffelstärke und Gelatine mit einem Gemisch aus den Waschmittelenzymen Savinase 16L und Termamyl 300L. Messmethode: Immersion-Raman-Sonde.

Wässrige Substratlösung aus Gelatinelösung und Kartoffelstärke wurden in Rührreaktor (20) vorgelegt. Danach erfolgte die Zugabe des Enzymgemisches aus Savinase 16L und Termamyl 300L. Die Versuchsparameter der Raman-Messungen mit der Immersion-Sonde in der Flüssigphase sind in der Tab. 9 erfasst. Tabelle 9. Batch-Hydrolyse von Substratgemischen mit Enzymgemischen.

Versuch	1	2
Vorlage 150 ml	- Kartoffelstärke: 1,6385 g/l	- Kartoffelstärke: 1,6385 g/l
Substratlösung	- Gelatine: 2,507 g/l	- Gelatine: 2,507 g/l
(pH>7)
Zugabe:	- 22,5 g Savinase 16L	- 15,0 g Savinase 16L
Enzymgemisch	- 9,0 g Termamyl 300L	- 15,0 g Termamyl 300L
Protease [Units/g Proteine]	- Savinase 16L: 1464	- Savinase 16L: 976
α-Amylase Novo	- Termamyl 300L: 7179	- Termamyl 300L: 11966
[Units/g Kohlenhydratel

Die Hydrolysegrade der glykosidischen und Amid-Bindungen nach 10 min Reaktionszeit und 24-25°C sind in 23 dargestellt. Versuch 1 mit 1464 Protease-Novo Units liefert einen Hydrolysegrad (Reaktionszeit 10 min) für die Amid-Bindung von 0,219 gegenüber 0,16 für Versuch 2 mit 976 Protease-Units. Der Hydrolysegrad der glykosidischen Bindungen von 0,254 für Versuch 1 (7179 α-Amylase-Novo Units) liegt höher als bei Versuch 2 mit 11966 α-Amylase-Novo Units. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Savinase 16L auch unspezifische Enzymbestandteile enthält.
Beispiel 10:
Kontinuierliche Messung der Hydrolyse von wässrigen Substratgemischen (Kartoffelstärke und Gelatine) mit Waschmittellösung unbekannter Zusammensetzung. Messmethode: Immersion-Raman-Sonde.
Die Hydrolyse des wässrigen Substratgemisches Kartoffelstärke (1,6385 g/l Kohlenhydrate DE 9,3) und Gelatine (2,507 g/l Proteinen) wurde mit Waschmittellösungen 10%v/v und 20%v/v Persil Universal Gel untersucht. Mit der Pumpe (6) erfolgten Dosierungen in den Mikromischer (10), und zwar von 1 bzw. 2 ml/min Gel aus dem Behälter (4) und von 9 ml/min bzw. 8 ml/min deionisiertes Wasser aus dem Behälter (7) mit der Pumpe (9).
Die Waschmittellösung befand sich nach Pumpen (14) im Rührreaktor (20) bei 24-25°C. Nach ca. 15 bzw. 30 min wurden 2 ml/min Substratgemisch aus dem Behälter (15) mit der Pumpe (17) über (18) in Rührreaktor (20) zudosiert. Die spektralen Messungen erfolgten ständig mit der Immersion-Raman-Sonde. In der 24 sind die Hydrolysegrade der glykosidischen und Amid-Bindungen für Versuch 1 (10%v/v Gelgehalt) und Versuch 2 (20%v/v Gelgehalt) bei den zwei Verweilzeiten von 10 und 30 min dargestellt.
Beispiel 11:
Vergleich der relativen Intensität der Amid-Bande I verschiedener Waschmittelgele aus dem Handel.
Messmethode: Immersion-Raman-Sonde.
Die Raman-Spektren von einigen Waschmittelgelen aus dem Handel wurden durch Immersion-Raman-Sonde in den Gel-Flaschen aufgenommen. Die Untersuchung der Spektren erfolgte mit der PCA-Analyse. Es sind die gemeinsamen spektralen Banden identifiziert worden. Aus der Peakhöhe und Fläche der Bandbreite wurden Kennzahlen für unterschiedliche Bestandteile der Formulierung gebildet.
Die relative Intensität, spezifisch für Amid-I Bande, ist für Dalli Gel, Tandil Gel, Persil Universal Gel, Persil Color Gel und Sunil Aktiv Gel in 25 dargestellt (Einzelversuche). Die relative Intensität wurde durch Dividierung der einzelnen Zahlen mit der gemessenen Zahl für Persil Universal Gel berechnet, weil Persil Universal Gel den höchsten Gehalt an Enzymen und die höchste Enzym-Aktivität aufweist.
Bezugszeichenliste

1 -: Zulaufstrom
2 -: Filter
3 -: Absperrventil
4, 7,15, 31 -: Behälter mit Rührwerk
5, 11, 12, 13, 14 -: enzymhaltiges Gemisch
6, 9,17: Dosierpumpen
8 -: Pufferlösung, deionisiertes Wasser
10 -: Mikromischer
16, 18, 19 -: Substrat- oder Kalibrierungslösung
20 -: Mikroreaktor
21, 22, 23, 25, 26, 28 -: Reaktionsgemisch
24 -: Messkopf für UV/VIS-/Raman-Spektroskopie
27 -: Abwasser
29, 30 -: Umwälzpumpen
32 -: Kalibrierungslösung
33 -: Spülwasser (deion. Wasser), Spülgas (Luft, N₂)
34 -: Rührwerk
35 -: Elektromotor mit Steuerung
36 -: Lappen, aufgehängt am Rührwerk
37 -: Immersions- Raman- Sonde
38 -: Immersions- UV/VIS- Sonde
39 -: Messfühler (Temperatur, pH)
40 -: Absperrventil
41 -: Dosierpumpe
42 -: Überlauf
43 -: Quarzküvette
44 -: non-invasive Messung
50 -: inzidenter Infrarotstrahl
51 -: reflektierter Strahl
52 -: Lappen oder zwei Flüssigkeitsfilme
53 -: ZnSe- Kristall
54 -: Immersions- Raman- Sonde
55 -: Waschlauge
56 -: Rücklauf
57 -: Saphirglas
58 -: Raman- Sonde

Literatur

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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P. J. Larkin, Infrared and Raman Spectroscopy-Principles and Spectral Interpretation, (2011), Elsevier Inc. [0173]

Claims

Methoden zur Bestimmung der hydrolytischen Aktivitäten von gelösten Enzymen in Gegenwart von Substraten, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionen online in Echtzeit über spektroskopische Aufnahmen mittels UV/VIS-, FTIR- und/oder Raman-Spektroskopie von einer oder von mehreren charakteristischen Bindungs-Banden in einem temperierten Mikrorührkessel verfolgt werden.
Methoden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Feststellung der Enzymaktivität gezielt chromophore, hydrolytisch in p-Nitrophenol spaltbare Substanzen (wie p-Nitrophenylacetat) und/oder definierte biologische Substrate der Flüssigkeit zugesetzt werden.
Methoden gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Analyse eingesetzte Flüssigkeit vorzugsweise aus einem mit Wasser und einer Pufferlösung verdünnten enzymhaltigen Wasch-, Reinigungs- oder Spezialmittel besteht, welches ein flüssiges oder gelartiges, wasserhaltiges Mittel oder ein weitgehend wasserfreies flüssiges Mittel oder ein in Wasser gelöstes festes Mittel (Pulver, Granulat, Tablette, Paste) sein kann.
Methoden gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen online in einem temperierten Mikro-Rührkessel (gemäß 1) ausgeführt werden, wobei in der Messapparatur ein Mikromischer und Mikrorührreaktor direkt aufeinander folgen (gemäß 2) und die Schaltung von Leitungen und Mikrodosierpumpen sowohl einen Batch- als auch einem Konti-Betrieb ermöglichen.
Methoden gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen direkt in der Flüssigkeit in der Waschmaschine oder in einem by-pass zur Waschmaschine durchgeführt werden.
Methoden gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Echtzeitmessungen in der Produktion und/oder Abfüllung von Wasch- und Reinigungsmittel zur Prozesssteuerung und Qualitätsüberwachung eingesetzt werden.
Methoden zur Bestimmung der hydrolytischen Aktivitäten von Enzymen in Gegenwart von biologischen Substraten auf festen Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen online in Echtzeit an den Grenzflächen fl/f über Bindungs-Banden mit der ATR-FTIR-Spektroskopie erfolgen.
Methoden nach den Ansprüchen 1 bis 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen in Gegenwart enzym- und tensidhaltiger Flüssigkeiten an immobilisierten, unlöslichen biologischen Substraten erfolgen, die sich auf festen Oberflächen befinden, wie Textilien, Porzellanen, Kunststoffen und/oder Gläsern.
Einsatz der Methoden nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mithilfe der Ergebnisse gezielt durchgeführter Messungen sowohl die Zusammensetzung des Enzymcocktails als auch die Zusammensetzung des Waschmittels in Richtung auf eine optimale Hydrolyse der biologischen Anschmutzungen im Temperaturbereich von 5 bis 65 °C hin formuliert werden können.
Methode zur Bestimmung der hydrolytischen Aktivität eines Enzyms mithilfe eines Standard-Substrats während der Fermentation nach den Ansprüchen 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fortschritt der Enzymbildung online über die Raman-Spektroskopie verfolgt wird.